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DETERMINACIÓN DE LA INHIBICIÓN DE QUORUM SENSING POR LA
VARIANTE LACTONASA 852 SOBRE LA PRODUCCIÓN DE BIOPELÍCULAS EN
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS MULTIDROGORESISTENTES.
JOHANA ALEXANDRA GALLARDO CASTRO
UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS BUCARAMANGA
2018
2
DETERMINACIÓN DE LA INHIBICIÓN DE QUORUM SENSING POR LA
VARIANTE LACTONASA852 SOBRE LA PRODUCCIÓN DE BIOPELÍCULAS EN
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS MULTIDROGORESISTENTES.
JOHANA ALEXANDRA GALLARDO CASTRO 16861003
Proyecto de Grado presentado como parte de los requisitos para la
obtención del título de Magíster en Investigación en Enfermedades
Infecciosas.
Tutor: Nohora Juliana Rueda Forero, MSc.
UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS BUCARAMANGA
2018
3
ACTA DE SUSTENTACIÓN
4
Deja en manos de Dios todo lo que haces……
Y tus proyectos se harán realidad.
Pr: 16-3
5
DEDICATORIA
A Dios, por colocarme en el camino buenas personas que me
acompañaron en este proceso, y contribuyeron de una u otra manera
a cumplir esta meta en mi vida personal y profesional, pero en
especial va dedicado a mi madre y esposo por su apoyo incondicional,
por sus palabras de motivación en todo momento porque creyeron en
mí y me ayudaron alcanzar esta meta en mi vida.
6
AGRADECIMIENTOS
A los integrantes del laboratorio de la Clínica San José de Cúcuta, por el apoyo en
la recolección de las muestras clínicas por el periodo de 1 año.
A los integrantes del laboratorio de biología molecular y biotecnología de la UDES,
por su apoyo infinito, en el ámbito de conocimiento y práctica en las técnicas
ejecutadas en el laboratorio.
A Rut Martínez Vega, PhD., por guiarme este tiempo en el proceso del análisis
estadístico del presente estudio.
A Nohora Rueda, MSc., por guiarme durante este periodo de 2 años y compartir su
experiencia y conocimiento en la ejecución del proyecto investigativo.
Al doctor Álvaro Mauricio Flórez, por su apoyo y asesoramiento en mi trabajo de
grado
A mi esposo, por brindarme esa compañía y apoyo emocional, en este nuevo
objetivo profesional de mi vida.
7
LISTA DE FIGURAS
1. Figura 1: La diversidad de señales QS se ejemplifica en diferentes caldos
de bacterias y archaeas……………………………………………………..22
2. Figura 2: Quórum Sensing………………………………………………….24
3. Figura 3. Formación de biopelículas……………………………………….26
4. Figura 4: Hidrolisis del anillo lactona producida por acción de lactonasas
……………………………………………………………………...………….29
5. Figura 5 : Metodo de difusión de señales QS en agar…………………..35
6. Figura 6: Bacterias Gram negativas……………………………………….42
7. Figura 7: Efecto de la lactonasa recombinante epp852 sobre la
producción de señales AHLs ……………………………………….………48
8. Figura 8: Formación de biopelículas en bacterias Gram negativas…….49
9. Figura 9: Estabilidad en la formación de la biopelícula vs formación de la
biopelícula…………………………………………………………………….51
10. Figura 10. Efecto de la atenuación por la lactonasa recombinante epp852
en la formación de la biopelícula.…………………….. ………………...…53
8
LISTA DE TABLAS
1. Tabla 1: Enzimas lactonasas identificadas………………………………..29
2. Tabla 2: Cepas y compuestos utilizados en el estudio …………….……34
3. Tabla 3: Distribución de los aislamientos colectados durante los 12 meses
……………………………………………………………………………...….41
4. Tabla 4: Resultados de tamizaje con biosensor CV026………………….43
5. Tabla 5: Clasificación de señales AHLs por pigmentación de las bacterias
de estudio……………………………………………………………………..44
6. Tabla 6: Cuantificación de violaceína en bacterias Gram negativas……45
7. Tabla 7: Efecto de atenuación en la formación de biopelículas ….……..46
8. Tabla 8: Formación de biopelículas…………………...…………………...49
9. Tabla 9: Estabilidad en la formación de biopelículas…………………….50
10. Tabla 10: Efecto de atenuación en la formación de biopelículas por la
lactonasa recombinante epp852……………………………………………52
11. Tabla 11: Efecto de la lactonasa epp852 en la atenuación de la formación
de biopelículas………………………………………………………………..54
9
LISTA DE ANEXOS
1. Anexo 1: Listado de bacterias Gram negativas………………………………77
2. Anexo 2: Formación de biopelículas…………………………………….…….84
3. Anexo 3: Efecto de la lactonasa epp852 en la atenuación de la formación de
biopelículas……..………………………………………………........................85
10
LISTA DE ABREVIATURAS
AHL Homoserina Lactona
AHLs Acíl Homoserina Lactona
AI2 Auto inductor de tipo 2
Amp-C Serin-betalactamasas
AZM Azitromicina
BF Formación de biopelículas
BLLE Betalactamasa
Bt Bacillus thuringiensis
C12-Oxo-HSL N- (3-oxo-dodecanoil) -l-homoserina lactona
C4-HSL N-butiril-L-Homoserina Lactona
C6-HSL N-hexanoil-L- Homoserina Lactona
C6-Oxo-HSL Oxo-Hexanoil-L-Homoserina Lactona
C8-HSL N-octanoil-L- Homoserina Lactona
C8-Oxo-HSL N-3-oxo-octanoil-L-Homoserina lactona
CDC Centro de control y prevención de enfermedades
CV026 Chromobacterium violaceum
DHBA Ácido 2,3-dihidroxibenzoico
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético
EP-PCR RCP propensa a error- “Error Prone PCR”
EPS Exo-PoliSacaridos
ESBL Extendido de Espectro de Beta-Lactamasa
EuSCAPE Encuesta europea de Enterobacteriaceae productoras de
carbapenemasas
IMP Imipenem
IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido
KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemasa
LB Luria Bertani
11
LPS Lipo-polisacáridos
NDM Nuevo Delhi métalo-beta-lactamasa
OD Densidad óptica
ODC Densidad óptica de control
OMS Organización Mundial de la Salud.
OXA Oxacilina
QQ Quorum Quenching
QS Quorum Sensing
QSI Inhibición del quorum sensing
SBF Índice de formación de biopelículas
UDES Universidad de Santander
VIM Verona Integron-encoded Metallo-betalactamas
12
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE ABREVIATURAS…………………………………………..………..10
RESUMEN………………………………………………………………………..14
ABSTRACT……………………………………………………………………….16
INTRODUCCION…………………………………………………………………17
1. MARCO TEORICO……………………………………………………………… 21
1.1 Quorum Sensing……………………………………………...……………...23
1.2 Mecanismo del Qs en Bacterias Gram Negativas…………….…............27
1.3 Quorum Sensing En La Formación De Biopelículas…………………..….25
1.4 Sistema De Inhibición Del Qs………………………………..……………..28
1.5 AHL – Lactonasa…………………………………………….……………....30
2. OBJETIVOS……………………………………………………………………... 32
2.1 OBJETIVO GENERAL …………………………………..…………………32
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................32
3. MATERIALES Y MÉTODOS …………………………………………………...33
3.1DISEÑO METODOLÓGICO………………………………………..……….33
3.2 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo…..………………………….33
3.3 Detección de señales AHL en las bacterias Gram negativa……………34
3.4 Cuantificación de violaceína……………………………............................36
3.5 Efecto de la lactonasa recombinante epp852 sobre la producción de
señales AHL.……....…………………………….............................................37
3.6 Desarrollo de biopelículas en placas de micro titulación…………………37
3.7 Evaluación del efecto en la inhibición de la formación de biopelículas por
la lactonasa epp852…………..………………………………………………….39
3.8 Análisis de datos.....................................................................................39
3.9. Aspectos éticos……………………………………………..……………….40
4. RESULTADOS…………………………………………………………………...41
4.1 Caracterización de los aislamientos obtenidos………………………….41
13
4.2 Tamizaje con el biosensor cv026…………………………………………...43
4.3 Cuantificación de las señales AHLs a través de las unidades de violaceína
………………………………….……………………………………………...45
4.4 Efecto de la lactonasa recombinante epp852 sobre la producción de
señales acíl homoserina lactona………………………………………..….47
4.5 Formación de biopelículas…………..………………………………………48
4.5.1 Estabilidad De La Formación De Biopelículas…………………….50
4.6 Efecto en la inhibición de la formación de biopelículas por la lactonasa
recombinante epp852………………………………………………............ 51
5. DISCUSIÓN………………………………………………………………………60
6. CONCLUSIONES………………………………………………………………..61
7. RECOMENDACIONES………………………………………………………….61
8. REFERENCIAS…………………………………………………………………..62
9. ANEXOS…………………………………………………………………………. 77
14
RESUMEN
TITULO: DETERMINACIÓN DE LA INHIBICIÓN DE QUORUM SENSING POR LA
VARIANTE LACTONASA 852 SOBRE LA PRODUCCIÓN DE BIOPELÍCULAS EN
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS MULTIDROGORESISTENTES.
AUTOR: JOHANA ALEXANDRA GALLARDO CASTRO
PALABRAS CLAVE: Bacterias, Biopelículas, multidrogoresistentes, Quórum
Sensing.
DESCRIPCIÓN
La regulación de la expresión génica asociada a la producción de biopelículas en
bacterias Gram negativas es mediada por Quórum Sensing (QS). Estudios previos
han demostrado la degradación de señales QS de la variante lactonasa epp852 y la
atenuación in vitro de infecciones producidas por Pectobacterium carotovorum,
Agrobacterium tumefaciens y Pseudomonas aeruginosa PAO1.
Materiales y Métodos: se investigó la inhibición de señales QS y la formación de
biopelículas en bacterias Gram negativas multidrogoresistentes, empleando la
lactonasa recombinante epp852. Se tamizaron cepas provenientes de muestras
clínicas, previamente aisladas e identificadas con patrón de resistencia antibiótica.
Se evaluó la producción de señales QS dependientes de acíl homoserina lactona
(AHL) mediante el biosensor Chromobacterium violaceum. Se cuantificó la
violaceína producida y se determinó la formación de biopelículas mediante la
microtitulación en placa y cuantificación de cristal violeta. Las cepas que produjeron
señales AHLs y formaron biopelículas se sometieron a estudios de inhibición QS
con la lactonasa recombinante epp852.
Resultados: se identificaron 29 aislamientos Gram negativos con fenotipos de
resistencia y sensibilidad antibiótica que producen señales AHL. En el aislamiento
92, S. marcescens productora de betalactamasa, se obtuvo una inhibición del
98.12%, en la formación de la biopelícula y para el aislamiento 28, P. aeruginosa
sensible se obtuvo una reducción en el índice de formación de biopelícula del
36.4%. Se observó diferencia estadísticamente significativa al comparar el
tratamiento con lactonasa para P. aeruginosa (P= 0,038) y S. marcescens (P=
0,028) Conclusiones: El efecto de la atenuación de la variante epp852 en
microorganismos patógenos, permite el desarrollo de nuevas estrategias
biomédicas para el control de las infecciones originadas por bacterias Gram
negativas multidrogo resistentes.
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ABSTRACT
TITLE: DETERMINATION OF QUORUM SENSING INHIBITION BY THE VARIANT
LACTONASE 852 IN THE BIOFILM FORMATION IN MULTIDRUG-RESISTANT
GRAM NEGATIVE BACTERIA
AUTHOR: JOHANA ALEXANDRA GALLARDO CASTRO
KEYWORDS: Bacteria, Biofilms, multidrug resistance, Quórum Sensing
DESCRIPTION
The regulation of gene expression associated with the production of biofilms in Gram
negative bacteria is mediated by Quorum Sensing (QS). Previous studies have
demonstrated the degradation of QS signals of the lactonase variant epp852 and
the attenuation in infections produced by Pectobacterium carotovorum,
Agrobacterium tumefaciens and Pseudomonas aeruginosa PAO1.
Materials and methods: we studied the inhibition of QS signals and the efect in the
biofilm formation in Gram-negative multiresistant bacteria by using a variant of
recombinant lactonase epp852. Strains from clinical samples were previously
isolated, identified and screened with known antibiotic resistance pattern. The
production of acyl homoserine lactone (AHL) signals were evaluated by the
biosensor Chromobacterium violaceum, the violacein produced was quantified and
biofilm formation was determined by microplate titration and crystal violet
quantification. The strains that produce AHL signals and form biofilms were
subjected to QS inhibition studies with recombinant lactonase epp852.
Results: 29 Gram-negative isolates with resistance and antibiotic sensitivity
phenotypes that produce AHL signals were identified. It was found that in one
isolates identified as beta-lactamase-producing S. marcescens, reduce in 98.12%
the biofilm formation and, for the isolate 28, P. aeruginosa sensitive an inhibition of
36.4% in biofilm formation was obtained. A statistically significant difference was also
obtained when treated in P. aeruginosa (P = 0.038) and S. marcescens (P = 0.028).
Conclusions: The effect of the attenuation of the epp852 variant on pathogenic
microorganisms allows the development of new biomedical strategies for the control
of infections caused by multidrug-resistant Gram negative bacteria.
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INTRODUCCIÓN
Con la aparición de la multirresistencia antibiótica detectada en bacterias de
ambiente hospitalario, se ha generado una alerta mundial debido el aumento en la
frecuencia y severidad de patologías asociadas a estos microorganismos, no solo
por el fracaso en el tratamiento terapéutico sino también ocasionando una estancia
hospitalización prolongada con altas repercusiones en el sistema de salud y
poniendo en riesgo la vida del paciente en la mayoría de los casos.
Según la organización mundial de la salud (OMS), la resistencia antibiótica
incrementa progresivamente los costos médicos, la estancia hospitalaria y la
mortalidad. Se estima que solo en la Unión Europea las bacterias
farmacorresistentes causan cada año 25 000 muertes y generan un costo de US$
1500 millones en gastos sanitarios (OMS 2015), por lo que se hace necesario la
implementación de prácticas en la prescripción y manejo de antibióticos modificando
los protocolos actuales pues, aunque se desarrollen nuevos medicamentos, la
resistencia a los antibióticos seguirá representando una grave amenaza (OMS
2015).
El nuevo sistema de vigilancia de la resistencia antimicrobiana reportó en muestras
de 500.000 personas de 22 países con sospecha de infección bacteriana,
ocasionada por Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus,
Streptococcus pneumoniae y Salmonella spp (OMS 2018).
La OMS, en febrero del 2017 publicó un listado de bacterias con resistencia
antibiótica destacando: Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa,
resistente a los carbapenémicos, Enterobacteriaceae, resistentes a los
carbapenémicos y productoras del Extendido-Espectro Beta-Lactamas (ESBL),
Enterococcus faecium, resistente a la vancomicina, Staphylococcus aureus,
resistente a la meticilina y vancomicina, Helicobacter pylori, resistente a
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claritromicina, Campylobacter, resistente a las fluoroquinolonas, Salmonella spp
resistente a fluoroquinolona, Neisseria gonorrhoeae, resistente a cefalosporinas de
tercera generación y fluoroquinolonas (OMS 2017).
En Colombia, diferentes instituciones de salud determinaron la prevalencia en
bacterias Gram negativas del gen blaKPC que codifica para enzimas
carbapenemasas, que facilitan la resistencia antimicrobiana ocasionando
dificultades de diagnóstico y tratamiento oportuno disminuyendo en la disponibilidad
de antibióticos para combatirlas (Pacheco et al., 2014).
Se ha detectado de forma significativa niveles de resistencia hasta del 37,1% a
imipenem (carbapenémicos) en 2009 y 98,8 % a meropenem en aislamientos
provenientes de unidades de cuidados intensivos en 2012 de Acinetobacter
baumannii (Vanegas et al., 2015). Igualmente, en Medellín se observó un aumento
del 28 al 35 % en la resistencia a meropenem y del 27 al 34 % a imipenem entre
2010 y 2012. Así mismo, se ha reportado la circulación en el país del gen blaOXA-
23, relacionado con una resistencia elevada de A. baumannii a los carbapenémicos
(Vanegas et al., 2015).
Como una respuesta inmediata a la resistencia antibiótica y con el fin de
contrarrestar los fenotipos de resistencia en los patógenos, se ha planteado el uso
de una estrategia combinatoria de dos o más moléculas que incluyan un antibiótico
resistente junto con uno o dos antibióticos nuevos de tercera generación con
sensibilidad en el microorganismo, pero que para implementarlo, requiere de equipo
de salud entrenado y de laboratorio que supervisen permanentemente el efecto del
tratamiento en el paciente ya que existe el riesgo latente del fracaso terapéutico y
la inducción de mutaciones en nuevos genes de resistencia (Brunel et al., 2017).
Sumado a lo anterior, el desarrollar y producir en masa un antibiótico efectivo
requiere aproximadamente 10 años (Strugeon et al., 2016).
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Este escenario ha colocado como una prioridad para los sistemas de salud del
mundo la obtención de agentes antimicrobianos que involucren nuevas moléculas
de amplio espectro y de bajo precio, previniendo la diseminación rápida de
microorganismos multirresistentes (Strugeon et al., 2016).
Considerando todo lo anterior, surge la necesidad proponer métodos alternativos
para el control de infecciones. Uno de ellos es inhibir el sistema de expresión génica
dependiente de la densidad celular en las bacterias, conocido Quorum Sensing (QS)
el cual regula la expresión de genes de virulencia mediante la producción de
moléculas de señal difusibles llamadas autoinductores (Jamal et al., 2018). Se ha
sugerido que inhibir estos sistemas se considera como una alternativa sustentable
para controlar la proliferación de bacterias infecciosas resistentes y mejorar en el
tratamiento y expectativa de vida de quienes cursan un proceso infeccioso
(Bhardwaj et al., 2013).
La inhibición de la comunicación celular surge como una estrategia evolutiva que le
ha permitido a los microorganismos en una población mixta, contrarrestar sus
competidores y garantizar su supervivencia. Basados en esta estrategia, algunos
microorganismos han desarrollado un sistema que elimina las señales de QS,
conocido como Quorum Quenching (QQ) (Grandclement et al, 2015). Se han
identificado múltiples formas de inhibir el sistema, entre esas se destacan tres
mecanismos enzimáticos: lactonasa AHL (hidrólisis lactona), acilasa AHL
(amidohidrólisis) y AHL oxidasa y reductasa (óxido-reducción) (Thang et al., 2013).
La inhibición del QS en bacterias Gram negativas ejerce una actividad sin presión
selectiva frente al cierre de porinas, pues no es bactericida o bacteriostático lo cual
facilita que no se genere resistencia a este tipo de intervención en comparación con
la terapia antimicrobiana que ocasiona nuevos fenotipos de multidrogo-resistencia
antibiótica (Prashanth et al., 2012). La actividad QQ ha demostrado la reducción de
señales de AHLs y con ello la inhibición en la formación, desarrollo y estabilidad de
biopelículas en el tratamiento con antibióticos en P. aeruginosa (Tay et al., 2013).
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Las enzimas AHL-Lactonasas se identificaron en Bacillus thuringiensis (Bt) (Dong
et al., 2000) cuya actividad consiste en hidrolizar el anillo lactona de la señal AHLs
inhibiendo la activación el QS. Se ha demostrado que las lactonasas atenúan
infecciones producidas por bacterias dependientes de QS como P. aeruginosa en
el control de formación de biopelículas (Barreto et al, 2013). En ese sentido el grupo
de investigación de Biología Molecular y Biotecnología ha venido trabajando con
estas proteínas y es así como, a partir de un estudio de bioprospección se logró
identificar el aislamiento 147-115-16 de Bacillus thuringiensis, que produce una
lactonasa que degrada señales AHL (Pedroza, Flórez et al., 2014) y se demostró
que atenúa la infección producida por Pectobacterium carotovorum en papa y lulo
(Sánchez et al., 2013), así como de Agrobacterium tumefasciens en zanahoria
(Robles et al., 2014).
Esta enzima fue sujeta a ensayos de evolución dirigida obteniendo la variante
epp852 con características mejoradas como la estabilidad térmica y la resistencia a
pH ácidos (pH4), y una alta especificidad en la degradación de señales AHL C8HSL
–C6-Oxo-HSL y actividad destacable para C6HSL - C12-Oxo-HSL (Rueda et al.,
2016). A su vez se ha encontrado que en cultivos con biosensores se previene la
acumulación de señales y afecta el fenotipo coordinado a través de QS (Rueda,
2016). Estos antecedentes permiten proponer a esta variante lactonasa como una
candidata para la degradación de señales AHL en bacterias Gram negativas
resistentes a los antibióticos.
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1. MARCO TEORICO
Pese la implementación de nuevas estrategias como el direccionamiento de nuevos
protocolos y guías de antibiótico en el manejo de cada una de las enfermedades
infecciosas y el reto que representa el manejo terapéutico de la multirresistencia
antibiótica en bacterias de amplio espectro, se requiere de las nuevas alternativas
dirigidas a contrarestar en resistencia antibiótica sin peder la eficacia terapéutica.
La resistencia antimicrobiana en bacterias Gram negativas está determinada por
mutaciones cromosómicas como la adquisición de genes transferibles entre
diferentes bacterias (Strugeon et al., 2016). El mecanismo de resistencia más
importante de las bacterias Gram negativas es la producción de betalactamasas
(BLEE) o las betalactamasas de tipo Amp-C y las carbapenemasas. Entre los
mecanismos no enzimáticos se encuentran los transportadores de membrana de
tipo porina y la expresión de las bombas de expulsión (Hernández et al., 2014). El
aislamiento de carbapenemasas en Enterobacteriaceae, P. aeruginosa y A.
baumannii ha incrementado durante los últimos 10 años, siendo las más
frecuentemente reportadas las carbapenemasas del grupo A, como la KPC
(Klebsiella pneumoniae Carbapenemasa), las del grupo B como la VIM (Verona
Integron-encoded Metallo-betalactamas) y la IMP (Imipenem), así como las del
grupo D, el cual está conformado por las OXA (Oxacilinasa) (Queenan et al., 2007).
Recientemente, la encuesta europea de Enterobacteriaceae productoras de
carbapenemasas (EuSCAPE) realizó un estudio prospectivo multinacional en 2703
aislados clínicos que incluía 455 hospitales centinelas en 36 países, obteniendo un
total de aislamientos 2703 donde el 85% corresponde a K. pneumoniae y el 15% de
E. coli. Dentro de las muestras se obtuvo que el 37% K. pneumoniae y 19% de E.
coli fueron productores de carbapenemasas que presentaban los siguientes genes
de resistencia kpc, ndm, oxa-48 similares o vim (Grundmann et al., 2017).
21
Las nuevas investigaciones se centran la inhibición del QS en bacterias Gram
negativas con la finalidad de no crear resistencia y cuyo efecto es interferir el
sistema de señalización en las bacterias, sin activar los mecanismos de evasión
como bombas de eflujo, impermeabilidad de la membrana, creación de biopelículas
o alteración del sitio de acción, contribuyendo así, a la no propagación de nuevos
fenotipos de multidrogo-resistencia antibiótica (Prashanth et al., 2012).
1.1 Quorum sensing
La comunicación célula a célula permite a los microorganismos liberar y detectar
pequeñas moléculas señal que se acumulan de acuerdo con la densidad
poblacional. Una vez se alcanza un umbral mínimo de individuos, su
comportamiento cambia a ser “multicelular coordinado”. A este fenómeno se le
conoce como Quórum Sensing (QS) (Zhang et al., 2013). La regulación de la
comunicación entre bacterias opera a través de una amplia gama de moléculas de
señales tales como: oligopéptidos, N-acíl homoserina lactonas, furanosilo borato,
éster metílico de ácido de hidroxilo-palmítico y de metilo ácido dodecanoíco. Estas
moléculas están vinculadas en la regulación de virulencia bacteriana y están
distribuidas en los grupos celulares como bacterias y Archaeas Figura 1
(Granclement et al., 2014)
22
Figura 1: Diversidad de señales QS se ejemplifica en diferentes clados de bacterias
y archaeas.
Fuente dé (Grandclement, Tanniers et al., 2015)
El QS en bacterias Gram negativas resistentes a antibióticos se caracteriza por
tener una expresión génica dependiente de la densidad celular y sus moléculas de
señal denominadas autoinductores (Kalia et al., 2013). Su resistencia se debe a
mutaciones en la expresión de genes o en las densidades poblaciones que
confieren la resistencia antibiótica (Qi et al., 2016). Por ejemplo, S. marcescens
23
tiene un QS bien caracterizado (SmaI / SmaR) que utiliza ketocaproil- homoserina
lactona (C4-HSL), hexanoil-homoserina lactona (C6-HSL) y octanoil-homoserina
lactona (C8-HSL) como señales que regulan la secreción de una amplia gama de
factores de virulencia tales como: prodigiosina, proteasa, lipasa, nucleasa,
quitinasa, hemolisina y la formación de biopelículas (Qi et al., 2016).
1.2 Mecanismo del QS en bacterias Gram negativas: Las bacterias han
desarrollado resistencia a la mayoría de los antibióticos principalmente debido al
uso a gran escala y "indiscriminado" de ellos por lo que es necesario estudiar
nuevos mecanismos para tratar infecciones bacterianas. La expresión genes de
virulencia durante las infecciones bacterianas está mediada por QS, (Kalia et al.,
2014). En bacterias Gram negativas, el QS está mediado por las moléculas de señal
(AHL) producidas por el gen de la sintasa (homólogos LuxI). Las AHLs contienen un
anillo lactona que se une por un enlace amida a un ácido graso que constituye la
cadena lateral que normalmente contiene entre 4 y 18 carbonos y que puede estar
saturada o insaturada con o sin sustituciones oxo o hidroxi en el tercer carbono
(Hawver et al., 2016). Estas moléculas se unen al receptor y activan el regulador
transcripcional (homólogos de luxR). Este complejo induce la activación genes
implicados en la patogenicidad (Van Baarlen et al., 2002). En general, la mayoría
de las bacterias posee un sistema de señales soportado en QS y que tienen un
único gen de señal sintasa y un gen regulador de la transcripción (I/R). Algunas
otras bacterias como las especies de Pseudomonas, Sinorhizobium y Vibrio tienen
sistemas múltiples (I/R) (Patankar et al., 2009).
El mecanismo de comunicación implica dos proteínas involucradas en la regulación
de QS: la proteína R regulador transcripcional (LuxR en V. fisheri) y la proteína I
(LuxI) responsable de la síntesis de la molécula de señal. Cuando se alcanza la
densidad de población y la concentración de AHLs llega al umbral mínimo de
concentración, permitiendo la interacción del autoinductor con la proteína R (Figura
24
2). El QS en P. aeruginosa, comprende dos sistemas principales: lasR y lasI, el
activador transcripcional lasR es activado por N-3- (oxododecanoil)- L-homoserina-
lactona el cual es sintetizado por LasI. El complejo LasR: 3- oxo-C12-HSL se
convierte en un factor de transcripción sensible (Barreto et al., 2013) activando
genes asociados a los factores de virulencia.
Figura 2: Quórum Sensing
Fuente: (Barrero et al., 2009), modificado Gallardo 2016.
La complejidad de estos sistemas refleja la diversidad de las señales producidas
por ciertas bacterias, por ejemplo en Pseudomonas, que como patógeno
oportunista, expresa una amplia gama de genes contribuyendo a la supervivencia
en condiciones adversas y dentro hospedero (Van Baarlen et al., 2007). Se ha
documentado que P. aeruginosa causa enfermedades como la fibrosis quística y la
queratitis microbiana a través de QS dependiente de AHL, activando los genes
responsables en la formación de biopelículas (infecciones crónicas) y reprimiendo
los genes implicados en la expresión del sistema de secreción tipo III (Bleves et al.,
2005).
También se ha documentado QS blinda los patógenos bacterianos contra el sistema
inmune como ocurre en P. aeruginosa. En este patógeno, la principal señal
autoinductora (3-oxododecanoil)-homoserina lactona inhibe la proliferación de
25
linfocitos y la secreción de varias citoquinas por los macrófagos y las células T
(Telford et al., 1998). QS también permite que las biopelículas de P.
aeruginosa inhiban la fagocitosis y las explosiones de radicales de oxígeno por
neutrófilos (Bjarnsholt et al., 2005). Además, las actividades de factores de
virulencia controlados por QS como elastasa, proteasa alcalina y los ramnolípidos
interfieren con la activación de la fagocitosis y la señalización celular (Leid et al.,
2005; Kuang et al., 2011; Dössel et al., 2012; Laarman et al., 2012). La relación
entre QS y la resistencia de las biopelículas a varios antibióticos como la tobramicina
también ha sido documentada (Davies et al., 1998; Hentzer et al., 2003).
La cantidad de genes mediados por QS puede constituir alrededor del 10% del
genoma bacteriano total (Hentzer et al., 2003), por lo tanto las bacterias patógenas
con esta característica única son capaces de evadir la defensa del huésped
(Hentzer et al., 2003). Así mismo, se ha descubierto que las bacterias presentes
dentro de la biopelícula mediada por QS son hasta 1000 veces más resistentes a
los antibióticos que las formas planctónicas (Rasmussen et al., 2006). Este cambio
en el comportamiento bacteriano complica el proceso de tratamiento.
Existen estudios dirigidos a prevenir o interrumpir el proceso de formación de
biopelículas con base en inhibidores QS (QSI) para cada una de estas etapas. Así
mismo, se han establecido un conjunto de criterios para identificar las moléculas de
QSI (Vattem et al., 2007), que a diferencia de los antibióticos, no tienen un efecto
bactericida y actúan a una concentración mucho más baja que los
antibióticos. Además, el efecto de QSI no genera presión indebida sobre las
bacterias para desarrollar resistencia contra ellas (Vattem et al., 2007)
1.3 Quórum sensing en la formación de biopelículas: La formación de
biopelículas en bacterias Gram negativas está mediada por una serie de eventos
mecánicos, bioquímicos y fisicoquímicos que comprende la adhesión bacteriana,
26
mediante pili y flagelos que se utilizan como adhesivo para ayudar la fijación a las
superficies bióticas o abióticas (Thakur et al., 2015). La fuerza e integridad de una
biopelícula depende de factores de interacción como fijación, fibra de celulosa y lipo-
polisacáridos (LPS) (Thakur et al., 2015). Después de la adhesión, se inicia una
cascada de señalización que permite que las bacterias generen cambios y
sobrevivan para formar un conjunto estructurado de biopelículas (Thakur et al.,
2015). Casi el 60% de las infecciones son un resultado de la formación de
biopelículas en la mucosa humana, por ejemplo: enfermedades causadas por E.
coli, Salmonella, Yersinia enterocolitica, Listeria sp, Campylobacter entre otras
(Thakur et al., 2015).
La formación de biopelículas inicia por la unión y la adhesión de las células
microbianas a una superficie a través de sus apéndices como pili y flagelos. Luego
se producen sustancias como ramnolípidos, sideróforos, eDNA y Exo-PoliSacaridos
(EPS) para la formación de micro colonias. Durante la formación de la biopelícula
las células microbianas se comunican entre sí mediante las señales autoinductoras
(Passos et al., 2017). Estos inductores automáticos facilitan el QS (Passos et al.,
2017). La maduración de la biopelícula se encuentra regulado por lectinas,
adhesinas y EPS que es el material principal en la estructura tridimensional de la
biopelícula y finaliza con la dispersión de las mismas (Passos et al., 2017).. Estas
etapas se puede apreciar en la Figura 3 (Passos et al., 2017). Durante el proceso
de desprendimiento, las comunidades microbianas dentro de la biopelícula,
producen diferentes enzimas sacarolíticas que ayudan a liberar a la superficie
nuevos microbios en una nueva área para la colonización (Jamal et al., 2017). El
desprendimiento de células microbianas en las biopelículas y la transferencia de los
microbios a un nuevo sitio ayudan en la propagación de infecciones (Otto et al.,
2013).
27
Figura 3. Formación de biopelículas
Fuente: (Passos et al., 2017)
Las bacterias con frecuencia viven en comunidades densamente pobladas
formando biopelículas (Hall et al., 2004). Las células que viven en estas dependen
de la secreción de sustancias extracelulares para construir sus comunidades y
capturar los nutrientes del medio ambiente (Flemming et al., 2010). Algunos factores
secretados se comportan como bienes producidos por bacterias y pueden ser
explotados por células no productoras (Popat et al., 2012). El microorganismo Vibrio
cholerae, que secreta enzimas extracelulares para digerir su principal fuente de
alimento de polímero de quitina, secreta quitinasas difusibles que degradan el
polímero sólido en oligómeros solubles de GlcNAc y GlcNAc, que pueden
importarse y catabolizarse (Meibom et al., 2004). Así que la secreción de quitinasa,
es explotable por otras bacterias que no secretan quitinasa este tipo de mecanismos
generales que resuelven este problema de bienes producidos por bacterias en
hábitats naturales (Drescher et al., 2014). Las bacterias que producen moléculas
extracelulares que pueden considerarse como bienes producidos por bacterias son
omnipresentes. Por lo que producen enzimas extracelulares como: exopolisacáridos
(utilizados en biopelículas), surfactantes (que ayudan a la motilidad), antimicrobiano
(para combatir otros microbios), factores de virulencia (para combatir el sistema
inmune del organismo huésped o para explotar los recursos del huésped) y
sideróforos (Heilmann et al., 2015), por ejemplo en P. aeruginosa los compuestos
28
secretados están significativamente sobrerrepresentados en la lista de productos
génicos regulados por QS, que a menudo se asume como bienes producidos por
este microrganismo, el cual proporciona más beneficios a mayores densidades de
población (Heilmann et al., 2015).
1.4 Sistema de inhibición del QS
La interrupción del sistema de comunicación se da por diferentes mecanismos que
se centran en contrarrestar la producción de las señales, la acumulación, recepción
o activación. El proceso de QS puede ser interrumpido por diferentes mecanismos:
el primero es la reducción de la actividad de la proteína receptora o AHL sintasa
(Kalia et al., 2013). El segundo es inhibir la producción de moléculas de señal QS
(Kalia et al., 2013), el tercero es la degradación de la AHL (Kalia et al., 2013) y el
cuarto son las moléculas de señal, principalmente mediante el uso de compuestos
sintéticos análogos (Kalia et al., 2013).
La acumulación de la señal QS se puede evitar por medio de hidrólisis enzimática
ya sea de proteínas sintéticas o naturales, estas últimas pueden ser: lactonasas,
acilasas y oxidorreductasas (Kalia et al., 2013). Las lactonasas AHL son
metaloproteínas que hidrolizan el enlace éster que une al anillo de homoserina
lactona para generar una acíl homoserina (Figura 4) (Kalia et al., 2013).
29
Figura 4: Hidrolisis del anillo lactona producida por acción de lactonasas.
Fuente: (Lasarre et al., 2013)
Las acíl Homoserinas lactonasas se caracterizan por ser enzimas con diferentes
secuencias de aminoácidos involucradas en la degradación de las señales AHL, las
cuales se dividen en cuatro grupos: las métalo-β-lactonasas, fosfotriesterasa,
paraoxonasas y las lactonasas alfa / beta-hidrolasa. La métalo-β- Lactonasas son
de tipo lactamasa y son codificadas por el gen aiiA de Bacillus thuringiensis (Bt) y
aiiB de Agrobacterium tumefaciens (Dong et al., 2000). Se han descrito diferentes
lactonasas producidas por más de 70 especies bacterianas, algunas de las cuales
se mencionan en la Tabla 1 (Fetzner et al., 2015).
Tabla 1: Enzimas lactonasas identificadas.
Grupo Proteína Fuente Especialidad Localización, cofactor o señal diana
Lactonasas
AiiA Bacillus sp. Superfamilia métalo β lactamasa
Zn2+
AiiB Agrobacterium tumefaciens C58 AttM
AhID Artrobacter sp cepa IBN110
AiiA 147-115-16 Bacillus thruringiensis147-115-
16
No depende de metales AiiA 852 Bacillus
thuringiensis 852
Fuente: (Lasarre et al., 2013)
30
1.5 AHL- Lactonasa.
Son enzimas con capacidad de hidrolizar el enlace éster del anillo lactona
inactivando el auto inductor e interrumpiendo el sistema de QS (Fetzner et al., 2015)
El gen aiiA fue el primero en ser descubierto en B. thuringiensis y que tiene la
capacidad QQ en bacterias Gram negativas controlando el proceso de infestación
en Erwinia carotovorum (Dong, xu et al 2000), actualmente Pectobacterium
carotovorum. La enzima que codifica para este gen se describió como lactonasa
(Dong, Wang et al 2011) y actualmente existen alrededor de 100 secuencias de
genes descritos que codifican para lactonasas, entre ellos del género Bacillus (Dong
et al., 2000). En solo esta especie se ha encontrado un 90% de identidad en sus
secuencias peptídicas ya que comparte un dominio de HXDH-H-D asociado a la
unión de zinc, que es característico en las métalo –β- lactamasas (Dong, Gusti et
al. 2002).
La lactonasa obtenida del aislamiento Bt147-115-16 ha demostrado que posee actividad
para: C8-HSL, C7-HSL, C6-HSL, C4-HSL y los ensayos realizados al expresar el
gen Aiia147-115-16 en un modelo recombinante, mostraron actividad lactonasa para
C6-Oxo-HSL y C12-Oxo-HSL (Flórez et al., 2014). El gen aiiA147-115-16, tiene
actividad de atenuación disminuyendo la acumulación de AHL, afectando las
señales controladas por QS reduciendo los síntomas de pudrición blanda generada
por P. carotovorum en papa y zanahoria (Dong et al., 2000, Flórez et al., 2014).
A partir de estudios de evolución dirigida de la lactonasa147-115-16 (Flórez et al., 2014),
se obtuvo, a través PCR propensa a error la variante de lactonasa epp852,
expresada en una cepa recombinante E.coli DE3BL21 que contiene el constructo
PcoldIV-aiiA de Bt 147-115-16 (nativa). Se encontró que esta variante tiene la capacidad
de hidrolizar C6-HSL, C8-HSL, C6-Oxo-HSL, C12-Oxo-HSL y se caracteriza por el
efecto de atenuación de infección de P. carotovorum en ensayos de papa y
zanahoria donde controla el proceso de pudrición blanda, además tiene actividad
31
catalítica a pH 4, convirtiéndola en una candidata ideal para determinar el efecto
sobre patógenos dependientes de QS como P. aeruginosa (Rueda et al., 2016).
32
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo General:
Determinar el efecto de la lactonasa 852 sobre la formación de biopelículas
enbacterias Gram negativas con multiresistencia antibiótica demostrada.
2.2 Objetivos Específicos
Identificar en las bacterias Gram negativas resistentes a antibióticos, la
producción de señales acíl-homoserina lactona.
Cuantificar la producción de violaceína con el biosensor CV026 en las
bacterias Gram negativas, productoras de señales de acíl-homoserina
lactona.
Evaluar el efecto de la variante 852 sobre la estabilidad de las biopelícula de
las bacterias Gram negativas multidrogerresistentes.
33
3. MATERIALES Y METODOS
3.1. Diseño metodológico.
Estudio experimental in vitro, compuesto por un grupo experimental de bacterias
sensibles y resistentes a los antibióticos.
3.2 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo.
Los aislamientos bacterianos se obtuvieron a partir de muestras de secreción
bronquial, hemocultivo, urocultivo, liquido pleural, líquido cefalorraquídeo, liquido
peritoneal, hisopado rectal entre otros, aislados de pacientes que se encontraban
hospitalizados en los diferentes servicios de atención como: urgencias, cirugía,
unidad de cuidado intensivos adulto – quirúrgica - pediátrica – neonatal y
hospitalización adulto, pediátrica entre Julio de 2016 a Julio de 2017.
Se seleccionaron cepas Gram negativas con patrón fenotípico de sensibilidad y
resistencia antibiótica, este último se verificó mediante test de Hodge (Malbrán et
al., 2016) positivo para bacterias productoras de carbapenemasa y betalactamasas,
contrastado con antibiograma.
Para efectos de este estudio la sensibilidad antibiótica se define como
microrganismos que no presenten resistencia diferente a la natural descrita en la
literatura. Los resistentes se definen como aquellos que presentan resistencia
antibióticos diferentes a la natural descrita en la literatura.
Las muestras se recolectaron en la ciudad de Cúcuta, se transportaron en cadena
de frío hasta el Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad
de Santander, UDES, en la ciudad de Bucaramanga. Las cepas se cultivaron en 5
ml de caldo Luria Bertani (LB) a 37°C a 200 RPM durante 12 horas y se preservaron
en glicerol al 20% a -20°C y -80°C.
Para las pruebas de tamizaje se utilizó la cepa E. coli DE3BL21 que contiene el
casete de expresión para la lactonasa variante Epp852, la cual se creció en medio
LB suplementado con 50 µg/mL de ampicilina a 37°C y 200 RPM. Además, se utilizó
34
para la detección de señales AHL en las bacterias Gram negativas, el biosensor
Chromobacterium violaceum CV026 donada por el Dr. Vittorio Venturii del Centro
Internacional de Ingenieria Genética y Biotecnología (ICGEB, siglas en inglés),
Italia. Esta cepa se incubó en 5 mL de caldo LB suplementado con kanamicina (100
µg/mL) a temperatura ambiente. Cabe resaltar que para cada ensayo realizado se
realizo por triplicado.
Para los controles de pigmentación del biosensor CV026 se utilizó una acíl
homoserina lactona de ocho carbonos, Octanoil Homoserina Lactona (C8-HSL) y
para las pruebas de atenuación se utilizó la lactonasa variante Epp852 purificada
(Tabla 2).
Tabla 2: Cepas y compuestos utilizados en el estudio.
Cepas Descripción Referencia
Chromobacterium violaceum CV026
Mutante mini-Tn5; violaceína negativa. Kanamicina (+)
Regula la pigmentación por la detección exógena de AHLs
Reconoce señales desde C4-HSL– C8-HSL
Donada: Profesor Vittorio Venturi-ICGEB
E coli DE3BL21 Competente para transformación y expresión de
proteínas
Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología
UDES
Enzima purificada 852 Enzima lactonasa inhibe señales AHLs
Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología
UDES
Acíl homoserina lactona C8-HSL Señal AHLs de cadena corta Uso de control positivo
U. de Nottingham
3.3. Detección de señales AHL en las bacterias Gram negativas
Las cepas de interés se cultivaron durante 12 horas en 5 mL de caldo LB sin
antibiótico a 37°C, 200 RPM, así como el biosensor CV026 en las condiciones
descritas previamente. Una vez trascurrido el tiempo de incubación, los cultivos se
centrifugaron a 8000 RPM durante 20 minutos para obtener el sobrenadante.
Para la detección de señales se empleó el método descrito por (Zhang et al., 2007).
Brevemente, en cajas de agar LB suplementado con kanamicina (100µg/mL) se
35
realizaron cortes sobre el agar formando seis carriles de 1 cm de grosor con 5 mm
de separación, tal como se observa en la Figura 5. De cada uno de los
sobrenadantes se tomaron 20 µL y se colocaron en el área de carga de muestras
(Figura 5). Luego se tomó el biosensor y con un asa de argolla se realizó una estría
en el área de siembra del biosensor sin tocar la zona de carga y se incubó a
temperatura ambiente por 3 días.
Para la interpretación se empleó el cirterio descrito por (Flórez et al., 2014) y que
corresponde a la presencia o ausencia de pigmentación. Si hay pigmentación se
representa con (+) e indica la presencia de AHLs. La clasificación de la pigmentación
de señales AHLs está comprendida de la siguiente manera:
(-) Ausencia del biosensor
(+) Ligeramente pigmentación.
(++) completamente pigmentado Figura 5 : Metodo de difusión de señales QS en agar
Fuente: (Rueda et al., 2009)
36
3.4. Cuantificación de violaceína
Las cepas se cultivaron en 5 mL de caldo LB a 37°C y 200 RPM durante 12 horas,
hasta que alcanzaron una OD600=1, en simultánea se cultivó el biosensor CV026 en
5 mL de caldo LB + 10 µL de CV026 + 100 μg/mL de kanamicina a temperatura
ambiente por 12 horas. Para la extracción y cuantificación del pigmento se realizó
el protocolo descrito por (Blosse et al., 2000) el cual fue modificado y validado por
los autores. Brevemente, una vez transcurrido el tiempo de incubación, se tomaron
1500 µL del cultivo y se centrifugaron a 15000 RPM a temperatura ambiente por 30
minutos. El sobrenadante se filtró de 2 µm y de este, se tomaron 800 µL que se
adicionaron a un nuevo tubo que contenía 400 mL de caldo LB + 200 µL del CV026
+ 100 μg/mL de kanamicina. Se incubó a temperatura ambiente en 200 RPM por
72 horas.
Se tomaron 200 µL del cultivo, se agitó con vórtex por 5 segundos y se adicionaron
200 µL de SDS al 10%, se mezcló con vórtex por 5 segundos y se incubó a
temperatura ambiente durante 15 minutos. Se adicionaron 900 µL de butanol
saturado con agua (proporción 1:1), se mezcló con vórtex por 5 segundos y se
centrifugó a 13000 RPM durante 5 minutos. Se tomó 1 µL del sobrenadante y se
determinó la producción de pigmento violaceína a OD585 en un NanoDrop ND- 2000.
Los controles se trataron bajo las mismas condiciones que las muestras; como
control positivo de pigmentación se utilizó C8-HSL (2,5 mM) y como control negativo
se utilizo 5 Ml sin adición de sobrenadantes. Finalmente, se cuantificaron las
señales AHLs mediante la absorbancia de violaceína diluida en el extracto de
butanol dividido por densidad celular del bioensayo, multiplicado por 1000: [(A585
nm/O.D.660 nm) * 1000]. Los valores obtenidos se expresaron en unidades de
violaceína según describe (Blosser y Gray et al., 2000).
37
3.5. Efecto de la lactonasa recombinante epp852 sobre la producción de
señales AHL.
Las cepas se cultivaron en 5 mL de caldo LB a 37°C con 2000 RPM durante 12
horas hasta que alcanzaron una OD600=1. En simultánea se cultivó el biosensor
CV026 en 5mL de caldo LB + 10 µL de CV026 + 100 μg/mL de kanamicina a
temperatura ambiente por 12 horas y la recombinante epp852 en 5 mL de caldo LB
a 37°C, 2000 RPM durante 12 horas. Posteriormente, se agregó a cada cultivo 8 µL
de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) se incubó a 37°C a 2000 RPM
durante 2 horas. Para la extracción y cuantificación del pigmento se realizó el
protocolo anteriormente descrito según (Blosse et al., 2000) y modificado por los
autores. Los volúmenes utilizados fueron los siguientes:
CV026 200 µL + Sobrenadante del cultivo bacterias 800 µL
CV026 200 µL + Sobrenadante del cultivo bacterias 800 µL + Sobrenadante
de E. coli epp852 250 µL.
CV026 200 µL +C8-HSL 16 µL (2,5 mM).
CV026 200 µL + C8HSL 16 µL (2,5 mM) + Sobrenadante de E. coli epp852
250 µL.
Transcurridas las 72 horas, se realizó el protocolo de extracción de violaceína
como se describe en el numeral 3.4.
3.6. Desarrollo de biopelículas en placas de micro titulación.
Para la cuantificación de biopelículas en la placa de micro titulación se realizó el
protocolo descrito por (O´toole et al., 2011). En 5 mL de caldo LB se colocó cada
cepa y se dejó crecer hasta la fase estacionaria (12 horas de incubación). Luego se
diluyó el cultivo 1:10 en caldo LB y se tomaron 100µL de cada uno y se ubicó en
cada pocillo cubriendo la placa con parafilm, se incubó a 37°C durante 12 horas.
Las placas de micro titulación se lavaron 3 veces con agua mili-Q y se dejó secar a
38
temperatura ambiente por 15 minutos. Para el teñido de las biopelículas se
añadieron a cada pocillo 120 µL de solución de cristal violeta al 0,1% (pre-filtrada
mediante un filtro de 0,44 μm), se incubaron durante 10 minutos a temperatura
ambiente. Los pocillos se lavaron sucesivamente con agua Mili- Q tres veces y se
dejaron secando durante 12 horas. Luego, se agregaron a cada pocillo 220 µL de
ácido acético al 0.5% v/v teñido, se incubaron entre 10 a 15 minutos a temperatura
ambiente. Transcurrido este tiempo se mezcló brevemente el contenido de cada
pocillo mediante pipeteo y se midió en 1µL, la OD de cada una de las muestras a
una longitud de onda de 550nm.
Para establecer la formación de biopelículas y la clasificación se aplicaron las
siguientes expresiones matemáticas según describe (Naves et al., 2008).
a) **BF = AB – CW
b) **BF = AB / CW
Donde BF es la formación de biopelículas, AB es la OD 550 nm de bacterias teñidas
y CW es la OD 550 nm de pozos de bacterias de control.
Para evaluar la estabilidad de las biopelículas se aplicó la fórmula matemática
utilizada por (Stepanovic et al., 2000), la cual es basada en la O.D. producido por
biopelículas bacterianas, las cepas se clasificaron en las siguientes categorías
Débiles, Moderadas y Fuertes, En pocas palabras, el corte O.D. (O.D.C) se definió
como tres desviaciones estándar por encima de la media O.D. del control negativo,
se clasificaron de la siguiente forma:
o OD<ODC: No adherente
o ODC<OD<2xODC: Débiles
o 2xODC<OD<4xODC: Moderadas
o 4xODC<OD: Fuertes
39
3.7. Evaluación del efecto en la inhibición de la formación de biopelículas por
la lactonasa epp852.
Para evaluar el efecto de la lactonasa epp852 sobre la estabilidad de las
biopelículas, se realizó el protocolo descrito anteriormente. Como control (sin
presencia de la lactonasa epp852), se añadieron 120 µM de lactonasa epp852 y 1X
de coctel anti proteasas (Cell Signaling) (1X) y finalmente, una mezcla de estas dos.
Los volúmenes utilizados en las placas de micro titulación fueron las siguientes:
Cultivo bacterias 100 µL + caldo LB 100 µL + 1 µL (120 M) enzima purificada
epp852 (120 M).
Cultivo bacterias 100 µL + caldo LB 100 µL + 1 µL (1X) anti-proteasa Cell
Signaling.
Cultivo bacterias 100 µL + caldo LB 100 µL + 1 µL enzima purificada epp852
+ 1 µL coctel anti-proteasa
El teñido y cuantificación se realizó como se describió en el numeral 3.6
3.8. Analisis de Datos
Para el análisis de datos, se utilizó el programa de Stata versión 12 en el que primero
se evaluó la normalidad de las variables utilizando la prueba de Kurtosis simétrica
(K-S, Kolmogórov-Smirnov). Posteriormente, para las variables con distribución
normal se utilizó la prueba de t de Student. Para comparación entre grupos y las
variables que no tuvieron distribución normal, se utilizó la prueba Kruskal-Wallis
para datos no pareados. Para la viabilidad y adherencia de las biopelículas se utilizó
promedio y desviación estándar. Cabe resaltar que cada uno de los ensayos
ejecutados en el presente estudio se realizó por triplicado.
40
3.9. Aspectos Éticos
Este trabajo de investigación se ejecutó según los lineamientos aplicables del
informe de Belmont y la Resolución 8430 de 1993 del Minesterio de Salud. Sobre
los aspectos éticos de la investigación en seres humanos según el artículo 6, se
obtuvo la autorización por el Director Científico de la Clínica con su respectiva
aprobación por el grupo de calidad y epidemiologia de esta institución para ejecutar
el proyecto de investigación en un lapso de 1 año. Según las disposiciones del
artículo 11 esta investigación se clasifica con riesgo minino, ya que se obtiene una
pequeña muestra del cultivo de microorganismo aislado en el laboratorio de la
institución. Las instalaciones donde se realizará la parte experimental de la
investigación corresponden a lo estipulado en el artículo 64. El Laboratorio de
Biología Molecular de la Universidad de Santander UDES, se clasifica como
Laboratorio Básico de Microbiología y los microorganismos que se manipularon
durante la ejecución de la propuesta investigativa correspondieron al grupo de
riesgo I según la clasificación del articulo 67 y la disgregación de residuos se realizó
de acuerdo a los lineamientos ambientales y de bioseguridad establecidos por la
universidad de Santander UDES, según los artículos 73 y 74. El material biológico
permaneció contenido en las instalaciones del Laboratorio y no se liberararon
microorganismos o productos recombinantes al medio ambiente.
41
4. RESULTADOS
4.1. Caracterización de los aislamientos obtenidos:
Durante el periodo de 12 meses se recolectaron en total 90 bacterias de
aislamientos clínicos dividiéndose en dos grupos: microorganismos sensibles y
microorganismos con resistencia antibiótica. De estas 90 bacterias se excluyeron
cinco muestras que contenían cultivo mixto y generaban dificultades en la
interpretación de los ensayos cualitativos posteriores. De acuerdo con esto se
estudiaron 85 aislamientos, clasificados según el género y el fenotipo de resistencia
y sensibilidad antibiótica. En la Tabla 3 y Figura 6, se encuentra una descripción
general de las bacterias recolectadas en este estudio.
Dentro de los 85 aislamientos, según su fenotipo de sensibilidad y resistencia
antibiótica, se encontró que 39 aislamientos (46%) correspondieron a bacterias
sensibles, seguido de 25 aislamientos correspondientes a bacterias productoras de
carbapenemasas (29%) y 21 aislamientos (25%) de bacterias productoras de
betalactamasas.
Tabla 3: Distribución de los aislamientos colectados durante los 12 meses.
BACTERIAS Grupo 1 SENSIBLES
Grupo 2 CARBAPENEMASAS
Grupo 3 BETALACTAMASAS
(BLEE)
Total
P. aeruginosa 7 13 1 21
K. pneumoniae 2 9 4 15
E. coli 22 1 10 33
E. cloacae 1 2 2 5
S. maltophilia 1 1
B. cepacia 1 1
E. aerogenes 1 1 2
Proteus vulgaris 2 2
M. morganii 1 1
42
P. putida 1 1
Proteus. mirabilis 1 1 2
S. marcescens 1 1
Total 39 25 21 85
Figura 6: Bacterias Gram negativas
Al discriminar por géneros se identificó que de los 85 aislamientos clínicos, se
recolectaron 22 aislamientos de Escherichia coli sensible a los antibióticos, seguida
de 13 aislamientos identificados como P. aeruginosa resistente a carbapenemasas,
nueve aislamientos de K. pneumoniae resistente a carbapenemasas y un
aislamiento de Serratia marcescens productora de betalactamasa (Figura 6).
0
5
10
15
20
25
7
2
22
1 1 1 12
1 11
4
10
21 1 1 1
13
9
1 2
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
sensible blee Carbapenemasa
43
4.2. Tamizaje con el biosensor CV026
Al aplicar la prueba cualitativa para detectar la presencia o ausencia de
pigmentación con el biosensor CV026 en los 85 aislamientos de bacterias Gram
negativas, se logró identificar un total de 29 que producen señales de comunicación
AHLs de cadena corta.
A partir de este tamizaje se establecieron tres grupos: el grupo uno corresponde a
los de microorganismos sensibles a los antibióticos, el grupo dos a microorganismos
resistentes a las carbapenemasas y el grupo tres de resistentes a betalactamasas
(BLEE). En el grupo uno se identificó ocho aislamientos, en el grupo dos se
identificaron 13 aislamientos y en el grupo tres se identificaron ocho aislamientos.
A continuación se describen los aislamientos que componen cada uno de los
grupos, destacando P. aeruginosa, K. pneumoniae, B. cepacia, E. aerogenes, P.
vulgaris y S. marcescens (Tabla 4).
Tabla 4: Resultados de tamizaje con biosensor CV026.
BACTERIAS Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 TOTAL
Sensibles Carbapenemasas Betalactamasas
P. aeruginosa 6 10 3 19
K. pneumoniae 1 3 2 6
B. cepacia 1 1
P. vulgaris 1 1
E. aerogenes 1 1
S. marcescens 1 1
TOTAL 8 13 8 29
Una vez se identificaron las bacterias Gram negativas que producen señales AHLs,
se encontró que 16 produjeron alta pigmentación (++) con el biosensor y 13 una
ligera pigmentación (+) (Tabla 5).
En este tamizaje se pudo observar que a diferencia del resto de los aislamientos de
P. aeruginosa, únicamente tres se categorizaron como ligeramente, así como
44
también la mayoría de los aislamientos identificados como K. pneumoniae que
presentaron el mismo patrón ante el biosensor.
Tabla 5: Clasificación de señales AHLs por pigmentación en las bacterias de
estudio.
Grupo Cepas Fenotipos (S/R) Ligeramente Completamente
1 28 P. aeruginosa Sensible (++)
1 38 E. aerogenes Sensible (+)
1 46 P. aeruginosa Sensible (++)
1 53 P. aeruginosa Sensible (++)
1 59 P. aeruginosa Sensible (++)
1 62 P. aeruginosa Sensible (++)
1 64 K. pneumoniae Sensible (+)
1 88 P. aeruginosa Sensible (++)
2 4 P. aeruginosa Carbapenemasas (++)
2 5 P. aeruginosa Carbapenemasas (++)
2 6 P. aeruginosa Carbapenemasas (++)
2 8 P. aeruginosa Carbapenemasas (++)
2 9 P. aeruginosa Carbapenemasas (++)
2 10 P. aeruginosa Carbapenemasas (++)
2 11 P. aeruginosa Carbapenemasas (+)
2 12 P. aeruginosa Carbapenemasas (++)
2 13 P. aeruginosa Carbapenemasas (++)
2 14 K. pneumoniae Carbapenemasas (+)
2 15 K. pneumoniae Carbapenemasas (+)
2 35 K. pneumoniae Carbapenemasas (+)
2 40 P. aeruginosa Carbapenemasas (++)
3 57 P. aeruginosa Betalactamasas (+)
3 69 B. cepacia Betalactamasas (+)
3 75 K. pneumoniae Betalactamasas (+)
3 76 K. pneumoniae Betalactamasas (+)
3 78 P. aeruginosa Betalactamasas (+)
3 85 P. aeruginosa Betalactamasas (+)
3 92 S. marcescens Betalactamasas (++)
3 97 P. vulgaris Betalactamasas (+)
TOTAL: 29 13 16
45
4.3. Cuantificación de las señales AHLs a través de las unidades de violaceína
Considerando los resultados obtenidos en la clasificación cualitativa de la
producción de señales AHLs, se seleccionaron aquellos aislamientos que
presentaron pigmentación alta y se cuantificó la producción de violaceína en el
biosensor como una medida indirecta de la producción de señales AHLs de cadenas
cortas C4 a C8 HSL sin modificaciones oxo en su cadena lateral. Se identificaron
16 aislamientos con producción de violaceina y que a su vez, se relaciona con la
producción de señales de QS con el biosensor. En la Tabla 6 se identifica al grupo
de 16 cepas Gram negativas con alta pigmentación y el resutado en unidades de
violaceína que produjeron cada una de estas.
Del mismo grupo, 15 correspondieron a P. aeruginosa y que según su fenotipo de
sensibilidad y resistencia antibiótica a carbapenemasas, se observó una diferencia
estadísticamente significativa entre ellas (P=0,0150) y así mismo, la comparación
entre las 16 cepas según el fenotipo de sensibilidad y resistencia a betalactamasas
y carbapenemasas, se encontraron diferencias estadísticamente significativas. En
el grupo de 15 cepas que pertenecen a sensibles y resistentes a carbapenemasas,
también se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre estas. Los
descriptivos de la prueba estadística se muestran en la (Tabla 6).
Tabla 6: Cuantificación de violaceína en bacterias Gram negativas.
MUESTRA MUESTRA (N)
UNIDADES DE VIOLACEINA
(OD) MEDIANA
RANGO INTERCUARTIL
(R/Q)
P
Grupo de bacterias. P. aeruginosa Carbapenemasa P. aeruginosa Sensible S. marcescens Betalactamasa
9 6 1
46,26 13,66 18,93
10,13 – 42,37 7,49 – 19,02
16,95 – 20,62
0,0001
Pseudomonas aeruginosa Carbapenemasa sensible
9 6
46,26 13,66
10,13 – 42,37 7,49 – 19,02
0,0150
Grupo de Bacterias Sensible Betalactamasa
6 1
12,27 13,31
6,83 – 17,97 9,13 – 19,23
0,0501
46
Carbapenemasa 9 42,33 9,07 - 40,49
Grupo de Bacterias Sensible Resistente carbapenemasas
6 9
12,27 42,33
6,83 – 17,97 9,07 - 40,49
0,0222
A continuación se describen las unidades de violaceína encontradas en cada una
de las 16 cepas de estudio (Tabla 7).
Tabla 7: Unidades de violaceína en las bacterias de estudio.
Grupo # Cepa Unidades de Violaceína Des.Est
1 28 P. aeruginosa 74.983 ±1.8
1 38 E. aerogenes 12.345 ±1.2
1 46 P. aeruginosa 17.251 ±10.3
1 53 P. aeruginosa 3.226 ±0.5
1 59 P. aeruginosa 15.251 ±12.2
1 62 P. aeruginosa 4.082 ±0.5
1 64 K. pneumoniae 2.538 ±0.3
1 88 P. aeruginosa 13.714 ±1.6
2 4 P. aeruginosa 36.667 ± 1,5
2 5
P. aeruginosa 9.078 ± 1.3
2 6 P. aeruginosa 14.851 ± 9.02
2 9 P. aeruginosa 6.789 ± 1.4
2 8 P. aeruginosa 197.143 ± 14.4
2 10 P. aeruginosa 14.248 ±1.5
2 11 P. aeruginosa 10.786 ±1.2
2 12 P. aeruginosa 33.582 ±1.5
2 13 P. aeruginosa 72.004 ±5.3
2 14 K. pneumoniae 6.632 ±1.2
2 15 K. pneumoniae 6.956 ±1.2
2 35 K. pneumoniae 11.908 ±1.3
2 40 P. aeruginosa 19.966 ±12.2
3 57 P. aeruginosa 19.022 ±11.5
3 69 B. cepacia 4.567 ±1.0
3 75 K. pneumoniae 11.876 ±3.8
3 76 K. pneumoniae 12.657 ±2.8
47
3 78 P. aeruginosa 45.198 ±1.9
3 85 P. aeruginosa 2.987 ±0.3
3 92
S. marcescens 20.623 ±1.6
3 97 P. vulgaris 10.215 ±1.0
Con base en los resultados anteriores, se seleccionaron cuatro aislamientos
representativos de los tres grupos, teniendo en cuenta la mejor categorización de
pigmentación de violaceína, cuantificación de unidades de violaceína y consistencia
al realizar el ensayo. Estos aislamientos fueron los siguientes: cepa # 92: S.
marcescens productora de betalactamasa; cepa #8: P. aeruginosa productora de
carbapenemasa; cepa #28: P. aeruginosa sensible y cepa #78: P. aeruginosa
sensible.
4.4 Efecto de la lactonasa recombinante epp852 sobre la producción de
señales acíl homoserina lactona.
En este ensayo se determinó el efecto de la lactonasa recombinante epp852 en los
cuatro aislamientos de bacterias anteriormente mencionadas. En la siguiente gráfica
(Figura 7) se evidencia la inhibición en la producción de señales AHLs en cada una
de las bacterias tratadas. Cabe resaltar que en este ensayo se observo que la
lactonsa recombinante 852 tuvo un efecto de funcionalidad en la bacteria el cual se
observo que la bacteria deja de pigmentar para el biosensor CV026 debido al efecto
de inhibición del quorum sensing en bacterias patógenas.
48
Figura 7: Efecto de la lactonasa recombinante epp852 sobre la producción de
señales AHLs
4.5. Formación de biopelículas.
De las 16 bacterias seleccionadas previamente, nueve formaron biopelículas de
acuerdo a la formula descrita por Naves et al. (Naves et al., 2018) En la Figura 8 se
observa las formación de biopelículas, determinado por el índice de formación,
encontrando la mayor formación de estas en las cepas: #12 P. aeruginosa, #8 P.
aeruginosa y con menor formación de biopelículas, la #92 S. marcescens y #40 P.
aeruginosa.
Al realizar el análisis de los datos estadísticos (Tabla 8) se encontró que las nueve
cepas con formación de biopelículas, mostraron una diferencia estadísticamente
significativa (P=0,0067). Sin embargo, al comparar el grupo entre cepas de P.
aeruginosa (carbapenemasa), P. aeruginosa (sensible), S. marcescens
(betalactamasa) no se observaron diferencias estadísticamente significativas
(P=0,0880). Al evaluar el grupo de cepas S. marcescens betalactamasa con la
78 92 28 8 C8HSL
control 45 20 74 197 37
lactonasa 8,1 3,6 7,27 14,18 8,8
0
50
100
150
200
250
Un
idad
es d
e V
iola
ceín
a
Efecto de la lactonasa recombinante epp852
49
cepas P. aeruginosa carbapenemasa se obtuvo diferencia estadísticamente
significativa (P=0,0117).
La comparación entre unidades de violaceína y la formación de biopelículas en las
bacterias de estudio, no mostró diferencia estadísticamente significativa (P=0.4335)
Figura 8: Formación de biopelículas en bacterias Gram negativas.
Tabla 8: Formación de biopelículas
MUESTRA N BIOPELICULAS MEDIANA
R/Q P
Cepas de Bacterianas
P. aeruginosa Sensible Grupo 1 P. aeruginosa Sensible Grupo 1 P. aeruginosa Sensible Grupo 1 P. aeruginosa Carbapenemasa Grupo 2 P. aeruginosa Carbapenemasa Grupo 2 P. aeruginosa Carbapenemasa Grupo 2 P. aeruginosa Carbapenemasa Grupo 2 P. aeruginosa Carbapenemasa Grupo 2 S. marcescens Betalactamasa Grupo 3
1 1 1 1 1 1 1 1 1
0,02 0,04 0,04 0,03 0,04 0,07 0,01 0,02 0,01
0,01 - 0,02 0,02 - 0,05 0,04 - 0,05 0,02 - 0,04 0,03 – 0,04 0,06 - 0,08 0,009 – 0,02 0,01 – 0,03 0,008 - 0,02
0,0067
Grupo Bacterias
50
P. aeruginosa Sensible Grupo 1 P. aeruginosa Carbapenemasa Grupo 2 S. marcescens Betalactamasa Grupo 3
3 5 1
0,02 0,03 0,01
0,01 - 0,05 0,009 – 0,08 0,008 - 0,02
0,0880
Bacterias Sensible Grupo 1 Carbapenemasa Grupo 2 Betalactamasa Grupo 3
3 5 1
0,03 0,03 0,01
0,01 – 0,05 0,009 – 0,08 0,008 – 0,02
0,0882
P. aeruginosa Sensible Grupo 1 Carbapenemasa Grupo 3
3 5
0,03 0,03
0,01 – 0,05 0,009 – 0,08
0,8756 *
P. aeruginosa Sensible Grupo 1 Carbapenemasa Grupo 3
1 1
0,02 0,04
0,01 - 0,02 0,03 – 0,04
0,0270 *
P. aeruginosa carbapenemasa Grupo 1 S. marcescens Betalactamasa Grupo 3
1 1
0,04 0,01
0,03 - 0,04 0,008 -0,02
0,0117 *
P. aeruginosa Sensible Grupo 2 S. marcescens Betalactamasa Grupo 3
1 1
0,04 0,01
0,04 - 0,05 0,008 -0,02
0,0031 *
* t Student
4.5.1. Estabilidad de la formación de biopelículas
La estabilidad de biopelículas, de acuerdo a la fórmula de Stepanovic (Stepanovic
et al., 2000), evidenció que las bacterias con estabilidad fuerte de biopelículas
pertenecen a P. aeruginosa con fenotipos de sensibilidad y resistencia a
carbapenemasa. Adicionalmente, se encontraron dos cepas: S. marcescens
resistente a betalactamasa y P. aeruginosa sensible, con estabilidad moderada de
la biopelícula (Tabla 9).
Tabla 9: Estabilidad en la formación de biopelículas
Cepas ODC
Stepanovic 2007
Desv. Est
Estabilidad Formacion De Biopeliculas
6 P. aeruginosa 0.025 ±0.012 Fuerte
8 P. aeruginosa 0.037 ±0.01 Fuerte
12 P. aeruginosa 0.053 ±0.01 Fuerte
28 P. aeruginosa 0.022 ±0.01 Fuerte
40 P. aeruginosa 0.015 ±0.005 Moderada
62 P. aeruginosa 0.017 ±0.007 Moderada
51
78 P. aeruginosa 0.037 ±0.01 Fuerte
88 P. aeruginosa 0.045 ±0.02 Fuerte
92 S. marcescens 0.016 ±0.004 Moderada
Al comparar los datos obtenidos, la formación de biopelícula y estabilidad no se
guardan una relación directa. De hecho, la prueba Kruskal Wallis para estos dos
grupos de formación de biopelículas con respecto a la estabilidad, no hubo
diferencia estadísticamente significativa (P= 0,33). Sin embargo, se observa una
tendencia que indica que a mayor formación de biopelículas mayor estabilidad de la
misma Figura 9.
Figura 9: Estabilidad en la formación de la biopelícula vs formación de la biopelícula
4.6. Efecto en la inhibición de la formación de biopelículas por la lactonasa
recombinante epp852.
Una vez clasificadas las nueve bacterias según su estabilidad de formación de
biopelículas en fuertes, moderadas y débiles, se evaluó el efecto de atenuación con
52
la proteína recombinante epp852, así como la actividad en presencia de
antiproteasas y de proteína recombinante epp852 más antiproteasa (mixto).
En esta etapa se encontró que al aplicar la formula de Stepanovic (Stepanovic et
al., 2000) antes y después del tratamiento, hubo cambios en dos aislamientos,
determinados por la inhibición en la formación de biopelicula para el caso de
aislamiento S. marcescens # 92 y P. aeruginosa #28 (Figura10),
Al realizar el análisis estadístico (Tabla 11) en el grupo de bacterias tratadas con los
diferentes tratamientos de proteína, anti proteasa y mixto se evidencia una
diferencia estadísticamente significativa (P= 0,0516). Al comparar el tratamiento
mixto en la cepa # 92 S. marcescens se encontró una difererencia estadísticamente
significativa (P= 0,028), así como también cuando se comparó el tratamiento en
presencia de la lactonasa con la cepa # 8 (P=0,038).
Tabla 10: Efecto de atenuación en la formación de biopelículas por la lactonasa
recombinante epp852
Cepa Prueba en Ausencia de Lactonasa epp
852
Prueba en Presencia de lactonasa epp852 y
Antiproteasas
6 P. aeruginosa 0.025 ±0.012 0.022 ±0.01
8 P. aeruginosa 0.037 ±0.01 0.033 ±0.01
12 P. aeruginosa 0.053 ±0.01 0.029 ±0.005
28 P. aeruginosa 0.022 ±0.01 0.014 ±0.001
40 P. aeruginosa 0.015 ±0.005 0.014 ±0.002
62 P. aeruginosa 0.017 ±0.007 0.017 ±0.006
78 P. aeruginosa 0.037 ±0.010 0.024 ±0.010
88 P. aeruginosa 0.045 ±0.020 0.035 ±0.008
92 S. marcescens 0.016 ±0.004 0.0003 ±0.001
En la gráfica (Figura 10) se observó como la lactonasa epp852 afecta la estabilidad
en la formación de la biopelícula. En la cepa # 92 que corresponde a S. marcescens
resistente a betalactamasas, se encontró efecto de inhibición en la formación de la
53
biopelícula (P=0,028) que se obtuvo al comparar el tratamiento con el control (Tabla
11). Para el aislamiento # 28 P. aeruginosa sensible, la formación de la biopelícula
se ve afectada significativativamente (P=0,038) (Tabla 11). Al evaluar el grado de
porcentaje de inhibición de producción de señales AHL en la cepa # 92 S.
marcescens al ser tratada con la lactonasa epp852, se obtuvo un porcentaje del
98% de inhibición en la formación de biopelícula. De igual modo, se obtuvo un 36%
de inhibición en la formación de biopelícula en cepa # 28 P. aeruginosa sensible a
antibiotico.
Figura 10: Efecto de la atenuación por la lactonasa recombinante epp852 en la
formación de la biopelícula
54
Tabla 11: Efecto de la lactonasa epp852 en la atenuación de la formación de
biopelículas
MUESTRA
N
BIOPELÍCULAS OD
MEDIANA
R/Q
P
Tratamiento Cepa con efecto de la lactonasa epp852 y Antiproteasas en S. marcescens Cepa sin tratamiento S. marcescens
1 1
0,02
0,01
0,004 - 0,012
0,002 – 0,010
0,028
Tratamiento Cepa con efecto de la lactonasa epp852 y Antiproteasas en P. aeruginosa Cepa sin tratamiento P. aeruginosa
1 1
0,06
0,05
0,06 - 0,012
0,07 – 0,018
0,038
55
5. DISCUSIÓN
La atenuación de la virulencia bacteriana a través de la interferencia de señales QS
se ha propuesto como una de las alternativas terapeúticas dado que no inducen
resistencia y han probado ser efectivos para el control de infecciones (Mühlen et al.,
2015). La interrupción de estas señales pueden proporcionar un enfoque alternativo
a la terapia antibacteriana convencional ya que se dirige en inhibir el sistema de
comunicación utilizado por las bacterias (Reuter et al., 2016).
En este trabajo se demuestra que la lactonasa recombinante epp852 es capaz de
inhibir las señales QS dependientes de AHLs que producen algunas de las bacterias
Gram negativas con fenotipos de sensibilidad y resistencia antibiótica, así como
interferir en la formación de biopelículas.
En este estudio se demostró un efecto inbitorio por acción de la lactonasa epp852,
de la formación de biopelículas del Grupo 1 en el aislamiento de la cepa #28 P.
aeruginosa sensible antibiótico, con una diferencia estadísticamente significativa
(P=0,038) (Tabla 11), En esta se observa que la estabilidad de la formación de la
biopeliculas pasa de ser fuerte antes del tratamiento y a moderada después del
tratamiento de la lactonasa, aplicando la formula de Stepanovic et., 2000 (Tabla 9).
Los ensayos realizados con la lactonasa recombinante epp852 (Figura 7), en P.
aeruginosa sensible y resistente a carbapenemasas (cepa # 8 P. aeruginosa
cabapenemasa,# 28 P. aeruginosa sensible y # 78 P. aeruginosa sensible), se
obtuvo inhibicíon en la producción de señales QS, evidenciadas en la disminución
de la producción de las unidades de violaceína (Figura 7) indicando su efecto de
QQ en la acumulación de las señales de comunicación y la actividad lactonasa de
la proteína de interés. Estudios con la N- acilhomoserina lactonasa Aii810
proveniente derivado de metagenoma de Mao-tofu el cual demostró una reducción
en la producción de factores de virulencia y el desarrollo de biopelículas en P.
56
aeruginosa PAO1 el 78,4%, sin tener efecto bacteriostático. En nuestro estudio se
obtuvo una diferencia de porcentajes de inhibición en las unidades de violaceina al
ser tratadas con la lactonasa recombinante epp852 en cada una de las bacterias de
estudio en donde se encontró un 90% inhibición para la cepa # 28 P. aeruginosa
sensible, un 82% inhibición en la cepa 78 P. aeruginosa sensible, un 90% inhibición
para la cepa P. aeruginosa sensible, 92% inhibición en la cepa 8 P. aeruginosa
resistente a carbapenemasas. Estos resultados indican que la lactonasa epp852
actua inhibiendo los tipos de QS expresados en microorganismos con fenotipos de
sensibilidad y resistencia antibiótica. Aunque no fue posible identificar los tipos de
señales AHL se encontraba produciendo cada uno de estos patógenos mediante
cromotografia liquida, dadas las características del biosensor, esta inhición se
produce preferiblemente sobre señales AHL como C6-HSL, C8-HSL, C6-Oxo-HSL,
C12-Oxo-HSL.
Con respecto a la comparación entre unidades de violaceína y la formación de
biopelículas en las bacterias de estudio, los datos no mostraron una diferencia
estadísticamente significativa (P=0.4335), por lo cual se presume que en cada
ensayo se presenta una variabilidad en la funcionalidad de la bacterias, según las
condiciones en las que se encuentra expuesto el microorganismo. Se sabe pro
ejemplo que cepas de K. pneumoniae y K. oxytoca producen altas actividades de
AHL únicamente cuando se cultivan microaerofílicamente en medio LB, contrario a
lo que produce cuando se cultivan en medio LB bajo condiciones aeróbicas (Wang
et al., 2006). Sin embargo, en aislamientos de cavidad bocal de K. pneumoniae se
producen cantidades detectables de AHL cuando se cultiva aeróbicamente en
medio LB tamponado con MOPS. En este caso, dado que las AHL tienen vida
mmedia corta en condiciones alcalinas (Yates et al., 2002), en medio LB
amortiguado MOPS proporciona protección a las AHL contra lactonolisis a pH
básico, estabilizando las AHL permitiendo que sean fácilmente detectadas al ser
colocadas con el biosensor NTL4 (Yin et al., 2012).
57
En nuestro estudio utilizamos el biosensor CV026 para el reconocimiento de señales
AHLs en bacterias Gram negativas multi – drogoresistentes antibióticos donde se
obtuvo un tamizado de 29 bacterias con QS regulado por señales AHL (Tabla 4).
Este biosensor reconoce señales AHL como N-hexanoil-L-homoserina lactona
(HHL) de cadenas laterales de N-acilo de C4 a C8 de longitud, con diversos grados
de sensibilidad y otras AHLs que detecta son C6-3-oxo-AHL y C8-AHL C8-3-oxo-
AHL y C4-AHL. Se ha reportado que este biosensor responde a señales AHL
producidas por bacterias como B. cepacia (C6HSL, C7HSL, C8HSL), P. aeruginosa
(3OC12HSL, C4HSL, C6HSL) y S. marcescens (C4HSL, C6HSL) (Koul et al., 2016),
las cuales se presume fueron reconocidas por el biosensor CV026. No obstante, no
responde adecuadamente a C4-3-oxo-AHL, y las AHL con cadenas de acilo de C10
y más largas, tienen poca o ninguna actividad agonista y para moléculas como 3-
hidroxi-AHL no son detectadas por CV026 (Steindler et al., 2006).
El biosensor CV026 tiene la capacidad para identificar señales AHL exógenas de
cadenas cortas y sin modificaciones generando una respuesta coordinada para la
producción de la violaceína (McClean et al., 1997). Esto se evidenció en el primer
tamizaje realizado en cepas P. aeruginosa, B. cepacia, S. marcescens que
produjeron señales AHL. Sin embargo, en cepas de K. pneumoniae que son
encargadas de producir señales de tipo AI2 se encuentra reguladas por el Luxs,
conocido como precursor de la sintasa I por lo cual produce señales AHL en baja
cantidad. En un estudio realizado por Li (Li et al., 2012) se encontró que en un
aisaldo de K. penumoniae de boca, producción de señales AHL de tipo C6 Oxo
HSL, C8 Oxo HSL en bajas cantidades al ser identificadas por el Biosensor NTL4
(Li et al., 2012), en otro estudio realizado por Wang (Wang et al., 2006) encontró en
aislamientos de K. pneumoniae, K. oxytoca produce señales AHL en baja cantidad
de tipo C6 Oxo HSL, C8 Oxo HSL (Wang et al., 2006). Lo cual sustenta el hecho de
que en este estudio para los aislamientos #64, #14,#15, #35 y #76 que corresponde
58
a K. pneumoniae generaran pigmentación en el biosensor CV026 (Tabla 5) . En
nuestro estudio al realizar la prueba cualitativa de clasificación de señales AHLs por
pigmentación de la CVO26, se encontró que algunas cepas de K. pneumoniae
produjeron pigmentación leve al ser reconocidas con el biosensor CVO26
sugiriendo la producción señales AHLs (Tabla 5). Este resultado se costransta con
lo evidenciado en la referencia bibliográficas por lo autores Yin y Wang, donde
logran identificar en K. pneumoniae y K. oxytica producción de señales AHL en baja
cantidad en donde produjeron señales de tipo C6 Oxo HSL, C8 Oxo HSL (Wang et
al., 2006; Yin et al., 2012;).
En este estudio se identificó el efecto de la lactanosa epp852 en S. marcescens
productora de betalactamasa, la cual mostró tener un efecto inhibitorio del 98.12%
en la formación de la biopelícula (P = 0,028) (Tabla 11). Así mismo, se encontró un
efecto de inhibición en la pigmentación de violaceína de CV026 (3,8 unidades de
violaceína comparada con la de control de 20 unidades de violaceína), indicando la
interferencia con la producción de señales AHL (Figura 7). Lo anterior permite
sugerir que la lactonasa 852 al ser utilizada en modelo recombinante epp 852 y con
proteína purificada 852, afecta el sistema de QS tanto en la formación de
biopelículas hasta en un 98% de inhibición (Tabla 10). Esta característica, permite
elucidar el efecto del tratamiento enzimático sobre las función de las señales
remanentes, pues al evaluar el cambio en las unidades de violaceína producidas
por los aislamientos de interés tratados con la lactonasa epp852 recombinante se
encontró una reducción del 82% (Figura 7). Esto sugiere que la lactonasa epp852
afecta la acumulación de señales para S. marcescens #92 productora de
betalactamasa. Se ha descrito que compuestos como fitol, que es un alcohol
diterpénico, inhibe en S.marcescens la formación de biopelícula, lipasa y la
producción de hemolisina en comparación con sus respectivos controles obteniendo
una diferencia estadísticamente significativa (P =0.0005) (Srinivasa et al., 2017).
Aunque son distintas aproximaciones, el efecto de la lactonasa epp 852 en la
59
inhibición de la formación de la biopelicula (P = 0,028) representa una alternativa
para ser explorada en mayor profundidad en S.marcences.
60
6. CONCLUSIONES
Este estudio permitió elucidar la frecuencia de bacterias gram negativas
multidrogoresitentes aisladas de ambientes hospitalarios y evidenciar que
aunque compartan género y especie cada aislamiento es independiente en
su comportamiento regulado (QS). Esto se identificó por la producción de
señales AHL a través del biosensor CVO26.
Las bacterias Gram negativas que no generaron cambio de coloración en el
biosensor CV026, presumiblemente utilizan otro tipo de señales que no están
dentro del rango de detección del biosensor o son señales diferentes a AHLs.
La capacidad de atenuar las infecciones producidas por bacterias Gram
negativas tales como P. aeruginosa sensible y productora de
carbapenemasas, S. marcencens productora de betalactamasas permite
evidenciar la aplicación de la variante epp852 como candidata para estudiar
los mecanismos moleculares especificos y la producción de señales para
estas cepas. A su vez representa un potencial biotecnológico con
aplicaciones biomédicas en la inhibición de procesos infecciosos mediadas
por el Quorum Sensing de patógenos que regulan sus procesos de virulencia
con la producción de señales de C6-HSL, C8-HSL, C6-Oxo-HSL, C12-Oxo-
HSL, lo cual permite el desarrollo de estrategias de atenuación de infecciones
mediante la producción de nano encapsulados.
61
7. RECOMENDACIONES
En este estudio no se alcanzó a evaluar el efecto de inhibición de la enzima
lactonasa 852 en la expresión de los genes relacionados con QS en la bacteria
P. aeruginosa sensible y resistente antibiótico, solo se evaluó el efecto de
inhibición en la formación de la biopelícula y en la atenuación de la producción
de señales AHL a través del biosensor CV026.
Se necesita evaluar la lactonasa 852, en presencia de otros tipos de biosensores
que permitan detectar señales de forma general como en el caso de NTL4, que
reconoce cadenas AHL de cadenas largas y biosensores mas específicos para
cada uno de los sistemas de expresión de QS, especialmente en P. aeruginosa.
Este estudio es piloto, por lo cual es promisorio para entender la actividad de la
lactonasa 852, considerando su origen y las caractersiticas que la hacen única,
se debe continuar estudiando para elucidar sus aplicaciones biomedicas.
Realizar estudios más robustos con la lactonasa 852 que incluyan cromatografía
para las señales y medidas de microscopía par las biopelículas.
62
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76
Zhang, Y., An, W. Ye, G. Yang, Z. G. Qian, H. F. Chen, L. Cuid and Y. Feng (2012(.
“Enhancing the promiscuous phopphotriesterase actvity of a termostable lactonase
(Gkap) for the efficient degradation of organophosphate pesticides”. Appl Environ
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77
9. ANEXOS
ANEXO 1: LISTADO DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS.
BACTERIA AISLAMIENTO Y
FENOTIPOS
AMP AMOX AMIK AZT CEFTZ CEFAL COLIS CIPRO CEFTR CEFU CEFE NITRO CEFO GENT IMIP LEVO MERO TRIMSUL PIPER ERT TIGL
1 Klebsiella
pneumoniae
CARBAPENAMASA
UROCULTIVO R R S R N/A R N/A S R R R S S S R N/A S S R R S
2 Klebsiella
pneumoniae
CARBAPENAMASA
UROCULTIVO R R I R R R N/A R R R R R R R R S R R R R N/A
3 Klebsiella
pneumoniae
CARBAPENEMASA
LIQUIDO PLEURAL R R S R I N/A R S R R I N/A S S R N/A S N/A N/A N/A N/A
4 Pseudomonas
aeruginosa
CARBAPENEMASA
LIQUIDO
PERITONEAL.
N/A N/A I R R N/A S R N/A N/A I N/A N/A R R R R N/A I N/A N/A
5 Pseudomonas
aeruginosa
CARBAPENEMASA
HEMOCULTIVO
C.CENTRAL.
N/A N/A R I R N/A S R N/A N/A I N/A N/A I R R R N/A I N/A N/A
6 Pseudomonas
aeruginosa
CARBAPENEMASA
SECRECION
BRONQUIAL
N/A N/A S I S N/A N/A S N/A N/A S N/A N/A S R I R N/A S N/A N/A
7 Enterobacter
cloacae
AMPC POSEE
BETALACTAMASA
CARBAPENAMASA
ESPUTO
R R S R N/A N/A N/A R R R R N/A N/A I S N/A S S R R S
8 Pseudomonas
aeruginosa
CARBAPENEMASA
UROCULTIVO N/A N/A I I R N/A S R N/A N/A I N/A N/A S R R I N/A I N/A N/A
9 Pseudomonas
aeruginosa
CARBAPENEMASA
HISOPADO RECTAL N/A N/A R I R N/A S R N/A N/A I N/A N/A I R R R N/A I N/A N/A
10 Pseudomonas
aeruginosa
CARBAPENEMASA
UROCULTIVO N/A N/A S S S N/A N/A N/A N/A N/A S N/A N/A R R R R N/A S N/A N/A
11 Pseudomonas
aeruginosa
CARBAPENEMASA
SECRECION X
TRAQUEOSTOMIA
N/A N/A S R S N/A S S N/A N/A I N/A N/A N/A I I S N/A I N/A N/A
12 Pseudomonas
aeruginosa
CARBAPENEMASA
SECRECION
BRONQUIAL
N/A N/A R R R N/A S R N/A N/A N/A N/A N/A R R R R R N/A N/A N/A
13 Pseudomonas
aeruginosa
CARBAPENEMASA
SECRECION
BRONQUIAL
N/A N/A R R R N/A S R N/A N/A R N/A N/A I R R R I N/A N/A N/A
78
14 Klebsiella
pneumoniae
CARBAPENAMASA
UROCULTIVO R R I R R R N/A R R R R R I R R R S R R N/A N/A
15 Klebsiella
pneumoniae
CARBAPEMASAS
UROCULTIVO R R S R R R N/A R R R R R S S N/A R N/A S N/A S N/A
16 Escherichia coli BETALACTAMASA
HERIDA QUIRURGICA R R S R R N/A N/A R R R R N/A S R S R S S N/A S S
17 Klebsiella
pneumoniae
BETALACTAMASA
UROCULTIVO R R S R R R N/A R R R R R S S N/A R N/A R N/A S S
18 Pseudomonas
aeruginosa
SENSIBLE
SECRECION
BRONQUIAL
N/A N/A S R S N/A S S N/A N/A S N/A N/A S S S I N/A S N/A N/A
19 Escherichia coli SENSIBLE PUS EN
EVENTRACION
CERRADA
R S S S S N/A N/A S N/A S S N/A N/A S S S S R S S N/A
20 Escherichia coli BETALACTAMASA
UROCULTIVO R R S R N/A N/A N/A R R R R S N/A R S R S R I S N/A
21 Enterobacter
cloacae
BETALACTAMASA
UROCULTIVO R R S S N/A N/A N/A S S R S S N/A S S S S S S S N/A
22 Klebsiella
pneumoniae
SENSIBLE
SECRECION
BRONQUIAL
R S S N/A N/A N/A N/A S S S S N/A N/A S S S S S S S N/A
23 Escherichia coli SENSIBLE
HEMOCULTIVO S S S S N/A N/A N/A S S S S N/A N/A S S S S R S S S
24 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO S S S N/A N/A S N/A S S S S S N/A S S N/A S S S S
25 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO R I S S R N/A N/A S S S S N/A S S R S S S S N/A
26 Proteus vulgaris SENSIBLE
LIQUIDO VESICULA R S S S N/A S N/A S R SR S N/A S S S N/A S S S S N/A
27 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO R S S S N/A I N/A S S S S S S S S N/A S R S S N/A
28 Pseudomonas
aeruginosa
SENSIBLE
SECRECION MUÑON N/A N/A S S S N/A N/A R N/A N/A I N/A N/A S S R S N/A S N/A N/A
29 Klebsiella
pneumoniae
SENSIBLE
UROCULTIVO
BETALACTAMASA
E. COLI
R
R
S
R
S
S
S
R
S I
R
S S
R
S
R
R S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
N/A S
S
S
R
S
S
S N/A
79
30 Klebsiella
pneumoniae
SENSIBLE
UROCULTIVO
BETALACTAMASA
E. COLI
R
R
S
R
S
S
S
R
S I
R
S
S
S
R
S
R
R S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
N/A S
S
S
R
S
S
S
S
N/A
31 Stenotrophomon
as maltophilia
SENSIBLE
ESPUTO
SENSIBLE
PSEUDOMONAS
AERUGINOSA
N/A N/A S S R
S
N/A S S N/A N/A S N/A N/A S S S S S S N/A N/A
32 Stenotrophomon
as maltophilia
SENSIBLE
ESPUTO
SENSIBLE
PSEUDOMONAS
AERUGINOSA
N/A N/A S S R
S
N/A S S N/A N/A S N/A N/A S S S S S S N/A N/A
33 Enterobacter
cloacae
BETALACTAMASA
LIQUIDO ABDOMINAL R R S S S N/A S S S R S N/A R S S S S S N/A S S
34 Enterobacter
cloacae
CARBAPENAMASAS
LIQUIDO
PERITONEAL
R R R R R N/A N/A R R R R N/A R I R R R S R R S
35 Klebsiella
pneumoniae
CARBAPENEMASAS
SECRECION
BRONQUIAL
R R I R R N/A S R R R R N/A R R R R R R N/A R S
36 Escherichia coli SENSIBLE
LIQUIDO BILIAR R S S S N/A N/A N/A S S S S N/A S S S N/A S S S S S
37 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO S S S S N/A I N/A S N/A S S S S S S N/A S S S S N/A
38 Enterobacter
aerogenes
SENSIBLE
PUNTA DE CATETER R R S S S N/A N/A S S R S N/A R S I S S S S S S
39 Entrerobacter
cloacae
BETALACTAMASA
SECRECION BILIAR R R S S N/A N/A N/A S S R S N/A R S S N/A S S S S S
40 Pseudomonas
aeruginosa
CARBAPEMASAS
UROCULTIVO N/A R R R N/A N/A R R R R R R N/A R R N/A R R R R N/A
41 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO R I S S N/A N/A N/A S S N/A N/A S S S S N/A N/A S N/A N/A N/A
42 Escherichia coli BETALACTAMASA
UROCULTIVO R R S R R R N/A R R R R S S S N/A S N/A R S S S
43 Escherichia coli SENSIBLE
SECRECION DE
PARED ABDOMINAL
R S S S S N/A N/A S S S S N/A S R S R S S S S S
80
44 Enterobacter
cloacae
CARBAPENEMASAS
TEST HODGE
POSITIVO
UROCULTIVO
R R S R R R N/A S R R R R R S I S S S R N/A N/A
45 Klebsiella
pneumoniae
CARBAPENEMASAS
TEST HODGE
POSITIVO
ESTOMA DE
TRAQUEOSTOMIA
R R S R N/A N/A N/A R R R R N/A I S I S S R I R S
46 Pseudomonas
aeruginosa
SENSIBLE
UROCULTIVO N/A N/A S S S N/A N/A I N/A N/A S N/A N/A R S R S N/A S N/A N/A
47 Morganella
morganii
BETALACTAMASAS
UROCULTIVO R R S S S N/A N/A R R R I N/A S I N/A R S S N/A S R
48
Pseudomonas
aeruginosa
Klebsiella
pneumoniea
SENSIBLE
PSEUDOMONA
AERUGINOSAS
CARBAPENEMASAS
TEST HODGE
POSITIVO TEST AC
BORONICO POSITIVO
KLEBSIELLA
PNEUMONIEA
R
N/A
R
S
I
S
R
S
R
R
S
S
R
R
R S
R
S
R S
R
S
R
S
R
S
R
R S
R
R S
49 Pseudomonas
putida
SENSIBLE
LAVADO
BRONCOALVEOLAR
N/A N/A S R S N/A N/A S S N/A S N/A N/A R S S S S S N/A N/A
50 Escherichia coli BETALACTAMASAS
UROCULTIVO R R S R R R N/A R R R R S S R S R S R N/A S N/A
51 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO R I S N/A S N/A N/A S S S S S S S S S N/A R N/A N/A N/A
52 Klebsiella
pneumoniae
SENSIBLE
HEMOCULTIVO
CENTRAL
R R S S S N/A N/A R I R S N/A S S S S S R I N/A N/A
53 Psedumonas
aeruginosa
CARBAPENEMASAS
SECRECION
BRONQUIAL
N/A N/A S R I N/A N/A R N/A N/A R N/A N/A R R R R N/A I N/A N/A
54 Escherichia coli SENSIBLE
LIQUIDO BILIAR R I S S S N/A N/A R S S S N/A S S S R S S S N/A N/A
55 Escherichia coli BETALACTAMASAS
PUS PERITONEAL R R S R R N/A N/A S R R R N/A S R S S S S S N/A N/A
56 Escherichia coli BETALACTAMASAS
UROCULTIVO R R S R R R N/A R R R R S S R S R S R N/A S N/A
81
57 Pseudomonas
aeruginosa
SENSIBLE
SECRECION DE
TRAQUEOSTOMIA
N/A N/A R R R N/A N/A R R N/A R N/A N/A S R R R N/A S N/A N/A
58 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO S S S S S I N/A S S S S S S S N/A S N/A S S S N/A
59 Pseudomonas
aeruginosa
SENSIBLE
LAVADO BRONQUIAL N/A N/A S S S N/A N/A S N/A N/A S N/A N/A S S S S N/A S N/A N/A
60 Escherichia coli RESISTENCIA
BETALACTAMICOS
UROCULTIVO
R R S R R R N/A R R R R S S S S R S R N/A N/A N/A
61 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO
R S S S S I N/A R S S S S S S S R S R N/A N/A N/A
62 Pseudomonas
aeruginosa
CARBAPENEMASA
S MECANISMO DE
BOMBA DE EFLUJO
UROCULTIVO
N/A N/A S I S N/A N/A S N/A N/A S N/A S S R S I R N/A N/A N/A
63 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO
R S S S S I N/A S S S S S S S S S S S S S N/A
64 Klebsiella
pneumoniae
CARBAPENEMASA
S TEST DE HODGE
POSITIVO, TEST AC
BORONICO
POSITIVO
LAVADO
BRONQUIAL
DERECHO
R R I R R N/A N/A R R R R N/A R R R R R R R R S
65 Proteus mirabilis BETALACTAMASAS
UROCULTIVO
R S S S S R N/A R R R R R S R N/A R S R S S N/A
66 Escherichia coli
CARBAPENEMASA
S TEST DE
HODGE POSITIVO
TEST AC
BORONICO
POSITIVO
UROCULTIVO
R R S R R N/A N/A R R R R N/A R R I R S R R R N/A
67 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO
S S S N/A S N/A N/A S S S N/A N/A S S N/A S N/A S S N/A N/A
68 Enterobacter
aerogenes
BETALACTAMASAS
SECRECION
R R S R R N/A N/A I R R R N/A R R S S S R S S N/A
82
RETROPERITONEA
L
69 Bukordelia
cepacia
SENSIBLE
HEMOCULTIVO
CATETER VENOSO
CENTRAL
N/A N/A N N/A R N/A N/A N/A N/A N/A R N/A N/A N/A N/A I S S N/A N/A N/A
70 Escherichia coli SENSIBLE
LIQUIDO BILIAR
R N/A S N/A S N/A N/A S S N/A S N/A S S S S S R R S N/A
71 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO
S S S S S N/A N/A S S N/A N/A S S S S N/A N/A R N/A N/A N/A
72 Klebsiella
pneumoniae
CARBAPENEMASA
S TEST DE HODGE
POSITIVO, TEST AC
POSITIVO
UROCULTIVO
R R I N/A N/A R N/A R R R R R I R R R R R R N/A N/A
73 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO
S S S N/A S N/A N/A S S S S N/A S S N/A S N/A S N/A S N/A
74 Escherichia coli BETALACTAMASAS
UROCULTIVO
R R S R R R N/A R R R R S S S N/A R N/A R S S N/A
75 Klebsiella
pneumoniae
BETALACTAMASA
HEMOCULTIVO
PERIFERICO
R N/A S N/A R N/A N/A R R N/A R N/A S R S R S R I S N/A
76 Klebsiella
pneumoniae
BETALACTAMASAS
HEMOCULTIVO
PERIFERICO
R R S R R N/A N/A I R R R N/A S R S S S R S S N/A
77 Klebsiella
pneumoniae
BETALACTAMASAS
UROCULTIVO
R R S R R R N/A I R N/A N/A R S R S N/A N/A R N/A N/A N/A
78 Pseudomonas
aeruginosa
SENSIBLE
HEMOCULTIVO
ARTERIAL
N/A N/A S N/A S N/A N/A R N/A N/A S N/A N/A S S R S N/A S N/A N/A
79 Proteus mirabilis SENSIBLE
SECRECION DE
OIDO
R N/A S N/A S N/A N/A S S N/A S N/A S R N/A S N/A R S S N/A
80 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO
R S S N/A S N/A N/A N/A S S S S S S N/A N/A N/A R R R N/A
82 Escherichia coli BETALACTAMASA
UROCULTIVO
R S S N/A R N/A N/A R R N/A R S I S S R S R N/A N/A N/A
83
83 Escherichia coli BETALACTAMASA
UROCULTIVO
R N/A S N/A R N/A N/A R R N/A R N/A S S N/A R S R S S N/A
85 Pseudomonas
aeruginosa
BETALACTAMASA
SECRECION
BRONQUIAL
N/A N/A S N/A S N/A N/A R N/A N/A S N/A N/A S R R N/A N/A S N/A N/A
86 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO
S N/A S N/A S N/A N/A S S N/A S N/A S S N/A S N/A S S S N/A
88 Pseudomonas
aeruginosa
SENSIBLE
CULTIVO DE
SECRECION
BRONQUIAL
N/A N/A S N/A S N/A N/A S N/A N/A S N/A N/A S S S S N/A S N/A N/A
91 Escherichia coli SENSIBLE
UROCULTIVO
R N/A S N/A S N/A N/A S S N/A S N/A S S N/A S N/A R S S N/A
92 Serratia
marcescens
BETALACTAMASA
TIPO AMPC
CULTIVO PLEURAL
R N/A S N/A S N/A N/A S S N/A S N/A S S S S S S S N/A N/A
97 Proteus Vulgaris SENSIBLE
UROCULTIVO
R N/A S N/A S N/A N/A S R N/A S N/A S S N/A S N/A S S N/A N/A
98 Eschericia coli SENSIBLE
UROCULTIVO
S N/A S N/A S N/A N/A S S N/A S N/A S S N/A S N/A S S N/A N/A
10
1
Stenotrophomon
as maltophilia
SENSIBLE
CULTIVO DE
SECRECION
BRONQUIAL
N/A N/A N/A N/A R N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A S N/A S N/A N/A N/A
AMP: Ampicilina, AMOX: Amoxacilina, AMIK: Amikacina, AZT; Aztreonam, CEFTZ: Ceftazidima, CEFAL: Cefalozina, COLIS: Colistin, CIPRO: Ciprofloxacina, CEFTR: Ceftriaxona, CEFU: Cefuroxina, CEFE: Cefepime, NITRO: Nitrofurantoina,
CEFO: Cefoxitina, GENT: Gentamicina, IMIP: Imipenem, LEVO: Levofloxacina, MERO: Meropenem, TRIMSUL: Trimetropim sulfametoxazol, PIPER: Piperacilina Tazobactam, ERT: Ertapenem, TIGL: Tigeciclina.
84
ANEXO 2: FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS
MUESTRA N BIOPELICULAS MEDIANA
R/Q P
P. aeruginosa Sensible Grupo 1 P. aeruginosa Sensible Grupo 1 P. aeruginosa Sensible Grupo 1 P. aeruginosa Carbapenemasa Grupo 2 P. aeruginosa Carbapenemasa Grupo 2 P. aeruginosa Carbapenemasa Grupo 2 P. aeruginosa Carbapenemasa Grupo 2 P. aeruginosa Carbapenemasa Grupo 2 S. marcescens Betalactamasa Grupo 3
1 1 1 1 1 1 1 1 1
0,02 0,04 0,04 0,03 0,04 0,07 0,01 0,02 0,01
0,01 - 0,02 0,02 - 0,05 0,04 - 0,05 0,02 - 0,04 0,03 – 0,04 0,06 - 0,08 0,009 – 0,02 0,01 – 0,03 0,008 - 0,02
0,0067
P. aeruginosa Sensible Grupo 1 P. aeruginosa Carbapenemasa Grupo 2 S. marcescens Betalactamasa Grupo 3
3 5 1
0,02 0,03 0,01
0,01 - 0,05 0,009 – 0,08 0,008 - 0,02
0,0880
Bacterias Sensible Grupo 1 Carbapenemasa Grupo 2 Betalactamasa Grupo 3
3 5 1
0,03 0,03 0,01
0,01 – 0,05 0,009 – 0,08 0,008 – 0,02
0,0882
P. aeruginosa Sensible Grupo 1 Carbapenemasa Grupo 3
3 5
0,03 0,03
0,01 – 0,05 0,009 – 0,08
0,8756 *
P. aeruginosa
Sensible Grupo 1 Carbapenemasa Grupo 3
1 1
0,02 0,04
0,01 - 0,02 0,03 – 0,04
0,0270 *
P. aeruginosa carbapenemasa Grupo 1 S. marcescens Betalactamasa Grupo 3
1 1
0,04 0,01
0,03 - 0,04 0,008 -0,02
0,0117 *
P. aeruginosa Sensible Grupo 2 S. marcescens Betalactamasa Grupo 3
1 1
0,04 0,01
0,04 - 0,05 0,008 -0,02
0,0031 *
(*) t Student
85
ANEXO 3: EFECTO DE LA LACTONASA EPP852 EN LA ATENUACIÓN DE LA
FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS
MUESTRA
N
BIOPELÍCULAS OD
MEDIANA
R/Q
P
Tratamiento Cepa con efecto de la lactonasa epp852 y Antiproteasas en S. marcescens Cepa sin tratamiento S. marcescens
1 1
0,02
0,01
0,004 - 0,012
0,002 – 0,010
0,028
Tratamiento Cepa con efecto de la lactonasa epp852 y Antiproteasas en P. aeruginosa Cepa sin tratamiento P. aeruginosa
1 1
0,06
0,05
0,06 - 0,012
0,07 – 0,018
0,038