HPLC 5 10/96 1

DETECTORES PARA HPLC

DETECCIÓN ULTRAVIOLETA (UV) - longitud de onda fija- longitud de onda variable - arreglo de fotodiodos

• DETECTOR ÍNDICE REFRACCIÓN

• DETECTOR FLUORESCENCIA

• DETECTOR ELECTROQUÍMICO

• MS/FTIR/Conductividad

HPLC 5 10/96 2

LINEALIDAD DEL DETECTOR

.

Seña

l del

det

ecto

r

Concentración de la muestra

Respuesta lineal máxima

Concentración mínima detectable

HPLC 5 10/96 3

RUIDO Y DERIVA DEL DETECTOR

Ruido de alta frecuencia

Ruido baja frecuencia

Deriva y ruido de baja frecuencia

HPLC 5 10/96 4

TIPOS DE FUENTES LUMÍNICASFUENTE DE LÍNEAS 253.7 nm

Lámpara deHg

Longitud de ondaFUENTE CONTÍNUA Lámpara de

Deuterio

Longitud de onda

E

E

HPLC 5 10/96 5

FACTOR DE RESPUESTA

Concentración

PENDIENTE = BD / AB

A B

CPENDIENTE = BC / AB

D

.

Res

pues

ta

HPLC 5 10/96 6

USO DE DETECTORES DE HPLC

Analytical Chemistry, 54 (1982) 323R.

TIPO PORCIENTO DE USOAbsorbancia 70.7

Ultravioleta, fija (28.0)Ultravioleta, filtro (8.7)Espectrofotométrica (34.0)

Fluorescencia 15.0Índice de Refracción 5.5Electroquímico 4.4Otros 4.4

HPLC 5 10/96 7

DETECTOR UV DE FIJA

Lente de Cuarzo Filtro

ReferenciaFotoDetectores

Registrador

Pre-AmpsFiltro UV

Fuente de mercurio

Muestra

Comparador LOG

HPLC 5 10/96 8

CELDA DE FLUJO: DOS CANALES

REFERENCIA

SALIDA

DE LA FUENTE

1 mm

AL DETECTOR

VENTANA DE CUARZO

ENTRADA

MUESTRA

SALIDA

ENTRADA

10 mm

1 mm

HPLC 5 10/96 9

LOS BENEFICIOS DE LA DETECCIÓN CON VARIABLE

Mantequilla hidrolizada 40 nanogramos de Estándar de Vitamina A en Alcohol

Vitamina AAlcohol

0 5 0 5

= 254 nm

= 325 nm

Tiempo de Retención ( Minutos)

Selectividad y sensibilidad mejoradas

HPLC 5 10/96 10

MUESTRAS IMPOSIBLES A 254nm

• Azúcares • Triglicéridos

• Esteroides • Barbitúricos

• Ésteres Metílicos • Ácidos carboxílicos

• Hidrocarburos • Polímeros

HPLC 5 10/96 11

DETECTOR DE UV DE VARIABLE : ESQUEMA

HPLC 5 10/96 12

HPLC 5 10/96 13

DE ABSORCIÓN DE CROMÓFOROS

CHROMOPHORE FORMULA MAX (nm)

Amine – NH2 195

Ethylene – C C – 190

Ketone > C = O 195

Ester – COOR 205

Aldehyde – CHO 210

Carboxyl – COOH 200-210

Nitro – NO2 310

Phenyl 202, 255

Naphthyl 220, 275

HPLC 5 10/96 14

DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS:ESQUEMA

HPLC 5 10/96 15

SALIDA 3-D DE UN DETECTOR PDA

HPLC 5 10/96 16

USO DEL MODO 3 - D DE PDA

• Número de picos

• de máxima sensibilidad

• de mínima interferencia

• programación en f (tiempo)

HPLC 5 10/96 17

PDA: PROCESOS CUALITATIVOS

• Pureza de pico

• Confirmación del compuesto - ( max. y tR )

• Identificación del compuesto (no es fácil)

• Índice de pureza (relación de 1/2, 10 pts)

intervalo : <1.5 puro, > 1.5 impuro

HPLC 5 10/96 18

VERIFICACIÓN DE PUREZA DE PICO

A C

BEl problema:¿está este pico “puro”?

HPLC 5 10/96 19

SUPERPOSICIÓN ESPECTRAL

• No, el pico representa al menos dos compuestos coeluyendo.

mAU

nm190 230 270 310

A

B

C

HPLC 5 10/96 20

DETECTORES DE ARREGLO DE DIODOS

• Ampliamente usados, aceptados

• Principal uso – verificación de pureza de pico

• Ahorra tiempo - no se requiere volver a analizar cuando los picos no han sido bien detectados

A. Se pueden registrar distintas 'sB. Se puede re-graficar y re-integrar

HPLC 5 10/96 21

ABSORBANCIA AL UV DE SOLVENTES LC

n-Hexano

Tetracloruro

Benceno

Clorofromo

Cloruro de metileno

Acetona

Acetonitrilo

Metanol

Agua

UV CORTESOLVENTE

254 nm Fuente Hg

200 250 300

HPLC 5 10/96 22

DETECTOR UV : RESUMEN

• Buena sensibilidad 10-6 a 10-10 g

• Selectivo

• Se puede eluir con gradiente

• Costo variable

• El más empleado

HPLC 5 10/96 23

DETECTOR ÍNDICE DE REFRACCIÓN :ESQUEMA

filtro

SOLVENTE PURO

EFLUENTE COLUMNA

HPLC 5 10/96 24

DETECTOR IR : RESUMEN

• Respuesta universal

• Mala sensibilidad ~ 10-6 g

• No se pueden gradientes

• Se afecta por la temperatura

• Básico para GPC

• Empleado en escalas preparativas

HPLC 5 10/96 25

COMPARACIÓN DE IR Y UV

A B C D E

Inyección

Inyección

Tiempo

IR

UV

HPLC 5 10/96 26

DETECTOR DE FILTRO FLUOROMÉTRICO :ESQUEMA

TUBO FOTOMULTIPLICADOR

FILTRO (EMISIÓN)LENTE

CELDA DE MUESTRA

EFLUENTE DELA COKUMNA

SALIDALENTEFILTRO (EXCITACIÓN)

LÁMPARA DE MERCURIO

HPLC 5 10/96 27

DETECTOR DE FLUORESCENCIA:CROMATOGRAMA DE EJEMPLO

Tiempo

Inyección

CROMATOGRAMA DE FLUORESCENCIA 5 picogramos

benzo(a)pireno

HPLC 5 10/96 28

DETECTOR AMPEROMÉTRICO DE PELÍCULA DELGADA PARA HPLC

DUALPARALLEL

LOCKINGCOLLAR

AUXILIARYELECTRODE

WORKINGELECTRODEBLOCK

MINIATUREREFERENCEELECTRODE

MOBILE PHASEPREHEATER COLUMN

GASKET

QUICK RELEASEMECHANISM

OUTLET

INLET

TOP VIEW

HPLC 5 10/96 29

EXTRACTOS DE BUPRENORFINADE PLASMA Y ORINA (ECD)

BLANCO DE PLASMA

8 1240

(a) (b)40 ng/ml (STD)

1.5

0 4 8 12 min

(c)

BLANCO DEORINA

0 4 8 12

(d)

ORINA

40 ng/ml

0 4 8 12

HPLC 5 10/96 30

DETECTOR ELECTROQUÍMICOENTRADA

SALIDASALIDA

Electrodo deReferencia Ag/AgCl

Electrodo de trabajo de grafito

Contraelectrodo

Tapón de vidrio poroso

B. Fleet, C.T. Little, J.Chrom.Sci, 12 (1974) 747

HPLC 5 10/96 31

DETECTOR ELECTROQUÍMICOAPLICACIONES

EN REDUCCIÓN

• Quinonas

• Compuestos nitro, nitroso y azo

• Compuestosorganometálicos

• Metales pesados

EN OXIDACIÓN

• Hidrocarburos aromáticos

• Aminas primarias, secundarias y terciarias

• Aminas aromáticas

• Compuestos fenólicos

• Compuestos heterocíclicos

HPLC 5 10/96 32

DERIVADOS SENSIBLES AL UV

Analyte ReagentRNH2 N-Succinimidyle

p-Nitrophenylacetate

RCOOH O-p-Nitrobenzyl-N,N'-Diisopropylisourea

ROH 3,5-DinitrobenzoylChloride

R2CO p-Nitrobenzyloxyamine-Hydrochloride 2,4-D.N.P.H.

HPLC 5 10/96 33

DERIVADOS SENSIBLES FLUORESCENCIA

Analyte ReagentRNH2 Dansyl Chloride

Fluorescamine

RCOOH 4-Bromomethyl-7-methoxycoumarin

R--OH Dansyl Chloride

R2C = ONH2

Dansyl Hydrazine

RCH-COOH Phthaldehyde

HPLC 5 10/96 34

DERIVADOS CON PROPIEDADES ELECTROQUÍMICAS

Analyte ReagentROH, R2NH,RNH2

2,4-DinitrobenzoylChloride

R-CH-COOH 2,4-Dinitrofluorobenzene

RCOOH O-p-Nitrobenzyl-N,N'-Diisopropylisourea

R2C = O 2, 4-Dinitrophenyl-Hydrazine

HPLC 5 10/96 35

ESPECTROMETRÍA DE MASAS / LCEspectrómetro de masas

Sistema de datos

Espectro de masasMuestra concentrada

AlVacío

Solvente

Muestra

Efluente LC