detección de estados neoplásicos y pre-neoplásicos en exámenes de rutina y biología molecular...
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Detección de Estados Detección de Estados Neoplásicos y Pre-Neoplásicos Neoplásicos y Pre-Neoplásicos
en Exámenes de rutina y en Exámenes de rutina y Biología MolecularBiología Molecular
Francisco Gutiérrez C(1); Adolay Sobarzo E(1);Juan Luís Castillo N(2).(1) Alumno carrera de Tecnología Médica, Universidad de Concepción.
(2) Tutor encargado del ramo Biología Molecular, Universidad de Concepción.
18/12/06
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¿QUÉ ES EL CÁNCER?¿QUÉ ES EL CÁNCER?
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Muerte Muerte celularcelular Proliferación Proliferación
celularcelular
DesequilibrioDesequilibrio
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¿Qué es el cáncer?¿Qué es el cáncer?
Neoplasia Maligna
Clon celular
Descontrol Ciclo celular
TumorInfiltración Metástasis
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Evolución Natural del CáncerEvolución Natural del Cáncer
• Tejido Normal
• Hiperplasia
• Metaplasia
• Anaplasia
• Displasia
• Neoplasia
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Génesis del cáncerGénesis del cáncer
Mutaciones AcumuladasMutaciones Acumuladas?
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Mutaciones AcumuladasMutaciones Acumuladas
CÁNCERCÁNCER??
1.1. Continuidad de señales Continuidad de señales positivas de proliferación por positivas de proliferación por activación de oncogenes.activación de oncogenes.
2.Pérdida de señales negativas 2.Pérdida de señales negativas de crecimiento por de crecimiento por inactivación de genes inactivación de genes supresores.supresores.
3. Escape de la apoptosis por 3. Escape de la apoptosis por producción de factores de producción de factores de sobrevida IGFsobrevida IGF
4. Inmortalización atribuible a la 4. Inmortalización atribuible a la activación de la telomerasa.activación de la telomerasa.
5. Angiogénesis sustentada por 5. Angiogénesis sustentada por factores angiogénicosfactores angiogénicos
6. Alteración de las moléculas 6. Alteración de las moléculas de adhesión celular.de adhesión celular.
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Genes InvolucradosGenes Involucrados
OncogenesOncogenes
• Oncogen ras
• Oncogen c-myc
• Oncogen c-fos
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Supresores de TumoresSupresores de Tumores
• Gen APC (poliposis adenomatosa coli)
• Gen DDC (deleted in cancer colorectal)
• Gen RB
Genes InvolucradosGenes Involucrados
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Reparadores del ADNReparadores del ADN• Gen TP53
• Gen MSH-2
• Gen MLH-1
• Gen PMS-1 y PMS-2
Genes InvolucradosGenes Involucrados
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Génesis del cáncerGénesis del cáncer
AneuploidíaAneuploidía Mutaciones AcumuladasMutaciones Acumuladas
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“Propone que el cáncer es causado por la dosificación anormal de miles de genes normales”“Esta dosificación anormal de genes es generada por la ganancia o pérdida de cromososmas específicos o segmentos de cromosomas, o simplemente una pequeña secuencia de ADN, alias aneuploidía”
Proc Natl Acad Sci USA 94:14506-11 (1997)Biochem J 340:621-30 (1999)Proc Natl Acad Sci USA 97:3236-4 (2000)Cell Motil Cystoskel 47:81-107 (2000)Cell cycle 2:202-10 (2003)IUBMB life 56:65-81 (2004)Nature Biotechnol 21:13-14 (2003)GENES VII (Lewin B.)
Teoría de Aneuploidía
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¿Cuál es el origen de la aneuplodía?
Ganancia o pérdida cromosómica durante la división celular:
• Espontánea• Inducción química
Mutat Res. 410:3-79 (1998)Biochem J. 340:621-30 (1999)
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División normal V/S aneuploidía
División Normal Aneuploidía
49,9
50,1
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Teoría de la Aneuploidía
Aneuploidía al azar
Estado de Aneuplodía
Desestabiliza genes y cromosomas
Reordenamientos y acortamientos cromosómicos
Des balance en grupos de proteínas que segregan, sintetizan y reparan cromosomas
Near diploid (2n)Baja inestabilidad
Near Aneuploid Alta inestabilidad y adaptabilidad
Muerte celular por aneuplodía:
• Nulisomías• Acortamientos
cromosómicos no viables
• Mutaciones letales
Cell cycle 3:823-828 (2004)
Near Triploid (3n)
Near tetraploid (4n)
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Aneuploidía Célula no cancerosa
Bajo el límite para el cáncer
Aneuploidía Célula cancerosa
Cytometry 22:307-316 (1995)Biochem J. 340:621-30 (1999)
Se alcanza o sobre pasa el límite para el cáncer (en forma gradual o abrupta)
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Métodos de DetecciónMétodos de Detección
Métodos morfológicos
Proteínas
ADN
Biología Molecular
Muestra de tejido o muestra
de sangre del paciente
Genómica
Proteómica
PatologíaMuestra de tejido del paciente
Chip del gen
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Detección por MorfologíaCitología
HistologíaHistología
InmunoHístoquímicaInmunoHístoquímica
Tsissue MicroarraysTsissue Microarrays
http://www.mibiopsia.com/images/CITOLOGIA.jpg
www.gyne.cz/fotogalerie/fotogalerie-images/ot-mucinous
%20adenocarcinoma.jpg
www2.udec.cl/~webpatologia/fotos/cancer2/pages/page_3.html
ww.zeiss.com/C12567BE00472A5C/GraphikTitelIntern/TMA_Array/$File/TMA_array_357.jpg
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Detección por Biología Detección por Biología MolecularMolecular
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Microarrays
Chip de gen
ADN
ADNc fluorescente
Microarreglo escaneado
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Microarregloescaneado
No hace juego El rojo hace juego
El rojo hace juego
Célula normal
Aislar a los ARNms
Añadir al microarreglo de ADN
Producir ADNcs fluorescentes
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Miocito
El ADNc fluorescente del linfocito “ilumina” al gen de inmunoglobulina
El ADNc fluorescente de la célula muscular “ilumina” al gen de miosina
ADNc fluorescente
ADNc fluorescenteARNm de inmunoglobulina
ARNm de miosina
+ transcriptasa inversa
Microarreglo escaneadoMicroarreglo de ADN
Inmunoglobulina
Linfocito
Miosina
+ transcriptasa inversa
MicroarregloescaneadoMicroarreglo de ADN
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Utilizando al ADN para CompararCélulas Cancerosas con Células Normales
Célula normal
Microarregloescaneado
Añadir al microarreglode ADN
Producir ADNcs fluorescentes rojos y verdes
Sólo los verdeshacen juego
Sólo los rojoshacen juego
Ambos, rojos y verdes
hacen juego
Ninguno hace juego
Aislar losARNms
Célula cancerosa
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Interpretando los Datos
El gen del cáncer se expresó 18 veces más que el gen normalArtwork by Jeanne Kelly. © 2002.
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Citometría de FlujoCitometría de Flujo
Estudio de Ploidía de ADN mediante
estudio del ciclo celular de lesiones pre-neoplasicas y
neoplasicas
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ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULARY CICLO CELULAR
• Se evalúa el contenido relativo de ADN en el núcleo de una célula normal o neoplásica.
• Se obtiene una estimación de las fases del ciclo celular.
• Se obtienen resultados de la cantidad de ADN celular, lo que se traduce en discriminar poblaciones diploides y aneuploides.
Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
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2X
1X
G1 S G2 M G1
FASES CICLO CELULARFASES CICLO CELULAR
CONTENIDO ADN
CANTIDAD DE CANTIDAD DE ADN V/S TIEMPOADN V/S TIEMPO
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0 200 400 600 800 1000
PI Fluorescence
Cou
nts
0 7
5 1
50 2
25 3
00
DNA Análisis
2N2N 4N4N
Purdue University Cytometry Laboratories
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0 200 400 600 800 1000
PI Fluorescence
Cou
nts
0 7
5 1
50 2
25 3
00
DNA Análisis
Aneuploid peakAneuploid peak
DNA index 1.21DNA index 1.21
Purdue University Cytometry Laboratories
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ESTUDIO DE PLOIDIA DE ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULARADN Y CICLO CELULAR
INDICE ADN (ID): Medición de Ploidia de ADN.
ID: Razón de la Cantidad de ADN de la Muestra v/s el control.
ID = Contenido ADN Células G0G1 MuestraContenido ADN Células G0G1 Control
Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
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ESTUDIO DE PLOIDIA DE ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULARADN Y CICLO CELULAR
PLOIDIA
ADN Diploide
ADN Aneuploide
ADN Hiperdiploide
ADN Hipodiploide
INDICE ADN
= 1
= 1
> 1
< 1
INDICE ADN (ID): Medición de Ploidía de ADN
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ProteómicaProteómica
• Entendida como una genómica funcional
• Biomarcadores
• Pautas terapéuticas
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Electroforesis BidimensionalElectroforesis Bidimensional
http://www.upf.edu/cexs/sct/proteomi/img/ef2D.gif
Nuevos puntos Puntos perdidos
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Protein ChipProtein Chip
www.ipht-jena.de/BEREICH_3/bilder/protein_array.jpg
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Espectrometría de Masa
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DiscusiónDiscusión
• Faltan mas estudios comparativos entre ambas teorías, motivo por el cual se conoce poco de Aneuploidía.
• Todas las neoplasias presentan aneuploidía, en contraste con mutaciones acumuladas.
• Existen estudios que desprecian la teoría de la Aneuploidía como causa común en neoplasias de Adenocarcinoma esofágico(1).
• La aneuploidía es una consecuencia de inestabilidad genómica de las mutaciones acumuladas.
(1)www.academia.cat/societats/digest/5curs/esofag.htm
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DiscusiónDiscusión
• Las técnicas de genómica, detectan los problemas a nivel de Ac. Nucleicos, lo que posibilita un diagnóstico oportuno y a la raíz misma de éste.
• Las técnicas proteómicas detectan el resultado de todo el proceso de expresión génica (inclusive los factores epigenéticos), siendo más efectivo y fácil de dilucidar.
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ConclusiónConclusión
La displasia es un concepto en el que ni los propios morfologos están de acuerdo, por lo que las técnicas de biología molecular son la futura solución a este dilema.
• Los diagnósticos morfológicos se hacen cada vez más incompletos sin técnicas complementarias que determinen más certeramente el pronóstico de la neoplasia.
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ConclusiónConclusión
• Es importante poder identificar cual técnica es la mas ideal para poder diagnosticar una neoplasia en particular, considerando que en un futuro se harán tratamientos personalizados.
• A futuro, la detección de estados neoplásicos y pre-neoplásicos serán diagnósticados de forma predictiva en base a la proteómica y genómica, identificando tempránamente el cáncer.
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AgradecimientosAgradecimientos
• Profesor Juan Luís Castillo N.
• Dr. Marcelo Larremendi.