desarrollo de un biosensor a partir de la …

DESARROLLO DE UN BIOSENSOR A PARTIR DE LA INMOVILIZACIÓN DE LA ENZIMA BIÓXIDO DE CARBONO DESHIDROGENASA, OBTENIDA DE

LA BACTERIA Metanococcus deltae.

Director:

RAUL ALBERTO CUERVO MULET. MSc

Estudiante:

CARLOS ANDRES DURAN DUQUE

UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA CALI2010

JUSTIFICACIÓN

• Colombia, país rico en biodiversidad, es uno de los principalesproductores de frutas a nivel mundial, debido a su climanetamente tropical y a la fertilidad de sus suelos.

• El consumidor cada vez es mas exigente con la calidad delproducto que demanda.

• Es de gran importancia desarrollar nuevas tecnologías,implementos y/o equipos que permitan determinar grado demaduración de la fruta, características de la fruta,metabolismo, entre otros.

• Uno de los parámetros más importantes en las frutas es lamedición de la respiración, el cual permite determinardiversas características metabólicas y fisiológicas.

• En la respiración los azúcares frutales se convierten enenergía y bióxido de carbono, después de pasar por laglucólisis y el ciclo de Krebs.

• Para las industrias que almacenan, comercian, transportanfrutas es de gran importancia el desarrollo de implementosque permitan la determinación de cantidades pequeñas en elorden de ppm de bióxido de carbono.

BIOSENSORES

(altamente específicos y

miden concentraciones

muy bajas de Bióxido de

Carbono.)

ANTECEDENTES

Cuervo, R; Hetz, J; y Pardo, J.F; (2009), “Optimización del proceso de lisis celular dela bacteria Methanococcus Deltae para la obtención de un extracto semipurificadocon actividad enzimática optima para un biosensor de CO2.

CUERVO y colaboradores (2005), “Obtención y purificación de extractos de laenzima monóxido deshidrogenasa de Oligotropha carboxidovoran CEPA OM5 conactividad electroquímica de oxidación de monóxido de carbono detectable pormedio de un microelectrodo de platino.

SANZ y colaboradores (2004) “Desarrollo de sistemas multisensores capaces dedetectar compuestos orgánicos volátiles presentes en alimentos”.

POCCIA y colaboradores (2002); VI Encuentro de jóvenes Investigadores de la UNL,Argentina “Disrupción celular”.

PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

• La biotecnología muestra interés por el estudio y la implementación de nuevos procesos,interés en el cual las enzimas o extractos enzimáticos son los componentes biológicos masempleados.

• Los biosensores y sus aplicaciones, son indispensables en el desarrollo creciente de distintosproductos los cuales demandan como el caso de frutas y hortalizas mayor calidad y mejordesarrollo poscosecha.

• Interés aunado en poder lograr evidenciar la presencia de moléculas en el ambiente o en unlugar determinado.

• El extracto enzimático es obtenido después de un proceso de lisis, que puede ser realizadopor varios métodos , sin embargo, la eficiencia del método conllevará a la obtención demayor volumen y mayor concentración.

• De otro lado se requiere semipurificar el extracto enzimático y determinar la actividadcatalítica de este con el objetivo de determinar la viabilidad del sensor enzimático.

BACTERIAS METANOGÉNICAS

Abundan en ambientes donde limitanaceptores de electrones tales como O2, NO-3

Fe+3, y (SO4)-2. Digestores anaerobios,sedimentos anóxicos, suelos de humedales ytractos gastrointestinales son hábitats típicospara encontrar estos microorganismos.

Methanococcus deltae• Bacteria gram negativa sin flagelos.

• Perteneciente al grupo de las bacterias metanogénicas.

• Enzima de interés es una reductasa de Dióxido de carbono.

• La reacción clave en el metabolismo de esta bacteria es la reduccióndel CO2 para la producción de CH4, catalizada por una reductasa, lacual posee dos clúster de Fe y S diferentes y un cofactor demolibdeno por cada unidad dimérica.

TAXONOMIA

Dominio Archaea

Filo Euryarchaeota

Clase Methanococci

Orden Methanococcales

Familia Methanococcaceae

Genero Methanococcus

Fuente: DURAN, C.A; HETZ, J; PARDO, J.F, 2009

PROCESOS DE LISIS CELULARPara lograr un proceso de lisis celular donde el objetivo es obtener una proteínaintracelular de algún microorganismo existen tres métodos generales: enzimáticos,químicos o físicos. Teniendo en cuenta que no todas las metodologías pueden serempleadas en procesos a gran escala.

MÉT

OD

OS

ENZI

MÁT

ICO

S •LITICASA

•LIZOSIMA

•BETAGLUCORONIDASAM

ÉTO

DO

S M

ECA

NIC

OS •Friccion mecanica.

•Prensa hidraulica

MÉT

OD

OS

FÍSI

CO

S •SONICACION

•DISRUPPCION CELULAR POR ULTRASONIDO

ENZIMASSon proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres vivos. En una reacción

catalizada por una enzima se produce una unión del sustrato en una regiónconcreta de la enzima denominada centro activo, que comprende un sitio deunión y un sitio catalítico. Una vez formados los productos la enzima se recuperapudiendo comenzar un nuevo ciclo de reacción.

ENZIMAS

Ventajas Desventajas

Elevada de sensibilidad Sensibilidad frente a condiciones

Respuesta rápida ambientales ( pH, temperatura o

Autoregenerables fuerza iónica)

Permiten monitorización continua En ocasiones requieren presencia de

No requieren pasos de lavado Cofactores

Gran variedad de enzimas disponibles Pueden ser inhibidos por sustancias

Permiten detectar tóxicos desconocidos de la muestra

que inhiben enzimas Tiempo de vida limitado

Permiten amplificar señales

Diseño sencillo

Fácil construcción

Bajo costo

Manejo sencillo

Fuente: Hall, R. H. (2002) Biosensor technologies for detecting

Microbiological foodborne hazards Microbes and Infection,

OBJETIVO GENERAL

Desarrollo de un Biosensor a partir de la

inmovilización de la enzima Bióxido de carbono

deshidrogenasa.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Cultivar y crecer la bacteria Methanococcus Deltae en un medio de

cultivo rico en nutrientes.

Realizar una semipurificación del extracto crudo obtenido mediante

la utilización de una columna de exclusión por tamaño y una columna

de intercambio iónico.

Evaluar la actividad catalítica presentes en el extracto enzimático

semipurificado obtenido de la bacteria Methanococcus Deltae.

Inmovilizar enzimas en un electrodo de platino.

Elaboración de un biosensor enzimático para bióxido de carbono.

Cultivo de la bacteria Methanococcus sp

Aislamiento e identificación bacteriana.

Preparación de los extractos enzimáticos

obtenidos por tres métodos de lisis celular

Lisis celular por Sonicación

Lisis celular por Fricción mecánica

Lisis celular por Agentes Químicos

Análisis de resultado de los distintos rompimientos

Semipurificación de los extractos enzimáticos obtenidos a partir de la

lisis celular.

Medición de la actividad enzimática de los extractos

celulares obtenidos a partir de los tres métodos de

lisis bacteriana.

Desarrollo del Biosensor

CULTIVO Y CRECIMIENTO DE M. deltae

La bacteria Methanococcus deltae se compróa la American Type Culture Collection, (ATCC# 35294).

Se tomaron varias muestras del lago principalde la Universidad de San Buenaventura-Seccional Cali, con el objetivo de aislar ycultivar cepas nativas de Methanococcus sp.

Las bacterias se crecieron en el mediorecomendado, por el método de estrías.

Se empleo una cámara de anaerobiosis.


CARACTERIZACIÓN DE M. deltae

Bacilo Gram (-)Negativo a la tinción de

capsulaNegativo a la tinción

de espora


CURVA DE CRECIMIENTO

La curva de crecimiento se

realizo mediante conteoscontinuos, mediante el uso dela cámara de NeuBauer.


Las bacterias alcanzaron la fase decrecimiento exponencial enaproximadamente 2 horas.

Se puede observar la curva decrecimiento de la población de M.deltae donde se observa que lapoblación termina la fase de latenciaal cabo de las dos horas siguientes.

En medio sólido todas las bacteriasmostraron características muysimilares, observándose coloniasmedianas y cremosas de borderegular.

CURVA DE CRECIMIENTO


PRUEBAS BIOQUIMICAS

PRUEBAS BIOQUIMICAS

Prueba: citrato de SimmonsPrueba: Voges Proskaver

PROCESOS DE LISADO


RESULTADOS DE LOS ROMPIMIENTOS

Rompimiento por Fricción Mecánica

Tratamiento Conteo inicial Conteo final Diferencia % eficiencia

1 28360000 19610940 8749060 30,85

2 36600000 23480000 13120000 35,846995

Promedio 33,348497

El método de mayor efectividad esel método enzimático.

Hay que mencionar que esta técnicaes la más costosa, lo cual en unmomento dado puede convertirseen un obstáculo porque limita elacceso a la realización de la técnica.

Rompimiento Químico Enzimático ( Bioquímico)

Tratamiento Conteo inicial Conteo final Diferencia

%

eficiencia

1 25000000 4000000 21000000 84

2 30000000 9000000 21000000 70

Promedio 77

Rompimiento por Sonicación

Tratamiento Conteo inicial

Conteo

final Diferencia

%

eficiencia

1 19566500 12553867 7012633 35,839997

2 17571429 8205857,34 9365572 53,3

Promedio 44,569998

• La actividad enzimática se determinó por el cambio de observancia.

• Actividad enzimática específica= actividad enzimática/cantidad proteica determinada.

MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.


• Columna de DEAE

• Columna de Sephadex G-100

• Determinación de la concentración proteica por el método de Folin Lowry

• Determinación de actividad enzimática.


MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.

• Unión en dos viales (M1 y M2) de lasfracciones 16, 17, 18 y 19

• Descarte de Las muestras 15, 20 y 21por no encontrarse actividadenzimática.


Biosensor

• Electrodo de Platino utilizado en lainmovilización enzimática.

• La inmovilización se realizó en:

10 ml de extracto enzimático

100 mg de Alginato de Sodio (1%)

Solución de CaCl2 200 mM

Se producen esferas de 3-5 mm de diámetro quepolimerizan al entrar en contacto con la soluciónde CaCl2. Las esferas se estabilizan durante 1 h enla solución de CaCl2 a temperatura ambiente. Lasesferas se lavaron con buffer acetato 0.1 M, pH:5.

CONCLUSIONES

• Se logró una semipurificación de la enzima bióxido de carbono deshidrogenasa apartir de extractor celulares procedentes de la bacteria Methanococcus deltae.

• El método de ruptura más eficiente fue el tratamiento con la enzima liticasa,puesto que ocurrió la lisis celular en menor tiempo y se obtuvo el mayorporcentaje de eficiencia medida como # de células bacterianas lisadas.

• La enzima semipurificada por la columna de DEAE y de exclusión por tamañoSephadex G-100 poseía actividad enzimática, lo cual lo hace ideal para serinmovilizada y utilizada en la fabricación del sensor enzimático.

CONCLUSIONES

• La actividad enzimática específica aumentó a medida que aumentaron los pasosde purificación, esta actividad fue directamente proporcional a la cantidad deproteína obtenida después del paso de lisis celular, el cual se optimizó mediante lautilización del método de lisis celular más efectivo, para nuestro caso eltratamiento enzimático con liticasa.

• Se logró el aislamiento de cepas nativas de bacterias metanógenas a partir delagua del lago principal de la Universidad de san Buenaventura-Cali.

• No se observaron diferencias bioquímicas entre la cepa aislada y la cepa deMethanococcus deltae comprada a la ATCC.

• Se obtuvo un biosensor experimental que permitió determinar concentracionesbajas de Bióxido de Carbono a partir de una enzima inmovilizada.

RECOMENDACIONES

• A pesar de la gran cantidad de investigaciones sobre tecnologías de biosensores enagroindustria, y más en el sector de alimentos, los productos comercializados sonescasos. Sería interesante que futuros proyectos del grupo de investigación delprograma de ingeniería agroindustrial de la universidad de San Buenaventura seenfocaran en generar este tipo de tecnología cada vez más indispensables.

• Se recomienda determinar las actividades enzimáticas de los extractos después decada paso de semipurificación para poder determinar a su vez el grado depurificación alcanzado.

• Se recomienda después de la lisis celular someter el extracto a un detergente talcomo Tritón X-100, esto debido a que en reportes de literatura mencionan a estaenzima como ligada a membrana. Si se somete a tritón X-100, se aumentaría laconcentración de enzima después de la lisis celular.

• Se recomienda determinar en futuros trabajos la vida útil del sensor relacionadacon la vida enzimática.

BIBLIOGRAFIA• COMMERCIAL BIOSENSORS: Applications to Bioanalytical sensors (Techniques in Analytical Chemistry

Series); Wiley & Sons: New York, 1998

• COPELAN, R. A. 1993. Methods for Protein Analysis: A Practical Guide to Laboratory Protocols. Chapman &Hall, New York.

• ESPÍN, Neyda. La biotecnología en la valorización de desechos agroindustriales. Escuela PolitécnicaNacional. Departamento de Bioprocesos. Ecuador. Disponible en Internet en:http://www.bvsde.paho.org/bvsaidis/ecuador10/biot.pdf

• GONZALEZ, Víctor; GARCÍA, Esther; RUIZ, Olga; GAGO, Lara; et al. Aplicaciones de Biosensores en laindustria Agroalimentaria. Colección Vt. Dirección General de Universidades e Investigación. España2005

• LODISH, H., BERK. A,. ZIPURSKY. S. L,. MATSUDAIRA. P., BALTIMORE. D., J. DARNELL. 2002. Biologia Celular yMolecular. Editorial MedicaPanamericana. Mexico.

• MONOGRAFÍA: Ciencia y tecnología para una sociedad abierta; COLCIENCIAS: Bogotá. 1990.

• VELASCO GARCÍA M. Y MOTTRAM T. (2003). Biosensor technology addressing agricultural problems.Review paper. Biosystems Engineering, vol. 84, nº 1, 1-12.

• POCCIA, María Eugenia. Operaciones Biotecnológicas. Laboratorio de Fermentaciones. Facultad deBioquímica y Ciencias Biológicas.[ citado en 2002] disponible en internet en:http://www.universia.com.ar/contenidos/investigacion/unl/C_BASICAS/biologia/1111.htm

• TREVAN, M. D., BOFFEY, S., GOULDING, K. H., STANBURY, P. 1990. Biotecnología: principios Biológicos. Ed.Acribia. Zaragosa. España.

http://www.bvsde.paho.org/bvsaidis/ecuador10/biot.pdf













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