biosensor es 2009

Transductores y Sensores Biosensores

Bioing. Maria Lorena López Rodriguez 1

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BIOSENSORES

Los sensores naturales son tan viejos como los organismos vivos. Estos bioreceptores son transductores naturales que convierten todo tipo de señales físicas y químicas del ambiente en señales eléctricas, resultando en potenciales de acción que pueden ser procesados por una “computadora natural”, nuestro sistema nervioso. La presencia de bioreceptores no se limita a los órganos de nuestros sentidos sino que aparecen en todos los procesos involucrados en los organismos vivos y células. La aparición de los sensores artificiales y su progresiva expansión permitió poner en contacto a los aparatos electrónicos con el mundo exterior, dotando de "sentidos" a la tecnología. Por lo tanto, podemos definir un biosensor como un dispositivo bioquímico-electrónico que permite identificar, transformar y cuantificar un evento biológico. Está compuesto por la combinación de un bioreceptor, componente biológico y un transductor, método de detección.

En la Fig. 1 se muestra el principio de operación de un biosensor el cual, comenzando desde el analito, puede proveer toda la información necesaria para su evaluación. Esta información puede ser procesada y almacenada.

El biosensor está en contacto directo con la muestra a través del bioreceptor, que le confiere la selectividad a través de un sitio selectivo que identifica al analito y lo transforma de alguna manera. Generalmente el bioreceptor es una enzima inmovilizada que transforma el analito en un producto que es detectable por el transductor.

Estos cambios que se producen al identificar al analito pueden ser: variaciones de temperatura, de masa, constante dieléctrica, potencial de media celda, de conductividad iónica, de turbidez de la muestra, entre otros. Por lo tanto, dependiendo de esta modificación bioquímica que se produzca se escoge el transductor.

El transductor debe dar una señal óptima, sensible, fácil de monitorear y con el mínimo de ruido. El transductor puede ser electroquímico, termométrico, fotométrico o piezoeléctrico y de acuerdo al tipo de bioreceptor con el que se combina pueden formarse múltiples tipos de biosensores.

Como era de esperar, la tecnología ha llegado aún más lejos en algunos casos que nuestro sistema sensorial. Los sensores se han convertido en "sentidos ultraperfeccionados" que llegan a lugares a los que nosotros no tenemos acceso, captan imágenes y movimientos con una resolución inimaginable para el ojo humano, y detectan estímulos que nosotros no percibimos, como las ondas electromagnéticas o los ultrasonidos. La información que aportan ha cobrado un valor extraordinario en todos los ámbitos de la actividad humana, desde la Alimentación y la Medicina hasta la Seguridad Nuclear o la búsqueda de vida en otros planetas.

Fig. 1. Etapas en la determinación con un biosensor



II.. EELL BBIIOORREECCEEPPTTOORR

El bioreceptor es crucial pues produce el efecto físico-químico que será detectado por el transductor. Esto involucra procesos como biocatálisis, acoplamientos inmunológicos o quimiorecepción.

1. Tipos de bioreceptores

Los bioreceptores más empleados son:

� Catalizadores biológicos (enzimas). Las enzimas pueden ser extraídas de una o más fuentes biológicas (in situ) para aplicaciones específicas y pueden usarse solas o con sus cofactores. Las enzimas que se consiguen comercialmente presentan las siguientes ventajas: se reproducen por lotes, tiempo de vida y características conocidas, disponibilidad inmediata. Las desventajas de las enzimas purificadas son que no son siempre estables y necesitan la presencia de sus cofactores para operar en forma apropiada. En algunos casos se necesitan cadenas enzimáticas para realizar las transformaciones, lo que debe asegurarse la operación óptima del biosensor en forma global.

� Microorganismos. Son entidades estructurales que poseen todas las enzimas necesarias y sus cofactores en un ambiente optimizado por la naturaleza. Pueden reproducir y compensar pérdidas en la actividad enzimática con el tiempo.

� Tejidos y organelas. El tejido tiene la ventaja de la cohesión, y tiene una estructura que es lo suficientemente robusta para adherirse a un transductor sin necesidad de recurrir a técnicas de inmovilización de proteínas. Pueden usarse:

� Tejidos de animales y vegetales: estos tejidos son fuentes naturales de material enzimático por lo cual pueden construirse biosensores muy estables.

� Organelas: se pueden encontrar biocatalizadores en lisosomas, cloroplastos, mitocondrias y microsomas.

� Inmunorreceptores. Debido a la reacción antígeno-anticuerpo se produce una débil variación del potencial que puede detectarse, pero deben utilizarse distintos procesos para mejorar la respuesta del transductor.

� Quimiorreceptores. Se emplean los receptores celulares específicos de membranas celulares que se excitan químicamente para producir cambios conformacionales. Ej: neurorreceptores para detectar drogas y toxinas.

2. Inmovilización de los bioreceptores

Un paso crucial en la construcción de un biosensor es inmovilizar las proteínas de interés (Ej: enzimas). Esto asegura máximo contacto con la muestra, y estabilización de la proteína para poder emplearla en forma repetida.

2.1. Inmovilización de enzimas

En la Fig. 2 se muestran distintos tipos de técnicas de inmovilización de enzimas.

Atrapamiento físico

Las enzimas tienen alto peso molecular y gran tamaño, lo suficiente como para atraparlas en geles de poliacrilamida o membranas de diálisis. El primer electrodo de enzima fue construido por Updike y Hicks atrapando glucosa oxidasa en una capa de gel de poliacrilamida, que a su vez se adhería a un electrodo de oxígeno.

El atrapamiento físico no se usa generalmente porque la presencia de enzimas en una solución no permite una actividad enzimática a largo plazo.



Fig. 2. Técnicas de inmovilización de enzimas.

Inmovilización por enlace cruzado (cross-linking)

Este proceso usa un agente bi o multifuncional para formar un puente entre distintas especies biocatalíticas o proteínas. Esto resulta en un incremento considerable del peso molecular, y los compuestos que se forman son insolubles.

Es posible enlazar moléculas de una misma enzima, o coreticular dos o más proteínas diferentes (enzima con enzima, enzima con proteína, etc). Un agente utilizado en cross-linking es el glutaraldehído. Este agente bifuncional tiene dos grupos aldehídos en sus extremidades que reaccionan con el grupo amina de una enzima o proteína.

Los métodos de cross-linking son: método de inmersión (para inmovilizar ureasa), método de enlace directo, uso de aerosoles, uso de membranas y, membranas prefuncionalizadas.

Inmovilización electromagnética

Si una enzima puede incorporarse en un soporte magnético, entonces puede usarse un campo electromagnético para inmovilizarla. La ventaja de este método es que los componentes biocatalíticos pueden ser cambiados tan frecuentemente como se desee. La enzima puede despegarse deteniendo la corriente en el solenoide. La dificultad es la fijación de la enzima a las partículas magnéticas. La interacción bioespecífica usada es frágil e irreversible, y la enzima puede ser despegada bajo ciertas condiciones de pH.

Inmovilización multienzimática

La naturaleza proteínica de las enzimas significa que contienen un gran número de grupos reactivos que pueden ser simultáneamente inmovilizados, lo que permite que el sustrato pueda ser reciclado, aumentando la sensibilidad de la respuesta del electrodo.

El uso de mediadores para reducir el potencial aplicado en los electrodos amperométricos, y la interferencia, algunas veces requiere inmovilización multienzimática.

La inmovilización multienzimática necesita la catálisis de reacciones de descomposición sucesivas que requieren muchas enzimas diferentes, pero eventualmente los productos pueden ser detectados por un electrodo.



Inmovilización de cofactores

Un cofactor (o coenzima) puede ser inmovilizado en un soporte insoluble al mismo tiempo que una enzima, gracias a que forman una unidad indisociable con la apoenzima. Además, el cofactor puede permanecer lo suficientemente móvil después de su inmovilización para pasar de un sitio activo de una apoenzima al sitio activo de otra para su regeneración.

La inmovilización física de los cofactores es imposible debido a su tamaño tan reducido y por lo tanto debe ser unido covalentemente ya sea a una enzima o un soporte insoluble.

A veces la regeneración de un cofactor no requiere otra enzima sino simplemente otro sustrato. El cofactor es inmovilizado en un sitio activo de una enzima para obtener la reacción enzimática con el primer sustrato, y luego el cofactor es regenerado por un segundo sustrato.

Inmovilización de mediadores

Los mediadores se usan para regenerar los cofactores involucrados en las reacciones redox catalizadas por enzimas. La movilidad de un cofactor se reduce si la enzima no está en solución y se requiere un mediador para transportar electrones entre el electrodo y el cofactor. Pueden usarse ferrocenos y sales orgánicas conductoras. Los mediadores se inmovilizan usando redes poliméricas inertes o electroactivas.

Sensores miniatura

Se utilizan en microsensores implantables para análisis clínicos in vivo. Pueden ser sensores potenciométricos o amperométricos.

2.2. Inmovilización de microorganismos

Como los microorganismos son de mayor tamaño que las enzimas pueden ser inmovilizados por atrapamiento físico. Pueden atraparse en geles agar o de poliacrilamida, o en membranas de diálisis o filtración. También se pueden inmovilizar células enteras en suspensiones de colágeno tratadas con glutaraldeido.

2.3. Inmovilización de inmunoagentes

Existen dos tipos de inmunosensores: aquellos que en forma directa explotan una variación de un parámetro como resultado de un acoplamiento inmunológico y aquellos que recurren a una enzima para liberar un producto, o consumir un co-sustrato, que es detectable por un transductor. El primer paso en ambos casos es fijar un antígeno, un anticuerpo, o un compuesto que tenga bioafinidad con el analito, sobre el transductor.

Inmovilización de anticuerpos

El objetivo de inmovilizar un anticuerpo en un transductor es detectar el antígeno correspondiente. Los anticuerpos tienen estructuras proteínicas y pueden ser inmovilizados de la misma forma que las enzimas, en forma directa (enlaces covalentes) o usando membranas.

Inmovilización de antígenos

Los antígenos no siempre poseen estructuras proteínicas como para inmovilizarlos en la misma forma que los anticuerpos o las enzimas, y por lo tanto se los une a portadores iónicos.

Inmovilización de los compuestos con bioafinidad

Los compuestos con bioafinidad pueden usarse para preparar proteínas complejas por procesos similares al acoplamiento inmunológico. Los compuestos se inmovilizan usando membranas obtenidas por copolimerización de 1,8-diamino-4-amino-metiloctano con triacetato de celulosa. Las membranas se sumergen en una solución que contiene ovalbúmina y luego HABA (ácido benzoico 2[(4-hidroxifenil)azo]), el compuesto con bioafinidad, se une con carbodiimida.

2.4. Inmovilización de tejidos y organelas

Se corta un trozo de tejido animal o vegetal que se inserta entre dos membranas semipermeables que luego se adjuntan al transductor. El transductor generalmente es un electrodo de pO2, pCO2, o pNH3 los cuales tienen su propia membrana hidrofóbica permeable a un gas. Los tejidos animales pueden ser de hígado de conejo o bovinos, músculo o mucosa intestinal de conejo. Los componentes celulares también se usan, por ejemplo mitocondrias. Estas organelas hacen más selectivo al



biosensor porque contienen enzimas más específicas. Los tejidos vegetales se inmovilizan usando retención mecánica.

Estos biosensores tienen un tiempo de respuesta mayor que los sensores de enzima correspondientes. Para obtener respuestas más rápidas se incorpora el tejido en pastas de carbón para facilitar el contacto entre el sitio biocatalítico y el componente sensible.

2.5. Inmovilización de quimiorreceptores

Los quimiorreceptores se adhieren en su estado natural a un electrodo potenciométrico para crear sensores llamados “receptrodes”. De esta forma pueden crearse neurorreceptores para medir toxinas y otros agentes químicos. Por ejemplo, el uso de receptores de acetilcolina permite la determinación de acetilcolina a través de la detección de una impedancia específica comparada con otros neurotransmisores.

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El transductor provee la evidencia de que ha ocurrido una reacción en el bioreceptor. La elección del transductor depende del tipo de reacción, y las sustancias liberadas o consumidas. Generalmente, la elección apropiada del transductor es el modelo comercial que existe para el método de detección requerido. Hay un gran número de electrodos disponibles para detección electroquímica, por ejemplo, electrodos sensibles a pH, a aniones o cationes, y a gases (pO2, pCO2, pNH3). El componente sensible puede comprarse independientemente y luego adherirlo al biosensor.

La elección del transductor también depende la aplicación deseada del biosensor. Si va a ser usado en ambientes biológicos, debe satisfacer criterios de biocompatibilidad, especialmente con respecto a la deposición de proteínas, lípidos o células sobre su superficie. Si va a ser utilizado in vivo, debe ser de tamaño reducido, y con forma adecuada para no dañar excesivamente los tejidos. Además deben tenerse en cuenta las características tóxicas, metálicas, o componentes poliméricos cuando se va a implantar por largo tiempo.

La interferencia química puede afectar la transducción, por lo que también debe tenerse en cuenta en el momento de la elección del transductor.

El transductor debe aprovechar óptimamente las modificaciones fisicoquímicas que resulten de las reacciones biológicas. Por ejemplo, si una reacción provoca una variación de la entalpía, se produce un incremento muy débil de la temperatura y por lo tanto un termistor es un transductor térmico más adecuado que una termocupla.

El mismo transductor puede usarse en modos de operación diferentes, que se eligen de acuerdo al objetivo deseado. Por ejemplo, una fibra óptica puede usarse como un transductor extrínseco, con un componente biorreactivo inmovilizado en su punta, o como un transductor intrínseco explotando la interacción entre las inmunoproteínas de su superficie y las ondas evanescentes de la superficie.

Los transductores pueden ser:

� Electroquímicos

� Potenciométricos

� Amperométricos

� Semiconductores

� Termométricos

� Piezoeléctricos

� Fotométricos



1. Transductores electroquímicos

1.1. Potenciométricos

1.2. Amperométricos

1.3. Semiconductores

2. Transductores termométricos

Un sensor enzimático térmico, o entalpimétrico, mide la concentración de un sustrato usando la variación de entalpía de una reacción enzimática. Existen distintos métodos para medir temperatura (ópticos, mecánicos, eléctricos) pero los eléctricos son los más usados para la construcción de biosensores térmicos debido a que la señal eléctrica puede obtenerse directamente de la variación de la temperatura.

Pueden usarse termistores o termocuplas para la medición de temperatura. Las termocuplas simples no son lo suficientemente sensibles para detectar las variaciones de entalpía de las reacciones enzimáticas.

Los termistores y termopilas sí pueden detectar pequeñas variaciones de temperatura. Los termistores son mezclas de óxidos metálicos con semiconductores cristalinos. La alta resistividad de estos materiales les confiere una rápida respuesta temporal gracias a su pequeño tamaño y capacidad calorífica reducida. La resistencia de un termistor es función de la temperatura, lo cual se ocupa como principio para la transducción. Las termopilas se construyen alternando uniones termoeléctricas y se usan para construir biosensores. Generan señales pasivas lo que las hace particularmente aptas para mediciones en soluciones fluidas.

Se emplean dos termistores, uno de los cuales está a una temperatura de referencia. La enzima inmovilizada se coloca directamente sobre el termistor de trabajo (Fig. 3). La enzima transforma el sustrato y libera o consume calorías que pueden medirse in situ por los termistores (o termocupla).

En una determinación se colocan dos termistores, uno mide las variaciones de la temperatura del medio, y el otro las variaciones de temperatura por la reacción enzimática más las del medio. La diferencia de las dos temperatura es la variación por la actividad enzimática.

Fig. 3. Esquema de un transductor termométrico.



3. Transductores piezoeléctricos

Las mediciones piezoeléctricas usan la aparición de una polarización eléctrica, o una variación en la polarización existente, en materiales anisotrópicos dieléctricos, por ejemplo cuarzo, cuando se aplica una fuerza en la dirección apropiada. Este efecto piezoeléctrico es reversible.

Un sensor piezoeléctrico mide la masa depositada en la superficie de un cristal piezoeléctrico, detectando la variación en la frecuencia de resonancia característica (FRC) del cristal. Intuitivamente, al aumentar el peso del cristal su FRC disminuye, esto es análogo a las cuerdas de una guitarra, que cuanto más gruesa es, resuena a una menor frecuencia.

Un sensor piezoeléctrico consiste en un cristal de cuarzo, electrodos metálicos y el receptor que brinda la selectividad. En la Fig. 4 se presenta un esquema de un sensor piezoeléctrico.

La frecuencia de resonancia disminuye con el aumento de masa:

AdM

FdF ..10.3.2 26−=

donde F es la frecuencia fundamental, dF es la variación de frecuencia, dM es la masa adsorbida y A es el área de la superficie cubierta por el receptor. Una frecuencia típica de trabajo es 10 MHz. Con este método se pueden detectar 10-12 gramos.

Fig. 4. Esquema de un sensor piezoeléctrico.

Aplicaciones

� Empleando enzimas

Detección y cuantificación de organofosfatos: se emplea la enzima colinesterasa, la cual forma compuestos con los derivados organofosfatados, permitiendo su detección en fase gaseosa. El aumento de peso sobre el cristal se debe a los compuestos formados.

� Empleando agentes inmunológicos

Detección y cuantificación de bacterias:

� La variación de masa se produce por el acoplamiento antígeno-anticuerpo.

� Inmovilizando el anticuerpo anti-Candida para la bacteria Candida albicans, se pueden medir concentraciones entre 106 y 5.108 bact/ml.

Cuantificación de Digoxina

� Se inmoviliza anti-Digoxina sobre el cristal de cuarzo.

� Se coloca el sensor en el ambiente con el antígeno.

� Se deja secar el sensor con el complejo antígeno-anticuerpo.

� Se mide frecuencia en fase gaseosa.



� Se obtiene una relación lineal entre concentración de Digoxina y frecuencia entre 100 y 800 ng/ml.

4. Transductores fotométricos

Se basan en la medición de la variación de las propiedades ópticas de un medio o un receptor inmovilizado. La luz puede atravesar, reflejarse o emitirse del material analizado.

Las fibras ópticas pueden usarse para construir biosensores. La luz entre una muestra y una fuente o detector se transporta a lo largo del interior de las fibras siguiendo los principios de reflexión total. La luz se propaga a lo largo de la fibra en diferentes modos, de acuerdo a un ángulo de incidencia dado.

La reflexión total en una fibra nunca es perfecta y por lo tanto algo de radiación electromagnética penetra la cubierta de la fibra. Esto se llama ondas evanescentes, y pueden usarse para detectar variaciones de las propiedades ópticas de películas químicas y biológicas que se colocan alrededor de la fibra.

Comúnmente el material (reactivo) que cambia sus propiedades ópticas (absorción, fluorescencia, y luminiscencia) es inmovilizado en la punta o alrededor de una fibra óptica.

Absorción de luz

El detector mide la reducción de la intensidad de la luz de la fuente. Esta reducción es causada por un producto absorbente que proviene de la reacción entre la sustancia inmovilizada y el analito. Generalmente se utilizan ondas de longitud de onda monocromática, y los rayos, incidente y emitido, tienen la misma longitud de onda.

Como se muestra en la Fig. 5, se basan en el recubrimiento de la punta de una fibra óptica con un indicador coloreado incorporado a una matriz polimérica. Se emplean en medidores de pH.

Fig. 5. Esquema de un sensor óptico.

Fluorescencia

La longitud de onda de la emisión fluorescente es diferente de la longitud de onda de la onda de excitación, y una sola fibra es suficiente para transportar la radiación de excitación y emisión. También se usa una sola fibra para medir fluorescencia, que ocurre cuando un compuesto absorbe en la misma región espectral que la emisión presente.

Es muy sensible y detecta muy bajas concentraciones. Se emplean indicadores fluorescentes inmovilizados en la punta de una fibra. Un cambio de pH provoca un cambio en la fluorescencia del indicador. Se emplea luz láser para iluminar la punta.

Bio o Quimioluminiscencia

La Bioluminiscencia está asociada a la emisión de luz de organismos vivos como las luciérnagas. Básicamente, una reacción es catalizada por la luciferasa y libera un compuesto en su estado excitado, que emite luz cuando vuelve al estado de reposo. Se emplea para cuantificar ATP o procesos que usen ATP como cofactor.



La Quimioluminiscencia proviene de reacciones químicas, en las que ocurre una oxidación que involucra oxígeno molecular, o peróxido de hidrógeno (H2O2). Estos sensores sirven para medir H2O2 .

IIIIII.. TTIIPPOOSS DDEE BBIIOOSSEENNSSOORREESS

Los biosensores pueden clasificarse de acuerdo al tipo de bioreceptor o del transductor usado. En este caso están clasificados por tipo de bioreceptor porque este componente es quien determina la acción primaria del biosensor.

1. Biosensores de enzima

Un biosensor de enzima es la combinación de un transductor y una capa delgada enzimática, que se usa normalmente para medir concentración de un sustrato. La reacción enzimática transforma el sustrato en un producto de reacción que el transductor puede detectar. La concentración de una sustancia se mide según cómo afecte su presencia a la velocidad de reacción enzimática.

Principios de operación

En la Fig. 6 se presenta un biosensor de enzima. La superficie sensible del transductor está en contacto con una capa enzimática, y se asume que no hay transferencia de masa a través de esta interfase. La superficie externa de la capa enzimática está inmersa en una solución que contiene el sustrato bajo estudio. El sustrato migra hacia el interior de la capa y se convierte en productos de reacción cuando reacciona con la enzima inmovilizada. Para alcanzar un rápido equilibrio de concentración la membrana enzimática debe ser tan delgada como sea posible. La solución debe agitarse para asegurar un suministro constante de sustrato. En resumen, los diferentes pasos son:

1. Transporte del sustrato desde el seno de la solución hacia la capa enzimática.

2. Difusión del sustrato en esta capa, acompañado por la transformación enzimática del sustrato en productos de reacción.

3. Migración del producto hacia el transductor.

4. Conversión de la concentración del producto en esta superficie en una señal eléctrica por el transductor.

Fig. 6. Representación esquemática de la difusión de un sustrato S

y su producto P en una capa enzimática sobre un transductor.

Los biosensores basados en enzimas pueden formarse usando principios de transducción electroquímicos, ópticos, térmicos o gravimétricos. Los basados en principios electroquímicos se denominan electrodos de enzima y miden la formación de un producto o el consumo de un sustrato, si el producto o sustrato es electroactivo.



El principio amperométrico se ha usado extensamente en electrodos de enzima en los cuales se mide el consumo de oxígeno o la formación de peróxido de hidrógeno con un electrodo polarográfico. Por ejemplo, la glucosa se oxida por la reacción enzimática de la glucosa oxidasa (GOD) según:

222cos OHtatoGluconolacOaGlu GOD + →+

Tanto el O2 como sustrato y H2O2 como producto pueden ser detectados. El electrodo de glucosa consiste de un electrodo polarográfico con una capa de GOD inmovilizada cubierta por una membrana permeable a glucosa, como se muestra en la Fig. 7. La concentración de glucosa se mide por el cambio de la corriente del electrodo de oxígeno o del electrodo de peróxido. Cuando se emplea medición de oxígeno, se necesita la operación diferencial de dos electrodos de oxígeno, con o sin GOD, en cambio la producción de peróxido de hidrógeno puede medirse con un solo electrodo por lo cual, se utiliza esta técnica más frecuentemente.

Fig. 7. Ejemplo de un electrodo de glucosa polarográfico.

Los electrodos de enzima también se forman por electrodos ión selectivo (ISE) y transistores de efecto de campo de ión selectivo (ISFET), ambos basados en el principio potenciométrico. A estos sensores se los denomina ENFET (Fig. 8). Consisten en un ISE o ISFET cubiertos por una capa de enzima inmovilizada y una membrana protectora. En los electrodos de enzima potenciométricos, se mide el producto de las reacciones enzimáticas. Por ejemplo, la hidrolización de urea es catalizada por la ureasa,

−++ + →++ 342 22 HCONHHOHUrea Ureasa

y luego NH3 se forma como:

OHNHOHNH 234 +→+ −+

Según estas reacciones la urea puede medirse a través de un electrodo de NH3. También hay otros electrodos potenciométricos para medir aminoácidos, penicilina, etc.

Fig. 8. Esquema de un ENFET. Las enzimas se inmovilizan en 2.



El principio termométrico también se utiliza para mediciones en algunos electrodos de enzima debido a que las reacciones enzimáticas siempre producen calor en un rango de 20 a 100 kJ mol-4. La cantidad de sustancia puede estimarse del calor producido. Inyectando una muestra estabilizada a una temperatura en una pequeña columna con enzimas inmovilizadas con una velocidad de flujo constante, puede medirse el calor producido como la diferencia entre las terminales de entrada y salida de la columna. Las sustancias típicas que se analizan por principios termométricos son etanol, glucosa, lactato, ácido oxálico, penicilina, sucrosa, y urea. Un termistor recubierto con una enzima inmovilizada puede ser un biosensor simple y se llama termistor unido a enzima.

La mayoría de los biosensores usados en medicina son biosensores de enzima debido a su especificidad, fácil implementación, y por la disponibilidad comercial de enzimas y su correspondiente transductor. El uso in vivo requiere la resolución de problemas de biocompatibilidad, especialmente aquellos referidos al depósito de fibrina y plaquetas en la membrana enzimática.

Entre las aplicaciones se encuentra el sensor de GOD para determinar glucosa en sangre y orina para el diagnóstico de diabetes. Otros biosensores también son capaces de medir metabolitos en un medio biológico. Los electrodos de urea y creatinina pueden controlar funciones renales; el electrodo de colesterol se usa para la detección y prevención de arteriosclerosis; el electrodo de acetilcolina puede monitorear los neurotransmisores relacionados a la transmisión química en la sinapsis; y el electrodo de lactato puede evaluar esfuerzo muscular. También hay enzimas con actividad antitumoral, cicatrizante y con otras acciones terapéuticas. Por ejemplo, la L-asparaginasa se utiliza en el tratamiento de leucemias y cánceres diseminados que requieren asparragina para desarrollarse. Se ha diseñado un hemodializador de fibra hueca que contiene asparaginasa inmovilizada. La tripsina o la colagenasa se utilizan para eliminar los tejidos muertos de heridas, quemaduras, úlceras, etc.; para acelerar el crecimiento de nuevos tejidos e injertos de piel, y también para inhibir el crecimiento de algunos microorganismos contaminantes. Este tipo de enzimas se pueden inmovilizar en celulosas o fibras que formarán parte del tejido de apósitos y vendas.

2. Inmunosensores

Los sensores inmunológicos o biosensores reconocen el acoplamiento entre un antígeno y un anticuerpo. El antígeno (Ag) y el anticuerpo (Ab) forman un complejo antígeno-anticuerpo (AgAb),

Ab + Ag ↔ AgAb

donde puede definirse una constante K porque la reacción es constante y reversible en el equilibrio. K es la constante de afinidad,

]][[

][

gb

gb

AA

AAK =

Cuando se introduce Ag y Ab se mantiene constante, la cantidad de Ag introducida se determina por el incremento de AgAb. Si el anticuerpo Ab se inmoviliza y fija en la superficie del sensor, como se muestra en la Fig. 9, la formación de AgAb causará un cambio en potencial de electrodo [3], o de la masa o de las propiedades ópticas, que pueden ser detectados directamente con una variedad de transductores [2].

La detección potenciométrica de la reacción antígeno-anticuerpo se demostró en un estudio en el cual se inmovilizó gonadotropina coriónica humana (hCG), o un anticuerpo contra hCG, en un alambre de titanio, y se observaron los cambios de potencial cuando se agregó el anticuerpo o antígeno correspondiente. Para detectar este cambio se utilizan transistores de efecto de campo ión selectivo llamados IMFET.

Pueden formarse inmunosensores altamente sensibles utilizando reacciones enzimáticas, en los cuales se fija una cantidad de antígeno marcado con una enzima. Como se muestra en la Fig. 9, antígenos marcados o no, se unen con anticuerpos inmovilizados. Después de remover los antígenos libre, la actividad enzimática se mide introduciendo un sustrato y detectando el cambio del producto a través de alguna técnica adecuada.

Los inmunosensores tienen un gran potencial en medicina debido a la especificidad de las reacciones inmunológicas. Estos biosensores se usan para medir drogas como theophylline (alcaloide que se extrae del te), y para determinar la hormona HCG para el diagnóstico de embarazo, alfa-fetoproteína para la identificación de cáncer, y el antígeno de superficie de hepatitis B.



Fig. 9. Inmunosensores de detección gravimétrica, electroquímica y óptica.

Estos biosensores no pueden usarse in vivo porque la amplificación enzimática involucrada requiere la adición de un sustrato para la operación del sensor. Además, la formación del complejo anticuerpo-antígeno es lenta y requiere un gran número de pasos.

La definición de inmunosensores corresponde a un biosensor ideal. Sin embargo, en la práctica la mayor parte de los dispositivos no cumplen alguno de los requisitos. Por ejemplo, gran parte de los inmunosensores desarrollados no dan una respuesta directa ante la presencia del analito; precisan de una señal secundaria producida por un marcador radiactivo, una enzima, un compuesto fluorescente o electroactivo, etcétera. Son los denominados inmunosensores indirectos. Por otro lado, gran número de inmunosensores no trabajan en condiciones de total reversibilidad, son difíciles de miniaturizar o no presentan la configuración electrónica adecuada para ser utilizados in-situ masivamente.

Los distintos inmunosensores pueden ser clasificados en función de la naturaleza física del transductor. De este modo existen inmunosensores electroquímicos, ópticos, piezoeléctricos, termométricos o magnéticos. Los tres primeros son los más desarrollados.



3. Biosensores microbianos

Los sensores microbianos surgen de la combinación de un microorganismo con un transductor capaz de detectar el metabolito involucrado. Los microorganismos poseen sistemas enzimáticos que son los que dan la selectividad. Los microorganismos se inmovilizan generalmente en geles o usando membranas de diálisis. Los electrodos potenciométricos y amperométricos son útiles porque tienen una membrana hidrofóbica en la cual se insertan los microorganismos (entre esta membrana y la membrana de diálisis).

Las ventajas que presentan frente a los electrodos de enzimas aisladas son:

- Los sensores microbianos son menos sensibles a inhibirse por solutos y más tolerantes en ambientes de pH subóptimo.

- Tienen mayor tiempo de vida que los electrodos de enzimas.

- Más baratos (porque la enzima no necesita aislarse).

- Mantienen las enzimas en su ambiente natural evitando los problemas de regeneración de cofactores.

Por otro lado la construcción de estos biosensores presenta algunos problemas:

- Son inapropiados para mediciones in vivo y, en ambientes biológicos complejos.

- El gran número de enzimas presente en los microorganismos puede hacer bastante difícil las interpretaciones analíticas.

- El crecimiento microbacterial incrementa el tiempo de respuesta del sensor porque varía con el espesor de la capa activa y el coeficiente de difusión del sustrato, el cual cambia durante la operación del biosensor.

Estos biosensores pueden clasificarse como biosensores de medición de respiración o de metabolitos. Como se muestra en la Fig. 10 (a) los sensores de medición de respiración consisten de microorganismos aeróbicos inmovilizados y un electrodo de oxígeno. Cuando un sustrato, que puede ser metabolizado por el microorganismo, se encuentra en una solución saturada de oxígeno, ocurre una reacción metabólica por el consumo de oxígeno disuelto, entonces puede medirse el sustrato por la disminución de la tensión de oxígeno. A través de estos biosensores pueden medirse muchas sustancias como glucosa, azúcares, ácido acético, amonio, y alcoholes. También puede medirse la demanda bioquímica de oxígeno (BOD).

En la Fig. 10 (b) se muestra un sensor microbiano de medición de metabolitos. Consiste de microorganismos inmovilizados y un sensor que detecta el metabolito producido por la reacción catalizada por ese microorganismo. Usando distintos tipos de sensores de gases e iones, pueden medirse muchas sustancias detectando los diferentes metabolitos. Por ejemplo, el electrodo de celda utilizado para detectar H2 para medir ácido fórmico, el electrodo de CO2 para ácido glutámico y lisina, y el electrodo de pH para céfalosporina y ácido nicotínico.

Algunas bacterias exhiben luminiscencia. Si se inmovilizan estas bacterias y se combinan con un fotodetector, se pueden medir sustancias que afecten la bioluminiscencia detectando el cambio en la luminiscencia con un sensor llamado biosensor fotomicrobiano. Algunas sustancias como la glucosa incrementan la luminiscencia, mientras que otras como el cromo, el mercurio, etc.

Existen los sensores híbridos que son la combinación de un biosensor microbiano y una membrana con enzimas inmovilizadas. Por ejemplo, el biosensor de urea se forma combinando un membrana de ureasa y un sensor microbiano de NH3 usando bacterias que causan nitración. Este sensor es superior al potenciométrico de amonio en el sentido de que la interferencia iónica o compuestos volátiles como aminas es menos común.

También se han propuesto sensores para detectar cambios químicos mutagénicos. Como la mutagenecidad se correlaciona con la carcinogenicidad, se espera usar este tipo de biosensores para monitorear carcinógenos.



Fig. 10. Sensores microbianos (a) medición de respiración y (b) medición metabólica.



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[1] Apunte de Transductores Biomédicos de la Maestría en Bioingeniería de la FACET - UNT.

[2] Tran Minh C. (1993). Biosensors, 217p. Ed. Chapman and Hall, London, UK.

[3] Togawa T., Tamura T., Oberg A. P. (1997). Chemical Measurement. Chapter 7 in Biomedical Transducers and Instruments, 366p. Ed. CRC Press, Boca Raton, Florida.

[4] Bergveld P. (1985). The Development and Application of FET-based Biosensors. Biosensors 2, 15-33. Elsevier Applied Science Publishers Ltd, England.

[5] Sensores para todos. Página en www.cienciadigital.net

[6] Arroyo M. (1998). Inmovilización de Enzimas. Fundamentos, Métodos y Aplicaciones. Ars Pharmaceutica, 39:2; 23-39.

[7] López Gil M.A., Ortega Ortiz F. (2002). Inmunosensores: herramientas analíticas con un gran potencial de futuro. Pdf en www.schironia.com

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