cultivo de virus en huevos embrionados

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS(Universidad del Perú, Decana de América)

Facultad de Ciencias BiológicasEAP: Microbiología y Parasitología.

CULTIVO DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS

Mesa 3 Grupo2.

Profesores: Dra. Egma Mayta Huatuco. Blg. Enrique Mamani Zapana.

Integrantes: Arone Ricardo. Espinoza Guerrero Cindy Larraín Loayza Katherine Lobatón Yraita Katherine Palma Villanueva Julio Rivera Ballón Isabel Romaní Bazán Cesar

2013


INTRODUCCIÓN

Se han utilizado huevos embrionados para cultivar virus durante más de15 años. El

cultivo de virus gripal en huevo embrionado fue empleado por primera vez por Burnet en

1935, demostrando que el embrión de pollo es un medio muy sensible para el aislamiento de

estos virus, siendo además un medio estéril y poco costoso.

Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos en varias cavidades del huevo

fecundado, o en el propio embrión en desarrollo. También se emplearon huevos de pato y de

ganso para cultivar ciertos virus, pues estos animales tienen un periodo de incubación más

prolongado que el pollo; pero como regla, sigue usándose huevo de gallina de 6 a 8 días de

incubación aproximadamente.

Los virus sólo pueden multiplicarse en determinadas partes del embrión; por

consiguiente, se deben inyectar en la región apropiada, dependiendo del virus que se esta

estudiando. La infección puede producir una lesión tisular local conocida como pústula, cuyo

aspecto, a menudo, es característico del virus de la viruela.

En el caso del virus de la viruela, se inocula en la membrana corioalantoidea del huevo

embrionado de gallina en 8 a 9 días, para poder observar las lesiones o “pústulas” que se

forman sobredicha membrana. Estos huevos embrionados se han utilizados como el huésped

natural de crecimiento de los virus de propagación y caracterización de los virus aviares y para

la producción de vacunas virales.

Las lesiones que presentan los embriones por los virus Herpes y Poxvirus son

principalmente en la membrana. Presencia de áreas focales (pústulas) engrosadas con necrosis

o un engrosamiento generalizado de la membrana.

Este método ofrece diversas ventajas ya que son fértiles, no tienen funciones

inmunológicas desarrolladas, no son costosas, son accesibles y no requieren para su manejo de

tanta destreza, tales como el mantenimiento y reproducción de cultivos.

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OBJETIVOS:

Conocer y aplicar correctamente los métodos adecuados para realizar inoculaciones de

virus en embriones aviares.

Cuantificar las pústulas en los huevos embrionados inyectados con virus de viruela

aviar.

MATERIALES:

Material Biológico

Virus de Viruela aviar.

Huevos embrionados de gallina de 9 a 11 días.

Material de Laboratorio

Ovoscopio.

Tijera Quirúrgica.

Agua Destilada.

Punzones de acero o aguja para perforar.

Agujas Hipodérmicas.

Placas Petri amplias.

Recipiente de descarte.

Marcador.

Cinta adhesiva.

Alcohol de 70˚ o alcohol yodado.

Tubos de goma.

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PROCEDIMIENTO

I. Titulación del virus de viruela aviar

Fig 1. La inoculación del Virus Aviar realizo en la cámara 5 (cavidad corioalantoidea)

Preparación de las diluciones del virus

Inoculación en la membrana

corioalantoidea

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ORGANOGRAMA DE INOCULACIÓN DE VIRUS AVIAR

II. Lectura del virus de viruela aviar

Preparación de la falsa cámara

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III. Fórmula:

La finalidad es determinar las unidades formadoras de pústulas o placas (UFP)

UFP=numerode pustulas x FDVolumen (UFPml )

RESULTADOS

Después de 6 días, se procedió a extraer una membrana que se encuentra directamente debajo de la cascar del huevo llamada membrana corioalantodea. Se tomaron en cuenta los resultados de los Grupos 1 y 2. Las membranas extraídas, presentaron formaciones de pústulas de colores rojizas en la vena principal y en sus ramificaciones, donde se visualizaron de mejor manera en el estereoscopio, tal como se muestra en la Fig 2 y 3.

Fig 2. Las flechas muestran la formación de pústulas debido a que el virus de New Castle, forma este tipo de efecto citopatico del gupo 1.

Fig 3. Las flechas muestran la formación de pústulas debido a que el virus de New Castle, forma este tipo de efecto citopatico del gupo 2.

El grupo 1 determino mayor número de pústulas (P = 388, 100%) en una concentración 10-2, dando como resultado las unidades formadoras de pústulas (UFP/ml) un total de 388x103

y un menor numero de pústulas (P = 35, 9.02%) en una concentración de 10 -7, dando como resultado UFP/ml un total de 35x108.

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Con respecto a los controles, no se pido determinar la cantidad de pústulas en el control positivo (0.1ml de virus), debido que el huevo inoculado, se presencio un gran desarrollo del feto (p), tal como se puede observar la tabla 1.

Tabla 1. Numero de pústulas y unidades formadoras de pústulas (UFP/ml) del grupo 1.

Dilución Controles

Concentración 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 + -Numero de pústulas (P)

p 388 p 150 78 p 35 p p -

UFP/ml - 388x103 - 150x1

0578×106

35×108 - - -

p = pollo

El grupo 2 determino mayor número de pústulas (P = 27, 100%) en una concentración 10-1, dando como resultado las unidades formadoras de pústulas (UFP/ml) un total de 27x102 y un menor numero de pústulas (P = 8) en una concentración de 10 -6, dando como resultado UFP/ml un total de 8x107. Con respecto a los controles, no se pido determinar la cantidad de pústulas en el control positivo, debido que el huevo inoculado, se presencio un gran desarrollo del feto (p) y el control negativo no hubo presencia de pústulas, tal como se esperaba, véase en la tabla 2.

Tabla 2. Numero de pústulas y unidades formadoras de pústulas (UFP/ml) del grupo 2.

Dilución Controles

Concentración 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 + -Numero de pústulas (P)

27 21 15 12 10 8 p p p -

UFP/ml 27x102

21x103

15x104

12x105 106 8x107 - - - -

p = pollo

Grafica 1. Cuerva de dosis-respuesta donde muestra porcentaje del número de pústulas vs el factor de dilución del grupo 1.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En la disección del los huevos embrionados, se mostro que no todos los huevos se encontraban al 8 – 9 de incubación, ya que algunos se encontró embriones desarrollados.

Hubo diferencias significativas en el número de pústulas halladas en la membrana corioalantoidea de los huevos embrionados después de 6 días de inoculación del virus de la viruela. En el grupo se encontró mayor cantidad de pústulas (p=388) a diferencia del grupo 2 (p=27). Esta diferencia significativa, hace suponer que en el grupo 2, no se realizo una buena inoculación del virus a la membrana corioalantoidea o la dilución del virus, era baja a diferencia del grupo2.

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No se pudo hacer un análisis de la Dosis de Infección de Huevos Embrionacion (DIE50), debido que los controles positivos del grupo 1 y 2, no se puedo hacer el conteo de pústulas por la presencia del embrión desarrollado ya que esto origina que la cámara corioalantoidea no sea visible.

En la práctica se deseo hacer un análisis de la DIE50, pero debido a la mala manipulación de las diluciones del Virus de la viruela y al no saber exactamente los días de embrionacion de los huevos de gallina, los datos obtenidos por los grupos 1 y 2, no fueron suficientes para obtener los cálculos.

CONCLUSIÓN

Para poder determinar la dosis de infección de huevo embrionados (DIE50), se debe de contar con todos huevos embrionados 8 a 9, ya que en esos días, la cámara coriolantoidea es visible. Es las pruebas, se puedo observar que algunos presentaban fetos de pollo desarrollados, haciendo que la cámara a este nivel ya haya desaparecido.

Gracias a las diluciones seriadas de virus de la gripe aviar en huevos embrionados de gallina, controlando los días después de la inoculación, se puede determinar la DIE50, realizando tabla y graficas, relacionando el número de pústulas con la dilución correspondiente.

En necesario hacer una buena inoculación del virus y las diluciones de este, ya que si fuese lo contrario, no se obtendría resultados de visualización de pústulas o la cantidad de pústulas disminuirían considerablemente.

BIBLIOGRAFÍA

ACTON, J. (1967) Virología. Edit. Interamericana. México D.F. MADIGAN, M. y J. PARKER (1997) Brock Microbiología de losMicroorganismos. 8º Edic.

Edit. Mc Graw Hill. México D.F. PRESCOTT L., J. HARLEY, D. KLEIN (1999). Microbiología. 4º Edic. Edit. Mc Graw Hill

Mexico D.F Mancipe L. Cultivos celulares como alternativa para el aislamiento y la producción de

biológicos contra el Virus de Influenza- 2011. http://www.slideshare.net/fabulosanoemi/embrion-de-pollo

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http://www.slideshare.net/fabulosanoemi/embrion-de-pollo

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