UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE INGENIERIA PESQUERA

DEPARTEMENTO ACADÉMICO DE ACUICULTURA

INFORME DE PRACTICA:

CULTIVO DE UNA MICROALGA (Dunaliella SP) MEDIANTE LA TÉCNICA DE LAMASIFICACION

CURSO :

ACUICULTURA I

PIURA − PERU

INTRODUCCION

Son llamadas microalgas a una gran cantidad de especies que constituyen el fitoplancton que abarca desdeorganismos autótrofos hasta microflagelados y microciliados auxótrofos.

Su posición taxonómica ha sido de gran polémica entre botánicos y zoólogos, como ejemplo podemosmencionar el grupo de los dinoflagelados, conocidos por unos como microalgas y por otros comoprotozoarios.

Estas especies aportan un alto contenido nutricional para peces, crustáceos y moluscos, además de ofrecerfacilidades de manejo en sistemas de cultivo tanto en laboratorio como en producción a gran escala con finescomerciales.

Debido a esto es necesario cultivar los diversos tipos de microalgas dándoles las condiciones yenriqueciéndoles con los nutrientes necesarios para darle mayor calidad a nuestros cultivos hidrobiologicos.

CULTIVO DE UNA MICROALGA MEDIANTE LA TÉCNICA DE LA MASIFICACION

DUNALIELLA SP

1.− DESCRIBA DETALLADAMENTE LA COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVOGUILLARD

TABLA DEL MEDIO DE GUILLARD F/2 (J. STEIN, 1979)

Nutrientes Mayores Solución Primaria

NaNO3 7.5

NaH2PO4.H2O 0.5

NH4Cl 2.65

Na2SIO3.9N2O 3

% w/v

% w/v

% w/v

% w/v

1

(calentar para disolver)

Usar 1 ml de éstas soluciones por litro de agua de mar, para preparar el medio F/2.

Sugerencia: preparar el NaNO3 junto con NaH2PO4 . H2O en 100 ml

Metales Traza Solución Primaria

CuSO4.5H2O

ZnSO4.7 H2O

ZnCl2

CoCl2.6H2O

MnCl2.4H2O

Na2MnO4.2H2O

0.98 % w/v

2.2 % w/v

1.05 % w/v

1.0 % w/v

18 % w/v

0.63 % w/v

Es conveniente hacer las soluciones primarias en forma individual, y con una concentración menor de 106mas concentrada que en el medio F/12

Solución Primaria De Metales Traza

Con Secuestrante Férrico (Cloruro Férrico): Disolver 5g del secuestrante férrico en 900 ml de aguadestilada y añadir 1 ml de cada una de las soluciones primarias de metales traza preparados anteriormente;aforar a un litro y asegurar que el pH quede cerca de 4.5. use 1 ml de esta solución por cada litro de agua demar para hacer el medio de cultivo. Agua de mar filtrada (5�, 10�, etc.) y de ser posible irradiada con UV

•

Con EDTA y Cloruro Férrico (FeCl.6H2O): disuelva 3.15 g de FeCl.6H2O ó 4.36 de EDTA (Na2) en900 ml de agua destilada, agregue 1 ml de cada una de las soluciones stock primarias de metales traza yafore a 1 litro, asegure un pH de 2.0

•

Use 1 ml de esta solución por litro de agua de mar para preparar el medio f/2

Solución Primaria De Vitaminas

Solución primarias de Biotina: se prepara a partir de cristales de Bl, disolver 10 mg de Biotina en 96ml de agua destilada. Haga esta solución ligeramente ácida para ser autoclavada y manténgase en uncongelador.

•

Solución de Vitamina B12: A partir de Cyanocobalamina U.S. de 100 mg/ml solución inyectable.Tomar 1 ml y aforarlo en 100 ml de agua destilada. La solución se acidifica para ser autoclavada y secongela.

•

Tomar 1ml de la solución primaria de Biotina y 0.1 ml de la solución stock primaria de B12, aforar a 100 mlcon agua destilada y añadir 20 mg de Tiamina HCl.

Se pueden preparar ampolletas de 2,5 ó 10 ml y almacenarlas estériles (acidificas) en el congelador.

Use ½ ml de esta solución por cada litro de agua de mar para preparar el medio f/12

Preparación del Buffer Tris

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Tome 50 g de tris y disuélvase en 200 ml de agua destilada y ajuste el pH a 7.2 en HCl. Use de 1 a 5ml porlitro de medio antes de la autoclave, ajustando el pH a 7.4 (recomendado usar 1 ml por litro cuando el pH delmedio es 7.9 − 8.2)

TABLA DEL MEDIO DE CULTIVO (AGUA DULCE)

(Guillard, In: Stein, 1979)

Guillard comunicación personal a J. Steinn, 1973. Handbook of phycological methods, Culture Methods andGrowth Measurements. Cambridge at the University Press: 448 pp

Macronutrientes:•

CaCl2.H2O 36.76 g/l• MgSO4.7H2O 36.97 g/l• NaHCO3 12.60 g/l• K2HPO4 8.71 g/l• NaNO3 85.01 g/l• Na2SiO3.9H2O 28.42 g/l•

De esta solución rotulada como a se obtiene 1 ml y se le adiciona a 1 litro de agua esterilizada.

Micronutrientes:• Na2EDTA 4.36 g/l◊ FeCl3.6H2O 3.15 g/l◊ CuSO4.5H2O 0.01 g/l◊ ZnSO4.7H2O 0.022 g/l◊ CoCl2.6H2O 0.01 g/l◊ MnCl2.4H2O 0.18 g/l◊ Na2MoO4.2H2O 0.006 g/l◊

Vitaminas:• Thiamine. HCl 0.1 mg/l♦ Biotin 0.5 g/l♦ Cyanocobalamina 0.5 g/l♦

De esta solución rotulada como c, se obtiene 1 ml y se adiciona a 1 litro de agua esterilizada

Tris:• Tris (Hydroxymethyl) − Aminomethano 50 g./200 ml H2O destilada♦

(Cuando el cultivo se encuentra axénico el tris puede reemplazarse por Glycylaglycine). De estasolución rotulada como d, obtener 2 ml y adicionar al litro de agua esterilizada que se esta preparandoen cultivo, se debe hacer ajuste de pH a 7.2 con HCl cuidadosamente para no obtener el pH ácido.

Solución Básica de Nutrientes

NaNo 75 mg♦ Po4H2NaH2O 5 mg♦ SiO2Na29H2O 15 − 30 mg♦

Solución de Metales Traza

Na2EDTA 4.36 mg.♦ Cl3FeGH2O 3.15 mg♦ So4CuSH2O 0.01 mg♦

3

So4Zn7H2O 0.022 mg♦ Cl2Mn4H2O 0.018 mg♦ MoO2Na22H2O 0.006 mg♦ Cl2Co6H2O 0.01 mg♦

Solución de Vitaminas

Cianolobalamina (B12) 0.5 mg♦ Tiamina Mc (B1) 0.1 mg♦ Biotina (vit. M) 0.5 mg♦

2. DESCRIBA PUNTUALMENTE TODO EL SISTEMA DE ACONDICIONAMIENTOREALIZADO EN EL CULTIVO DE MICROALGAS.

Para el cultivo de la microalga Dunaliella sp y para las demás microalgas, se llevo a cabo unacondicionamiento muy cuidadoso, dado que cualquier negligencia cometida en elacondicionamiento podría ocasionar el fracaso de nuestros cultivos.

Materiales

♦

Biotero♦ Fluorescente♦ Termómetro♦ Inóculo o cepa♦ Aireador♦ 1 pali globo♦ Cocina eléctrica♦ Botellas de vidrio y plástico de 500 ml, 1500 ml y 3000 ml♦ Sustancias Madres: Nitrógeno y Fósforo♦ Agua de mar esterilizada♦ Pipetas♦ Fiolas♦

En El Biotero

Este inicialmente presentaba el inoculo o cepa de donde se extraería las muestras para elcultivo, y que posteriormente albergaría a todos los cultivos de las microalgas a cultivar.

Acondicionamiento Químico

Desinfección.− se llevo a cabo en las botellas a utilizar que fueron de vidrio y plástico. Lasbotellas de vidrio y de plástico fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio o lejía, detergentes,las cuales fueron necesarias colocarles un tapón hecho de algodón para evitar el ingreso demicroorganismos.

Esterilización.− ésta se llevo a cabo en el agua de mar a usar, para esterilizarla solo eranecesario dejar que el agua haga un pequeño burbujeo, sin dejarlo que ebullicione debido a quese precipitarían los fosfatos y las sales minerales, si esto sucedía, era necesario volver aesterilizar una nueva muestra de agua.

Acondicionamiento Físico

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En el interior del biotero se acondiciono un fluorescente el cual estaba iluminado las 24 horasdel día, con el propósito de dar energía e iluminación a los cultivos para realizar la fotosíntesis.

También se coloco un termómetro para poder llevar el control diario de la temperatura.

Fue necesario obtener un aireador o agitador, el cual al final de la manguera del aireador se lecoloco un pali globo para que pueda tener las condiciones necesarias de aireación a los cultivos,de la misma manera evitar la sedimentación de las microalgas.

3.− ¿CÓMO SE HA LOGRADO CONTROLAR LA CONTAMINACIÓN DE SU CULTIVO?

Se logro controlar la contaminación del cultivo de Dunaliella sp, debido a las siguientes razones:

El medio de cultivo que se uso fue el medio de cultivo Guillard.♦ Para cada botella de cada masificación se colocó un tapón de algodón el cual evitaba elingreso de microorganismos, solamente se permitía el paso de la manguera del aireador.

♦

Las botellas fueron desinfectadas con Hipoclorito de Sodio o lejía, con detergentes,alcohol.

♦

Al momento de realizar la masificación, la persona que manipulaba los cultivos teníaque estar en buen estado de salud, así como evitar los estornudos, evitar el habla, evitarel acercamiento del inóculo con la cara o boca.

♦

Las pipeta y la fiola debían estar desinfectadas♦ El agua de mar a usar para las masificaciones debían de estar completamente estériles.♦ Durante las 24 horas del día el cultivo permanecía en el interior del biotero, el cualsolamente se sacaba para llevar a cabo la siguiente masificación.

♦

4.− ¿CUÁL HA SIDO EL EFECTO DE LA TEMPERATURA REGISTRADA DURANTE ELEXPERIMENTO, SOBRE EL DESARROLLO DE CULTIVO DE LA MICROALGA?

1er Experimento

Se realizó un primer experimento el cual se dejaron los cultivos en la parte externa dellaboratorio, para lo cual se llevo a cabo los mismos procedimientos de cultivo, usando la mismatécnica.

Estos cultivos fueron depositados en el interior de una tolda para darle mayor temperatura,también se les coloco fluorescentes a medio metro de distancia de los cultivos, pero se notodiferentes cambios de temperaturas muy bruscos que variaban de 24ºC a 32ºC, y comoconsecuencia ocasiono la decoloración de las microalgas, de un color verde pálido a un colortransparente en solo pocos días ocasionando el colapso y fracaso de los cultivos por lo que se viola necesidad de volver a cultivar pero esta vez se tuvo un mayor control de temperatura debidoque los cultivos fueron colocados en el laboratorio en el interior de un biotero.

2do Experimento en el Laboratorio

Durante el tiempo que duro el 2do experimento, la temperatura ha sido un factor físico muyimportante para el desarrollo de la microalga, debido que su efecto ha sido satisfactorio, ya quese mantuvo dentro del rango óptimo para el desarrollo de la microalga cultivada.

La temperatura registrada se mantenía en el rango de 25 − 27 ºC, el cual permitió que lasmicroalgas se reproducieran satisfactoriamente, en el transcurso de los días se noto el cambio dela coloración de verde pálida a otra coloración verde oscura. El cual indicaba que el cultivomarchaba en buenas condiciones.

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Esta temperatura se dio gracias a la iluminación de los fluorescentes colocados en el interior delbiotero.

5.− DESCRIBA DIARIAMENTE EL DESARROLLO DEL CULTIVO (PUNTUALICE LAVARIACIÓN DEL COLOR ) DESPUÉS DE CADA MASIFICACIÓN.

MASIFICACIÓNES DE Dunaliella SP

1ERA MASIFICACION A 500 ml (10/11/2004)

1 ml de Nitrógeno para 500 ml de agua de mar♦ 1 ml de Fósforo para 500 ml de agua de mar♦ 160 ml del inóculo de Dunaliella sp♦ 350 ml de agua de mar♦

DíasTemperaturas

9:00 a.m. − 11:00a.m.

4:00 p.m. − 6:00p.m.

10/11/2004 26 ºC 27 ºC

11/11/2004 25 ºC 27 ºC

12/12/2004 26 ºC 26.5 ºC

15/11/2004 26 ºC 26.5 ºC

16/11/2004 25.5 ºC 26 ºC

17/11/2004 26 ºC 27 ºCCuando se llevo a cabo la primera masificación se noto que el color era verde pálido, y a medidaque iban pasando los días se observaba que la coloración de las microalgas de nuestra especieDunaliella sp. iba tomando la coloración verde mas intenso y al mismo tiempo se notaba laevaporación del agua.

2 MASIFICACION 1500 ml (17/11/2004)

2 ml de Nitrógeno para 1000 ml de agua de mar♦ 2 ml de Fósforo para 1000 ml de agua de mar♦ Se evaporo 20 ml de agua por lo que se contó con 490 ml del inóculo de Dunaliella sp dela primera masificación

♦

1000 ml de agua de mar♦

Días

Temperaturas

9:00 a.m. − 11:00 a.m.

4:00 p.m. − 6:00 p.m.

17/11/2004

26 ºC

27 ºC

6

18/11/2004

25 ºC

27 ºC

19/12/2004

26 ºC

−−−

22/11/2004

26 ºC

−−−

23/11/2004

25.5 ºC

26 ºC

24/11/2004

27 ºC

27 ºC

3 MASIFICACION 3000 ml (24/11/2004)

3 ml de Nitrógeno para 1500 ml de agua de mar♦ 3 ml de Fósforo para 1500 ml de agua de mar♦ Se evaporo 55 ml de agua por lo que se contó con 1435 ml del inóculo de Dunaliella sp dela primera masificación

♦

1500 ml de agua de mar♦

DíasTemperaturas

9:00 a.m. − 11:00a.m.

4:00 p.m. − 6:00p.m.

24/11/2004 26 ºC 27 ºC

25/11/2004 26 ºC 27 ºC

26/12/2004 26 ºC −−−

29/11/2004 26 ºC −−−

30/11/2004 26 ºC 26 ºC

01/12/2004 26 ºC 27 ºC

02/12/2004 26 ºC 26.5 ºC

03/12/2004 26 ºC 27 ºC

06/12/2004 26 ºC 27 ºC

07/12/2004 26 ºC 27 ºC

7

08/12/2004 26 ºC 27 ºCPorcentaje de Evaporación de agua en las Masificaciones

1era Masificación (500 ml)

De los 510 ml de la 1ra masificación se evaporo 10 ml de agua quedando 490 ml de agua,entonces tenemos

510 ml −−−−−−−−−−−−−−−−−−−100 %

490 ml −−−−−−−−−−−−−−−−−−− x

x = 96 %, entonces se evaporo el 4% del total de agua

2da Masificación (1500 ml)

490 ml + 1000 ml de agua = 1490 ml de agua

De los 1490 ml de la 2da masificación se evaporo 55 ml de agua quedando 1435 ml de agua,entonces tenemos

1490 ml −−−−−−−−−−−−−−−−−−−100 %

1435 ml −−−−−−−−−−−−−−−−−−− x

x = 96.31 %, entonces se evaporo el 3.69% del total de agua

3ra Masificación (3000 ml)

1435 ml + 1500 ml de agua = 2935 ml de agua

De los 2935 ml de la 2da masificación se evaporo 105 ml de agua quedando 1435 ml de agua,entonces tenemos

2935 ml −−−−−−−−−−−−−−−−−−−100 %

2830 ml −−−−−−−−−−−−−−−−−−− x

x = 96.42 %, entonces se evaporo el 3.58% del total de agua

CONCLUSIONES GENERALES

El cambio de color es un factor determinante del progreso del cultivo, a mayorcoloración verde, la Dunaliella sp se esta desarrollando en mejores condicionesambientales.

♦

La temperatura debe de ser estable, no debe de existir cambios bruscos de temperatura,ya que esto podría ser mortal para las microalgas

♦

Cuando se da un acondicionamiento adecuado y se evita la contaminación, el cultivoprogresa grandemente.

♦

Se recomienda trabajar en laboratorio, siendo mejor colocar los medios de cultivo en elinterior de un bioterio, controlando la temperatura constantemente

♦

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Se recomienda que la persona que manipulea las masificaciones no debe de estarenferma, ni acercar las cepas y cultivos cerca de la cara o boca debido a losmicroorganismos que poseemos y que podrían contaminar el cultivo

♦

Para evitar la contaminación se debe tener como principio general la desinfección de losmateriales a usar como botellas, fiolas, pipetas, etc; asi como la esterilización del agua demar para el caso de la Dunaliella sp

♦

DISCUSIONES

A mayor volumen de masificación se obtendrá menores cantidades de evaporación deagua.

♦

No se debe de hacer hervir el agua porque si esto sucede el agua quedará inactiva parala masificación.

♦

Cuando se llevo a cabo el primer experimento colocando los medios de cultivos en laparte exterior del laboratorio, resulto la muerte total de las microalgas debido a que nose pudo tener un control de la temperatura.

♦

No se logro determinar la absorvancia y tramitancia debido que el laboratorio principalno se encontraba en las condiciones básicas para llevar a cabo estas determinaciones,además no se podía tener acceso a los equipos necesarios.

♦

Al finalizar las practicas de masificaciones, se logro obtener volúmenes mayores deinóculos, los cuales deben de ser aprovechados y no dejarlos morir.

♦

BIBLIOGRAFÍA

http://www.fao.org/docrep/field/003/AB473S/AB473S02.htm#tbl13♦ http://www.cibnor.mx/colecciones/malgas/eintro.php♦ www.google.com♦ www.yahoo.com♦ http://www.fao.org/docrep/field/003/AB473S/AB473S00.htm♦ Manual de producción de algas; SENAIM♦ Gilbert Bernabé (1988) Acuicultura. Vol. 1, 681 pág♦

ANEXOS

1. CONSIDERACIONES GENERALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS

Muchos factores contribuyen para el desarrollo óptimo de los cultivos de microalgas, algunos de éstosafectan las características del crecimiento.

Los recipientes de cultivo más comúnmente usados son de materiales no tóxicos como las cajas dePetri, matraces Erlenmeyer, matraces Ferenback, carboys o garrafas, etc., adecuados para cultivos delaboratorio. Para cultivos a gran escala los recipientes de plástico, madera y concreto son los másrecomendables, incluyendo los estanques rústicos en áreas rurales son los sistemas más económicos.

En cultivos masivos la aireación es un factor muy importante para la homogenización de losnutrientes y para evitar la sedimentación de las microalgas. Las diatomeas suelen acumularse enlugares donde el agua no se mezcla, esto también depende de la forma del recipiente de cultivo quecuando no es adecuado retarda el crecimiento.

Otro factor importante es la penetración de la luz en el cultivo; en los cultivos masivos la profundidades tan grande que la intensidad de la luz insidente no es suficiente para la fotosíntesis, hasta el fondodel tanque. En los cultivos masivos a la intemperie la penetración de la luz es más efectiva, pero sedebe reducir la intensidad de la luz fuerte, cubriendo estos estanques con una malla. En cultivos agran escala es recomendable la inyección de CO2 (0.5%) para contribuir al proceso fotosintético.

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El crecimiento y la división celular son afectados por la intensidad de la luz y el fotoperíodo (horas deiluminación y oscuridad) en relación también a la temperatura, por ejemplo en Diatomeas a 20°C y1,000 lux se obtiene un crecimiento favorable.

Tabla Nº 1: Características De Algunas De Las Especies De Algas Unicelulares Utilizadas EnAcuacultura (Coll−Morales J., 1983)

GENERO CICLOTEMPERATURAOPTIMA

DIAMETROMEDIO

Phaeodactylum(diatomea)

10 h 25°C 10.4�

Skeletonema(diatomea)

13.1 h 18°C >20�

Dunaliella(cloroficea)

24 h 16°C 17.8�

Chlorella (cloroficea)7.7 h 25°C 5�

Tetraselmis(cloroficea)

18 h 18°C 18.4�

Monochrysis(crisoficea)

15.3 h 20−25°C 10�

Isochrysis(crisoficea)

30.2 h 20°C 10.2�

Estas especies se han utilizado en acuicultura marina dados su valor nutritivo y digestibilidad, ademásde su capacidad para crecer en cultivos masivos. La duración del ciclo celular como losrequerimientos de temperatura son susceptibles de variación mediante selección de variedades.

TABLA Nº 2 Requerimientos PRINCIPALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS

REQUERIMIENTOSCOMPUESTOSQUIMICOS

VALORES

Físicos

Luz2,000 −4,000 lux

Temperatura15 −22°C

Salinidad 0.37

pH 7 − 9

Redox

Nutritivos C CO2CO3" g/100 ml

O, H O2H2O g/100 ml

NN2NH4+NO3

g/100 ml

P PO4" g/100 ml

S SO4" g/100 ml

Na, K, Ca, Mg Sales g/100 ml

Fe, Zn, Mn, B, Br,Si

Salesmg/100ml

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Cu, Co, Cl, I, Sr,Rb, Al, et

Sales�g/100ml

VitaminasB12, tiamina,biotina

�g/100ml

En esta tabla Nº 1 se exponen los requerimientos principales de los cultivos de microalgas y susvalores aproximados. En cada caso habrá que estudiar los requerimientos particulares de la especie yde la variedad que se vaya a cultivar en las condiciones concretas de cultivo que se van a utilizar, porlo que estos datos son sólo orientación (Kinne, 1979).

En la tabla Nº 2 se muestran las características de algunas de las especies de microalgas unicelularesutilizadas en acuacultura para la nutrición de moluscos y crustáceos.

Además del control de los parámetros antes mencionados es necesario considerar que para elestablecimiento de un sistema de producción de alimento vivo es importante el dominio de lastécnicas de aislamiento, purificación y mantenimiento de cepas, así como el conocimiento de lafisiología, ciclo de vida, bioquímica, etc. de las especies para determinar su factibilidad de cultivo ysobre todo su contenido nutricional para poder llevarse a niveles masivos de producción para finesacuaculturales. La Tabla 8 muestra algunos de los principales requerimientos de los cultivos demicroalgas.

2. MEDIOS DE CULTIVO

Se han desarrollado diferentes medios para el cultivo de microalgas que van desde las fórmulas paraenriquecer el agua de mar natural, hasta el uso de medios artificiales que permitan resultadosconstantes en contraste con los resultados tan variables que brinda el uso del agua de mar natural queentre otros factores depende del lugar donde se colecta ésta, y el tiempo de almacenamiento de lamisma.

Los medios artificiales se usan principalmente para fines experimentales, ya que como se hamencionado, brinda resultados constantes, aunque existen algunas especies que no crecen en mediosartificiales por factores desconocidos que afectan su crecimiento, las principales fórmulas utilizadasvan desde el agua de Miguel, que data de 1910, desarrollada por Allen−Nelson; el medio deEnd−Schereiber de 1934, hasta fórmulas específicas para familias como la fórmula del LaboratorioHaskins de Nueva York para diatomeas, Provasoli et al., 1975; Matthiesen & Thorner, 1966;McIachlan, 1973; Guillard F., 1973; Droop, 1975, 1979; Schoene, 1982, etc. Las principalesformulaciones de los medios de cultivo, tanto de mantenimiento de cepas como de producción masiva(minerales, enriquecidos y orgánicos), se describen desde la Tabla 9 hasta la Tabla 16.

El fitoplancton se desarrolla y multiplica en relación de las condiciones fisicoquímicas del medio. Entérminos generales son los macronutrientes o factores limitantes del crecimiento el carbono,Nitrógeno, Fósforo, Silicio, Magnesio, Potasio y Calcio, que se requieren en cantidades relativamentegrandes, mientras que los llamados micronutrientes (Fierro, Manganeso, Cobre, Zinc, Sodio,Molibdeno, Cloro y Cobalto) se necesitan en menores cantidades.

Existen otros medios que incluyen en su composición sustancias orgánicas (vitaminas, aminoácidos)necesarios para aquellas especies de microalgas Auxótrofas, es decir que no sintetizan por medio de lafotosíntesis este tipo de compuestos y resultan factores que pueden limitar su crecimiento; tal es elcaso de Platimonas, Chrysophytas y algunas Bacillariophyceas.

3. TECNICAS DE AISLAMIENTO Y PURIFICACION

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Muchos métodos se han desarrollado para obtener cultivos monoespecíficos (de una sola especie) yaxénicos (libres de contaminantes). A continuación se brinda una breve descripción de algunos de losprincipales métodos que se utilizan para aislar y purificar microalgas (O. Umebayashi, 1975) (Fig. 1).

1) Aislamiento

Pipeteo capilar: Se utiliza para separar microalgas mayores de 10�, mediante una pipeta construídacon un tubo capilar, a través del microscopio óptico se pesca las células y se separan en pequeñasgotas de nutrientes colocados alrededor de una Caja de Petri o en portaobjetos escabados.

Rayado de Placas de Agar: Se transfieren pequeñas gotas de plancton con una asa de siembra,extendiendo por estrías (rompiendo un poco el agar). Este agar se prepara con una solución nutritivapara microalgas y con una relación de 1−1.5% w/v de agar disuelto en el medio nutritivo, se incuba laplaca bajo iluminación a 18−20°. De este primer crecimiento se transfiere a tubos con agar inclinadosembrando por estrías o bien, se transfiere a medios líquidos en subcultivos sucesivos para supurificación, de tal manera que en cada dilución se reduzca el número de organismos en una gota, esrecomendable combinar la técnica de diluciones con la de transferencia en placa de agar o tuboinclinado para obtener cultivos clonales (de una sola colonia o célula) y poder establecer el cultivomonoespecífico. Después de 10 días, pequeñas colonias aparecen sobre la superficie del agar, que sepueden transferir mediante el Método de Hocking o de la micropipeta a medios líquidos.

2) Purificación

Como ya se mencionó al describir las técnicas de aislamiento, estas mismas nos permiten purificar elcultivo a través de las resiembras clonales sucesivas, pero además es recomendable entre otrosmétodos el uso de antibióticos para eliminar otros microorganismos, generalmente de tipo bacterianoque estén contaminando el cultivo de microalgas de nuestro interés. En el inciso 5 de este mismocapítulo correspondiente a Métodos de Esterilización se amplian las alternativas.

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