Universidad Nacional Autónoma

De México

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza

Cromatografía

Extracción y separación de pigmentos vegetales

Laboratorio de Ciencia Básica III

Gizeh Cecilia Rayón Picazo

Ma. Eugenia Ibarra Hernández

23 Octubre 2011 Grupo: 3304

Resumen:

Objetivo:

Extraer el pigmento de un producto natural asignado por el profesor haciendo uso de la técnica mas adecuada.

Elegir mediante cromatografía en capa fina el eluyente o mezcla de eluyentes ideales para separar los diferentes pigmentos de un producto natural por cromatografía en columna

Separar por medio de cromatografía en columna los pigmentos vegetales Verificar por cromatografía los pigmentos vegetales pigmentos por cromatografía

en columna Utilizar reveladores físicos y químicos

La practica de cromatografía a aparte de ser laboriosa y cada vez interesante fue en cada paso preocupante para nuestro equipo ya que el primer paso de la extracción nos daba muy poco pigmento tal vez también se debió al que se realizaron pocas extracciónes asi el volumen de nuestro pigmento no era igual que el de los demás, y también cada vez que se quería utilizar este ya había evaporado una considerable cantidad asi que caundo esto pasaba agregábamos cloruro de metileno tal vez esto también pudo haber afectado nuestros resultado en una mínima cantidad pero un factor, en cuanto nuestros resultados la preparación de las cromatoplacas, y cámaras de elución y después la realización de esta encontramos cuatro disolventes que nos podrían ayudar como el Tolueno, Etanol, Cloruro de metileno y por ultimo el cual era el mas seguro el Acetato de etilo y uno mas el Metanol pero al mezclarlos estos no nos daban los mejores resultados así con estas observaciones se realizo la cromatografía en columna con un poco de problemas al prepararla pero mas que nada aprendiendo, así esta además de tardada por lo mismo que metíamos disolvente no muy polar agregando el Tolueno, después Etanol, en este punto apareció el pigmento de la espinaca que fue 1ml. Se empezaba a distinguir el amarillo del verde y en un momento el amarillo bajo mas rápido pero la columna se veía fluorescente después de esto se agrego el acetato de etilo y así bajo mas rápido y se empezó a recuperar los colores desde el amarillo tenue hasta pasa a un verde claro, oscuro y uno mas claro, pero desafortunadamente esto no fue lo mismo en la cromatografía en capa fina ya que ninguno de nuestros pigmentos que se habían obtenido dio ese mismo color.

Introducción:

Cuando queremos saber que compuestos están formados en una sustancia o en un compuesto utilizamos una técnica llamada Cromatografia la cual nos puede auxiliar a descubrir que sustancias hay pero no solo hay un solo tipo o solo podemos aplicar una solo tipo de cromatografía, si no que esta depende de dos cosas ya que en el compuesto hay una fase móvil y una estacionaria la cual nos determinara que tipo de cromatografia estamos hablando. La fase estacionaria como lo dice su propio nombre es aquella que se queda inmóvil, que puede ser de estado solido o liquido, y la móvil puede ser gas o liquido, pero claro los tipos de cromatografía a partir de qlo quees a son las fases pueden ser o son vairas como la cromatografía de partición, cromatografía de intercambio ionico.

Ahora todos estos tipos de cromatografía se llevan a cabo en distintos medios y claro los que se conocer como mayor frecuencia son la cromatografía en capa fina esta técnica es mas utilizada ya que es barata y fácil solo se utilizan placas de vidrio o lo que comúnmente se utiliza son los portaobjetos, ahora otra que conocemos es la cromatografía en columna para las dos se utiliza eluyentes y adsorbentes para que estos actúen sobre las sustancias que se quieran separar.

Ahora en cuanto a la cromatografía en capa fina lo que sucederá es que se pondrá el concentrado en las placas y mediante disolventes y eluyentes, los compuestos de este se descompondrán en la placa ya que por medio de colores se pueda identificar sus compuestos y con ayuda de reveladores podamos distinguirlos de mejor manera, ahora en la cromatografía en columna se prepara de distinta forma una columna con eluyentes donde pasara el concentrado y con tubos de ensayo se recolectaran los colores que vayan saliendo y así se identificar.

Hay otra forma también que es la medición del Rf, donde se mide el inicio del disolvente y el inicio del concentrado y hasta donde acaban cada uno y también esta la medición del Rx pero esto es para sustancias estándar.

Esta técnica se usa para varios campos como en física, biología y sobre todo en la industria.

Por medio de la una extracción solido- liquido se tomaran muestras de los pigmentos de la espinaca y haciendo uso de la técnica de cromatografía en capa fina y en columna se determinaran los pigmentos caroteno (rosa), xantofilia (amarillo), clorofila a, clorofila b. (verde).

Material: Equipo:

1 Matraz Erlenmeyer Parilla de calentamiento1 Matraz Bola Balanza analítica1 Vidrio de Reloj Rota vaporAlgodón Reóstato1 Embudo Butcher Recirculador2 Soportes Universales Lámpara de Luz UltravioletaPinzas de tres dedos con nuez1 Refrigerante recto2 Clips verdes1 Embudo de cuello largo1 Embudo de decantación1 Aro de metal1 Bandeja de plásticoManguerasPapel Filtro28 PortaobjetosAprox. 12 Tubos capilaresPapel aluminio12 Frascos de vidrio (Gerber)1 Bureta de 25ml.1 Pinzas para BuretaVasos de precipitado 25ml. 100ml. 150ml.Frascos de color ámbarFrascos de plástico para residuos11 Pipetas de 10ml.Jeringa o Perilla de succión20 Tubos de ensayo

Instrumento:

TijerasEspátulaAgitadorMechero de Bunsen o EncendedorGradillaRegla

Reactivos:

5g. EspinacaSulfato de SodioHieloAguaSal Na ClGel de sílice para capa fina y columnaAgua destiladaHexanoCiclo hexanoBencenoToluenoCloroformoCloruro de metilenoAcetato de etiloAcetonaEtanolMetanolCloruro de metileno

Procedimiento:

Extracción

Se cortaron unas hojas de espinaca con ayuda de las tijeras y se pesaron 5g. de esta se colocaron en un matraz añadiendo 10ml. De etanol del 95% calentándose a ebullición durante 5 minutos procurando que el disolvente no se evaporara tanto.

Se filtro la mezcla caliente a través de un embudo Buchner sin el vacio se limpio todo el matraz sin dejar ninguna muestra y que se dejara una pequeña masa semisólida así con la espátula se comprimió.

Pasándolo a un matraz Erlenmeyer el extracto, la masa semisólida se volvió a pasar al matraz inicial y ahí se le volvía agregar 10ml. De cloruro de metileno calentándolo a reflujo durante 3 o 4 minutos con suavidad.

Nuevamente se filtro este reflujo y se añadió al otro filtrado anterior, así se hicieron de dos a tres extracciones añadiendo mas cloruro de metileno.

En un embudo de decantación se añadieron unos mililitros de solución saturada de cloruro de sodio y se agito de la forma como indicaba la técnica.

Se coloco un embudo debajo del decantación poniéndole un algodón (1cm) con sulfato de sodio anhidro se agrego la solución salmonera con el extracto y decanto.

Esta solución se guardo en un frasco

Concentración en el Rota vapor

Se realizo una destilación en el rota vapor para la concentración de los pigmentos.

Se monto el aparato y se comenzó el debido procedimiento así hasta ver el concentrado del pigmento y con la temperatura debida.

Cromatografía en capa fina:

Se procuro que el disolvente no se hubiera diluido, al pasar esto se agrego algunas gotas de cloruro de metileno.

Se realizo el procedimiento de el preparado de las placas con su respectivo orden.

Colocando gel de sílice aproximadamente 35g. de esta sustancia y aplico a los portaobjetos cuidadosamente midiendo 1cm. Esto para que quedara un espacio para su manejo.

Se dejaron secar ya aplicada la gel de manera uniforme así manteniéndolas verticalmente para su uso ya secas.

De la sustancia o el concentrado se extrajo con una micro pipeta anteriormente realizada con un tubo capilar y un encendedor, se coloco una gota aproximadamente de 1-2mm.

Esta placa se coloco verticalmente en un ángulo de 80° en una cámara cromatografica o cámara de elución previamente preparada, conteniendo el disolvente que se quería experimentar o comprobar, en esta misma tenia un papel filtro pero dejando una línea para ver la placa al introducirla, se tenia que tener cuidado de que el disolvente no tocara la mancha del concentrado.

Se tapaba el frasco y se observaba la ascensión del disolvente hasta alcanzar la línea marcada anteriormente y sacándola y marcando donde llego el disolvente asi se dejo secar.

Se observo la placa y mientras estaba en la cámara de elución se observaba las manchas coloridas o se examinaron con LUV. U otro revelador

En el ultimo paso se midieron el inicio y final de las manchas para calcular el Rf. Y visualizar el pigmento que contenía.

Cromatografía en columna

Se sujeto la columna se coloca en un pinza de Mohr

Se puso una bola de algodón en la parte inferior de esta

Se agrego una capa de 3 cm de sal

Se pesaron 10 g. de alúmina y se mezclaron con Hexano y se vertieron en la columna y se dejaba que el liquido saliera

Esta tenia que llenarse con una velocidad uniforme y que no se secara

Se saco el exceso de disolvente hasta que quedo la alumna pero dejandoun pco de disolvente

Ya lista se vertió 1ml. Del pigmento sobre la columna y se dejo que bajara agregándole mas disolvente o la mezcla de disolventes,

Se tomaron los que son los eluidos incoloros y se reunió los mas concentrados en los tubos

Diagrama de Bloques

5g. de Espinaca con 10m. de etanol

Calentar a ebullcion y filtrar

Reflujo con cloruro de metileno

Filtrar y realizar 3 veces reflujo seguido

de otra filtracion y agregar cloruro de

metileno en cada una

Realizar una decantacion con NaCl.

saturada y anh. NaS

Rotavapor Cromatografi en Capa Fina

Se elige el disolvente y mezcla de disolventes

Cromatografia en columna

Se recolectan los pigmentos en lso tubos de ensayo

Se realiza una segunda

Cromatografia en Capa fina

Se obsservan y anotan todos los

resultados y cambios

Resultados:

Hexano: Ciclo hexano Benceno

7min. 13min. 12min.

Rf=0.56.5

=0.076 Rf=0.86.5

=0. 1230 Rf=5.36.5

=0.815

Tolueno Cloroformo Cloruro de metileno

10min 9min. 6min.

Rf=5.46.3

=0.8571 Rf=56=0.833 Rf=

5.46.3

=0.8571

Acetato de etilo Acetona Etanol

7min. 6min. 6min.

Rf=5.26.5

=0.8 Rf=5

6.3=0.793 Rf=

4.25.3

=0.7924

Metanol

6min.

Rf=2

6.4=0.3125

Análisis de Resultados:

En primer lugar nuestra cromatografía en capa fina a pesar de lo que fue la mínima cantidad del pigmento de la espinaca pudimos desarrollar toda la practica con la cantidad que extrajimos, ahora en la cromatografía en capa fina como se puede ver en las imágenes el disolvente que mas nos favorecía para elegirlo era el acetato de etilo esto por que es el que mas corrió los colores desde un amarillo verde, corriendo amarillos, y luego verdes, esto nos daba una buena idea de que teníamos dos colores y que este disolvente los pudo separar, el otro que también era convincente el cloruro de metileno ya que igual separaba los verdes y amarillos aunque el Etanol era una buena elección solo que solamente separaba los verdes y no tanto los amarillos, asi que también se eligio el Metanol esto con la ayuda de la profesora, después de las observaciones que teníamos de las pruebas se realizo la mezcla de dos compuestos y en total dos mezclas de disolventes una de Metanol mas Cloruro de metileno 1:4, otra de Acetato de etilo mas Etanol 4:1, pero estas no daban una buena separación de colores simplemente se llevaban el pigmento asi que se decidió realizar las mismas mezclas solo que la concentración invertirla Etanol mas Acetato de etilo 1:4 y Metanol mas Cloruro de metileno 4:1 asi estas dieron un mejor resultado pero sin embargo no tan convincente como la prueba de los disolventes puros asi que se decidió proseguir a la cromatografía en columna asi al prepararla y quitarle el aire que se quedaba en la sal y en la gel para que esta fuera uniforme se decidió poner el pigmento agregar Tolueno sin embargo este no bajaba decidió poner Etanol el pigmento empezó a bajar un amarillo exactamente este siguió bajando pero en un momento se desapareció y este empezó a verse flourescente pensando que nuestra columna estaba mal, vimos que si era un flourescente asi que decidimos tomar una muestra de este asi esperando que bajara mas, no pasaba nada, y con le tiempo sobre nosotros se decidió agregar el disolvente que mas nos quedaba el Acetato de etilo se vertió y no tardo tnato en que empezó a separarse un amarillo y apareció luego el verde bajo y se tomaron las demás muestras como desde un verde limón a uno oscuro hasta un verde tenue.

Asi con nuestras muestras de pigmentos proseguimos a preparar las cromatoplacas, y con la curiosidad de el tubo que contenía un fluorescente se observo bajo la lámpara de luz ultravioleta y si este era fluorescente, así sin explicación de que lo causo, decidimos hacer una cromatografía de este pero desafortunadamente este no aparecía nada ni debajo de nuestra lámpara, tal vez el tiempo que se quedo ya que duraron las muestras cuatro días y esto nos afecto ya que algunas muestras se habían secado, tal vez un factor por el cual al

realizar las 13 cromatografías en capa fina, ninguna nos dio un corrido de algún verde o amarillo.

Todos los resultados pudieron habernos dado una idea errónea por el factor de el tiempo que se tardo en realizar la practica, las condiciones de que se quedaban y los disolventes se evaporaban como era su naturaleza y mas le damos una razón a la cantidad de pigmento que resulto.

Conclusiones:

Para la practica de cromatografía podemos concluir que la hipótesis no fue acertada para nuestro equipo y nuestra experimentación solo pudimos comprobar que estaban presentes los pigmentos por los colores que obtuvimos en la cromatografía en columna, el verde de la clorofila y el amarillo de la xantofilia, además de eso sirvió de mucho realizarla para conocer la técnica por que en cuanto a la elección del disolvente fue muy certera.

Sugerencias:

En realidad no hay muchas sugerencias ya que la practica se lleva tiempo pero mas es el tiempo que el alumno se tarda al ser su primera experiencia con esta técnica, podría ser mas rápida con el asunto de la columna ya que también nos sirvió mucho como realizar una columna pero podría estar presente la columna ya echa pro algún motivo no se haya realizado de manera correcta y haya influido.

Bibliografía:

. Brewster Ray Q. Curso Practico Quimica Organica

España: Alhambre 1979 Fieser L.F. Experimentos de Quimica Organica. España: España Reverte 1967. R.Kesse, R. K. Muller T.P. Toube. Metodos de Laboratorio para Quimica Organica,

1° ed. Mexico: Noriega, Limusa 1990. Dominguez S. Xorge Alejandro. Quimica Organica Experimental. 1°ed. México:

LImusa 1982. Abbott David and Andrew R.S. Introducción a la Cromatografia 3°ed. España:

Alhambra 1973 Durst H. Dupont and Gakel George W. Quimica Organica Experimental 1°ed.

España: Reverte 1985 Pavia Donald L. Qumica Organica Experimental. 1°ed. España: EUNIBAR

(Editorial Universitaria de Barcelona) 1978.