Contribución y avances del laboratorio en el diagnóstico y seguimiento de Leucemias Agudas

Inmunofenotipo en Leucemias Agudas

Dra. Evangelina Agriello

Bahía Blanca - Argentina

MÉDULA ÓSEA NORMAL

MÉDULA ÓSEA NORMAL

CD45-PERCP

MÉDULA ÓSEA NORMAL

CD45-PERCP

PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS

CD34+

CD45-PERCP

CD34+: 1,1±0,6 %

PRECURSORES HEMATOPOYÉTICOS CD34+ COMPROMISO HACIA LOS DISTINTOS LINAJES

CELULARES

HSC

A.Orfao.ESCCA 2012

Estrategia de procesamiento de muestras para diagnóstico hematológico

Punción Aspiración

con Aguja Fina médula ósea sangre periférica LCR

HEPARINA

EDTA

EDTA

TRANSFIX

entidades clínico biológicas

THE UPDATED WHO CLASSIFICATION OF HEMATOLOGICAL MALIGNANCIES

The 2016 revision to the World Health Organization

classification of myeloid neoplasms and acute leukemia Daniel A. Arber,1 Attilio Orazi,2 Robert Hasserjian,3 J¨urgen Thiele,4 Michael J. Borowitz,5

Michelle M. Le Beau,6Clara D. Bloomfield,7 Mario Cazzola,8 and James W. Vardiman9

BLOOD, 19 MAY 2016 VOLUME 127, NUMBER 20

CITOMETRIA DE FLUJO

PANEL DE SCREENING

PANEL AMPLIADO DE IDENTIFICACION

ESTUDIO CITOGENÉTICO

CELULAS LISADAS FIJADAS CELULAS DEL CITOGENETICO

BIOLOGIA MOLECULAR ARN TRIZOL(alto costo)

ADN

Punción Aspiración

con Aguja Fina médula ósea sangre periférica LCR

HEPARINA

EDTA

TRANSFIX

EDTA

FISH

SIEMPRE!!! 20 METAFASES!!

CITOMETRIA DE FLUJO PANEL DE SCREENING

PANEL AMPLIADO DE IDENTIFICACION

ESTUDIO CITOGENÉTICO

FISH

BIOLOGIA MOLECULAR p190,p210

FLT3 NPM1

cKit CEBPA

PML RAR

t(9;22)(q34.1;q11.2);BCR-ABL1

t(v;11q23.3);KMT2A

t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6-RUNX1

t(5;14)(q31.1;q32.3) IL3-IGH

t(1;19)(q23;p13.3);TCF3-PBX1

t(8;21)(q22;q22.1);RUNX1-RUNX1T1

inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22);CBFB-MYH11

PML-RARA

t(9;11)(p21.3;q23.3);MLLT3-KMT2A

t(6;9)(p23;q34.1);DEK-NUP214

inv(3)(q21.3q26.2) or t(3;3)(q21.3;q26.2); GATA2,

MECOM

hyperdiploidy

hypodiploidy

Punción Aspiración

con Aguja Fina médula ósea sangre periférica LCR

HEPARINA

EDTA

EDTA

TRANSFIX

ANTICOAGULANTE CITOMETRIA DE FLUJO

FISH CITOGENETICO

BIOLOGIA MOLECULAR

HEPARINA X X X

EDTA X X X

Anticoagulantes para el procesamiento

de cada técnica para diagnóstico hematológico

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma, NOS

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with recurrent genetic abnormalities

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(9;22)(q34.1;q11.2);BCR-ABL1

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(v;11q23.3);KMT2A rearranged

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6-RUNX1

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with hyperdiploidy

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with hypodiploidy

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(5;14)(q31.1;q32.3) IL3-IGH

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(1;19)(q23;p13.3);TCF3-PBX1

Provisional entity: B-lymphoblastic leukemia/lymphoma, BCR-ABL1–like

Provisional entity: B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with iAMP21

T-lymphoblastic leukemia/lymphoma

Provisional entity: Early T-cell precursor lymphoblastic leukemia

Provisional entity: Natural killer (NK) cell lymphoblastic leukemia/lymphoma

Acute leukemias of ambiguous lineage

Acute undifferentiated leukemia

Mixed phenotype acute leukemia (MPAL) with t(9;22)(q34.1;q11.2); BCR-ABL1

MPAL with t(v;11q23.3); KMT2A rearranged

MPAL, B/myeloid, NOS

MPAL, T/myeloid, NOS

2016

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I

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WHO

ESTRATEGIA DE SCREENING 4 colores

BUSQUEDA DE LINAJE DE LA POBLACIÓN PROBLEMA

8 colores!!

Panel de anticuerpos para la LLA de células Precursoras B

t(9;22) BCR-ABL1

Panel de anticuerpos para la LLA de células Precursoras B

t(v;11q23.3);KMT2A rearranged

t(12;21) ETV6-RUNX1

DNA Index

t(v;11q23.3);KMT2A rearranged

t(9;22);BCR-ABL1

t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6-RUNX1

t(1;19);TCF3-PBX1

hyperdiploidy

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma, NOS

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with recurrent genetic abnormalities

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(9;22)(q34.1;q11.2);BCR-ABL1

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(v;11q23.3);KMT2A rearranged

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6-RUNX1

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with hyperdiploidy

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with hypodiploidy

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(5;14)(q31.1;q32.3) IL3-IGH

B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(1;19)(q23;p13.3);TCF3-PBX1

Provisional entity: B-lymphoblastic leukemia/lymphoma, BCR-ABL1–like

Provisional entity: B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with iAMP21

T-lymphoblastic leukemia/lymphoma

Provisional entity: Early T-cell precursor lymphoblastic leukemia

Provisional entity: Natural killer (NK) cell lymphoblastic leukemia/lymphoma

Acute leukemias of ambiguous lineage

Acute undifferentiated leukemia

Mixed phenotype acute leukemia (MPAL) with t(9;22)(q34.1;q11.2); BCR-ABL1

MPAL with t(v;11q23.3); KMT2A rearranged

MPAL, B/myeloid, NOS

MPAL, T/myeloid, NOS

2016

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WHO

V450 V500 FITC PE PerCPC5.5 PECy7 APC APC H7

cyCD3 CD45 nuTdT CD99 CD5 CD10 CD1a smCD3

cyCD3 CD45 CD2 CD117 CD4 CD8 CD7 smCD3

cyCD3 CD45 TcRɣδ TcRαβ CD33 CD56 cyTcRβ smCD3

cyCD3 CD45 CD44 CD13 HLA DR CD45RA CD123 smCD3

Panel de anticuerpos para la LLA T

Enfermedad Mínima Residual EMR

La enfermedad mínima residual (EMR) es la persistencia de una cantidad pequeña de células malignas durante o al finalizar el tratamiento en cantidades indetectables por microscopia óptica.

Acute myeloid leukemia (AML) and related neoplasms

AML with recurrent genetic abnormalities

AML with t(8;21)(q22;q22.1);RUNX1-RUNX1T1

AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22);CBFB-MYH11

APL with PML-RARA

AML with t(9;11)(p21.3;q23.3);MLLT3-KMT2A

AML with t(6;9)(p23;q34.1);DEK-NUP214

AML with inv(3)(q21.3q26.2) or t(3;3)(q21.3;q26.2); GATA2, MECOM

AML (megakaryoblastic) with t(1;22)(p13.3;q13.3);RBM15-MKL1

Provisional entity: AML with BCR-ABL1

AML with mutated NPM1

AML with biallelic mutations of CEBPA

Provisional entity: AML with mutated RUNX1

AML with myelodysplasia-related changes

Therapy-related myeloid neoplasms

AML, NOS

AML with minimal differentiation

AML without maturation

AML with maturation

Acute myelomonocytic leukemia

Acute monoblastic/monocytic leukemia

Pure erythroid leukemia

Acute megakaryoblastic leukemia

Acute basophilic leukemia

Acute panmyelosis with myelofibrosis

Myeloid sarcoma

Myeloid proliferations related to Down syndrome

Transient abnormal myelopoiesis (TAM) Myeloid leukemia associated with Down syndrome

2016

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WHO

Anomalías Inmunofenotípicas por citometría de flujo

Bloqueos de maduración

Expresión antigénica aumentada/disminuida

Infidelidad de linaje

Asincronismo madurativo

Pronóstico?

LMA/SMD PANEL OBJETIVOS GENERALES

IDENTIFICAR

Marcadores pan-presentadores de Ag: HLADR Marcadores células inmaduras: CD34 y CD117 Marcadores poblaciones hematopoyéticas: CD45

Marcadores de las características físicas de las células: FSS/SSC

CUANTIFICAR

Tamaño o grado de infiltración al diagnóstico. Evaluación del tratamiento: EMR

CARACTERIZAR

Marcadores relevantes para establecer PATRONES DE MADURACIÓN:

Granulocítica: CD11b-CD13, CD10-CD16, monocitica:CD14, CD300e, Eritoride:CD36, CD71, CD105

Marcadores relacionados con INFIDELIDAD DE LINEA:CD19,CD7,CD56,CD22

Marcadores relacionados con det aberraciones genotípicas recurrentes:CD15, CD19, CD7,CD56, NG2(7.1)

11b/13/DRAQ5.105

DRAQ5 ->

0 256 512 768 1024

11b/13/DRAQ5.105

DRAQ5 ->

0 256 512 768 1024

11b/13/DRAQ5.105

DRAQ5 ->

0 256 512 768 1024

24%

11b/13/DRAQ5.105

DRAQ5 ->

0 256 512 768 1024

25%

NEUTRÓFILO

EM BASTÃO e

MADURO

MIELOBLASTO

PROMIELÓCITO

MIELÓCITO e

METAMIELÓCITO

Combinaciones de tubos múltiples para clasificación de SMD/LMA según Euroflow

L M A / S M D

L M A

M 7

LINEA NEUTROFILICA

LINEA MONOCITICA

LINEA ERITROIDE

MEGACARIOCITO

EXP ABERRANTE LINFOIDE

LINEA BASOF Y DENDRITICA

103

102

101

BAND/ NEUTROPHIL

METAMYELOCYT MYELOCYTE PROMYELOCYTE MYELOBLAST

CD34

HLA-DR CD117

CD13

CD33

CD11b

CD64

CD65

CD54

CD10

CD35

CD13

MPO

CD15

CD16

Cambios fenotípicos durante la diferenciación neutrofílica normal de la médula ósea

Maduración de neutrófilos en N dimensiones en MO normal APS SEPARADOR AUTOMÉTICO DE POBLACIONES

It is an independent scientific consortium that aims at innovation and standardization of flow cytometric immunophenotyping to further improve and progress diagnostic

patient care

JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907

Citometría de Flujo Multicolor (8 colores) con Estandarización técnica completa

Seteo del instrumento Protocolos de Inmunofenotipage (SOPs) Precise diagnostic panels definition

Desarrollo de Nuevo software: Combinación de multiples tubos: cálculo y vista APS Mapeo de muestras de leucemias de diagnóstico y follow-up contra

templados de “normal/control” muestras

Desarrollo de protocolos Development of 8-color antibody diagnosis, classification and monitoring of hematological malignancies

Paneles diseñados para contester una pregunta clínica específica

JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907

Logros del Consorcio EuroFlow

Our data

Results of the Euroflow QA programme 6th round, on May 2015

CD5 CD19 CD8 T cell CD4 T cell B cell

CD5 CD19 CD8 T cell CD4 T cell B cell

CD19 CD56

Varón de17 años

Muestra remitida:

médula ósea

heparina

(mejor muestra!!!)

+ EDTA

Leucemia Mieloblástica

Aguda

MARCADORES ABERRANTES

ASOCIADOS A LMA CON t(8;21)

RUNX1-RUNK1T1

Leucemia Mieloblástica Aguda . . . con expresión de CD19 y CD56

FISH t(8;21); RUNX1-RUNK1T1

Análisis citogenético

Software Applied Spectral Imaging

46,XY,add(2)(q37)[3],add(7)(q36)[6],t(8;21)(q22;q22)[6], t(9;22)(q34;q11.2)[6],add(12)(p13)[3] [cp 6]

RQ-PCR (sonda Taqman) Según protocolo Leukemia 2003: Gabert, J et al.

Gen control ABL BCRABL p190 BCRABL p210

FISH y RQ PCR: identificación del transcripto

Día 33: Enfermedad Mínima Residual Muestra analizada : médula ósea Detección molecular de BCR ABL p190 en Tiempo Real Método: RQ PCR System (sonda Taqman) Applied Biosystems %BCR ABL: 1,77% Copias de BCRABL p 190: 198 copias Copias de gen control ABL: 11.167 copias Detección de EMR por CFM: panel a 8 colores según EUROFLOW Se detecta 0.2% de células patológicas. Conclusión: enfermedad mínima residual positiva

En resumen

Al diagnóstico, considerar todas las herramientas técnicas para la mejor caracterización clínico biológica

Importante: dialogo!!!! datos clínicos anticoagulantes interpretación de resultados en conjunto

Contextualizar las muestras!!

mo ≠ sp, diagnóstico ≠ seguimiento

EDTA ≠ heparina emr? B o T o M?

Gracias!!!!