Contribución y avances del laboratorio en el diagnóstico y seguimiento de Leucemias Agudas
Inmunofenotipo en Leucemias Agudas
Dra. Evangelina Agriello
Bahía Blanca - Argentina
PRECURSORES HEMATOPOYÉTICOS CD34+ COMPROMISO HACIA LOS DISTINTOS LINAJES
CELULARES
HSC
A.Orfao.ESCCA 2012
Estrategia de procesamiento de muestras para diagnóstico hematológico
Punción Aspiración
con Aguja Fina médula ósea sangre periférica LCR
HEPARINA
EDTA
EDTA
TRANSFIX
entidades clínico biológicas
THE UPDATED WHO CLASSIFICATION OF HEMATOLOGICAL MALIGNANCIES
The 2016 revision to the World Health Organization
classification of myeloid neoplasms and acute leukemia Daniel A. Arber,1 Attilio Orazi,2 Robert Hasserjian,3 J¨urgen Thiele,4 Michael J. Borowitz,5
Michelle M. Le Beau,6Clara D. Bloomfield,7 Mario Cazzola,8 and James W. Vardiman9
BLOOD, 19 MAY 2016 VOLUME 127, NUMBER 20
CITOMETRIA DE FLUJO
PANEL DE SCREENING
PANEL AMPLIADO DE IDENTIFICACION
ESTUDIO CITOGENÉTICO
CELULAS LISADAS FIJADAS CELULAS DEL CITOGENETICO
BIOLOGIA MOLECULAR ARN TRIZOL(alto costo)
ADN
Punción Aspiración
con Aguja Fina médula ósea sangre periférica LCR
HEPARINA
EDTA
TRANSFIX
EDTA
FISH
SIEMPRE!!! 20 METAFASES!!
CITOMETRIA DE FLUJO PANEL DE SCREENING
PANEL AMPLIADO DE IDENTIFICACION
ESTUDIO CITOGENÉTICO
FISH
BIOLOGIA MOLECULAR p190,p210
FLT3 NPM1
cKit CEBPA
PML RAR
t(9;22)(q34.1;q11.2);BCR-ABL1
t(v;11q23.3);KMT2A
t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6-RUNX1
t(5;14)(q31.1;q32.3) IL3-IGH
t(1;19)(q23;p13.3);TCF3-PBX1
t(8;21)(q22;q22.1);RUNX1-RUNX1T1
inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22);CBFB-MYH11
PML-RARA
t(9;11)(p21.3;q23.3);MLLT3-KMT2A
t(6;9)(p23;q34.1);DEK-NUP214
inv(3)(q21.3q26.2) or t(3;3)(q21.3;q26.2); GATA2,
MECOM
hyperdiploidy
hypodiploidy
Punción Aspiración
con Aguja Fina médula ósea sangre periférica LCR
HEPARINA
EDTA
EDTA
TRANSFIX
ANTICOAGULANTE CITOMETRIA DE FLUJO
FISH CITOGENETICO
BIOLOGIA MOLECULAR
HEPARINA X X X
EDTA X X X
Anticoagulantes para el procesamiento
de cada técnica para diagnóstico hematológico
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma, NOS
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with recurrent genetic abnormalities
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(9;22)(q34.1;q11.2);BCR-ABL1
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(v;11q23.3);KMT2A rearranged
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6-RUNX1
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with hyperdiploidy
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with hypodiploidy
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(5;14)(q31.1;q32.3) IL3-IGH
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(1;19)(q23;p13.3);TCF3-PBX1
Provisional entity: B-lymphoblastic leukemia/lymphoma, BCR-ABL1–like
Provisional entity: B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with iAMP21
T-lymphoblastic leukemia/lymphoma
Provisional entity: Early T-cell precursor lymphoblastic leukemia
Provisional entity: Natural killer (NK) cell lymphoblastic leukemia/lymphoma
Acute leukemias of ambiguous lineage
Acute undifferentiated leukemia
Mixed phenotype acute leukemia (MPAL) with t(9;22)(q34.1;q11.2); BCR-ABL1
MPAL with t(v;11q23.3); KMT2A rearranged
MPAL, B/myeloid, NOS
MPAL, T/myeloid, NOS
2016
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WHO
Panel de anticuerpos para la LLA de células Precursoras B
t(v;11q23.3);KMT2A rearranged
t(12;21) ETV6-RUNX1
DNA Index
t(v;11q23.3);KMT2A rearranged
t(9;22);BCR-ABL1
t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6-RUNX1
t(1;19);TCF3-PBX1
hyperdiploidy
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma, NOS
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with recurrent genetic abnormalities
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(9;22)(q34.1;q11.2);BCR-ABL1
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(v;11q23.3);KMT2A rearranged
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6-RUNX1
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with hyperdiploidy
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with hypodiploidy
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(5;14)(q31.1;q32.3) IL3-IGH
B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with t(1;19)(q23;p13.3);TCF3-PBX1
Provisional entity: B-lymphoblastic leukemia/lymphoma, BCR-ABL1–like
Provisional entity: B-lymphoblastic leukemia/lymphoma with iAMP21
T-lymphoblastic leukemia/lymphoma
Provisional entity: Early T-cell precursor lymphoblastic leukemia
Provisional entity: Natural killer (NK) cell lymphoblastic leukemia/lymphoma
Acute leukemias of ambiguous lineage
Acute undifferentiated leukemia
Mixed phenotype acute leukemia (MPAL) with t(9;22)(q34.1;q11.2); BCR-ABL1
MPAL with t(v;11q23.3); KMT2A rearranged
MPAL, B/myeloid, NOS
MPAL, T/myeloid, NOS
2016
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WHO
V450 V500 FITC PE PerCPC5.5 PECy7 APC APC H7
cyCD3 CD45 nuTdT CD99 CD5 CD10 CD1a smCD3
cyCD3 CD45 CD2 CD117 CD4 CD8 CD7 smCD3
cyCD3 CD45 TcRɣδ TcRαβ CD33 CD56 cyTcRβ smCD3
cyCD3 CD45 CD44 CD13 HLA DR CD45RA CD123 smCD3
Panel de anticuerpos para la LLA T
Enfermedad Mínima Residual EMR
La enfermedad mínima residual (EMR) es la persistencia de una cantidad pequeña de células malignas durante o al finalizar el tratamiento en cantidades indetectables por microscopia óptica.
Acute myeloid leukemia (AML) and related neoplasms
AML with recurrent genetic abnormalities
AML with t(8;21)(q22;q22.1);RUNX1-RUNX1T1
AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22);CBFB-MYH11
APL with PML-RARA
AML with t(9;11)(p21.3;q23.3);MLLT3-KMT2A
AML with t(6;9)(p23;q34.1);DEK-NUP214
AML with inv(3)(q21.3q26.2) or t(3;3)(q21.3;q26.2); GATA2, MECOM
AML (megakaryoblastic) with t(1;22)(p13.3;q13.3);RBM15-MKL1
Provisional entity: AML with BCR-ABL1
AML with mutated NPM1
AML with biallelic mutations of CEBPA
Provisional entity: AML with mutated RUNX1
AML with myelodysplasia-related changes
Therapy-related myeloid neoplasms
AML, NOS
AML with minimal differentiation
AML without maturation
AML with maturation
Acute myelomonocytic leukemia
Acute monoblastic/monocytic leukemia
Pure erythroid leukemia
Acute megakaryoblastic leukemia
Acute basophilic leukemia
Acute panmyelosis with myelofibrosis
Myeloid sarcoma
Myeloid proliferations related to Down syndrome
Transient abnormal myelopoiesis (TAM) Myeloid leukemia associated with Down syndrome
2016
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Anomalías Inmunofenotípicas por citometría de flujo
Bloqueos de maduración
Expresión antigénica aumentada/disminuida
Infidelidad de linaje
Asincronismo madurativo
Pronóstico?
LMA/SMD PANEL OBJETIVOS GENERALES
IDENTIFICAR
Marcadores pan-presentadores de Ag: HLADR Marcadores células inmaduras: CD34 y CD117 Marcadores poblaciones hematopoyéticas: CD45
Marcadores de las características físicas de las células: FSS/SSC
CUANTIFICAR
Tamaño o grado de infiltración al diagnóstico. Evaluación del tratamiento: EMR
CARACTERIZAR
Marcadores relevantes para establecer PATRONES DE MADURACIÓN:
Granulocítica: CD11b-CD13, CD10-CD16, monocitica:CD14, CD300e, Eritoride:CD36, CD71, CD105
Marcadores relacionados con INFIDELIDAD DE LINEA:CD19,CD7,CD56,CD22
Marcadores relacionados con det aberraciones genotípicas recurrentes:CD15, CD19, CD7,CD56, NG2(7.1)
11b/13/DRAQ5.105
DRAQ5 ->
0 256 512 768 1024
11b/13/DRAQ5.105
DRAQ5 ->
0 256 512 768 1024
11b/13/DRAQ5.105
DRAQ5 ->
0 256 512 768 1024
24%
11b/13/DRAQ5.105
DRAQ5 ->
0 256 512 768 1024
25%
NEUTRÓFILO
EM BASTÃO e
MADURO
MIELOBLASTO
PROMIELÓCITO
MIELÓCITO e
METAMIELÓCITO
L M A / S M D
L M A
M 7
LINEA NEUTROFILICA
LINEA MONOCITICA
LINEA ERITROIDE
MEGACARIOCITO
EXP ABERRANTE LINFOIDE
LINEA BASOF Y DENDRITICA
103
102
101
BAND/ NEUTROPHIL
METAMYELOCYT MYELOCYTE PROMYELOCYTE MYELOBLAST
CD34
HLA-DR CD117
CD13
CD33
CD11b
CD64
CD65
CD54
CD10
CD35
CD13
MPO
CD15
CD16
Cambios fenotípicos durante la diferenciación neutrofílica normal de la médula ósea
It is an independent scientific consortium that aims at innovation and standardization of flow cytometric immunophenotyping to further improve and progress diagnostic
patient care
JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907
Citometría de Flujo Multicolor (8 colores) con Estandarización técnica completa
Seteo del instrumento Protocolos de Inmunofenotipage (SOPs) Precise diagnostic panels definition
Desarrollo de Nuevo software: Combinación de multiples tubos: cálculo y vista APS Mapeo de muestras de leucemias de diagnóstico y follow-up contra
templados de “normal/control” muestras
Desarrollo de protocolos Development of 8-color antibody diagnosis, classification and monitoring of hematological malignancies
Paneles diseñados para contester una pregunta clínica específica
JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907
Logros del Consorcio EuroFlow
Our data
Results of the Euroflow QA programme 6th round, on May 2015
CD5 CD19 CD8 T cell CD4 T cell B cell
CD5 CD19 CD8 T cell CD4 T cell B cell
CD19 CD56
Varón de17 años
Muestra remitida:
médula ósea
heparina
(mejor muestra!!!)
+ EDTA
Leucemia Mieloblástica
Aguda
MARCADORES ABERRANTES
ASOCIADOS A LMA CON t(8;21)
RUNX1-RUNK1T1
Análisis citogenético
Software Applied Spectral Imaging
46,XY,add(2)(q37)[3],add(7)(q36)[6],t(8;21)(q22;q22)[6], t(9;22)(q34;q11.2)[6],add(12)(p13)[3] [cp 6]
RQ-PCR (sonda Taqman) Según protocolo Leukemia 2003: Gabert, J et al.
Gen control ABL BCRABL p190 BCRABL p210
FISH y RQ PCR: identificación del transcripto
Día 33: Enfermedad Mínima Residual Muestra analizada : médula ósea Detección molecular de BCR ABL p190 en Tiempo Real Método: RQ PCR System (sonda Taqman) Applied Biosystems %BCR ABL: 1,77% Copias de BCRABL p 190: 198 copias Copias de gen control ABL: 11.167 copias Detección de EMR por CFM: panel a 8 colores según EUROFLOW Se detecta 0.2% de células patológicas. Conclusión: enfermedad mínima residual positiva
En resumen
Al diagnóstico, considerar todas las herramientas técnicas para la mejor caracterización clínico biológica
Importante: dialogo!!!! datos clínicos anticoagulantes interpretación de resultados en conjunto
Contextualizar las muestras!!
mo ≠ sp, diagnóstico ≠ seguimiento
EDTA ≠ heparina emr? B o T o M?