contribución a la caracterización biofarmacéutica de un

Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de

Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides

Paula Michelle Sepúlveda Ramos

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Área Curricular de Farmacia

Bogotá, Colombia

2021



Paula Michelle Sepúlveda Ramos

Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias Farmacéuticas

Directora:

DSc. Diana Marcela Aragón Novoa

Codirector:

PhD. Geison Modesti Costa

Línea de Investigación:

Plantas con actividad antidiabética

Grupos de Investigación:

Principios Bioactivos en plantas Medicinales (Universidad Nacional de Colombia)

Grupo de Investigación Fitoquímica Universidad Javeriana (Pontifica Universidad Javeriana)

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Área Curricular de Farmacia

Bogotá, Colombia

2021

A mis padres.

Ustedes son la luz que guía mi camino.

Agradecimientos

Agradezco a la Universidad Nacional de Colombia, la Facultad de Ciencias, y especialmente, al

Departamento de Farmacia, por mi formación como profesional e investigadora.

Gracias a COLCIENCIAS, por la financiación del proyecto “Estudio de la actividad antidiabética

de un extracto nanovehiculizado de hojas de Passiflora ligularis (granadilla)” (Contrato 836 de

2017).

A mi directora, Marcela Aragón, por darme la oportunidad de hacer parte de este proyecto, por

motivarme desde un principio a ir un poco más allá de lo fundamental; a proponer y solucionar.

Por impulsar mayor confianza en mi criterio y capacidades. No pude haber tenido mejor tutora.

A mi codirector, Geison Costa, por su constante disposición a resolver mis dudas, su apoyo y

motivación permanente.

A los profesores Leonardo Castellanos y Freddy Ramos, por ser parte fundamental de mi

formación académico-investigativa. Gracias por sus enseñanzas, apoyo incondicional, y la

confianza depositada en mí desde el pregrado. Por mantener siempre las puertas abiertas del

grupo “Estudio y aprovechamiento de productos naturales marinos y frutas de Colombia”. A

mis marineros eméritos, Luz Adriana, Sandra, Farja, Charlie, Adriana, Diana, Gabriel, Paola y

Juan David, aprender con y de ustedes, hizo la experiencia a diario mucho más feliz, pues las

risas nunca faltaron. A Vane, tu llegada al grupo, y amistad, fue la más inesperada de todas pero

la más oportuna, hubiese sido más difícil culminar la etapa final del posgrado sin tu apoyo. A

los demás marineros, somos una gran familia para nombrarlos a todos, pero una familia al fin

y al cabo.

Al grupo de trabajo del NanoPK Lab, empezando por el profesor Luis Fernando Ospina, gracias

por los consejos y apoyo en la realización de los bioensayos. A mis compañeras, Diana Vásquez,

Diana Rey, Gina, Maria Isabel, y Andrea, porque no hay mejor motivación que ser parte de un

grupo de mujeres inteligentes y perseverantes. Pero especialmente, a Ivonne, por su

conocimiento y ayuda indispensable en el desarrollo de los ensayos de permeabilidad; y a

Sandra, con quien desde un principio formamos el mejor equipo de trabajo, gracias por

enseñarme tanto, motivarme a diario, pero ante todo, por tu amistad.

A mis mejores amigos. Simón, gracias por tu compañía a largo de este proceso, contar con tu

apoyo es siempre motivo de alegría; y a Mateo, compartir la experiencia de la maestría contigo

hizo que el camino fuese aún mejor, porque aprendimos y crecimos juntos.

Finalmente, a mi familia y motor en la vida. Especialmente a mis padres, que son mi mayor

ejemplo a seguir a diario. Gracias por su amor y apoyo totalmente incondicional.

Resumen y Abstract IX

Resumen



Passiflora ligularis, comúnmente conocida como granadilla, es una especie que ha demostrado

resultados prometedores de actividad hipoglicemiante/antidiabética. Con el presente trabajo,

se aplicó la utilidad del Sistema de Clasificación Biofarmacéutica en el estudio de nuevos

principios activos, para caracterizar y evaluar un extracto de hojas de P. ligularis, como matriz

de partida útil en el de diseño y desarrollo de una formulación; y así, contribuir al desarrollo

de un producto fitoterapéutico a partir de las hojas de esta especie.

Inicialmente, se estandarizaron las condiciones de extracción de flavonoides (considerados

como los marcadores activos) a partir de las hojas, mediante extracción asistida por

ultrasonido, para lo cual, previamente se desarrolló y validó una metodología analítica por

UHPLC-DAD. Se evaluó la actividad farmacológica del extracto optimizado según un modelo in

vitro de actividad antiglicante y, en el modelo in vivo de tolerancia a la glucosa en ratones Swiss

ICR. Adicionalmente, se determinó la estabilidad bajo condiciones de estrés, y las

características biofarmacéuticas, solubilidad y permeabilidad intestinal, del extracto

optimizado, en función de los marcadores activos.

De acuerdo con el análisis de superficie de respuesta, las condiciones óptimas de extracción

de flavonoides por ultrasonido fueron, etanol 63%, 70ºC, durante 33 minutos; el extracto

optimizado demostró mayor actividad inhibitoria de la formación de los productos finales de

glicación avanzada, y, mejor actividad anti-hiperglicemiante, que un extracto de las hojas

obtenido por infusión, método de extracción de la medicina tradicional. Por otro lado, se

catalogó el extracto optimizado como prácticamente estable, fotoestable, lábil y muy lábil, bajo

condiciones oxidativas, fotolíticas, de hidrólisis neutra e hidrólisis ácida-básica,

respectivamente.

Por último, se comprendieron algunos de los factores que influencian el proceso de absorción

intestinal de los flavonoides presentes en el extracto, como su alta solubilidad, y baja

permeabilidad en el modelo in situ SPIP (Single Pass Intestinal Perfusion), que permitieron

catalogarlo dentro de la clase III del sistema de clasificación biofarmacéutico (SCB). Con el fin

de evaluar posibles efectos de la matriz vegetal sobre las propiedades biofarmacéuticas de los

marcadores activos, se estudiaron dichas características en el flavonoide mayoritario

(isoquercetina), al ser un componente dentro del extracto o un compuesto puro. En el primer

caso, se clasificó también dentro de la clase III, y en el segundo, como clase II (baja solubilidad-

alta permeabilidad); considerándose la baja solubilidad como uno de los mayores retos a

superar en etapas de investigación y desarrollo

Debido a todo lo anterior, se propone aprovechar el extracto optimizado y caracterizado de

hojas de P. ligularis, aplicando estrategias de tecnología farmacéutica que favorezcan la

permeabilidad de principios activos clase III, para el diseño y desarrollo de un potencial

producto fitoterapéutico, que ayude en el tratamiento de la hiperglicemia y/o diabetes.

Palabras clave: Passiflora, extracción asistida por ultrasonido, SCB, permeabilidad,

solubilidad, diabetes.

Abstract

Contribution to the biopharmaceutical characterization of an extract of leaves of

Passiflora ligularis (granadilla) optimized in flavonoids

Passiflora ligularis, commonly known as granadilla, is a species that has shown promising

results of hypoglycemic/antidiabetic activity. With the present work, the usefulness of the

Biopharmaceutical Classification System in the study of new active principles, was applied to

characterize and evaluate an extract of P. ligularis leaves, as an active multicomponent matrix,

useful in the design and development of a formulation; and thus, contribute to the

development of a herbal medicinal product from the leaves of this species.

Initially, the extraction conditions by ultrasound-assisted extraction of the leaves flavonoids

(considered as active markers) were standardized, for which an analytical methodology was

previously developed and validated by UHPLC-DAD. The pharmacological activity of the

optimized extract was evaluated according to the an in vitro model of antiglycation activity

and, in the in vivo model of glucose tolerance in Swiss ICR mice. Additionally, the stability

under stress conditions, and the biopharmaceutical characteristics, solubility and intestinal

permeability, of the optimized extract were determined, as a function of the active markers.

According to the response surface analysis, the optimal flavonoid extraction conditions by

ultrasound were 63% ethanol, 70 °C, for 33 minutes. The optimized extract showed greater

inhibitory activity on the formation of advanced glycation end products, and better anti-

hyperglycemic activity, than a leaf extract obtained by infusion, an extraction method of

traditional medicine. On the other hand, the optimized extract was classified as practically

stable, photostable, labile and very labile, under oxidative, photolytic, neutral hydrolysis and

acid-base hydrolysis conditions, respectively.

Finally, some of the factors that influence the intestinal absorption process of the flavonoids

present in the extract were understood, such as their high solubility and low permeability in

the SPIP (Single Pass Intestinal Perfusion) in situ model, which allowed it to be classified

within Class III of the Biopharmaceutical Classification System (SCB). In order to evaluate

possible effects of the plant matrix on the biopharmaceutical properties of the active markers,

these characteristics were studied in the major flavonoid (isoquercetin), as a component

within the extract or as a pure compound. In the first case, it was also classified within class

III, and in the second one, as class II (low solubility-high permeability). Low solubility is

considered as one of the greatest challenges to overcome during research and development

stages.

Due to all of the above, it is proposed to use the optimized and characterized extract of P.

ligularis leaves, applying pharmaceutical technology strategies that favor the permeability of

class III active principles, for the design and development of a potential herbal medicinal

product, which helps in the treatment of hyperglycemia and/or diabetes.

Keywords: Passiflora, ultrasound-assisted extraction, SCB, permeability, solubility, diabetes.

Contenido XV

Contenido

Pág.

Resumen IX

Lista de figuras .................................................................................................................................. XVII

Lista de tablas ...................................................................................................................................... XX

Lista de Símbolos y abreviaturas ................................................................................................ XXII

Introducción ............................................................................................................................................ 1

1. Marco Teórico ................................................................................................................................. 5 1.1 Sistema de Clasificación Biofarmacéutica ................................................................................... 5

1.1.1 SCB aplicado a extractos vegetales .................................................................................. 7 1.2 Género Passiflora ..................................................................................................................................... 9

1.2.1 Passiflora ligularis (Granadilla) ...................................................................................... 12

Objetivos 17

2. Desarrollo y validación de metodología analítica para la cuantificación de flavonoides presentes en hojas de P. ligularis ........................................................................... 19

2.1 Metodología............................................................................................................................................. 20 2.1.1 Reactivos y equipos .............................................................................................................. 20 2.1.2 Material vegetal ...................................................................................................................... 20 2.1.3 Extractos analizados ............................................................................................................ 21 2.1.4 Curvas de calibración preparadas ................................................................................. 21

2.2 Resultados y Discusión ...................................................................................................................... 23 2.2.1 Desarrollo de la metodología analítica ....................................................................... 23 2.2.2 Validación de la metodología analítica ....................................................................... 26 2.2.3 Análisis de los flavonoides presentes en el extracto optimizado de hojas de granadilla mediante UHPLC-MS/MS ................................................................................................ 29

2.3 Conclusiones ........................................................................................................................................... 40

3. Obtención de un extracto de hojas de P. ligularis optimizado en flavonoides con actividad hipoglicemiante ................................................................................................................ 41

3.1 Metodología............................................................................................................................................. 41 3.1.1 Material vegetal ...................................................................................................................... 41 3.1.2 Planteamiento del diseño experimental para el proceso de extracción por ultrasonido ................................................................................................................................................... 41 3.1.3 Procedimiento de extracción por ultrasonido......................................................... 42

3.1.4 Ensayo de actividad inhibitoria de la formación de productos finales de glicación avanzada (AGEs)..................................................................................................................... 43 3.1.5 Evaluación in vivo de la actividad hipoglicemiante ............................................... 45 3.1.6 Análisis estadístico ................................................................................................................ 46

3.2 Resultados y Discusión ....................................................................................................................... 47 3.2.1 Determinación del tamaño de partícula del material vegetal a extraer ...... 47 3.2.2 Optimización de flavonoides totales mediante extracción asistida por ultrasonido .................................................................................................................................................... 49 3.2.3 Correlación entre el CFT y la actividad antiglicante de extractos de P. ligularis 61 3.2.4 Evaluación in vivo de la actividad hipoglicemiante de extractos de hojas de Passiflora ligularis ...................................................................................................................................... 66

3.3 Conclusiones ............................................................................................................................................ 68

4. Estabilidad del extracto optimizado de P. ligularis bajo condiciones de estrés ...... 69 4.1 Metodología ............................................................................................................................................. 70

4.1.1 Condiciones de hidrólisis, oxidación y degradación fotolítica ......................... 70 4.2 Resultados y Discusión ....................................................................................................................... 75

4.2.1 Estabilidad bajo condiciones de estrés de hidrólisis neutra ............................. 76 4.2.2 Estabilidad bajo condiciones de estrés de hidrólisis ácida ................................ 78 4.2.3 Estabilidad bajo condiciones de estrés de hidrólisis básica .............................. 80 4.2.4 Estabilidad bajo condiciones de estrés de oxidación ........................................... 82 4.2.5 Estabilidad bajo condiciones de estrés fotolíticas ................................................. 85

4.3 Conclusiones ............................................................................................................................................ 87

5. Caracterización biofarmacéutica del extracto optimizado de P. ligularis ................. 89 5.1 Metodología ............................................................................................................................................. 90

5.1.1 Determinación de la solubilidad ..................................................................................... 90 5.1.2 Determinación de la permeabilidad intestinal mediante el modelo Single Pass Intestinal Perfusion (SPIP) ......................................................................................................... 92 5.1.3 Análisis estadístico ............................................................................................................. 100

5.2 Resultados y discusión .................................................................................................................... 100 5.2.1 Solubilidad de flavonoides totales e isoquercetina en el extracto optimizado .................................................................................................................................................. 100 5.2.2 Evaluación de la permeabilidad de los flavonoides presentes en el extracto optimizado .................................................................................................................................................. 107 5.2.3 Clasificación biofarmacéutica de los flavonoides presentes en el extracto optimizado de P. ligularis .................................................................................................................... 115

5.3 Conclusiones ......................................................................................................................................... 119

6. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................................... 121 6.1 Conclusiones ......................................................................................................................................... 121 6.2 Recomendaciones .............................................................................................................................. 122

A. Anexo: Información suplementaria Capítulo 2 y 3......................................................... 123

B. Anexo: Información suplementaria capítulo 5................................................................ 126

Bibliografía ......................................................................................................................................... 131

Lista de Figuras XVII

Lista de figuras Pág.

Figura 1-1: A. Flor de Passiflora ligularis. B. Fruto granadilla. C. Hojas de Passiflora ligularis

(72). ...................................................................................................................................................................................... 12

Figura 2-1: Perfiles cromatográficos (350 ηm) obtenidos para el extracto de hojas de P.

ligularis tras realizar diferentes modificaciones al método A. Se utilizó la Columna

Phenomenex® Kinetex C18 (100 × 2,1 mm; 2,6 μm) y volumen de inyección 10 μL en todos los

casos..................................................................................................................................................................................... 24

Figura 2-2: Cromatogramas del extracto optimizado de hojas de P. ligularis mediante UHPLC-

MS/MS. A) Cromatograma UV a 350 ηm. B) Cromatograma de iones totales (TIC). Se presenta

con numeración los picos con espectros de absorción característicos de flavonoides; en azul

los flavonoides identificados, y en rojo compuestos fenólicos sin identificar. ................................ 30

Figura 2-3: Esqueletos estructurales de las principales clases de flavonoides. Las flechas

indican las posiciones de O- y C- glicosilaciones más comunes (102). ................................................ 37

Figura 3-1: Distribución del tamaño de partícula de las hojas de P. ligularis molidas en un

molino de cuchillas. ...................................................................................................................................................... 48

Figura 3-2: Superficie de respuesta (A) y gráfico de contorno (B) del contenido total de

flavonoides (CFT) (mg-eq isoquercetina/g extracto seco) en función del porcentaje de etanol

y la temperatura, manteniendo el factor tiempo en un nivel medio constante (40 min). ......... 53



y el tiempo, manteniendo el factor de temperatura a un nivel medio constante (50 ºC). ......... 53


flavonoides (CFT) (mg-eq isoquercetina / g extracto seco) en función de la temperatura y el

tiempo, manteniendo el factor de etanol en un nivel medio constante (80%). .............................. 54

Figura 3-5: Cromatograma del extracto optimizado por ultrasonido (naranja) y el extracto

obtenido por infusión (negro). Condiciones cromatográficas descritas en la sección 2.2.1.... 56

Figura 3-6: Fenómeno de cavitación acústica durante la extracción asistida por ultrasonido.

Modificado de Lavilla I, Bendicho C. Fundamentals of ultrasound-assisted extraction. En: Water

Extraction of Bioactive Compounds: From Plants to Drug Development. Elsevier; 2017. p. 294.

(122) .................................................................................................................................................................................... 58

Figura 3-7: Formación endógena de AGEs. ..................................................................................................... 61

Figura 3-8: Relación monotónica entre el contenido de flavonoides totales y la actividad

antiglicante de los extractos de hojas de P. ligularis. Quercetina utilizada como control positivo

(70 µg/mL) presentó un porcentaje de inhibición de 96.92 ± 3.76 %. ................................................62

Figura 3-9: Actividad anti-hiperglicemiante de extractos de hojas de P. ligularis. NGS: Niveles

de glucosa en sangre. Los datos se expresan como promedio ± SEM, n = 6 animales por grupo;

fueron analizados mediante un ANOVA de dos vías, seguido de una prueba Tukey con un valor

de **p <0.01 y ****p <0.0001 con respecto al grupo vehículo; #p <0.05 respecto al extracto de

infusión. ..............................................................................................................................................................................67

Figura 4-1: Montajes para evaluar condiciones de estrés hidrolíticas. A. Montaje de hidrólisis

neutra, ácida, o básica en reflujo. B. Montaje de hidrólisis neutra, ácida, o básica, a 40ºC. .......71

Figura 4-2: Diagrama de decisión seguido para determinar la estabilidad en condiciones de

hidrólisis neutra (pH del agua entre 5-6)...........................................................................................................71


hidrólisis ácida y básica. .............................................................................................................................................72


peroxidación. ....................................................................................................................................................................73

Figura 4-5: A. Cámara de fotoestabilidad. B. Muestras de extracto optimizado de P. ligularis

sometido a las condiciones de estrés fotolíticas. ............................................................................................74


estrés fotolíticas. .............................................................................................................................................................74

Figura 4-7: Cromatograma UV a 350 ηm del extracto optimizado de hojas de P. ligularis

mediante las condiciones cromatográficas descritas en la sección 2.1.3. Los picos numerados

en azul corresponden a los flavonoides identificados y en rojo compuestos fenólicos sin

identificar. ..........................................................................................................................................................................75

Figura 4-8: Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés de hidrólisis

neutra -agua, 12h, reflujo- en tiempo cero (negro) y punto final (azul). Los picos numerados en

negrilla representan los flavonoides de identidad conocida que presentaron principales

cambios. Condiciones cromatográficas descritas en la sección 2.2.1 ..................................................76

Figura 4-9: Propuesta de degradación por hidrólisis neutra. Ejemplificación de la

transformación de quercetina-3-O-(6''-malonil)-glucósido (1) a quercetina-3-O-glucósido (3).

.................................................................................................................................................................................................77

Figura 4-10: Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés a pH ácido –

HCl 0.01N, 8h, 40ºC- en tiempo cero (negro) y punto final (azul). Los picos numerados en


cambios. Condiciones cromatográficas descritas en la sección 2.2.1. .................................................78

Figura 4-11: Propuesta de degradación por hidrólisis ácida. Ejemplificación de la

transformación de luteolina-7-O-(6''-malonil)-glucósido (9) a luteolina-7-O-glucósido (2). ..79

Figura 4-12: Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés a pH básico –

NaOH 0.01N, 8h, 40ºC- en tiempo cero (gris) y punto final (azul). Los picos numerados en


cambios. Condiciones cromatográficas descritas en la sección 2.2.1. .................................................81

Figura 4-13: Degradación por hidrólisis básica. A. Propuesta del mecanismo de hidrólisis del

enlace tipo éster; ejemplificación de la transformación de crisina-7-O-(6”-O-acetil)-glucósido

(13) en crisina-7-O-glucósido (12). B. Mecanismo de hidrólisis del enlace glucosídico

(179,180); ejemplo de degradación de quercetina-3-O-glucósido (1). El grado de

desprotonación en la estructura depende del pH del medio y valor de pKa de cada uno de los

hidroxilos fenólicos. ..................................................................................................................................................... 82

Figura 4-14: Ejemplo de oxidación de flavonoides (178). ....................................................................... 84

Figura 4-15: Cromatogramas del extracto optimizado bajo condiciones de oxidación con H2O2

30%, temperatura ambiente. A. Comparación perfiles en tiempo cero (negro) y punto final 24h

(rosa). Los picos numerados en negrilla representan los flavonoides de identidad conocida

que presentaron principales cambios. B. Comparación entre el perfil de peroxidación punto

final 24h (rosa) e hidrólisis neutra a las 12h (azul). Condiciones cromatográficas descritas en

la sección 2.2.1. .............................................................................................................................................................. 85

Figura 4-16: A. Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés fotolíticas.

En tiempo cero (negro) y punto final día 30 (azul). B. Características estructurales que

disminuyen la fotoestabilidad de flavonoides. Condiciones cromatográficas descritas en la

sección 2.2.1. ................................................................................................................................................................... 87

Figura 5-1: Montaje para ensayo de perfusión intestinal de un solo paso. A. Calentador de

ambientes. B. Zona quirúrgica. C. Cubeta para recolección de residuos y ubicación de viales

colectores. D. Bomba peristáltica. E. Plancha de calentamiento y agitación magnética con

muestras a perfundir. F. Viales de vidrio de 10 mL vacíos y pesados. G. Balanza analítica. ..... 97

Figura 5-2: Ilustración de la canulación de los segmentos intestinales. ........................................... 98

Figura 5-3: A. Solubilidad aparente de flavonoides totales en soluciones acuosas a diferente

pH y temperatura. B. Solubilidad de isoquercetina como componente del extracto optimizado

(ISQ-OPT) y como compuesto puro (ISQ-EST), en soluciones acuosas a diferente pH y

temperatura. Los datos se expresan como promedio ± DS (n=3); fueron analizados mediante

un ANOVA de dos vías, seguido de una prueba Sidak de múltiples comparaciones para las

solubilidades de cada solución entre las dos temperaturas, con un valor de significancia **p

<0.01, ***p <0.001 y ****p <0.0001. .................................................................................................................. 102

Figura 5-4: Principales mecanismos de permeación intestinal de fármacos. A, difusión

transcelular; B, transporte paracelular; C, transporte transcelular facilitada por

transportadores; D, transcelular activo mediado por transportadores; E, eflujo. Figura creada

en BioRender.com. ..................................................................................................................................................... 110

Figura 5-5: Coeficiente de permeabilidad efectiva de FT (A) e isoquercetina contenida en el

extracto optimizado ISQ-OPT y como estándar ISQ-EST (B), por SPIP en ratas (n=5). ........... 112

Figura 5-6: Posibles mecanismos de absorción reportados para isoquercetina. Q-3-gluc:

quercetina-3-O-glucósido; Q: quercetina; LPH: lactasa-floricina hidrolasa; SGLT1:

transportador de glucosa dependiente de sodio; β-G: β-glucosidasa; UGT: uridina-difosfato

glucuroniltransferasa; Q-glucA: glucurónidos de quercetina. Modificado de Gee,J; et al. 2000,

(220). Figura creada en BioRender.com. ........................................................................................................ 113

Lista de tablas XX

Lista de tablas Pág.

Tabla 1-1: Principales actividades terapéuticas para las hojas de algunas especies del género

Passiflora. ...........................................................................................................................................................................10

Tabla 1-2: Metabolitos identificados a partir de extractos polares de hojas de P. ligularis. ....14

Tabla 2-1: Soluciones preparadas para cada curva de calibración. .....................................................22

Tabla 2-2: Rango de concentraciones para las curvas de calibración de flavonoides totales,

isoquercetina y astragalina que cumplen con el parámetro de linealidad de acuerdo con la

prueba t-student. ............................................................................................................................................................28

Tabla 2-3: Datos de precisión y exactitud de la curva de calibración de flavonoides totales,

isoquercetina y astragalina. ......................................................................................................................................29

Tabla 2-4: Comparación de datos UHPLC-MS/MS entre el extracto optimizado y extractos

acuosos de hojas de granadilla. ...............................................................................................................................32

Tabla 3-1: Condiciones de extracción a evaluar mediante el diseño Box-Behnken. ....................42

Tabla 3-2: Soluciones de reacción evaluadas en el ensayo de antiglicación mediante el modelo

BSA-ribosa. ........................................................................................................................................................................44

Tabla 3-3: Flavonoides totales cuantificados y actividad antiglicante de extractos obtenidos

bajo las condiciones del diseño experimental Box-Behnken. ...................................................................50

Tabla 3-4: Análisis de varianza ANOVA del modelo de regresión. .......................................................51

Tabla 3-5: Cuantificación de flavonoides totales bajo las condiciones óptimas de extracción en

3 días diferentes. ............................................................................................................................................................55

Tabla 3-6: Condiciones optimizadas para la extracción de flavonoides totales en diferentes

especies del género Passiflora. ................................................................................................................................59

Tabla 3-7: Valores de IC50 en ensayo de antiglicación de marcadores terapéuticos y extractos

de hojas de Passiflora ligularis. ................................................................................................................................64

Tabla 3-8: Concentraciones inhibitorias 50 reportadas en la literatura para algunos de los

flavonoides presentes en las hojas de Passiflora ligularis. .........................................................................66

Tabla 5-1: Composición de las soluciones buffers preparadas. .............................................................90

Tabla 5-2: Composición de los medios de perfusión para yeyuno e íleo...........................................94

Tabla 5-3: Preparación de los tratamientos a evaluar mediante el ensayo de perfusión

intestinal en yeyuno e íleo. ........................................................................................................................................94

Tabla 5-4: Solubilidad aparente de flavonoides totales e isoquercetina en el extracto

optimizado de P. ligularis, y estándar de isoquercetina, en diferentes medios acuosos. ......... 101

Tabla 5-5: Número de dosis Do calculado para los flavonoides totales e isoquercetina

contenidos en el extracto optimizado de P. ligularis, e isoquercetina pura. .................................. 106

Tabla 5-6: Coeficiente de permeabilidad efectiva (Peff) de FT, ISQ-OPT e ISQ-EST. ................. 109

Tabla 5-7: Clasificación biofarmacéutica, Peff y Fa predicha en humanos de FT, ISQ-OPT e ISQ-

EST. .................................................................................................................................................................................... 115

Lista de símbolos y abreviaturas XXII

Lista de Símbolos y abreviaturas Símbolos Símbolo Término Do Número de dosis IC50 Concentración inhibitoria 50 log P Coeficiente de reparto log D Coeficiente de distribución λmax Longitud de onda de máxima absorbancia m/z Relación masa carga %CV Porcentaje de coeficiente de variación

Peff Permeabilidad efectiva

Unidades de medida Unidad Término cm Centímetro min Minutos mL Mililitro mM Milimolar mg Miligramo kg Kilogramo ηm Nanómetro µM Micromolar µg Microgramo µm Micrómetro μL Microlitro

Abreviaturas Abreviatura Término ACN Acetonitrilo

AGEs Advanced glycation end products - Productos finales de glicación avanzada

ATP Trifosfato de adenosina BD Biodisponibilidad BE Bioequivalencia

Lista de símbolos y abreviaturas XXIII

Abreviatura Término

BSA Bovine serum albumine - Albúmina sérica bovina

CFT Contenido de flavonoides totales DAD Detector de arreglo de diodos EAU Extracción asistida por ultrasonido

EMA European Medicines Agency - Agencia Europea de Medicamentos

FDA Food and Drug Administration GLUT-4 Transportador de glucosa tipo 4 HPLC High Performance Liquid Chromatography

ICH International Council for Harmonisation of International Conference Harmonization

LC-MS Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas

LC-MS/MS Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem

LDD Límite de detección LDC Límite de cuantificación

LDL Low-density lipoprotein – Lipoproteína de baja densidad

MAPK, MEK/ERK

Vías de proteínas quinasas activadas por mitógenos

MV Material vegetal OMS Organización mundial de la salud PI3K Fosfatidilinositol 3-quinasa RMN Resonancia magnética nuclear

RSM Response Surface methodology – metodología de superficie respuesta

SCB Sistema de clasificación biofarmacéutica TPA 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato

UHPLC Ultra High Performance Liquid Chromatography

USP United States Pharmacopeia – Farmacopea de los Estados Unidos

UV Ultravioleta

Introducción

La diabetes Mellitus es una enfermedad generada por un conjunto de trastornos metabólicos

y cuya principal característica es la presencia de concentraciones elevadas de glucosa en la

sangre de manera crónica y persistente. Debido a esta complejidad, la población que la padece

ha recurrido al uso de plantas medicinales como parte de su tratamiento, es así como más de

1200 plantas a nivel mundial han sido usadas con fines medicinales por personas

diagnosticadas con diabetes (1).

Aunque las fuentes naturales han sido ampliamente utilizadas como tratamientos alternativos

a lo largo de la historia de la humanidad, y a pesar de los avances científicos en el estudio de

los productos naturales, aún hoy en día el uso de las medicinas naturales se basa en

observaciones empíricas en lugar de evidencia científica (2). La importancia de los productos

herbales es tal, que incluso la Organización Mundial de la Salud (OMS), recomienda y promueve

programas nacionales de atención en salud basado en este tipo de productos, ya que están

fácilmente disponibles, son de bajo costo, deben ser seguros y la población confía en ellos (3).

Desafortunadamente, aún existe un factor de gran controversia, que impide la aceptación de

los productos naturales por cierta parte de la población; la falta de caracterización de los

extractos o productos obtenidos a partir de éstos, no permite alcanzar los criterios de

seguridad y eficacia establecidos por las entidades regulatorias en diferentes países (4). En

gran medida la dificultad para desarrollar este tipo de productos se relaciona con el hecho de

que se trata de matrices complejas, con un gran número de metabolitos que en su mayoría son

desconocidos, y de los cuales no se sabe con exactitud los componentes responsables de la

actividad y mucho menos los modos de acción (4). Aunque éstos deben cumplir con los mismos

requerimientos de seguridad y eficacia que los productos elaborados con fármacos sintéticos,

el interés por desarrollar productos naturales bajo las mismas exigencias de calidad es un

campo de estudio reciente (5, 6).

2 Introducción

Con el fin de avanzar en el cumplimiento de dichas exigencias de calidad y tener mayor

aceptación de la terapia convencional, se han propuesto dos líneas de trabajo generales para

un mayor desarrollo de productos fitoterapéuticos: uno, la autenticación, estandarización y

purificación de drogas naturales; y dos, el desarrollo y estandarización de formulaciones de las

mismas (7). Se entiende por producto fitoterapéutico, al “producto medicinal empacado y

etiquetado, cuyas sustancias activas provienen de material de la planta medicinal o

asociaciones de estas, presentado en forma farmacéutica que se utiliza con fines terapéuticos.

También puede provenir de extractos, tinturas o aceites. No podrá contener en su formulación

principios activos aislados y químicamente definidos” (8).

Dentro de las fuentes naturales con actividad antidiabética reportada en la literatura, se

encuentran diversos órganos de las especies del género Passiflora, un conjunto de plantas de

gran relevancia económica y tradicional en Colombia debido a las cualidades de sus frutos. Con

base en información previa descrita en la literatura científica y reportes etnofarmacológicos,

el grupo de investigación Principios Bioactivos en Plantas Medicinales se ha interesado por el

estudio de las hojas de diferentes especies de Passiflora, obteniendo resultados prometedores

como hipoglicemiantes, para extractos de hojas de Passiflora ligularis, comúnmente conocida

como granadilla. Con la participación de diversos grupos de investigación, nacionales e

internacionales, se ha planteado el proyecto “Estudio de la actividad antidiabética de un

extracto nanovehiculizado de hojas de Passiflora ligularis (granadilla)”. Dentro del cual, se han

desarrollado diferentes trabajos relacionados con el estudio químico de extractos de P.

ligularis, su caracterización metabolómica y correlación con el sitio de colecta, así como la

evaluación mediante diferentes técnicas in silico, in vitro e in vivo, de los posibles modos de

acción hipoglicemiante y antidiabético de los extractos, fracciones y compuestos puros

obtenidos. Si bien, los resultados de estos estudios han sugerido a los flavonoides como los

principales metabolitos responsables de la actividad (9–11), es el extracto completo el que se

emplea en el desarrollo de productos fitoterapéuticos, conllevando al análisis de múltiples

factores adicionales al análisis químico y la actividad biológica.

El presente trabajo, tiene como fin realizar aportes a las dos líneas de trabajo mencionadas

(estandarización de drogas naturales y desarrollo de formulaciones a partir de éstas), aplicado

al diseño y desarrollo de un potencial producto fitoterapéutico a partir de las hojas de P.

Introducción 3

ligularis. Para el primer eje, se propone contribuir a la estandarización del extracto obtenido a

partir de las hojas (un subproducto de los cultivos), estableciendo las condiciones óptimas de

extracción por ultrasonido para maximizar el contenido de flavonoides, con el fin de aumentar

la actividad terapéutica. Además, se desarrollarán metodologías analíticas para su estudio y

evaluarán las condiciones de estrés bajo las cuales el extracto optimizado puede sufrir

procesos de degradación.

Para el segundo eje de trabajo, se busca aplicar el sistema de clasificación biofarmacéutica

(SCB) como una herramienta útil en el diseño y desarrollo de productos terapéuticos. El SCB

caracteriza la solubilidad y permeabilidad de los fármacos debido a que son dos parámetros

fundamentales en el proceso de absorción intestinal de los mismos. Este es un requisito para

el desarrollo de estudios de bioequivalencia entre dos productos, ensayos de disolución

durante la etapa de diseño y desarrollo, la correlación de datos in vitro-in vivo que permitan

sustituir los estudios en humanos por estudios de disolución in vitro; entre otras ventajas (12).

Aunque son pocos los reportes que se encuentran respecto a la aplicación del sistema en

extractos o productos herbales , los estudios encontrados describen la utilidad del SCB como

un método para apoyar el desarrollo de productos fitoterapéuticos y garantizar la calidad de

los mismos (6,13,14).

1. Marco Teórico

1.1 Sistema de Clasificación Biofarmacéutica El Sistema de Clasificación Biofarmacéutico (SCB) fue publicado por el Doctor Gordon Amidon

y colaboradores en 1995, como un fundamento de clasificación de fármacos basado en dos

aspectos básicos que se relacionan con la cantidad y velocidad de absorción de los mismos: la

solubilidad acuosa y la permeabilidad gastrointestinal de la dosis terapéutica más alta, dentro

de un rango de pH fisológicamente relevante, pH 1.2 a 7.4. El sistema está constituido por 4

clases de fármacos: Clase I: Fármacos de alta solubilidad y alta permeabilidad; Clase II: Baja

solubilidad, alta permeabilidad; Clase III: Alta solubilidad, baja permeabilidad; Clase IV: Baja

solubilidad, baja permeabilidad (15).

Posteriormente el SCB fue aceptado y modificado por diferentes entidades (FDA, EMA, OMS y

una guía armonizada preliminar de la ICH), como un marco legal para los medicamentos de

administración oral y liberación inmediata que quisieran aplicar a la bioexención de los

estudios de Biodisponibilidad (BD) y/o Bioequivalencia (BE) in vivo. Entendiéndose por

bioexención, el reemplazo de estudios in vivo por una prueba de disolución como base para

aceptar la equivalencia entre dos productos farmacéuticos (16–19). Basado en las guías

anteriores, se estableció en Colombia la ‘Guía que contiene los criterios y requisitos para el

estudio de Biodisponibilidad y Bioequivalencia de medicamentos’, mediante la Resolución

1124 de 2016. De acuerdo con esta guía y basado en el sistema de clasificación

biofarmacéutica, se considera que un fármaco es altamente soluble cuando la dosis más alta

reportada de la formulación, es soluble en 250 mL o menos de medio acuoso a valores de pH

1.2, 4.5 y 6.8, a una temperatura de 37 ± 1 °C. Adicionalmente, el principio activo es altamente

permeable cuando el grado de absorción en humanos es mayor o igual al 85%; la

permeabilidad puede ser determinada mediante estudios en humanos (estudios de balance de

masas, biodisponibilidad absoluta o perfusión intestinal in vivo) o métodos adicionales de

6 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de


perfusión intestinal in vivo/in situ en modelos animales, o de permeación in vitro, a través de

células epiteliales cultivadas (por ejemplo, monocapa de células Caco-2) (20).

Además de proporcionar los criterios para la bioexención de un medicamento y así demostrar

la bioequivalencia entre dos productos, el SCB tiene como objetivo la predicción de aspectos

del comportamiento farmacocinético in vivo de los fármacos a partir de la información de

solubilidad y permeabilidad (determinada como el grado de absorción por vía oral)(21,22).

Adicionalmente, tiene aplicaciones útiles en diferentes etapas del desarrollo de medicamentos:

1) Durante el descubrimiento de nuevos compuestos, la caracterización de fármacos en

clasificaciones diferentes al tipo 1, indican la necesidad de mejorar la solubilidad y

permeabilidad de compuestos subsecuentes (23). 2) En la etapa de diseño y formulación, si se

parte de fármacos clase I, éstos dependen principalmente de la velocidad de liberación de la

forma farmacéutica para su disolución a nivel gastrointestinal; por el contrario, si están dentro

de la clase II, la selección adecuada de excipientes es indispensable para favorecer la

solubilidad y promover la mejor condición de disolución posible tanto para formulaciones de

liberación inmediata como controlada. Para el caso de fármacos de las clases III y IV, aunque

pueden ser igualmente formulados, también se puede optar por desarrollar formulaciones

menos convencionales que favorezcan la biodisponibilidad, como por ejemplo, dispersiones

sólidas amorfas, nanotecnología, sistemas de entrega basados en lípidos, entre otros (24,25).

3) En etapas clínicas, en las cuales compuestos con clasificaciones II, III y IV, advierten de

aspectos como posibles interacciones con alimentos (23).

Se han planteado diferentes modificaciones, enfoques y aplicaciones del sistema de

clasificación biofarmacéutica que han servido como base para desarrollar otro tipo de sistemas

de clasificación, como es el caso del BDDCS, Sistema de Clasificación Biofarmacéutica basado

en la Disposición del Fármaco. Este difiere del SCB en no tener en cuenta el parámetro de

permeabilidad, sino un criterio basado en el metabolismo, componente relacionado con la ruta

de eliminación del fármaco (21). En 2010, se planteó un sistema de clasificación enfocado a los

retos asociados al desarrollo de productos orales, ‘Developability Classification System’, DCS;

introduciendo factores importantes para la predicción en el comportamiento in vivo, como la

solubilidad en medios biorelevantes, un mayor volumen de fluidos gastrointestinales

disponible (500 mL) y la subdivisión de la clase II en fármacos cuya absorción se ve limitada

por la velocidad de disolución (IIa) y de absorción limitada por la solubilidad (IIb); entre otras

Capítulo 1 7

modificaciones (26). Este último fue recientemente modificado por los mismos autores en

‘Refined Developability Classification System’, rDCS, con el fin de que el DCS tuviese un enfoque

más pragmático para la aplicación en la industria (27,28). También se ha planteado la

expansión del sistema, realizando subclasificaciones de los fármacos Clase II y IV en subclases

a, b y c, dependiendo del carácter ácido (a), básico (b) o neutro (c) de la molécula (29,30). Otros

sistemas como el ‘ABΓ’, basado en la fracción de dosis absorbida (31), y el ‘ECCS’ (Extended

Clearance Classification System), relacionado con el peso molecular, el estado de ionización y

la permeabilidad de la membrana, entre otros, han sido sistemas de clasificación desarrollados

(32).

Por otro lado, se ha buscado ampliar los ámbitos de aplicación del SCB. Tal es el caso del

sistema de clasificación biofarmacéutico pediátrico (33–35), tópico (36) e incluso para

productos herbales (13).

1.1.1 SCB aplicado a extractos vegetales

Aunque hablar de conceptos como la biodisponibilidad, bioequivalencia, o estudios

farmacocinéticos en matrices complejas de extractos y productos fitoterapéuticos, no es

frecuente como lo es para medicamentos elaborados con fármacos sintéticos, diferentes

autores y entidades regulatorias mencionan la importancia de realizar más estudios

relacionados con el análisis cualitativo y cuantitativo de marcadores químicos, analíticos y/o

terapéuticos en productos herbales medicinales (fitoterpeúticos en Colombia).

Adicionalmente, se contempla la estandarización de los extractos, la realización de estudios

biofarmacéuticos, el desarrollo de modelos preclínicos in vivo o in vitro, y el diseño de ensayos

clínicos adecuados, como parámetros necesarios para el desarrollo de productos herbales de

calidad, que cuenten con efectividad y tolerabilidad clínica (5,37).

Un estudio realizado por Waldman y colaboradores (13), planteó que los fundamentos del SCB

podían ser aplicados en la caracterización biofarmacéutica de los productos herbales

medicinales, ya que, aunque éstos sean matrices complejas en su composición, cada

ingrediente ya sea activo o no, puede clasificarse teniendo en cuenta algunas consideraciones,

como por ejemplo, las características de los marcadores presentes en los extractos de acuerdo



con la categoría A, B o C, planteadas en la Farmacopea Europea y aceptadas por la Agencia

Europea de Medicamentos EMA:

Clase A: Contienen los constituyentes que son los únicos responsables de la actividad

terapéutica reconocida y documentada.

Clase B: Contienen los constituyentes químicamente definidos que poseen propiedades

farmacológicas relevantes (marcadores activos), que podrían contribuir a la eficacia

clínica, sin embargo, no hay información disponible respecto a si son los únicos

responsables de la actividad terapéutica.

Clase C: Con constituyentes cuya relevancia farmacológica, clínica o en la eficacia del

extracto no se ha documentado. Con fines prácticos en el control de calidad de los

extractos, se pueden utilizar constituyentes o marcadores químicamente definidos, sin

actividad terapéutica conocida (7,38).

De este modo, para los extractos Clase A, se pueden aplicar los principios del SCB de manera

similar que para los fármacos químicamente definidos, es decir, podría utilizarse para

establecer la bioequivalencia entre dos productos, ya que los marcadores responsables de la

actividad son los usados para asignar la clasificación. Para las categorías B y C, la aplicación del

sistema de clasificación se verá enfocada a la selección de marcadores, pruebas o ensayos

adecuados en el control de calidad del material vegetal o del producto terminado y a la

comparación in vitro entre productos.

La clasificación de los marcadores presentes en los extractos de acuerdo con el SCB, presenta

diferentes ventajas. En primera medida, permite proporcionar información valiosa respecto a

dichos constituyentes para seleccionar el(los) marcadore(s) más adecuados respecto a sus

características biofarmacéuticas; esto por ejemplo, con el fin de determinar la calidad lote a

lote de los productos terminados; para demostrar la similitud in vitro de dichos productos

herbales tras realizar cambios posteriores a la aprobación de los mismos, seleccionar el

marcador más apropiado para llevar a cabo ensayos de disolución en el desarrollo del

producto, o incluso la selección de marcadores con propiedades de solubilidad y

permeabilidad adecuadas para su detección in vivo durante los estudios clínicos.

Capítulo 1 9

Por otro lado, el conocimiento de la clasificación según el SCB, permitirá decidir si puede ser

significativa la comparación in vitro entre dos productos para evaluar posibles diferencias

terapéuticas. Todo lo anterior puede verse como un paso importante hacia el diseño,

desarrollo y control de calidad de los productos fitoterapéuticos (13).

Estudios como los realizados por Waldmann et al. y Fong y colaboradores, han logrado

clasificar un gran número de marcadores activos presentes en plantas de uso medicinal gracias

a información ya reportada en la literatura y al uso de métodos in silico que predicen factores

descriptivos de la permeabilidad y solubilidad (log P, log D, o número de dosis Do) (13,14).

Otros reportes han evaluado experimentalmente las características biofarmacéuticas de

especies como Centella asiática y Rosmarinus officinalis L. En el primer caso, se determinó que

a pesar de que el ácido asiático presente en el extracto demostró alta permeabilidad, la baja

solubilidad y rápido metabolismo conllevaban a la baja biodisponibilidad del mismo (39); y en

el segundo, se clasificó a la mayoría de metabolitos de tipo flavonoides, diterpenos, triterpenos

y fenilpropanoides, dentro de las clases III y IV del SCB (40). Por otro lado, en un estudio de

nuestro grupo de investigación, Domínguez y colaboradores evaluaron el efecto de la matriz

en las propiedades biofarmacéuticas de la rutina, metabolito mayoritario en extractos de

cálices de Physalis peruviana. Encontrando que éste presentaba alta solubilidad/baja

permeabilidad (clase III) como componente del extracto hidroetanólico, pero, baja

solubilidad/permeabilidad (clase IV) dentro de la fracción butanólica del extracto y como

compuesto puro (41).

1.2 Género Passiflora El género Passiflora de la familia Passifloraceae está representado por alrededor de 530

especies. En su mayoría son lianas o enredaderas, aunque también existen algunas especies

arbóreas o arbustivas (42,43). En Colombia se han reportado alrededor de 170 especies,

constituyendo así el país con mayor diversidad de Passifloraceae (44).

Algunas especies altamente cultivadas por los agricultores colombianos incluyen las curubas

(P. tripartita var mollisima, P. tripartita var tripartita, P. tarminiana y P. cumbalensis), badea

(P. quadrangularis), gulupa (P. edulis var edulis), cholupa (P. maliformis), granadilla (P.



ligularis) y maracuyá (P. edulis var flavicarpa). Estas especies se cultivan en 24 departamentos

de Colombia, siendo Huila, Antioquia, Meta, Valle del Cauca y Boyacá las regiones más

productivas (45).

Este género es de gran interés no solo por su valor comercial (en la agricultura y a nivel

ornamental) sino además por su importancia en la medicina tradicional (46). Parte de los usos

etnofarmacológicos y las actividades farmacológicas comprobadas reportadas para las hojas

de algunas especies se muestran en la Tabla 1-1.

Tabla 1-1: Principales actividades terapéuticas para las hojas de algunas especies del género

Passiflora.

Especie Usos tradicionales de las

hojas Actividades biológicas de

extractos de las hojas

P. tripartita var mollisima (Curuba de castilla)

Calmante (47)

Actividad antimicrobiana contra Staphyloccus aureus y

Salmonella typhi (48). Anti-hiperglicemiante (49).

P. edulis var flavicarpa (Maracuyá)

Se reportan usos como tranquilizante, o para el

tratamiento de afecciones inflamatorias cutáneas de P. edulis sin especificación de la

variedad (50).

Actividades ansiolíticas y antidepresivas (51,52).

Propiedades antiinflamatorias (50).

P. edulis var edulis (Gulupa)

Como tranquilizante, diurético, tónico y para el

tratamiento de la hipertensión o enfermedades

de la piel (46).

Ansiolítico y antidepresivo (51).

Actividad antioxidante, antiinflamatorio (53).

P. quadrangularis (Badea)

Tranquilizante, para el tratamiento del insomnio, epilepsia, dolor de cabeza,

bronquitis, asma, tos y como antidiabético (46,54).

Ansiolítico (55), antioxidante (56), actividad hemolítica (57),

sedante (58). Inhibición moderada de

S. aureus, y B. cereus (56).

P. alata (Maracuyá dulce)

Tranquilzante, diurético y analgésico (46).

Efecto ansiolítico (59), gastroprotector (60) y

antioxidante (61).

Capítulo 1 11

Especies del género Passiflora con potencial actividad antidiabética Diferentes estudios se han llevado a cabo para entender el rol que las especies del género

Passiflora pueden jugar en el manejo o tratamiento de la diabetes. En dos estudios de Colomeu

y colaboradores, se evaluó la actividad antioxidante y antiinflamatoria del extracto acuoso de

las hojas de P. alata como los posibles modos mediante los cuales éste ejerce su efecto

antidiabético; los ensayos fueron realizados en ratones NOD (diabéticos no obesos). En estas

investigaciones, se reporta que el grupo tratado con el extracto presentó un nivel de insulitis

(inflamación de los islotes de Langerhans) inferior al grupo control, lo que da un indicio de las

propiedades antiinflamatorias del extracto. Adicionalmente, sugieren que la capacidad

antioxidante y los altos niveles de glutatión obtenidos para el grupo tratado se pueden

relacionar con un efecto protector de los islotes pancreáticos ante el estrés oxidativo. Ambos

efectos son importantes en el tratamiento de la diabetes tipo 1 (62,63).

Resultados positivos se han obtenido en el estudio del efecto hipoglicemiante de la cáscara de

los frutos de Passiflora edulis, aunque no se especifica la variedad de la especie utilizada (P.

edulis var edulis o P. edulis var flavicarpa). Varios autores reportan que la cáscara ejerce un

efecto antioxidante importante para el estrés oxidativo desarrollado durante la enfermedad

(64). Además, debido a su riqueza en fibra, es útil en la prevención de la digestión y absorción

de carbohidratos, de manera que controla y reduce los niveles sanguíneos de glucosa (65,66).

Para el caso específico de Passiflora edulis var flavicarpa, se llevó a cabo un estudio clínico de

fase II con 43 pacientes que presentaban diabetes mellitus tipo 2, a los cuales se les administró

durante 60 días un producto de harina de la cáscara de maracuyá, rica en pectina. Dentro de

los resultados se obtuvo una disminución de los triglicéridos y cambios positivos en los niveles

de glucosa en sangre, evidenciando la utilidad del tratamiento como complemento a las

terapias convencionales (67). Reportes similares se han encontrado para otras especies del

género, como por ejemplo Passiflora mollisima bailey, Passiflora foetida y Passiflora nitida

Kunth (49,68–70).



1.2.1 Passiflora ligularis (Granadilla)

Generalidades, valor comercial y etnofarmacológico

La granadilla o Passiflora ligularis es una enredadera de tallo herbáceo y leñoso hacia la base.

Sus hojas se insertan al tallo mediante un peciolo largo y grueso, miden entre 8-20 cm de largo

y 6-5 cm de ancho, son gruesas, acorazonadas y de color verde intenso. Las flores son vistosas,

de color violeta, y aproximadamente 7 a 10 cm de diámetro. El fruto, es una baya casi esférica,

de cubierta dura y cuyo color varía de verde a amarillo intenso dependiendo de la etapa de

madurez, usualmente presenta puntos blanquecinos; está constituido por el epicarpio,

exocarpio (corteza dura), mesocarpio (corteza blanca y esponjosa), el endocarpio (pulpa

comestible) y las semillas (71) (Figura 1-1).

A B C

Figura 1-1: A. Flor de Passiflora ligularis. B. Fruto granadilla. C. Hojas de Passiflora ligularis (72).

Passiflora ligularis se distribuye desde México hasta Bolivia, pero especialmente a lo largo de

los Andes y se encuentra entre 1.500 y 2.500 msnm. En Colombia, representa la segunda

especie de mayor importancia económica debido al valor que tienen sus frutos tanto a nivel

nacional como internacional (73). Cuenta aproximadamente con 7219 Hectáreas plantadas,

siendo en Huila el área de mayor producción (74).

Adicionalmente, es de gran valor tradicional teniendo en cuenta los múltiples usos medicinales

que se atribuyen a las diferentes partes de la planta; principalmente como descongestionante

nasal, antitusivo, para la gripa, regulación de la digestión, antidiarreico, para contrarrestar la

gastritis, úlceras, y el insomnio, aliviar contusiones, e incluso controlar ataques epilépticos, la

Capítulo 1 13

presión arterial, o los síntomas del guayabo, entre otras. Las formas más frecuentes de uso son

la preparación de infusiones, y cataplasmas o el consumo del fruto o su jugo. Para el caso de

las hojas, se administra por vía oral una infusión con el fin de regular la digestión y la diarrea;

también se aplica sobre la piel como cataplasma para el alivio de las contusiones (75).

Composición química y actividades biológicas de extractos de hojas de P.

ligularis

La mayoría de estudios encontrados en la literatura sobre la composición química de Passiflora

ligularis han sido realizados a partir de los frutos (76,77) y poca información se encuentra

respecto al estudio de las hojas.

Se conoce gracias al desarrollo de marchas fitoquímicas, la presencia de compuestos fenólicos,

leucoantocianidinas, saponinas, taninos, triterpenos y quinonas (75), mientras que trabajos

realizados dentro del grupo de investigación, han tenido como objetivo contribuir al estudio

químico de las hojas. En el trabajo realizado por Meneses, se identificaron como principales

metabolitos del extracto acuoso y fracción butanólica de hojas colectadas en Anolaima,

diferentes saponinas tipo lanostano y compuestos fenólicos (78), Tabla 1-2. Adicionalmente,

el estudio metabólico llevado a cabo por Monzón permitió la identificación de aminoácidos,

carbohidratos, ácidos orgánicos, saponinas y compuestos polifenólicos (flavonoides en su

mayoría) en muestras de hojas colectadas en Cundinamarca y Huila, que fueron extraídas

mediante ultrasonido por 10 minutos, con una mezcla de metanol-buffer fosfatos 90mM (9). A

partir de estos estudios se confirmó lo previamente planteado por Zuccoloto et al. (79)

respecto a la presencia de flavonoides O-glicósidos, diferentes a los usualmente encontrados

para otras especies del género Passiflora (C-glicósidos).



Tabla 1-2: Metabolitos identificados a partir de extractos polares de hojas de P. ligularis.

Grupo de metabolitos Compuestos

Aminoácidos

Alanina a Ácido glutámico a

Glutamina a Prolina a Tirosina a

Carbohidratos Glucosa a Sacarosa a

Polialcohol Myo-inositol a

Ácidos orgánicos GABA a

Ácido cítrico a Lactato a

Saponinas Ligularósidosb A, B, C* y D

Compuestos fenólicos

Catequina* Quercetina-3-O-glucósido*

Luteolina-7- O-glucósido a

Quercetina-3-O-(6''-malonil)-glucósido a Kaempferol-3- O-glucósido*

Apigenina-7- O-glucósido a

Isoramnetina-3-O-glucósidoa

Kaempferol-3-O-(6”-malonil)-glucósido a

Isoramnetina-3-O-(6”-malonil)-glucósido a

Crisina-7-O-glucósidoa

Crisina-7-O-(6”-O-acetil)-glucósidoa

Apigenina a

Kaempferol a Crisina*

a Compuestos identificados por Monzón (9). b Compuestos identificados por Meneses (78).

*Metabolitos encontrados por los dos autores anteriormente mencionados.

Consecuentemente, son pocos los estudios encontrados en relación con los posibles efectos

terapéuticos de los extractos obtenidos a partir de las hojas. Se describen principalmente la

actividad antioxidante, antimicrobiana, y antiinflamatoria. En el primer caso, el alto contenido

tanto de fenoles como de flavonoides totales se relacionan con la captación de radicales libres

y el poder reductor férrico de los extractos. De acuerdo con el estudio de Navarro et al, los

extractos hidroalcohólicos presentaron mayor actividad respecto a los extractos acuosos

(80,81). En relación con la actividad antimicrobiana, la mayor inhibición de los cultivos de

Capítulo 1 15

Escherichia coli y Staphylococcus aureus se obtuvo para los extractos acuosos; se evidenció un

porcentaje de inhibición mayor para E. coli lo cual se relaciona con el efecto que pueden

generar las saponinas sobre la capa lipídica presente en la membrana de las bacterias Gram

negativas (80).

Por otro lado, en el trabajo de maestría de Meneses se encontró que la fracción butanólica

obtenida a partir del extracto acuoso, junto con dos compuestos mayoritarios (Ligularósido C

y quercetina-3-O-glucósido) presentan un efecto antiinflamatorio promisorio en el modelo de

edema de oreja en ratón inducido por TPA (78).

Respecto al potencial antidiabético de la especie, se encuentran algunos reportes de evaluación

de la actividad a partir de la pulpa de las frutas. De acuerdo con un estudio llevado a cabo por

Anusooriya et al, la administración oral durante 30 días de un extracto acuoso de la pulpa de

granadilla (400 mg / kg) a ratas con diabetes inducida mediante estreptozotocina (STZ, 30

mg/kg de peso corporal), conllevó a la disminución de la glucosa en sangre (similar a los

niveles alcanzados por glibenclamida), además de un aumento significativo de antioxidantes

tanto enzimáticos como no enzimáticos y la disminución de la peroxidación lipídica. El extracto

demostró la actividad hipoglicemiante posiblemente debido a una mejoría de la secreción de

insulina mediante la recuperación de las células β pancreáticas y con potencial antioxidante

para la prevención del daño oxidativo desarrollado durante la diabetes (82). Otro estudio

informa del efecto antidiabético generado por el extracto en acetona del fruto de P. ligularis,

pero en este caso lo reporta como la inhibición de la actividad α-amilasa (82.56%) y α–

glucosidasa (75.36%), demostrando porcentajes de inhibición muy cercanos a los del control

positivo utilizado, acarbosa (79,87%) (83).

Finalmente, y haciendo parte del proyecto de investigación dentro del cual se encuentra

enmarcada esta tesis, se han desarrollado dos trabajos que demuestran el potencial

antidiabético de los flavonoides presentes en las hojas de P. ligularis. Por un lado, teniendo en

cuenta el papel de las enzimas glucosil-hidrolasas en la etapa inicial del metabolismo de los

carbohidratos en humanos, Monzón realizó un estudio de acoplamiento molecular entre los

compuestos identificados en las hojas y las enzimas α-amilasa y α-glucosidasa. El ligularósido

C y varios de los flavonoides mono-glicosidados, presentaron el perfil de interacciones más

energéticamente estables y similares a los del inhibidor de referencia de la α-amilasa; siendo



la saponina, la quercetina-3-O-glucósido (isoquercetina) y el kaempferol-3-O-glucósido

(astragalina) quienes presentaron valores de IC50 inferiores a los de la acarbosa en el ensayo

de inhibición in vitro. De manera similar, para la inhibición de la α-glucosidasa, solamente los

flavonoides mono-glicosidados demostraron ser los mejores candidatos de acuerdo con el

análisis computacional, y únicamente la isoquercetina presentó un IC50 menor al compuesto de

referencia (9).

Por otra parte, Rey y colaboradores, estudiaron el efecto del extracto acuoso y fracción

etanólica de hojas de granadilla, en un modelo in vivo de tolerancia a la glucosa en ratas

hiperglicémicas, donde ambos redujeron la glicemia de manera dosis-dependiente (125-500

mg/Kg); y la fracción etanólica (500 mg/Kg), aumentó el contenido de glicógeno hepático

(65%) y muscular (40%). Adicionalmente, demostraron mediante el modelo ex vivo de

músculo sóleo, que la isoquercetina (uno de los flavonoides mayoritarios) estimula la

absorción de la glucosa respecto al control hiperglicémico, de 92-129% en un rango de

concentraciones de 10-150 µM; proponiendo como mecanismo de acción, la translocación del

transportador de glucosa al activar las vías de señalización PI3K, MAPK, MEK/ERK y la síntesis

de proteínas de novo del transportador GLUT-4 (11). A su vez, en el estudio del efecto

hipoglicemiante de la astragalina, encontraron que ésta disminuye la glicemia y aumenta la

secreción de insulina a una dosis de 10 mg/Kg en ratas hiperglicémicas, y que dicha secreción,

estaría mediada por la estimulación de la entrada de calcio a través de canales de potasio

dependientes de ATP, canales de calcio dependientes de voltaje tipo L (L-VDCC), la

movilización de calcio desde las reservas intracelulares y la activación de las proteínas

quinasas PKC y PKA (10).

Otros de los flavonoides identificados en la Tabla 1-2 presentan reportes sobre sus posibles

efectos en el control de la diabetes, como por ejemplo, la reducción de la hiperglicemia e

hiperinsulinemia por parte de luteolina-7-O-glucósido en ratones diabéticos (84), la

potenciación de la captación de glucosa ejercida por isoramnetina-3-O-glucósido en un ensayo

in vitro con células musculares de ratón (85), o los efectos protectores de la crisina, frente a

diferentes complicaciones diabéticas al modular el estrés oxidativo, la inflamación y apoptosis

en diferentes modelos animales (86).

Objetivos

Objetivo general

Estudiar las características biofarmacéuticas de un extracto de hojas de Passiflora ligularis,

optimizado en flavonoides, con actividad hipoglicemiante.

Objetivos específicos

Desarrollar y validar una metodología analítica que permita la cuantificación simultánea de

los flavonoides presentes en extractos de hojas de P. ligularis.

Proponer condiciones de extracción que permitan obtener un extracto de hojas de P.

ligularis optimizado en flavonoides, con actividad hipoglicemiante.

Determinar la estabilidad de los flavonoides presentes en el extracto de P. ligularis frente a

condiciones de estrés.

Evaluar la solubilidad y permeabilidad de los flavonoides presentes en el extracto

optimizado de hojas de P. ligularis.

2. Desarrollo y validación de metodología analítica para la cuantificación de flavonoides presentes en hojas de P. ligularis

Como se mencionó anteriormente, tanto reportes de la literatura como estudios previos

realizados dentro del grupo de investigación, permiten relacionar a los flavonoides con la

actividad antidiabética del extracto de granadilla; de modo que se seleccionó el contenido de

flavonoides totales (CFT) como la variable de respuesta a optimizar en el proceso de

extracción, y principal factor a analizar en todos los ensayos de caracterización del extracto.

Por ende, se describe en el presente capítulo, las condiciones desarrolladas para la

cuantificación del CFT como marcador activo del extracto de hojas de P. ligularis,

entendiéndose por tal (según la EMA), al grupo de constituyentes aceptados para contribuir a

la actividad terapéutica de una sustancia o preparación herbal (87). De manera

complementaria y teniendo en cuenta que se ha avanzado en el estudio del mecanismo de

acción de isoquercetina, identificada en el extracto, se muestran los resultados para la

cuantificación individual de este flavonoide.

Por otro lado, y para un mejor seguimiento de los siguientes capítulos, se presentan los

resultados de comparación de los datos de cromatografía líquida acoplada a espectrometría

de masas (LC-MS) entre el extracto optimizado (descrito en el Capítulo 3) y los datos

reportados previamente por Monzón para extractos acuosos de hojas de granadilla (9), con el

fin de confirmar la identidad de los flavonoides observados en los cromatogramas.



2.1 Metodología

2.1.1 Reactivos y equipos

La metodología analítica desarrollada y validada para la cuantificación de los flavonoides por

cromatografía líquida UHPLC se llevó acabo en un cromatógrafo Thermo scientific Dionex

Ultimate 3000 equipado con un detector de arreglo de diodos Dionex Ultimate 3000, bomba

cuaternaria Dionex Ultimate 3000 RS, desgasificador en línea e inyector automático. Los datos

se procesaron utilizando el software Chromeleon Client, versión 6.80 SR15.

Para el análisis por UHPLC-MS/MS de los flavonoides presentes en el extracto optimizado se

utilizó un cromatógrafo UHPLC Shimadzu Nexera con bomba binaria LC-30AD,

automuestreador SIL-30AC, y detector de UV SPD-20AV, acoplado a un espectrómetro de

masas LC-MS 9030 de cuadrupolo-tiempo de vuelo (Q-TOF), con fuente de ionización

electrospray (ESI). La detección con ESI se realizó en modo negativo para un rango de masas

entre 100-800 m/z. Los resultados fueron analizados por medio del software LabSolutions

LCMS.

Se utilizó acetonitrilo (HoneywellTM) y metanol (Merck®) ambos en grado HPLC y grado LC-

MS, ácido fórmico (Carlo Erba) y agua purificada mediante un sistema Milli-Q Millipore®. El

estándar analítico utilizado fue isoquercetina (Quercetina-3-O-β-D-glucósido, ≥ 90%); de

Sigma Aldrich.

2.1.2 Material vegetal

La colecta del material vegetal (MV) se llevó a cabo en junio de 2018 en el municipio de

Anolaima en Cundinamarca (Latitud: 4°50.0172′ N; Longitud: 74°29.97′ O; Altitud: 1850

m.s.n.m) mediante el permiso de recolección de muestras otorgado por el ANLA y el Ministerio

de Ambiente y Desarrollo: "BIOSPROSPECCION DE ESPECIES DE SOLANUM, PASSIFLORA,

PHYSALIS, HYPERICUM, CECROPIA E ILEX", código 38024, resolución 0699 de abril 26 de

2018, Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible OtroSi No7 al contrato 121 del 22 de

enero del 2016.

Capítulo 2 21

Para ello, se solicitó a uno de los cultivadores la recolección de aquellas hojas que eran cortadas

como parte del proceso de poda de los cultivos, de manera que se aseguró exclusivamente la

recolección de material considerado como subproducto del cultivo. Posteriormente, se

seleccionaron las hojas que no presentaran daños morfológicos por exposición solar, plagas,

entre otros. Un ejemplar de la especie estudiada fue depositado en el Herbario Nacional

Colombiano (COL 602878), Anexo: -Figura S3- 1:.

2.1.3 Extractos analizados

Para el desarrollo de la metodología analítica se utilizaron extractos acuosos de las hojas,

obtenidos mediante infusión con agua durante 10 minutos (proporción 1:10 droga-solvente);

se filtró por gravedad y liofilizó el extracto obtenido (88).

Posteriormente, para el análisis de los flavonoides por LC-MS/MS, se estudió el extracto

optimizado obtenido mediante extracción asistida por ultrasonido, cuyas condiciones de

extracción se discuten en el Capítulo 3.

2.1.4 Curvas de calibración preparadas

Fueron preparadas dos curvas de calibración mediante el método de patrón externo, una para

la determinación del contenido de flavonoides totales (CFT), expresados como mg-

equivalentes de isoquercetina/g extracto seco y otra para la cuantificación individual de

isoquercetina (quercetina-3-O-glucósido). La determinación del CFT se realizó mediante la

suma de las señales cromatográficas que presentaran espectros de absorción característicos

de flavonoides, es decir, dos bandas de absorción máximas entre: 240-295 ηm y 300-400 ηm

(89).

Como se puede observar en la Tabla 2-1, las soluciones preparadas para la curva de

flavonoides totales e isoquercetina fueron las mismas. Sin embargo, se varió la longitud de

onda a la cual se identificaron los valores de área bajo la curva debido a que a 350 ηm se podía

detectar con mayor especificidad los flavonoides en el cromatograma; por el contrario, 260 ηm

corresponde a la longitud de onda de máxima absorbancia de isoquercetina. Todas las

soluciones fueron preparadas por triplicado, disueltas en metanol-agua (1:1) y filtradas por

una membrana de 0.22 µm previo a su inyección en el cromatógrafo.



Tabla 2-1: Soluciones preparadas para cada curva de calibración.

Curva de

calibración

Solución madre

(µg/mL)*

Rango de

concentraciones

(µg/mL)*

Longitud de onda

de detección (ηm)

Flavonoides totales 1170 0.059 – 292.7 350

Isoquercetina 1170 0.059 – 292.7 260

*Se muestran los valores de concentración ajustados de acuerdo con el porcentaje de pureza

de los estándares analíticos utilizados.

Los parámetros de validación analizados se evaluaron de acuerdo con las pautas de la guía ICH

(International Conference Harmonization) (90). Los parámetros validados fueron:

- Linealidad: Definida como la proporcionalidad directa entre la respuesta evaluada, en

este caso área bajo la curva, y la concentración del analito en la muestra. Para su

determinación dentro del rango de concentraciones estudiado, se utilizó la prueba

estadística t-Student.

- Precisión: La precisión del procedimiento analítico se evaluó en dos niveles:

repetibilidad (precisión intra-ensayo) y precisión intermedia (precisión inter-día).

Para ello se analizaron 3 niveles de concentración de las soluciones estándar por

triplicado en un día y en tres días consecutivos, respectivamente.

- Exactitud: La exactitud se expresó como el porcentaje de recuperación obtenido

después de adicionar cantidades conocidas de la solución estándar a una solución de

extracto; se calculó siguiendo la ecuación: Recuperación (%) = (Contenido teórico *

100) / Contenido experimental.

- Límite de detección (LDD) y límite de cuantificación (LDC): Determinados mediante

diluciones sucesivas hasta observar una relación señal-ruido de 3:1 para el LDD y 10:1

junto con un %CV < 5 para el LDC.

Se utilizó el software Microsoft Excel para el análisis estadístico de los parámetros

mencionados anteriormente.

Capítulo 2 23

2.2 Resultados y Discusión

2.2.1 Desarrollo de la metodología analítica

Para el desarrollo de la metodología analítica por UHPLC-DAD se partió de una metodología

previamente validada para la cuantificación de vitexina y crisina en extractos y productos

comerciales de diferentes especies del género Passiflora (91) (Método A, Figura 2-1).

Resolver el cromatograma para la cuantificación de los flavonoides representó un reto debido

a la polaridad alta a media que éstos mostraron y a la complejidad del extracto. Fue necesario

realizar algunas modificaciones al método de elución, flujo y temperatura del horno, con el fin

de lograr la mayor resolución posible de los picos.

Inicialmente se extendió el tiempo de la rampa entre el 20-35% de acetonitrilo (Método B,

Figura 2-1), ya que en estos valores se presentó coelución de la mayoría de metabolitos en el

método A. Sin embargo, solo se observó como resultado la separación de los picos de menor

polaridad. Por tal motivo, se iniciaron las rampas desde un menor porcentaje de ACN, y se

evaluó el efecto de la temperatura. Al comparar el método C con el método D (Figura 2-1) se

ve que en este último la combinación de varias rampas cortas con cambios leves en la

proporción de los solventes, facilitaban más la separación de los metabolitos de mayor

polaridad y que a su vez, en el método C, el cambio de la temperatura de 35 a 40ºC generó

disminución del tiempo muerto. Esto se debe a que aumentos en la temperatura conllevan a la

disminución de la viscosidad de la fase móvil, y por ende menor resistencia al flujo en la

columna, de modo que disminuye la retención y la presión del sistema, lo cual permite utilizar

flujos más altos (92). Finalmente, se decidió combinar el incremento de la temperatura del

horno de la columna (del método C), con la implementación de 5 rampas que aumentaran el

poder de elución lentamente desde 5 al 40% de acetonitrilo (como en el método D), gradiente

que a pesar de prolongarse por un tiempo considerable para una corrida cromatográfica

UHPLC, permitió obtener mayor resolución de todos los picos tal como se observa en la Figura

2-1, Método E.

Método Método Método



Figura 2-1: Perfiles cromatográficos (350 ηm) obtenidos para el extracto de hojas de P.

ligularis tras realizar diferentes modificaciones al método A. Se utilizó la Columna

Phenomenex® Kinetex C18 (100 × 2,1 mm; 2,6 μm) y volumen de inyección 10 μL en todos los

casos.

A: Acido fórmico 0.5%

B: Acetonitrilo Tº: 35ºC.

Flujo: 0.3 mL/min

Método A

10

35

85

100

50

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16

%B

min

Método B

A: Acido fórmico 0.5%


Flujo: 0.3 mL/min 10

20 35

85

100

50

100

0 5 10 15 20 25 30

%B

min

Método C

5 1020

25

50

50

20

40

60

0 5 10 15 20 25 30 35%

Bmin

A: Acido fórmico 1%.


Flujo: 0.4 mL/min

Método D

5 10 13 1825

40

50

20

40

60

0 10 20 30 40

%B

min

A: Acido fórmico 1%. B: Acetonitrilo Tº: 35ºC. Flujo: 0.4 mL/min

Método E

A: Acido fórmico 1%. B: Acetonitrilo Tº: 40ºC. Flujo: 0.5 mL/min

5 10 13 1825

40

50

20

40

60

0 10 20 30 40

%B

min

Capítulo 2 25

Al realizar la revisión de la literatura para el estudio de especies del género Passiflora, se

encontró que la principal aplicación de la cromatografía líquida de alta eficiencia es el análisis

cualitativo o estudio químico de diferentes extractos, tanto poco complejos como compuestos

de un gran número de metabolitos, de modo que la mayoría de métodos desarrollados no

buscan la obtención de perfiles cromatográficos con gran resolución de los picos, y por ende,

consisten de condiciones relativamente más sencillas, como por ejemplo: gradientes de 17-

35% ácido fórmico 0.5% en ACN (0-20 min; fase acuosa acidificada 0.5%) (93); acetonitrilo

15-35% (0-8 min), 35% (8-10 min) (94), o combinaciones de las dos fases A: agua, B: ACN

(ambas acidificadas al 0.1%), iniciando al 5% B (0-1 min), 5-95%B (1-16 min), 95%B (16-18

min) para retornar a la condición inicial en 2 minutos (95). Todas las condiciones anteriores

fueron utilizadas para el análisis de diferentes extractos de hojas de Passifloras mediante

UHPLC, en fases estacionarias C-18, sin control de temperatura de la columna (lo cual puede

afectar la reproducibilidad del método), con flujos entre 0.15-0.35 mL/min.

Por otro lado, en caso de requerirse la cuantificación del contenido de flavonoides, muchos

estudios reportan el uso de técnicas colorimétricas como por ejemplo la de cloruro de aluminio

(96); y en caso de desarrollar una metodología por HPLC, se enfocan usualmente en la

cuantificación de 1 o pocos flavonoides específicos, principalmente, vitexina, isovitexina,

orientina, e isoorientina, (97). Mediante condiciones bastante similares a las anteriormente

mencionadas, como mezclas de la fase acuosa acidificada (A) y acetonitrilo como fase orgánica

(B), en un gradiente lineal de 5-20% de B en A durante 30 minutos (96), lo cual se asemeja al

método C evaluado para el extracto de hojas de P. ligularis, pero que no otorgó suficiente

resolución entre los dos primeros picos del perfil ni a los que co-eluían entre el minuto 16-17.

Se encontraron algunos métodos reportados para el estudio de P. ligularis mediante HPLC,

considerablemente diferentes al presentado anteriormente. Por un lado, porque se llevaba a

cabo el análisis de extractos del fruto, donde se utilizaban como fases móviles (A) ácido fórmico

al 0.1% y (B) metanol en un gradiente que alcanzaba condiciones mucho más apolares, desde

10-70%B (0-4 min), 70-100%B (4-7 min), 100-10%B (7-8 min) (98); o por otro lado, porque

el método desarrollado estaba basado en condiciones previamente reportadas para el análisis

de flavonoides C-glicosilados, principales metabolitos identificados en diferentes especies de

Passiflora. El método se diferencia especialmente en la composición de la fase móvil en modo

isocrático: solvente A (tetrahidrofurano:isopropanol:acetonitrilo, 10:2:3, v/v/v) y solvente B



(H3PO4 0.5%) (12% A en B) a un flujo de 1 mL/min. Sin embargo, en dicho reporte no se

presenta el cromatograma de las hojas de granadilla ya que no se identificó en su extracto los

compuestos C-glicosilados, y adicionalmente, en las matrices complejas evaluadas como el

extracto de P. tripartita var mollissima, los compuestos eluían desde el minuto 5 hasta el 45,

con muy poca resolución de los picos (79).

Con el fin de cumplir con los objetivos planteados en el presente trabajo, era necesario obtener

la mayor resolución posible de los picos observados en los extractos de P. ligularis, para lograr

una cuantificación más certera del contenido de flavonoides totales, identificar la posible

degradación de los metabolitos (ya fuese por desaparición de los picos o aparición de nuevos

compuestos) en las pruebas bajo condiciones de estrés, e igualmente, evaluar y cuantificar

potenciales cambios en el contenido de las muestras biológicas obtenidas tras los ensayos de

permeabilidad. Es así, como finalmente se plantea el siguiente sistema cromatográfico, para la

cuantificación de flavonoides en extractos polares de hojas de granadilla (perfil

correspondiente al Método E en la Figura 2-1):

Fase estacionaria: Phenomenex® Kinetex C18 (100 × 2,1 mm; 2,6 μm)

Temperatura del horno: 40 °C

Flujo constante: 0,5 ml/min

Volumen de inyección: 10 μL.

Fase móvil: ácido fórmico 1.0% en agua (fase A) y acetonitrilo (fase B), comenzando desde 5-

10 %B (0-10 min), 10-13 %B (10-20 min), 13-18 %B (20-25 min), 18-25 %B (25-32 min), 25-

40 %B (32-38 min), 40-5 %B (38-40 min).

2.2.2 Validación de la metodología analítica

A continuación, se presentan los resultados de los parámetros de validación evaluados.

- Linealidad

El grado de correlación entre el área bajo la curva y la concentración de las muestras se

determinó inicialmente mediante el coeficiente de correlación, el cual fue superior a 0.995

para las 3 curvas de calibración. De igual modo, se observa en la Tabla 2-2, los rangos de

Capítulo 2 27

concentraciones que en cada curva cumplieron con las pruebas de hipótesis realizadas

mediante el estadístico t; es decir, que teniendo como criterio el rechazo de la hipótesis nula

con un t calculado mayor al t tabulado, ninguna de las curvas presentó sesgo en la pendiente

(es decir, se rechazó que la pendiente fuese igual a cero), ni en el intercepto (se aceptó punto

de corte en 0). En los tres casos, los datos se ajustaron con un 95% de confianza al modelo

de regresión lineal; cumpliendo así con el parámetro de linealidad.

- Precisión y Exactitud

Como se mencionó anteriormente, la precisión se evaluó como repetibilidad y precisión

intermedia. Se observa en la Tabla 2-3 que se cumple con dicho parámetro, ya que las 3

concentraciones analizadas para cada curva, tanto en un día como en tres días consecutivos,

presentan valores de coeficiente de variación inferiores al 5%, límite recomendado por la

ICH. Adicionalmente, se observa en la misma tabla que la exactitud expresada como el

porcentaje de recuperación, se encuentra entre el 90-110% con coeficientes de variación

aceptables entre 1.141-4.045%.

- Límite de detección y límite de cuantificación

Se determinaron como límites de detección y cuantificación, 0.059 y 0.293 µg/mL para las

curvas de FT e isoquercetina.

28 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de Passiflora ligularis

(granadilla) optimizado en flavonoides

Tabla 2-2: Rango de concentraciones para las curvas de calibración de flavonoides totales, isoquercetina y astragalina que cumplen con el

parámetro de linealidad de acuerdo con la prueba t-student.

Analito

Rango de

linealidad

(µg/mL)

Ecuación de

calibración (r2)a Parámetro Ho b t Calculado t Tabuladoc Criterio

Isoquercetina (FT)

(350 nm) 5.841 – 292.7 y = 0.4393x – 0.2855 0.9991

Pendiente b=0 tb = 137.1 2.119 Rechazar H0

Intercepto a=0 ta = 0.677 2.119 Aceptar H0

Regresión

No hay

correlación

entre X y Y

tr = 133.3 2.119 Rechazar H0

Isoquercetina

(260 nm) 5.841 – 117.1 y = 0.5621x – 1.5005 0.998

Pendiente b=0 tb = 12.43 2.178 Rechazar H0

Intercepto a=0 ta = 0.551 2.178 Aceptar H0

Regresión

No hay

correlación

entre X y Y

tr = 82.64 2.178 Rechazar H0

a Coeficiente de correlación. b Hipótesis nula. c Valor de t de dos colas; n-2 g.l; α = 0.05.

Capítulo 2 29

Tabla 2-3: Datos de precisión y exactitud de la curva de calibración de flavonoides totales,

isoquercetina y astragalina.

Analito (µg/mL) Precisión Exactitud

Repetibilidad (1 día)

X ± %CV (n=3)

Precisión intermedia

(3 días) X ± %CV

(n=3)

%Recuperación X ± %CV (n=3)

Isoquercetina (350 ηm)

5.841 1.960 ± 3.404 1.990 ± 1.714 102.2 ± 2.307

58.55 27.08 ± 2.888 27.18 ± 4.077 108.1 ± 4.045

117.1 53.52 ± 1.014 53.66 ± 1.180 110.7 ± 3.610

Isoquercetina (260 ηm)

5.841 2.342 ± 1.082 2.404 ± 2.489 106.5 ± 3.292

58.55 32.47 ± 2.585 32.67 ± 3.223 108.1 ± 4.199

117.1 64.36 ± 1.812 64.75 ± 0.944 110.2 ± 3.299

2.2.3 Análisis de los flavonoides presentes en el extracto optimizado de hojas de granadilla mediante UHPLC-MS/MS

Como se mencionó anteriormente, se han realizado dos trabajos de investigación enfocados al

estudio químico de extractos polares obtenidos a partir de las hojas de P. ligularis (9,78).

Monzón, logró realizar la identificación de la gran mayoría de picos observados en los

cromatogramas, principalmente mediante la comparación de los patrones de fragmentación

MS/MS con reportes en la literatura, y en algunos casos, confirmó la identificación mediante

resonancia magnética nuclear (RMN). A partir de esta información, se buscó corroborar la

identidad de los flavonoides observados mediante UHPLC-DAD en el extracto optimizado, ya

que, aunque el perfil cromatográfico de éste fuese similar a los presentados en el trabajo

mencionado, se encontraron algunas diferencias en la zona media de los cromatogramas, que

dificultaron la asignación de los flavonoides basándose solamente en los espectros de

absorción. De este modo, se presenta en la Figura 2-2 la numeración de los picos analizados

en los cromatogramas del extracto optimizado.



Figura 2-2: Cromatogramas del extracto optimizado de hojas de P. ligularis mediante UHPLC-

MS/MS. A) Cromatograma UV a 350 ηm. B) Cromatograma de iones totales (TIC). Se presenta

con numeración los picos con espectros de absorción característicos de flavonoides; en azul

los flavonoides identificados, y en rojo compuestos fenólicos sin identificar.

Condiciones cromatográficas similares a las del método E; fase A: ácido fórmico 0.1% y fase B:

acetonitrilo. La fase estacionaria, temperatura del horno de la columna y gradiente de las fases móviles

se mantuvo igual. La muestra se preparó a una concentración de 2 mg/mL, y el volumen inyectado fue

3 µL.

1

2

3ª

3b

4

6

7

8ª

8b

9

12

13

15

A

B

Ab

sorb

anci

a (m

AU

)

1

2 4

6

7 9

12 13

15

Inte

nsi

dad

14

14

5

5

10

10

11

11

3ª

3b

8ª

8b

Capítulo 2 31

Para el análisis de los resultados de UHPLC-MS/MS, se muestra en la Tabla 2-4 los resultados

reportados por Monzón, utilizados como base para confirmar la identificación de los picos

observados en el perfil cromatográfico del extracto optimizado. Adicionalmente, se utilizó una

herramienta de derreplicación en línea con las librerías disponibles en el Global Natural

Products Social Molecular Networking (GNPS), una plataforma de libre acceso para el

almacenamiento, intercambio, análisis y difusión de datos de espectrometría de masas en

tándem (MS/MS), que incluye tanto bases de datos relevantes en productos naturales (como

por ejemplo MassBank, ReSpect, HMDB, NIST, entre otras), como bibliotecas espectrales

experimentales depositados por la comunidad. De modo que el GNPS permite analizar y

comparar un conjunto de datos con todos los disponibles públicamente. Dicha comparación se

basa en un algoritmo de correspondencia o puntuación de coseno, que determina la similitud

en la fragmentación de dos espectros con puntajes desde cero (totalmente diferentes) hasta 1

(idénticos) (99). Por ende, además de presentar los resultados de MS/MS del extracto

optimizado en la Tabla 2-4, se relaciona el valor de coseno obtenido para cada espectro

identificado mediante la comparación con las librerías de datos disponibles en el GNPS. Se

establecieron como parámetros para la búsqueda, un puntaje de coseno mínimo de 0.65 y por

lo menos 6 picos coincidentes entre dos espectros, para reconocer o establecer

correspondencia con una molécula (match o hit). En los casos donde el proceso de

derreplicación no encontró match con un compuesto de referencia, puede deberse a diferentes

circunstancias, como por ejemplo: aún no se ha incluido dicho espectro dentro de las librerías

del GNPS; diferencias en las condiciones para la toma de datos espectroscópicos, entre los

datos experimentales y los almacenados en la plataforma, que cambian significativamente la

calidad de los mismos, como el uso de equipos de baja/alta resolución, o energías de colisión

distintas que alteran los patrones de fragmentación, entre otros.



Tabla 2-4: Comparación de datos UHPLC-MS/MS entre el extracto optimizado y extractos acuosos de hojas de granadilla.

Nº

Monzón, 2019 Extracto optimizado

Identificación propuesta Identificado

por RMN [M-H]-

Datos MS/MS

λmax (ηm)

[M-H]-

Tiempo retención

(min)

Datos MS/MS λmax

(ηm) Coseno

1 Sí 463.0864

301(26), 300(46), 271(33), 255 (8), 151(5)

255

357

463.0881

Tr: 15.44

271.0240 (100)

255.0296 (42)

300.0269 (35)

151.0027 (7)

301.0341 (6)

255 353

0.92

Quercetina-3-O-glucósido

(Flavonol)

2 Sí 447.0937 285(74), 284(83), 175(5)

255

347

447,0900

Tr: 15.92

284.0319 (100)

285.0397 (70)

133.0286 (13)

151.0022 (8)

175.0382 (4)

255 347

0.94

Luteolina-7- O-glucósido

(Flavona)

3a No detectado/No identificado 505.0900

Tr: 18.63

271.0240 (100) 300.0268 (40) 255.0291 (31) 243.0293 (26) 255

354

0.91

Quercetina-3-O-(6''-acetil)-glucósido (Flavonol)

3b No 549.0808 505 (10) 300 (25) 151 (3.1)

255 357

549.0000

Tr: 18.66

271.0240 (100) 300.0266 (72) 255.0292 (46) 243.0296 (18)

0.92

Quercetina-3-O-(6''-malonil)-

glucósido (Flavonol)

Capítulo 2 33

Nº



por RMN [M-H]-

Datos MS/MS

λmax (ηm)

[M-H]-

Tiempo retención

(min)

Datos MS/MS λmax

(ηm) Coseno

4 No 447.0928

285(22) 284(5),

255(42), 227(44)

265 355

447.0927

Tr: 19.92

227,0343 (100) 255,0291 (95) 183.0443 (15) 284,0327 (12)

265 354

0.92

Kaempferol-3- O-glucósido

(Flavonol)

5 No [M+H]+

433.1115 271(20)

258 350

431.0981

Tr: 20.55

270,0427 (100) 269, 0405 (85) 268, 0365 (48) 241, 0440 (29) 212, 0446 (21)

267 337

0.90

Apigenina-7- O-glucósido

(Flavona)

6 No detectado/No identificado 549,000

Tr: 22.62

271.0233 (100) 300.0267 (65) 255.0294 (53) 301.0348 (17)

255 350

Sin hit Desconocido (Flavonol)

7 No

[M+H]+ 479.1164

317(67) 256 351

477.1034

Tr: 22.98

299.0189 (100) 271.0241 (86) 199.0395 (10) 243.0293 (8) 300.0263 (6) 314.0425 (4)

255 350

Sin hit

Isoramnetina-3-O-glucósido (Flavonol)



Nº



por RMN [M-H]-

Datos MS/MS

λmax (ηm)

[M-H]-

Tiempo retención

(min)

Datos MS/MS λmax

(ηm) Coseno

8a

No detectado/No identificado 489.1000

Tr: 23.8

255.0291 (100) 227.0342 (77) 284.0324 (23) 285.0401 (9)

265 345

Sin hit

Kaempferol-3-O-(6”-acetil)-glucósido (Flavonol) (100)

8b No 533.0881 489 (8) 285(22)

264 346

533.0934

Tr: 23.8

255.0288(100) 284.0319 (65) 227.0345 (51) 285.0399 (34)

Sin hit

Kaempferol-3-O-(6”-malonil)-


9 No detectado/No identificado 533.0934

Tr: 24.38

285.0398 (100) 284.0325 (87) 151.0029 (5) 133.0285 (5) 489.1033 (2)

266

350 Sin hit

Luteolina-7- O-(6”-O-malonil)-

glucósido (Flavona) (101)

Capítulo 2 35

Nº



por RMN [M-H]-

Datos MS/MS

λmax (ηm)

[M-H]-

Tiempo retención

(min)

Datos MS/MS λmax

(ηm) Coseno

10 No 565.1119b 519 (10) 317 (15)

254 347

563.1000

Tr: 25.5

300.0269 (100) 271.0234 (66) 255.0290 (29) 315.0487 (3)

251-

260,

350-

355

Sin hit

Isoramnetina-3-O-(6”-malonil)-


11 No detectado/No identificado

473.1000

Tr: 27.2

268.0367 (100) 267.0290 (10) 240.0427 (9) 269.0442 (8)

267

337

Sin hit Desconocido (Flavona)

12 Sí 415.1025

253(100) 267

415.1000

Tr: 27.7

253.0501 (100) 143.0496 (18) 119.0493 (11)

267

305

Sin hit

Crisina-7-O-β-glucósido

(Flavona)

13 Sí 457.1137 253(100) 267 457.1100

Tr: 31.9

253.0497 (100)

267 Sin hit

Crisina-7-O-(6”-O-acetil)-

glucósido (Flavona)



Nº



por RMN [M-H]-

Datos MS/MS

λmax (ηm)

[M-H]-

Tiempo retención

(min)

Datos MS/MS λmax

(ηm) Coseno

14 No detectado/No identificado 559.1000

Tr: 32,3

253.0499 (100) 209.0604 (4) 143.0491 (3)

267 Sin hit Desconocido (Flavona)

15 Sí 253.050 145(3) 267 253,05

Tr: 36,45

143,0494 (100) 145,0288 (80) 119,0498 (79)

267

315 Sin hit

Crisina (Flavona)

Capítulo 2 37

Los flavonoides, son un grupo de compuestos polifenólicos que se caracterizan por presentar

una estructura básica C6-C3-C6, donde usualmente el puente de 3 carbonos que une los dos

anillos fenólicos (A y B) se ciclan para la formación del anillo C. Dependiendo de la ciclación de

dicho puente, el grado de insaturación y oxidación del anillo C, o del número del carbono al

cual éste se une con el anillo B, los flavonoides se pueden clasificar en diferentes grupos tal

como se muestra en la Figura 2-3 (102).

Figura 2-3: Esqueletos estructurales de las principales clases de flavonoides. Las flechas

indican las posiciones de O- y C- glicosilaciones más comunes (102).

Como se mencionó anteriormente, dos bandas de absorbancia son características en los

espectros UV-Vis de flavonoides. La banda A puede presentarse desde 310-350 ηm para

flavonas y de 350-385 ηm en el caso de los flavonoles. Por el contrario, la banda B, en el rango

de 250-290 ηm es constante a estos dos subgrupos. En el caso de las flavanonas, la banda A se

parece a un hombro reducido entre 300-330 ηm y la banda B, el pico principal, se restringe un

poco de 277-295 ηm (89). De acuerdo con los resultados de la Tabla 2-4, se observa que el

extracto de hojas de granadilla cuenta principalmente con flavonoides tipo flavonol y flavona,

la mayoría glucosilados mediante enlaces O-C en las posiciones 3 del anillo C o 7 del anillo A.

Flavonoles Antocianinas Flavanona

s

Chalconas Flavonas Isoflavonas



Dentro del grupo de los flavonoles, el pico 1, uno de los mayoritarios, ya había sido

previamente identificado por co-inyección con estándar y mediante RMN, como la

isoquercetina (9). Un derivado de este, quercetina-3-O-(6''-malonil)-glucósido (3b, también

mayoritario) fue identificado por Monzón debido a la pérdida del grupo O-hexosa-malonato a

partir del ion pseudo-molecular [M-H]⎺̅ 549 m/z, generando el fragmento m/z=300 junto con

los demás fragmentos característicos del núcleo de quercetina como 271 y 255 m/z (103). Sin

embargo, en el trabajo de Monzón no se contempló la sobreposición de quercetina-3-O-(6''-

malonil)-glucósido con quercetina-3-O-(6''-acetil)-glucósido (3a), este último se puede

explicar por la presencia del ion [M-H]⎺̅ 505 m/z, que al perder el grupo acetil-glucosa,

fragmenta en el ion 300 m/z [M-H-204]⎺ ̅•. Ambos picos 3ª y 3b, fueron identificados por

dereplicación con el GNPS con valores de coseno 0.91 y 0.92, respectivamente.

A su vez los picos 4, 8ª y 8b presentaron iones característicos del patrón de fragmentación del

núcleo kaempferol, 255 m/z (M-CO+H) y 227 m/z (M-2CO+H); sin embargo, en el pico 4, la

fragmentación MS2 del ion pseudo-molecular 447 m/z condujo a la escisión de la hexosa y

detección del fragmento 284 m/z [M-H-162]⎺ ̅•, confirmando la presencia de kaempferol-3-O-

glucósido. Para el pico 8ª [M-H]⎺ ̅ 489 m/z, se propuso la pérdida de 204 unidades de masa

atómica (u) de una acetil hexosa, que generaron el fragmento 285 m/z, lo que corresponde en

la literatura con el kaempferol-3-O-(6”-acetil)-glucósido (100); y en el pico 8b, la pérdida

de 248 u a partir del ion [M-H]⎺̅ 533 m/z, indicó nuevamente la fragmentación de la hexosa

con el grupo malonato, generando el ion m/z =285, es decir, kaempferol-3-O-(6”-malonil)-

glucósido (9).

Por otro lado, se detectó un ion pseudo-molecular [M-H]⎺ ̅ 548 m/z (pico 6), cuya

fragmentación es similar a los derivados de quercetina, sin embargo, se desconoce su

identidad. El pico 7, se relacionó a la identificación propuesta por Monzón como isoramnetina-

3-O-glucósido, debido al ion [M-H]⎺ ̅ 477 m/z y el fragmento característico 315 m/z [M-H-162]⎺ ̅

o 314 m/z [M-H-162]⎺ ̅• causados por la pérdida de la glucosa (104,105); se propuso la

glicosilación en la posición 3 teniendo en cuenta que, al estar sustituido el hidroxilo de dicha

posición, el máximo de la banda A de los flavonoles se presenta alrededor de 348-355 ηm

(106). De igual modo, el pico 10 coincidió con la propuesta de isoramnetina-3-O-(6”-malonil)-

Capítulo 2 39

glucósido debido a los fragmentos 563 m/z [M-H]⎺ ̅ y 315 m/z [M-H-248]⎺ ̅, el último sugiere la

pérdida de la hexosa y el grupo malonato.

Del subgrupo de las flavonas, se contrastó el patrón de fragmentación de luteolina-7-O-

glucósido (pico 2) y siendo los fragmentos m/z 175, 151 y 133 característicos del núcleo de

luteolina (103), se propone que el pico 9 (no detectado o identificado por Monzón) sea un

derivado de éste, específicamente luteolina-7-O-(6”-malonil)-glucósido, teniendo en cuenta

que para este compuesto se reporta en la literatura los fragmentos [M-H]⎺̅ 533 m/z, [M-H-

CO2]⎺ ̅ 489 m/z y [M-H-248]⎺ ̅ 285 m/z; con dos máximos en su espectro de absorbancia en 350

y 267 ηm (101), datos concordantes con los encontrados experimentalmente.

Por otro lado, se confirmó la presencia de apigenina-7-O-glucósido (pico 5) ya que, la pérdida

de 162u (hexosa) a partir del ion [M-H]⎺̅ 431 m/z produjo el fragmento 269 m/z en mayor

proporción que el ion 268 m/z, correspondiente a la aglicona radical, lo cual indica la

sustitución del hidroxilo en la posición 7 (107); además, el espectro de absorción observado

para el pico 5 es similar al reportado en la literatura, λmax 270 y 338 ηm (108). Estos valores

no concuerdan con los de Monzón debido probablemente, a que el espectro de este compuesto

se vió afectado por la co-elución con kaempferol-3-O-glucósido (9).

El pico 11, con un espectro de absorción y fragmentos similares a los observados para el pico

5, podría corresponder a un derivado de apigenina, posiblemente acetil-glucosilada, ya que se

observó la pérdida de 204 u (acetil-hexosa) a partir del [M-H]⎺̅ 473 m/z, obteniendo el ion 269

m/z. Sin embargo, la proporción de este último fragmento fue mucho menor respecto a la del

ion 268 m/z, lo cual podría indicar la sustitución de un hidroxilo diferente al de la posición 7.

Para lo cual no se encontró patrón de fragmentación coincidente en la literatura.

Adicionalmente, se confirmó la presencia de los diferentes derivados de crisina identificados

por Monzón (tanto por LC-MS/MS como por RMN), teniendo en cuenta que éstos presentan

como máximo de absorbancia característico la longitud de onda de 267 ηm y, el fragmento de

[M-H]⎺ ̅ 253 m/z del núcleo de crisina. De modo que los picos 12, 13 y 15, correspondieron a

crisina-7-O-β-glucósido, crisina-7-O-(6”-O-acetil)-glucósido y crisina respectivamente. El pico

14 se propone sea otro derivado de crisina.



Gracias a la derreplicación mediante el GNPS, fue posible corroborar la presencia de seis

flavonoides con valores de coseno superiores a 0.9 (picos 1, 2, 3ª, 3b, 4, 5), de los cuales, los

picos 3b y 5 no pudieron ser confirmados por Monzón mediante otras técnicas como RMN,

debido a su baja concentración en el extracto y/o dificultad para aislarlos; y 3a se propone en

este trabajo como un compuesto coeluyente con 3b (ambos derivados de quercetina-3-O-

glucosa). Asimismo, el análisis derreplicativo encontró un alto grado de similitud de dos

espectros MS/MS con dos procianidinas, indicando la presencia de procianidina B1 ([M-H]⎺ ̅

577.1359 m/z, tr: 2.98 min, coseno: 0.91) y procianidina B2 ([M-H]⎺ ̅ 577.1349 m/z, tr: 5.95

min, coseno: 0.90). Este tipo de flavanoles o taninos condensados se han reportado en otras

especies del género Passiflora como P. coccinea y P. tripartita var. mollissima (109,110).

2.3 Conclusiones

Se desarrolló una nueva metodología analítica mediante cromatografía líquida de ultra-alta

eficiencia, que permite mayor resolución de los picos detectados por UV en un extracto de

hojas de granadilla, respecto metodologías previamente reportadas para el análisis de

diferentes especies del género Passiflora. Gracias a la preparación de 2 curvas de calibración

que cumplen con los parámetros de validación de linealidad, precisión, exactitud, límites de

cuantificación y detección, es posible cuantificar los flavonoides presentes en la matriz

estudiada, tanto flavonoides totales (expresados como mg-equivalentes de isoquercetina/g

extracto seco), como del principal metabolito estudiado hasta el momento, isoquercetina

(quercetina-3-O-glucósido).

Gracias al análisis de UHPLC-MS/MS, se logró corroborar para el extracto optimizado de hojas

de granadilla, la presencia de los principales flavonoides identificados previamente por

Monzón, junto con 3 picos (6, 11, 14) de identidad desconocida pero que presentaron espectros

de absorción característicos de flavonoides. Adicionalmente, se planteó la identidad de tres

picos, 3ª, 8ª y 9, no detectados en el trabajo de referencia, pero cuyos patrones de

fragmentación correspondieron con los flavonoles quercetina-3-O-(6''-acetil)-glucósido,

kaempferol-3-O-(6”-acetil)-glucósido, y la flavona luteolina-7-O-(6”-O-malonil)-glucósido,

respectivamente.

3. Obtención de un extracto de hojas de P. ligularis optimizado en flavonoides con actividad hipoglicemiante

3.1 Metodología

3.1.1 Material vegetal

Colecta

El material vegetal utilizado fue el mismo al descrito en el capítulo anterior, en la colecta

realizada en el municipio de Anolaima (2.1.2 Material vegetal).

Secado, molienda y tamizaje

Se seleccionó como método de secado, la liofilización de las hojas por un periodo de 24-48

horas, esto debido a los resultados obtenidos por Monzón en la evaluación del efecto del

método de almacenamiento y secado de las muestras en la composición química de los

extractos (9).

Las hojas liofilizadas fueron pulverizadas en un molino de cuchillas y tamizadas mediante la

batería de tamices USP Mesh 10, 40, 50 y 80, que se dejó en vibración durante 15 minutos.

3.1.2 Planteamiento del diseño experimental para el proceso de

extracción por ultrasonido

Se utilizó un diseño experimental Box-Behnken el cual es sugerido para estudiar procesos que

no incluyan puntos o niveles extremos, evaluar interacciones entre los factores y plantear



diseños con menos experimentos (más económicos) pero con el mismo número de factores

que se podrían analizar en otros diseños (111).

Basado en la revisión de la literatura y de acuerdo con las características que podían ser variadas en el equipo de ultrasonido empleado, se seleccionó el tiempo de extracción, la temperatura y porcentaje de etanol, como los factores a evaluar en tres niveles: bajo (-1), medio (0), y alto (1), ( Tabla 3-1). Se evaluó como variable dependiente o variable respuesta a maximizar, el

contenido de flavonoides totales, cuantificados mediante la metodología analítica de FT

descrita previamente en el Capítulo 2.

Tabla 3-1: Condiciones de extracción a evaluar mediante el diseño Box-Behnken.

Nivel

Factor

Tiempo (min) Temperatura (°C) %Etanol

-1 20 30 60

0 40 50 80

1 60 70 100

3.1.3 Procedimiento de extracción por ultrasonido

Se puso un gramo (1g) de material vegetal molido en contacto con 20 mL de la solución hidro-

etanólica en un tubo para centrífuga de 50 mL con tapa. Dicho tubo fue colocado en un baño

de ultrasonido Digital Ultrasonic Cleaner (PS-30A; Shenzhen huatai Ultrasonic Cleaning

Machine Co. Ltd) con capacidad de 6.5L, frecuencia de 40 KHz y potencia de 180W. Para la

preparación del solvente de extracción en los porcentajes planteados en la Tabla 3-1, se utilizó

etanol 99.5% (PanReac AppliChem) y agua destilada.

Los extractos obtenidos se filtraron por gravedad, se concentraron bajo presión reducida a

temperatura controlada (40ºC), fueron congelados y finalmente liofilizados para su posterior

análisis y cuantificación de flavonoides totales.

Una vez obtenidas las condiciones óptimas de extracción mediante la metodología de

superficie respuesta (RSM-Response Surface methodology), estas se emplearon para obtener

Capítulo 3 43

extracto en 3 días diferentes, por triplicado cada uno, con el fin de verificar la validez del

modelo estadístico obtenido y la reproducibilidad del proceso de extracción.

Adicionalmente, se comparó el perfil cromatográfico y el CFT del extracto optimizado con el

de un extracto obtenido por infusión, método de extracción comúnmente utilizado en la

medicina tradicional. La extracción por infusión se llevó a cabo con agua en ebullición durante

10 minutos, en proporción droga-solvente 1:10; se filtró por gravedad y liofilizó el extracto

obtenido (88)

3.1.4 Ensayo de actividad inhibitoria de la formación de productos finales de glicación avanzada (AGEs)

Las proteínas, lípidos y ácidos nucleicos expuestos a niveles elevados de glucosa durante

períodos prolongados de tiempo, sufren varias modificaciones químicas como reacciones de

glicación entre el grupo carbonilo de azúcares reductores y grupos amino libres, que conducen

a la formación de compuestos altamente estables, los productos finales de glicación avanzada

(AGEs - Advanced glycation end products)(112). La formación de AGEs se acelera en la

hiperglicemia, y su acumulación se asocia con diabetes, nefropatía diabética, microangiopatía,

aterosclerosis, entre otros (113). Por lo tanto, el estudio de moléculas con actividad

antiglicante representa una estrategia para la búsqueda de compuestos capaces de prevenir o

retrasar algunas de las complicaciones presentadas durante la diabetes. Adicionalmente, el

ensayo de inhibición de AGES, es una herramienta in vitro de rápido uso que requiere poca

cantidad de material a evaluar. Para ello, el ensayo busca simular la reacción de Maillard

utilizando como modelo de proteína la albúmina sérica bovina (BSA por sus siglas en inglés)

la cual presenta un 76% de homología de secuencia con la albúmina humana (114), principal

proteína glicada en sangre in vivo. Se ha evaluado la reactividad de BSA con diferentes

azúcares, de los cuales se ha visto el siguiente orden de velocidad de reacción: ribosa > fructosa

> glucosa. Sadowska y colaboradores han reportado que la tasa inicial de formación de AGEs

es 2.7 y 14.2 veces respectivamente, más alta con fructosa y ribosa que con glucosa (115), de

modo que se prefiere el uso de ribosa con el fin de disminuir el tiempo de duración del ensayo.

Finalmente, y similar a las condiciones fisiológicas, la reacción se lleva a cabo a 37ºC en buffer

a pH 7.4 (al cual se adiciona azida de sodio con el fin de evitar contaminaciones



microbiológicas) y se detecta la formación de los productos de glicación avanzada, gracias a

que algunos de ellos exhiben propiedades fluorescentes.

De este modo y como una aproximación inicial para estudiar el efecto del proceso de

optimización del extracto en la actividad biológica del mismo, se evaluó la actividad

antiglicante o inhibitoria de la formación de AGEs de todos los tratamientos del diseño

experimental.

Para esto, se utilizó la fracción V de albúmina sérica bovina (Roche), D(-)-Ribosa, extra pura

(Scharlau) y Quercetina ≥ 95%, (HPLC, Sigma-Aldrich®) como control positivo. Se siguieron

las condiciones experimentales propuestas por Derbré et al, con ligeras modificaciones

(116,117). Brevemente, se incubaron diferentes mezclas de reacción en microplacas de 96

pozos; los diferentes volúmenes especificados en la Tabla 3-2 se tomaron a partir de

soluciones concentradas de cada uno de los reactivos, para obtener concentraciones finales en

los pozos de 10 mg/mL, 0.5 M y 500 µg/mL de BSA, D-Ribosa y extractos, respectivamente. La

quercetina, se evaluó a 70 µg/mL. El volumen final de 100 µL en cada pozo se completó con

buffer fosfato 50 mM (pH 7.4, NaN3 0.02%).

Tabla 3-2: Soluciones de reacción evaluadas en el ensayo de antiglicación mediante el modelo

BSA-ribosa.

Solución

Reactivo (a Ci)

Inhibidor

(Extracto o

quercetina)

Blanco del

inhibidor

Control 100%

formación de

AGEs

Blanco del

control 100%

formación

AGEs

Albúmina

(14.3 mg/mL) 70 µL 70 µL 70 µL 70 µL

D-Ribosa (5M) 10 µL --- 10 µL ---

Muestra (extracto o

quercetina)b 5 µL 5 µL --- ---

Buffer 15 µL 25 µL 20 µL 30 µL

aCi: Concentración inicial de las soluciones a partir de las cuales se tomaron los volúmenes

especificados. bPara los extractos: A partir de soluciones stock preparadas en DMSO a una

Capítulo 3 45

concentración de 12.5 mg/mL, se tomaron 80 µL y se completó con buffer a un volumen de

100 µL; de esta solución diluida se tomaron las alícuotas de 5 µL llevadas a la microplaca. Para

quercetina: 70 µL de una solución de 2 mg/mL de quercetina completamente disuelta en

DMSO, se diluyeron con 30 µL de buffer. Todas las muestras fueron evaluadas por triplicado.

La incubación se realizó durante 24 h, a 37ºC con agitación (50 rpm), en un Heidolph Polymax

1040-Inkubator 1000. La medición de la fluorescencia de los AGEs se realizó en un

espectrofluorómetro TECAN Genios FL (λexc 360 nm; λem 465 nm). El porcentaje de

inhibición de la formación de AGEs se calculó de la siguiente manera:

% Inhibición de AGEs = [1 − (𝐹𝐼 − 𝐹𝐵𝐼

𝐹100% − 𝐹𝐵100%)] × 100

Donde:

FI = Fluorescencia de la solución del inhibidor.

FBI = Fluorescencia de la solución blanco del inhibidor.

F100% = Fluorescencia de la solución control 100% formación de AGEs.

FB100% = Fluorescencia de la solución blanco del control 100% formación de AGEs.

Determinación de la concentración inhibitoria 50

Se determinó la concentración inhibitoria 50 (IC50) de los dos extractos, optimizado y obtenido

por infusión, de los estándares de isoquercetina y astragalina, y de la quercetina como control

positivo. Para ello se evaluaron 5 concentraciones finales en pozo para cada muestra dentro

de los siguientes rangos: 125-1000 µg/mL para los extractos, 10-30 µg/mL para astragalina y

quercetina y 15-250 µg/mL para isoquercetina; cada concentración y su blanco respectivo fue

ensayado por triplicado.

3.1.5 Evaluación in vivo de la actividad hipoglicemiante

Se estudió la actividad hipoglicemiante del extracto obtenido por infusión y optimizado

mediante el ensayo de sobrecarga oral de glucosa. Para ello, ratones adultos, hembras, Swiss

ICR, (24 animales, 47-52 semanas de edad, peso entre 30-43 g) se aclimataron en condiciones

de temperatura constante (22 ° C ± 1), ciclos de luz/oscuridad de 12 horas, y consumo de

alimento y agua ad libitum una semana antes del bioensayo.



Tras 6h de ayuno, se midieron los niveles basales de glucosa en sangre e inmediatamente

después se administró vía oral cada tratamiento. A los 30 minutos se realizó la sobrecarga oral

de glucosa SOG (2000 mg / kg) a los animales; se determinó la glicemia antes de la SOG y a los

30, 60 y 120 minutos después, utilizando el equipo Accu-Chek Performa®. Se evaluaron los

cuatro tratamientos descritos a continuación, la dosis de administración de los grupos III y IV

se basó en estudios previos dentro de nuestro grupo de investigación.

Grupo I: vehículo (agua destilada)

Grupo II: glibenclamida como control positivo (200 mg/kg)

Grupo III: el extracto hidroalcohólico optimizado (125 mg/kg)

Grupo IV: el extracto hidroalcohólico optimizado (250 mg/kg)

Grupo V: el extracto hidroalcohólico optimizado (500 mg/kg)

Grupo VI: extracto por infusión (250 mg/Kg).

Los animales fueron suministrados por el Departamento de Farmacia de la Universidad

Nacional de Colombia. El bioensayo contó con el aval del Comité de Ética de la Facultad de

Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia (Acta 09 de 2018).

3.1.6 Análisis estadístico

El software Minitab® (versión 17 State College, PA, USA) fue utilizado para el planteamiento

del diseño experimental, analizar los resultados y optimizar el contenido de flavonoides

totales. Se utilizó el software GraphPad Prism® (versión 6, San Diego, CA, EE. UU.) para el

análisis de correlación entre la actividad antiglicante y el contenido de flavonoides totales, la

determinación de las IC50 y para el análisis de los datos de la prueba de sobrecarga oral de

glucosa.

Capítulo 3 47


3.2.1 Determinación del tamaño de partícula del material vegetal a extraer

Dentro de las variables que pueden influenciar cualquier proceso de extracción, se encuentra

el tamaño de partícula del material vegetal de partida; la reducción de éste conlleva a un

aumento en el área de contacto y disminución de la distancia de difusión de los metabolitos,

aumentando así la tasa de extracción (118).

De acuerdo con la guía de Métodos de Control de Calidad para Materiales de Plantas Medicinales

de la Organización Mundial de la salud, se puede clasificar de la siguiente manera, el corte del

material vegetal según el tamaño de apertura de la malla a través del cual es tamizado (119):

- Corte grueso: 4.00 mm

- Corte medio: 2.80 mm

- Corte fino: 2.00 mm

Teniendo en cuenta lo anterior, el material vegetal liofilizado y molido se clasificó como corte

fino ya que el 100% quedó retenido a lo largo de los tamices con promedios de luz de malla de

0.237, 0.361, 1.213 y 2.000 mm, correspondientes a las mallas (Mesh) No. 80, 50, 40 y 10

respectivamente; y tal como se observa en la ¡Error! No se encuentra el origen de la

referencia., más del 80% de las hojas molidas se retuvieron en el tamiz 40.



Figura 3-1: Distribución del tamaño de partícula de las hojas de P. ligularis molidas en un

molino de cuchillas.

Diversos tamaños de partícula se encontraron reportados en la literatura para la optimización

de la extracción -mediante diferentes métodos- de compuestos fenólicos, desde 5 mm hasta

diámetros inferiores a 1 mm; y en la mayoría de casos concluyen que a menor tamaño, mayor

eficiencia de extracción (118,120). Sin embargo, en el caso de la extracción asistida por

ultrasonido (EAU), es necesario tener en cuenta que el mecanismo en el cual éste se basa, la

cavitación acústica (formación de burbujas debido a la propagación de ondas de presión en un

medio líquido), provee la energía necesaria para romper el material vegetal y reducir el

tamaño de partícula del mismo (121,122). Lo anterior se vio corroborado en el estudio de Both

y colaboradores, en el cual se encontró una disminución del 5%, en el diámetro de partícula al

implementar este método en la extracción de polifenoles a partir de té negro (123). Por otro

lado, Jovanović et al., al optimizar diferentes parámetros para la extracción de polifenoles en

Thymus serpyllum, mediante 3 métodos de extracción, no obtuvieron diferencia

estadísticamente significativa entre los 3 tamaños evaluados (0.3, 0.7, 1.5 mm) para la EAU,

mientras que para los métodos de maceración y extracción asistida por calor, el rendimiento

más bajo sí se obtuvo con el tamaño de partícula más alto estudiado (124).

Al tener en cuenta esta información, que el material vegetal tamizado presentó un tamaño de

partícula considerado como fino y, que en la literatura no se recomienda el uso de fragmentos

ColectorMesh 80

Mesh 50

Mesh 40

Mesh 100,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

< 0,237 0,237 0,361 1,213 2,000

% M

ate

ria

l v

eg

eta

l re

ten

ido

Tamaño de partícula (mm)

Capítulo 3 49

demasiado pequeños ya que pueden ser difíciles de filtrar (121), se seleccionó únicamente el

material retenido en la malla Mesh 40 para continuar con la optimización del proceso de

extracción.

3.2.2 Optimización de flavonoides totales mediante extracción asistida por ultrasonido

Las condiciones consideradas para la evaluación a través del diseño de Box-Behnken -Tabla

3-1- se escogieron con base en la literatura y en experimentos previos realizados dentro del

grupo de investigación. Se seleccionó una proporción droga-solvente de 1:20 como factor

constante, ya que es una relación aceptada a escala de laboratorio y se ha reportado

previamente como una condición óptima de extracción de flavonoides por ultrasonido (125–

127). Se evaluaron temperaturas relativamente altas (30-70ºC) porque los aumentos de

temperatura conducen a un mayor número de burbujas de cavitación, un área de contacto

sólido-solvente más grande y disminución de la viscosidad del solvente, generando una

difusión más rápida de los metabolitos (128,129). Es importante mencionar que se llevaron a

cabo extracciones de prueba, para confirmar que los compuestos no se degradaran a la

temperatura máxima. Las mezclas de etanol-agua fueron elegidas debido a que es un solvente

no tóxico, amigable con el medio ambiente y frecuentemente empleado para la extracción de

flavonoides glicosidados. De este modo, el diseño experimental obtenido consistió de 15

tratamientos con 3 réplicas en el punto central, tal como se observa en la Tabla 3-3. En esta

tabla también se encuentran los resultados obtenidos en la variable de respuesta (CFT) e

inhibición de la formación de AGEs.



Tabla 3-3: Flavonoides totales cuantificados y actividad antiglicante de extractos obtenidos

bajo las condiciones del diseño experimental Box-Behnken.

Ttoa

Factor (nivel)

CFTb

% Inhibición de formación

de AGEs c Temperatura

(ºC) Tiempo (min)

% Etanol

1 30 (-1) 40 (0) 100 (1) 35.56 ± 1.02 43.09 ± 1.06

2 30 (-1) 40 (0) 60 (-1) 53.04 ± 0.91 52.79 ± 1.19

3 50 (0) 20 (-1) 100 (1) 25.97 ± 0.57 32.46 ± 1.68

4 70 (1) 60 (1) 80 (0) 53.26 ± 0.99 52.20 ± 1.13

5 50 (0) 40 (0) 80 (0) 47.68 ± 2.23 48.86 ± 1.85

6 30 (-1) 20 (-1) 80 (0) 48.49 ± 1.08 46.46 ± 1.15

7 70 (1) 40 (0) 60 (-1) 54.59 ± 0.14 54.84 ± 0.84

8 70 (1) 20 (-1) 80 (0) 52.54 ± 1.24 51.77 ± 0.66

9 50 (0) 40 (0) 80 (0) 51.03 ± 1.98 50.89 ± 0.69

10 50 (0) 60 (1) 60 (-1) 50.55 ± 1.17 49.54 ± 0.68

11 50 (0) 40 (0) 80 (0) 51.97 ± 2.28 50.89 ± 1.80

12 50 (0) 20 (-1) 60 (-1) 54.68 ± 1.13 56.77 ± 0.78

13 70 (1) 40 (0) 100 (1) 32.13 ± 0.98 39.97 ± 0.66

14 30 (-1) 60 (1) 80 (0) 44.12 ± 1.51 48.17 ± 2.8

15 50 (0) 60 (1) 100 (1) 32.78 ± 1.07 41.46 ± 0.55

Todos los resultados corresponden al promedio ± desviación estándar (n=3). aTratamiento. bCTF:

Contenido de Flavonoides Totales, expresados como mg-equivalentes de isoquercetina/g extracto seco.

cTodos los extractos fueron evaluados a 500 µg/mL. La quercetina utilizada como control positivo (70

µg/mL) presentó un porcentaje de inhibición de 96.92 ± 3.76 %.

El análisis de superficie respuesta es una metodología que, mediante un conjunto de técnicas

estadísticas y matemáticas permite estudiar el efecto de diferentes variables independientes

en una o más variables dependientes o de respuesta, mediante la generación de un modelo que

permite predecir y por ende optimizar dicha respuesta de interés (111,130).

A partir de los resultados de CFT presentados en la Tabla 3-3, se llevó a cabo el análisis de

varianza del modelo de regresión generado, el cual mediante una prueba de hipótesis permite

estudiar la influencia de los factores en la variable dependiente. Valores relativamente grandes

del estadístico F y valores de p muy pequeños (menores a 0,05), permiten rechazar la hipótesis

Capítulo 3 51

de que ninguno de los factores está relacionado linealmente con la variable respuesta,

indicando que al menos uno de los factores tiene un efecto en la misma (131). De este modo,

se observa en la Tabla 3-4 que el modelo obtenido es significativo y se ajusta a un modelo

lineal (p < 0.01). Además, el valor de p > 0.05 para la falta de ajuste y el coeficiente de

determinación (R2) 0.9613, indicaron que éste tiene la capacidad de explicar correctamente la

variabilidad de la respuesta y por ende, la Ecuación 3-1 de segundo orden, es adecuada para

predecir el contenido de flavonoides totales dentro del rango del diseño experimental.

[CFT] = -14.2 – 0.366 f1 - 0,085 f2 + 2,347 f3 - 0,00433 f1 2 + 0,00277 f2 2 - 0,01878 f3 2

+ 0,00319 f1* f2 + 0,00684 f1* f3 - 0,00312 f2* f3 Ecuación 3-1

Donde, f1: tiempo; f2: temperatura; f3: porcentaje de etanol.

Tabla 3-4: Análisis de varianza ANOVA del modelo de regresión.

Fuente g.l SS MS Valor-F Valor-p* Modelo 9 1219,68 135,520 13,80 0,005

Lineal 3 951,95 317,317 32,32 0,001 Tiempo 1 0,12 0,120 0,01 0,916 Temperatura 1 16,04 16,044 1,63 0,257 %Etanol 1 935,79 935,787 95,32 0,000

Cuadrático 3 225,05 75,015 7,64 0,026 Tiempo*Tiempo 1 11,07 11,075 1,13 0,337 Temperatura*Temperatura 1 4,55 4,548 0,46 0,526 Etanol*Etanol 1 208,40 208,401 21,23 0,006

Producto cruzado 3 42,69 14,228 1,45 0,334 Tiempo*Temperatura 1 6,50 6,499 0,66 0,453 Tiempo*%Etanol 1 29,96 29,965 3,05 0,141 Temperatura*%Etanol 1 6,22 6,221 0,63 0,462

Error 5 49,09 9,818 Falta de ajuste 3 38,86 12,954 2,53 0,296 Error Puro 2 10,23 5,113

Total 14 1268,77 *Nivel de significancia α = 0.05.

Por otro lado, se observa en la Tabla 3-4 que el único factor significativo para la extracción de

flavonoides fue el porcentaje de etanol, junto con el efecto cuadrático etanol*etanol (p < 0.05)

y que no existe un efecto de interacción significativo entre ninguno de los factores (tiempo *



temperatura, tiempo * etanol, temperatura * etanol, p> 0.05) que pudiese afectar la variable

dependiente.

Los gráficos de superficie y contorno de respuesta son la representación visual (tri- y

bidimensional respectivamente) de la ecuación de regresión (Ecuación 3-1) muestran los

efectos interactivos de dos de los tres factores sobre la variable dependiente y permiten

visualizar más fácilmente el área que cumple con las condiciones de optimización (111).

Como se puede ver en la Figura 3-2 (A) y

Figura 3-3 (A), los cambios en el porcentaje de etanol son los que más afectan el valor de CFT.

Ambas gráficas de contorno, Figura 3-2 (B) y

Figura 3-3¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. (B), muestran claramente

que las mezclas hidroetanólicas entre 60-70% de etanol conducen a la mayor cantidad de

flavonoides (> 50 mg-eq de isoquercetina/g de extracto seco). En el primer caso, con

temperaturas entre 60-70 ºC y en el segundo, independientemente del tiempo. Por el

contrario, a niveles de concentración de etanol superiores al 75%, el contenido de FT comienza

a disminuir. El uso de mezclas hidroalcohólicas ha demostrado ser efectivo en la extracción de

este tipo de compuestos (132,133). El carácter menos polar dado por el etanol permite una

mayor penetración de las paredes celulares y la disolución de metabolitos hidrofílicos, de

media a alta polaridad, azúcares, aminoácidos, nucleótidos y polisacáridos (134,135).

Adicionalmente, la alta polaridad del agua aumenta el contacto soluto-solvente al aumentar la

hinchazón efectiva del material vegetal y disminuir la viscosidad de la mezcla (132). La Figura

3-4 muestra que el tiempo y la temperatura requeridas para el mayor contenido de flavonoides

son alrededor de 40 minutos y 65-70ºC, respectivamente.

Finalmente, de acuerdo con la función de optimización del software, el tiempo, temperatura y

porcentaje de etanol óptimos para la extracción de flavonoides por ultrasonido a partir de

hojas de Passiflora ligularis son: 32.92 minutos, 70ºC y 62.82% respectivamente; valores que

fueron aproximados a 33 minutos, 70ºC y 63% de etanol.

Capítulo 3 53



y la temperatura, manteniendo el factor tiempo en un nivel medio constante (40 min).



y el tiempo, manteniendo el factor de temperatura a un nivel medio constante (50 ºC).

B

501

0930

04

5702

40 0606

50

TFC

lonatE %

)nim( opmeiT

Temperatura 50

constante:

Nivel medio

Tiempo (min)

% E

tan

ol

6050403020

100

90

80

70

60

>

–

–

–

–

< 30

30 35

35 40

40 45

45 50

50

TFCA

30

04

50

0345

60

105

09

57

6075

50

06

TFC

lonatE %

)Cº( arutarepmeT

Tiempo 40

constante:

Nivel medio

Temperatura (ºC)

% E

tan

ol

7060504030

100

90

80

70

60

>

–

–

–

–

< 35

35 40

40 45

45 50

50 55

55

TFCA B




flavonoides (CFT) (mg-eq isoquercetina / g extracto seco) en función de la temperatura y el

tiempo, manteniendo el factor de etanol en un nivel medio constante (80%).

Con el fin de validar las condiciones óptimas de extracción, se realizaron extracciones por

triplicado en 3 días diferentes. Se comparó la variable de respuesta predicha por el modelo

(57.77 mg-eq de isoquercetina/g de extracto seco) con el contenido de flavonoides totales

obtenido experimentalmente (59.76 ± 1.903 mg-eq de isoquercetina/g de extracto seco)

mediante el error porcentual medio absoluto (MAPE), Ecuación 3-2.

𝑀𝐴𝑃𝐸 = 100

𝑛∑

|𝐶𝑒𝑖 − 𝐶𝑐𝑖|

𝐶𝑒𝑖

𝑛

𝑖=1

Donde, Cei es el valor de concentración experimental, Cci es el valor de concentración calculado

o predicho y n es el número de datos experimentales. En la Tabla 3-5 se resumen los valores

de cuantificación y el MAPE obtenido para los 3 lotes de extracción evaluados.

64

48

50

0240

54

0306

75

60

25

TFC

arutarepmeT

)nim( opmeiT

%Etanol 80

constante:

Nivel medio

Tiempo (min)

Tem

pera

tura

(ºC

)

6050403020

70

60

50

40

30

>

–

–

–

–

–

< 47

47 48

48 49

49 50

50 51

51 52

52

TFCB A

Ecuación 3-2

Capítulo 3 55

Tabla 3-5: Cuantificación de flavonoides totales bajo las condiciones óptimas de extracción en

3 días diferentes.

Lote CFT ± DS (n=3) Promedio % CV MAPE (%), n=3

1 57.70 ± 4.285

59.76 3.184 3.353 2 60.15 ± 2.119

3 61.44 ± 0.547

CFT: Contenido de Flavonoides Totales. DS: Desviación estándar. CV: Coeficiente de variación.

MAPE: Error porcentual medio absoluto.

Se considera que un modelo es aceptable si el valor del error porcentual medio absoluto es

menor al 10% (136), de modo que se pudo corroborar la capacidad predictiva del modelo de

regresión generado.

Adicionalmente, se comprobó la reproducibilidad del proceso de extracción debido al

coeficiente de variación obtenido, inferior al 5%, para los 3 días estudiados (3.18%).

Por otro lado, teniendo en cuenta que se buscaba aumentar el CFT respecto al método de

extracción más comúnmente realizado para las hojas de Passiflora ligularis, se comparó el

extracto optimizado con el extracto obtenido por infusión. La Figura 3-5 muestra los perfiles

cromatográficos de ambos extractos; se observa para el extracto optimizado un aumento

generalizado en la absorbancia de los metabolitos a 350 ηm y, de acuerdo con la cuantificación

de los flavonoides totales, la optimización del proceso de extracción produjo un incremento

del 33% en comparación con el extracto por infusión (40,22 ± 0,95 mg-equivalentes de

isoquercetina/g de extracto seco).

Adicionalmente, se identificó que el contenido de isoquercetina es 40% superior en el extracto

optimizado en comparación con el extracto obtenido por infusión, presentando: 14.17 ± 0.667

mg de isoquercetina/g extracto seco en el primero y 8.463 ± 0.251 mg de isoquercetina/g

extracto seco en el segundo.



Figura 3-5: Cromatograma del extracto optimizado por ultrasonido (naranja) y el extracto

obtenido por infusión (negro). Condiciones cromatográficas descritas en la sección 2.2.1.

Diversos métodos para la extracción de flavonoides en especies de Passiflora han sido

descritos, dependiendo de la parte de la planta estudiada. Específicamente para las hojas se

han reportado procesos clásicos como soxhlet, sonicación, percolación, decocción e infusión.

Sin embargo, hay pocos estudios disponibles sobre la optimización y validación del proceso de

extracción (137), y la mayoría usan las semillas o pulpa de fruta como droga (138–142). Uno

de los métodos de extracción no convencionales que ha demostrado gran potencial en el

procesamiento de material vegetal es la extracción asistida por ultrasonido, debido a que la

capacidad de disrupción celular de las ondas ultrasónicas y el fenómeno de cavitación,

permiten mayor penetración del solvente en la matriz y, por lo tanto, una difusión más rápida

de los componentes de la planta hacia el solvente. De modo que es un método más simple,

económico y efectivo que otras técnicas, tanto convencionales como no convencionales

(143,144).

Capítulo 3 57

En la Tabla 3-6 se presentan los reportes encontrados en cuanto a la optimización de

flavonoides. Se puede observar que se han establecido condiciones para la percolación de hojas

de Passiflora quadrangularis, las cuales requieren mucho más tiempo (horas a días), cantidad

solventes (más de 150-200 mL) (145,146) que técnicas como la extracción por ultrasonido,

adicionalmente pueden conllevar a una menor recuperación de los metabolitos de interés. Por

otro lado, se ha estudiado la utilización de algunos fluidos supercríticos para la extracción

(SFE) de flavonoides glicosidados de P. edulis (147). También se encuentra reportada la

optimización de la extracción acelerada con solventes (ASE) de flavonoides a partir de hojas

de P. alata, donde posteriormente, las condiciones obtenidas se aplicaron en la extracción de

17 especies de Passiflora, donde P. ligularis no fue incluida (96). Al comparar estos reportes y

los encontrados para la extracción de otras drogas del género Passiflora, con las condiciones

optimizadas para las hojas de granadilla de este trabajo, se hallaron algunas similitudes para

la extracción de flavonoides, como la preferencia de mezclas hidroetanólicas con porcentajes

de etanol entre 50-70% y temperaturas entre 70-80ºC principalmente.

Las metodologías no convencionales utilizadas para la extracción de las hojas (SFE y ASE),

comparten ciertas ventajas con la EAU: el tiempo requerido para la extracción por ultrasonido

puede tomar desde pocos minutos hasta 1 o 2 horas, entre 15 a 100 min mediante fluidos

supercríticos o menos de 1 hora para el caso de ASE. De igual manera, utilizan solventes

amigables con el ambiente y su consumo usualmente se ve reducido a cantidades inferiores a

100 mL en escala laboratorio (148). Sin embargo, en la extracción acelerada por solventes, es

indispensable aplicar altas temperaturas (50-200ºC) y presión (1450-2175 psi) con el fin de

que el solvente que se encuentra en contacto con el material vegetal permanezca en estado

líquido, y por ende, no es adecuado para compuestos termolábiles. Por otro lado, la extracción

por fluidos supercríticos requiere altos costos de inversión y mantenimiento (149,150).

La extracción asistida por ultrasonido es un método eficiente y económicamente viable, útil

para la extracción de compuestos termolábiles (135), y que ha sido eficaz en la extracción de

compuestos fenólicos de diferentes fuentes naturales (135,151). En este método, la onda

mecánica de ultrasonido actúa inicialmente como un pistón que produce un desplazamiento

de las moléculas del medio, las cuales se comprimen pudiendo chocar con otras; luego, una

disminución de la presión durante la fase de rarefacción las separa. Si la presión negativa es

suficiente para exceder las fuerzas de atracción entre ellas, se crea un vacío o una burbuja de



cavitación. Una vez que las burbujas alcanzan un tamaño crítico y colapsan cerca de la

superficie del material vegetal, se libera una presión y temperatura elevadas, produciendo

micro-burbujas y ondas de choque que impactan e inducen daños en la matriz, liberando el

contenido celular o forzando el solvente hacia las células, disolviendo así los componentes

interiores y transportándolos al exterior (

Figura 3-6). Como consecuencia de este proceso físico de creación, ampliación e implosión de

las micro-burbujas, el ultrasonido mejora la disrupción celular, transferencia de masa y la

penetración del solvente para la extracción de metabolitos (143,152).

Figura 3-6: Fenómeno de cavitación acústica durante la extracción asistida por ultrasonido.

Modificado de Lavilla I, Bendicho C. Fundamentals of ultrasound-assisted extraction. En: Water

Extraction of Bioactive Compounds: From Plants to Drug Development. Elsevier; 2017. p. 294.

(122)

Capítulo 3 59

Tabla 3-6: Condiciones optimizadas para la extracción de flavonoides totales en diferentes especies del género Passiflora.

Especie Droga Método Cuantificación FT Solvente Temperatura Tiempo Referencia

P. quadrangularis Hojas Percolación

1:15

65.29 ± 2.08 mg vitexina-eq /g extracto

seco

Etanol 50%

Ambiente 48h (153)

P. alata a Hojas Extracción

acelerada por solventes

Concentraciones más

altas de: Isoorientina: 1.61

mg/g extracto P. edulis f. flavicarpa.

Orientina: 2.10 mg / g extracto P. morifolia. Vitexina: 2.48 mg / g extracto P. setacea.

Isovitexina: 8,46 mg / g de extracto P.

setacea. Rutina: 3,48 mg / g de

extracto P. galbana. a

Etanol 64 %(P/P)

80ºC

5 ciclos de extracción de

10 min: 50 min. 1500 psi.

En cada ensayo se

extraían 3g de hojas

(96)

P. edulis Hojas

Extracción por fluidos

supercríticos b

6.81 ± 0.19 mg/g material vegetal seco

CO2 modificado

con 10% metanol

70ºC

15 min (0.5g extraídos con

un total de 15mL de solvente)

(147)



Especie Droga Método Cuantificación FT Solvente Temperatura Tiempo Referencia

P. edulis Sims Semillas

Extracción sólido-líquido

en baño termostatado con agitación

constante

1.03 ± 0.02 g Catequina-eq/100 g

semillas en base seca

Etanol 70%

80ºC 30 minutos (140)

P. mollissima Semillas

Extracción líquida

presurizada (100 bar)

0.94 mg-eq quercetina/g extracto

en base seca

Etanol 100%

150ºC No

especificado (139)

P. edulis Sims f. flavicarpa

Pulpa

Sonicación (10 mL de pulpa con 30 mL de

solvente)

158.037 ± 0.602 mg-eq rutina/L

Etanol 60%

25ºC (Factor constante)

1.5 min (141)

a El proceso de optimización se realizó con P. alata para después sí extraer 17 especies de Passiflora bajo las condiciones optimizadas

obtenidas. Aunque una de las variables respuesta del proceso de optimización fue el contenido de FT, solo reportan los valores de los

extractos del diseño experimental. Después de extraer las 17 especies bajo las condiciones optimizadas, cuantificaron los 5 flavonoides

especificados en cada especie.bEn este caso no se llevó a cabo un proceso de optimización, se evaluaron diferentes solventes modificadores

del dióxido de carbono para obtener un extracto con el mayor contenido de flavonoides glicosidados posible a partir de hojas de P. edulis.

Capítulo 3 61

3.2.3 Correlación entre el CFT y la actividad antiglicante de extractos

de P. ligularis

La formación de los productos de glicación avanzada inicia con una glicación no enzimática

temprana, mediada por la adición nucleofílica entre grupos amino de proteínas, lípidos o

ácidos nucleicos y el grupo carbonilo de azúcares reductores, esta reacción de Maillard (dada

durante unas horas) origina bases de Schiff, productos inestables y reversibles que en el

transcurso de días, sufren reordenamientos estructurales para formar cetoaminas más

estables y prácticamente irreversibles, llamados productos de Amadori. Estos posteriormente,

en un periodo de meses o años, sufren diferentes reacciones de deshidratación, oxidación,

transposición o fragmentación, que mediante intermediarios dicarbonilos altamente reactivos,

conllevan a la formación de los productos finales de glicación avanzada (154,155) (Ver Figura

3-7).

Figura 3-7: Formación endógena de AGEs.

Son múltiples los factores que contribuyen al desarrollo de complicaciones diabéticas, dentro

de los cuales, los AGEs, pueden verse implicados mediante diferentes mecanismos.

La glicación de proteínas conlleva a un mal funcionamiento de las mismas, alteraciones en su

tiempo de vida media, en la actividad enzimática, y la unión a ligandos, produciendo daños

celulares y eventualmente organopatías (156). Adicionalmente, la interacción entre los AGEs

y sus receptores celulares (como RAGE, lactoferrina, galectina-3, oligosacaril transferasa-48,

CD36, entre otros) encontrados en tejido muscular liso, macrófagos, astrocitos y células



endoteliales, puede conllevar a la alteración de rutas de señalización intracelular y la expresión

genética, y consecuentemente, desencadenar procesos inflamatorios y estrés oxidativo (155).

Debido a todas estas implicaciones, el estudio de moléculas inhibidoras de la formación de

AGEs, es una aproximación distinta al control de la glucosa en sangre, como posible

tratamiento de la diabetes y prevención de algunas complicaciones asociadas a la misma.

Los porcentajes inhibitorios de la formación de AGEs de todos los extractos del diseño

experimental (Tabla 3-3), se correlacionaron con el contenido de flavonoides totales

mediante el coeficiente de correlación de Spearman (ρ). Se obtuvo una correlación alta y

significativa entre las variables; ρ = 0.9821, p <0.0001, es decir que existe una relación

monotónica entre las mismas (Figura 3-8¡Error! No se encuentra el origen de la

referencia.) y por ende, un mayor contenido de flavonoides se asocia con mayor actividad

antiglicante. Esto fue confirmado mediante el porcentaje de inhibición obtenido para el

extracto optimizado (500 µg/mL): 58.79 ± 0.51, que fue el valor más alto en comparación con

los tratamientos del diseño experimental.

C F T (m g -e q is o q u e r c e t in a /g e x t r a c to s e c o )

Inh

ibic

ión

de

la

fo

rm

ac

ión

de

AG

Es

(%

)

2 0 3 0 4 0 5 0 6 0

3 0

4 0

5 0

6 0

Figura 3-8: Relación monotónica entre el contenido de flavonoides totales y la actividad

antiglicante de los extractos de hojas de P. ligularis. Quercetina utilizada como control positivo

(70 µg/mL) presentó un porcentaje de inhibición de 96.92 ± 3.76 %.

La actividad antiglicante de algunas especies de Passiflora, se ha evaluado previamente en

ensayos de glicación de glucosa/fructosa-BSA. P. alata y P. edulis mostraron porcentajes de

Capítulo 3 63

inhibición entre 10-20% a concentraciones de 1, 5 y 10 µg/ml (61); y P. manicata disminuyó

significativamente las unidades arbitrarias de fluorescencia en comparación con la albúmina

glicosilada, a 1, 10 y 100 µg/ml (157).

La búsqueda de compuestos o productos de origen natural con actividad inhibitoria de la

formación de AGEs, es de gran interés debido a las múltiples dianas terapéuticas mediante las

cuales pueden ejercer la actividad biológica. De los mecanismos antiglicantes reportados para

compuestos polifenólicos se encuentra: inhibición de las especies reactivas de oxígeno

producidas en la etapa de glicación temprana (de modo que se disminuye la generación de

grupos carbonilos reactivos), inhibición de las bases de Schiff o los productos de Amadori,

bloqueo de carbonilos de azúcares reductores o atrapamiento de los dicarbonilos precursores

de los AGEs, y bloqueo de la interacción AGE-RAGE (158). Además han sido particularmente

estudiados debido a la capacidad antioxidante y antiinflamatoria que presentan, ya que gran

parte de las complicaciones de la diabetes están relacionadas con el aumento del estrés

oxidativo, generado a partir de la formación y acumulación de dichos productos de glicación

avanzada (159).

En el estudio realizado por Séro y colaboradores, se evaluó el potencial anti-AGEs de diferentes

plantas, caracterizadas por presentar alto contenido de polifenoles y capacidad antioxidante o

captadora de dicarbonilos reactivos (160). Las concentraciones inhibitorias 50 (IC50)

encontradas para los extractos acuosos y etanólicos de las 11 especies, evaluados en un modelo

de glicación ribosa-BSA, se encontraron en su mayoría entre 100-700 µg/ml (160), valores

similares a los obtenidos para los dos extractos de hojas de granadilla estudiados. Se observa

en la Tabla 3-7, que la optimización del contenido de flavonoides totales conllevó

efectivamente a un menor valor de IC50 del extracto obtenido por ultrasonido, en comparación

con el extracto por infusión.



Tabla 3-7: Valores de IC50 en ensayo de antiglicación de marcadores terapéuticos y extractos

de hojas de Passiflora ligularis.

Inhibidor IC50 (Límites de confianza del 95%)

(µg/ml)

Extracto optimizado 380.3 (356.6 - 405.4)

Extracto por infusión 641.2 (595.7- 690.2)

Isoquercetina (Quercetina-3-O-glucósido) 78.03 (69.8 – 87.22) – 168.1 µM

Astragalina (Kaempferol-3-O-glucósido) 24.58 (23.68 – 25.51) – 54.82 µM

Quercetina (Control positivo) 22.95 (22.10 – 23.83) - 75.93 µM

Ver curvas de log[concentración] vs % inhibición en Anexo: Información suplementaria

Capítulo 2 y 3, desde la Figura S3- 2 a Figura S3- 5.

Al realizar la revisión de la literatura sobre la actividad inhibitoria de los compuestos puros

evaluados, y otros flavonoides presentes en el extracto de P. ligularis, se encontraron valores

de IC50 muy variados (

Capítulo 3 65

Tabla 3-8). Los resultados obtenidos dependen del modelo de glicación empleado (115) pero

en todos los casos, los reportes consultados se destaca la actividad antiglicante significativa de

los flavonoides estudiados. Se ha visto específicamente que metabolitos pertenecientes a los

grupos flavonas, flavonoles y flavan-3-oles (como es el caso de la mayoría de flavonoides

presentes en el extracto de granadilla), presentan mayor actividad inhibitoria de la formación

de AGEs que las flavanonas e isoflavonas (161).

Respecto al resultado obtenido para la quercetina como control positivo, se han reportado IC50

para el modelo de glicación utilizado de 600 µM (116) y 198.5 µM (160); la diferencia con el

valor experimental 75.95 µM puede deberse a las longitudes de onda utilizadas para realizar

la lectura, ya que en los valores reportados se utilizaron λexc 370 nm-λem 440 nm, mientras

que en el presente ensayo se evaluaron los niveles de fluorescencia a λexc 360 nm y λem 465

nm debido a las características del equipo utilizado.



Tabla 3-8: Concentraciones inhibitorias 50 reportadas en la literatura para algunos de los

flavonoides presentes en las hojas de Passiflora ligularis.

Modelo de glicación

Flavonoide Glucosa-BSA Glucosa/fructosa-BSA Ribosa-BSA

Isoquercetinaa 167 µM (161) 14.6 µM (162) -

Astragalinaa - 90.4 µM (162) -

Kaempferola - - 90 µM (117)

Apigeninab 172 µM (161) - 1000 µM (116)

Luteolina-7-O-

glucósidob 169 µM (161) - -

Catequinac 112 µM (161) 28.7 µM (163)

20.7 µM (162) 60 µM (116)(160)

aFlavonol. bFlavona. cFlavan-3-ol.

3.2.4 Evaluación in vivo de la actividad hipoglicemiante de extractos de hojas de Passiflora ligularis

Los resultados de la actividad hipoglicemiante de ambos extractos de P. ligularis, el obtenido

por infusión y el extracto optimizado por ultrasonido, se muestran en la Figura 3-9. Aunque

no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos y el vehículo a los 60-120

minutos, está claro que los extractos atenuaron el pronunciado aumento de la glicemia 30

minutos después de la administración de la sobrecarga oral de glucosa. Este efecto se define

como anti-hiperglicemiante, y no hipoglicemiante, teniendo en cuenta que los niveles de

glucosa finales no fueron inferiores a los niveles basales (164). Sin embargo, esto no implica

que los extractos no puedan presentar actividad hipoglicemiante al considerar que, algunas

plantas sólo muestran tal efecto al alcanzar concentraciones más altas en el cuerpo durante la

realización de estudios crónicos (165). De hecho, en el ensayo de tolerancia a la glucosa

realizado por Rey, et al, en ratas, los extractos hidroalcohólicos de P. ligularis también

mostraron un efecto anti-hiperglicemiante en las dosis 125 y 250 mg/kg; pero a 500 mg/kg se

alcanzaron niveles hipoglicemiantes al minuto 180 (60 mg/dL) (11).

Al comparar entre las tres dosis administradas del extracto optimizado, solo se encontró

diferencia estadísticamente significativa entre 125 y 500 mg/kg (p<0.05). Se observa que el

Capítulo 3 67

extracto optimizado (250 mg/kg) exhibió un efecto anti-hiperglicemiante mayor al del

extracto por infusión (250 mg/kg) (#p<0.01).

Estos resultados son favorables, ya que muestran el potencial de los extractos obtenidos a

partir de hojas de P. ligularis para controlar la glicemia, sin producir una hipoglicemia severa,

efecto adverso grave de algunos fármacos antidiabéticos.

Figura 3-9: Actividad anti-hiperglicemiante de extractos de hojas de P. ligularis. NGS: Niveles

de glucosa en sangre. Los datos se expresan como promedio ± SEM, n = 6 animales por grupo;

fueron analizados mediante un ANOVA de dos vías, seguido de una prueba Tukey con un valor

de **p <0.01 y ****p <0.0001 con respecto al grupo vehículo; #p <0.05 respecto al extracto de

infusión.

También se han obtenido resultados promisorios para otras especies del género Passiflora.

Bajo el ensayo de tolerancia a la glucosa en ratones normoglicémicos, la administración de 200

mg/Kg de un extracto metanólico de hojas de P. incarnata redujo significativamente los niveles

de glucosa en suero en todos los tiempos de muestreo (0, 30, 60 y 120 min) respecto al grupo

control (166).

En otro estudio donde se evaluó el extracto acuoso de hojas de P. suberosa, aunque la

administración de 50 mg/Kg del extracto no produjo resultados significativamente diferentes

a los del grupo control en el ensayo de tolerancia a la glucosa, sí disminuyó la glicemia en un

13% y 18%, 3 y 5 horas post-tratamiento en un ensayo de sobrecarga oral de sacarosa (167)



En el caso de P. ligularis, se ha reportado la evaluación de la actividad del extracto acuoso de

los frutos en un ensayo de tolerancia a la glucosa en ratas diabéticas, donde se observó

disminución significativa de la glucosa en sangre en el intervalo de 60-120 minutos para las 3

dosis evaluadas, 200, 400 y 600 mg/Kg (82)

Aunque la actividad del extracto puede deberse a la mezcla de diferentes grupos de

metabolitos, se ha demostrado que los flavonoides desempeñan un papel importante en el

control de la glicemia y la diabetes (168–170). Con estos resultados se confirma que la

optimización del CFT en el extracto de hojas de P. ligularis, favorece o mejora el control de la

glicemia ejercido por el mismo.

3.3 Conclusiones

Se logró la optimización de la extracción de los flavonoides presentes en las hojas de Passiflora

ligularis mediante extracción asistida por ultrasonido. Un método práctico y económico que,

según nuestro conocimiento, no se había descrito previamente en la optimización de extractos

a partir de hojas de especies del género Passiflora. El modelo estadístico obtenido por la

metodología de superficie de respuesta, predijo satisfactoriamente los valores óptimos de la

variable dependiente y el proceso de extracción demostró ser reproducible, logrando un

aumento del 33% en el contenido de flavonoides totales respecto al extracto obtenido

mediante infusión.

Se evidenció por medio de diferentes métodos, cómo la optimización del CFT del extracto de

hojas de granadilla puede aumentar la actividad farmacológica del mismo. Primero, mediante

la correlación de Spearman encontrada entre el contenido de flavonoides y la actividad

antiglicante de los diferentes extractos del diseño experimental, obteniendo un valor de IC50

inferior para el extracto optimizado respecto al extracto obtenido por infusión, y segundo,

debido al mayor efecto anti-hiperglicemiante ejercido por el extracto optimizado en el ensayo

de tolerancia a la glucosa en ratones normogliclémicos.

4. Estabilidad del extracto optimizado de P. ligularis bajo condiciones de estrés

Los estudios de estabilidad bajo condiciones de estrés o de degradación forzada, permiten

identificar posibles productos o rutas de degradación de principios activos o productos

terminados, además de demostrar la especificidad de métodos desarrollados y validados para

el análisis de los mismos. Aunque se cuenta con guías de estabilidad como “Stability testing of

new drug substances and products” de la ICH (Q1A-R2), esta detalla las condiciones a evaluar

en los estudios de estabilidad acelerada, intermedia y a largo plazo, pero poca información se

especifica para llevar a cabo las pruebas de degradación forzada. Se establece que se deben

realizar pruebas para evaluar el efecto de la temperatura, oxidación, fotólisis, hidrólisis en un

rango amplio de pH y, humedad en caso de ser necesario (171).

Debido a lo anterior, y teniendo en cuenta la gran variabilidad de condiciones reportadas en la

literatura, Singh y Bakshi propusieron diferentes diagramas de flujo con las condiciones a

seguir en hidrólisis neutra, ácida y alcalina, oxidación y fotólisis, para proponer un sistema de

clasificación de la estabilidad inherente de un principio activo (172). Si bien dicha guía está

propuesta para compuestos puros, se tomó como referencia para evaluar la estabilidad bajo

condiciones de estrés, de los flavonoides presentes en el extracto optimizado de Passiflora

ligularis.



4.1 Metodología

4.1.1 Condiciones de hidrólisis, oxidación y degradación fotolítica

La metodología planteada por Singh y Bakshi consiste en seguir diferentes diagramas de

decisión. Con estos diagramas, de acuerdo con el nivel de degradación alcanzado en una

condición específica, se decide aplicar condiciones de estrés más leves o severas hasta alcanzar

un nivel de descomposición significativo, el cual es especificado como un porcentaje de

degradación entre el 20-80% del compuesto en estudio. Dependiendo de la severidad de las

condiciones bajo las cuales se llega a un valor dentro de dicho rango, se puede clasificar el

principio activo dentro de las siguientes categorías: prácticamente estable, muy estable,

estable, lábil, muy lábil o extremadamente lábil, en el caso de las reacciones de hidrólisis y

oxidación; o como foto-lábil o foto-estable en el caso de fotólisis.

A continuación, se describen los lineamientos seguidos para determinar la estabilidad

inherente del extracto, según el contenido de flavonoides totales cuantificado.

Hidrólisis

La estabilidad del extracto ante la hidrólisis se evaluó en un rango de pH amplio, siguiendo las condiciones planteadas en la Figura 4-2 para el caso de hidrólisis neutra, y de la Figura 4-3 para hidrólisis ácida y básica.

En los 3 casos, se partió de 125mg de extracto disueltos en 50ml del medio correspondiente

(agua, HCl o NaOH; ver montaje de hidrólisis Figura 4-1); posteriormente, alícuotas de 1 mL

fueron tomadas en los tiempos establecidos, neutralizadas en el caso de las soluciones ácidas

o básicas, y diluidas con MeOH-agua (1:1) hasta alcanzar la concentración esperada de

1mg/mL. Las muestras, por triplicado, fueron filtradas por membranas de tamaño de poro de

0.22 µm, e inyectadas en el cromatógrafo para la cuantificación de flavonoides totales. En cada

muestreo, se realizó la reposición del medio tomado con el mismo volumen de agua, ácido

clorhídrico o hidróxido de sodio, a las concentraciones específicas según el caso.

Capítulo 4 71

Figura 4-1: Montajes para evaluar condiciones de estrés hidrolíticas. A. Montaje de hidrólisis

neutra, ácida, o básica en reflujo. B. Montaje de hidrólisis neutra, ácida, o básica, a 40ºC.


hidrólisis neutra (pH del agua entre 5-6).

A B




hidrólisis ácida y básica.

Los diagramas de decisión muestran en paréntesis, la categoría de estabilidad bajo la cual

quedaría clasificada la muestra, al presentar un valor de degradación significativo en la

condición de reacción respectiva.

Oxidación

Para llevar a cabo los estudios de degradación forzada por oxidación, 15 mg del extracto se

disolvieron en 15 mL de peróxido de hidrógeno en las concentraciones descritas en la Figura

4-4. Las muestras tomadas antes de iniciar la reacción o durante el periodo de tiempo

establecido en cada condición, se filtraron por 0.22 µm previo a su inyección directa en el

cromatógrafo.

Capítulo 4 73


peroxidación.

Fotólisis

En el caso de los estudios de degradación fotolítica, se utilizó una cámara de fotoestabilidad

diseñada para cumplir con las condiciones de exposición propuestas por Singh y Bakshi. El

equipo cuenta con una lámpara halógena y otra fluorescente con el fin de simular las

condiciones solares, fuentes de flujo de aire, para evitar degradación de las muestras debido a

un leve aumento en la temperatura causado por la lámpara fluorescente, y una malla donde se

ubican las muestras. El extracto (50mg) fue depositado de manera homogénea en cajas de

vidrio que se ubicaron en el centro de la malla (Figura 4-5). Los muestreos fueron realizados

antes de empezar la exposición a la luz, a los 10 días y al día 30 de iniciado el ensayo, ya que al

cabo de ese tiempo se alcanza respectivamente la exposición especificada en la primer y

segunda condición del diagrama de decisión (Figura 4-6). En cada caso, 3 muestras de 2 mg

de extracto fueron tomadas, disueltas en 2 mL de MeOH-agua (1:1) cada una, y filtradas por

membranas de 0.22 µm previo a su inyección en el cromatógrafo.



Figura 4-5: A. Cámara de fotoestabilidad. B. Muestras de extracto optimizado de P. ligularis

sometido a las condiciones de estrés fotolíticas.


estrés fotolíticas.

Capítulo 4 75


Con el fin de dar seguimiento a los resultados de este capítulo, se presenta brevemente en la

Figura 4-7 la identificación planteada anteriormente de los flavonoides presentes en el

extracto optimizado de hojas de P. ligularis.

Figura 4-7: Cromatograma UV a 350 ηm del extracto optimizado de hojas de P. ligularis

mediante las condiciones cromatográficas descritas en la Figura 2-2. Los picos numerados en

azul corresponden a los flavonoides identificados y en rojo compuestos fenólicos sin

identificar.



4.2.1 Estabilidad bajo condiciones de estrés de hidrólisis neutra

La primera condición de degradación forzada evaluada consistió en exponer el extracto a

hidrólisis durante 12 horas. Antes de iniciar el reflujo, el valor de flavonoides totales

cuantificado fue 48.67 ± 1.446 mg-eq de isoquercetina/g de extracto seco; y se obtuvo, 33.51

± 0,767 mg-eq de isoquercetina/g de extracto seco, en el punto final de la reacción,

presentando un porcentaje de degradación de 31.14%; valor que al encontrarse dentro del

rango de 20-80% de degradación significativa, permite clasificar al extracto como LÁBIL, de

acuerdo con el diagrama de decisión de la Figura 4-2.

Figura 4-8: Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés de hidrólisis

neutra -agua, 12h, reflujo- en tiempo cero (negro) y punto final (azul). Los picos numerados en


cambios. Condiciones cromatográficas descritas en la sección 2.2.1

Al analizar los cambios generados en el perfil cromatográfico del punto final de la reacción

respecto a la muestra de partida (Figura 4-8), y teniendo en cuenta la identificación de los

13 12

8

3

1

4

7

2

5 9

6

10 11

14 15

Capítulo 4 77

picos presentada en la Figura 4-7, es posible proponer 5 cambios principales: la

transformación del pico 3 (quercetina-3-O-(6''-malonil)-glucósido) en el pico 1 (quercetina-3-

O-glucósido ), el aumento del pico 2 (luteolina-7-O-glucósido) por la desaparición del pico 9

(luteolina-7-O-(6”-malonil)-glucósido), incremento del pico 4 (kaempferol-3-O-glucósido) tras

la degradación del pico 8 (kaempferol-3-O-(6”-malonil)-glucósido), al igual que 7

(isoramnetina-3-O-glucósido) gracias a la disminución de 10 (isoramnetina-3-O-(6”-malonil)-

glucósido), y finalmente, la formación de 12 (crisina-7-O-glucósido) a partir del compuesto 13

(crisina-7-O-(6”-O-acetil)-glucósido); las 5 transformaciones mediadas por la hidrólisis del

enlace tipo éster en la posición 6” de la unidad de glucosa (Figura 4-9).

Por otro lado, se propone que la degradación total de los picos intermedios, entre el tiempo de

retención 22.5 a 26.5 minutos (Figura 4-8), se debe especialmente a una inestabilidad debida

a la temperatura por un tiempo prolongado más que por efecto del pH. Esto teniendo en cuenta

que la reacción se llevó a cabo por 12h en reflujo al pH del agua (entre 5-6) y que al comparar

con los perfiles cromatográficos presentados más adelante a pH ácido y básico, se observa una

disminución parcial y no total de los mismos picos.

Figura 4-9: Propuesta de degradación por hidrólisis neutra. Ejemplificación de la

transformación de quercetina-3-O-(6''-malonil)-glucósido (1) a quercetina-3-O-glucósido (3).

En el estudio de la estabilidad en condiciones de estrés (bajo la misma metodología empleada

en esta tesis) de un extracto de Passiflora quadrangularis, éste se clasificó como prácticamente

estable tras 5 días de reacción. El resultado obtenido para esta especie en comparación con el

extracto de granadilla, puede deberse a su composición en flavonoides tipo vitexina, orientina

y derivados de éstos, cuyas unidades de azúcar, no presentaban sustituciones en los grupos

hidroxilo. Por el contrario, como se propone en la Figura 4-9, el grupo carbonilo de los

flavonoides glucosilados sustituidos, es altamente susceptible a ataques nucleofílicos,

explicando así la menor estabilidad del extracto de P. ligularis (153).



4.2.2 Estabilidad bajo condiciones de estrés de hidrólisis ácida

Tras someter el extracto a las condiciones iniciales planteadas en el árbol de decisión Figura

4-3 (HCl 0.1N, reflujo, 8h), el contenido de flavonoides totales disminuyó en un 89.99%, siendo

necesaria la evaluación de una condición de estrés menos severa. En el segundo nivel evaluado

(HCl 0.01N, 8h, 40ºC), no varió significativamente el contenido de FT , entre el punto inicial y

final de la reacción ( t0: 47.22 ± 0.407 y t8: 49.31 ± 0.444 mg-eq de isoquercetina/g de extracto

seco), pero sí se generaron algunos cambios en el perfil cromatográfico del extracto, tal como

se observa en la

Figura 4-10.

Figura 4-10: Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés a pH ácido –

HCl 0.01N, 8h, 40ºC- en tiempo cero (negro) y punto final (azul). Los picos numerados en


1

3

4 8

12 13 2

5

15 14 11

9

7 10

Capítulo 4 79

cambios. Condiciones cromatográficas descritas en la sección ¡Error! No se encuentra el

origen de la referencia..

Las mismas 5 principales transformaciones descritas para la hidrólisis neutra, fueron

observadas bajo la condición de hidrólisis en ácido clorhídrico 0.01N, durante 8h a 40ºC;

donde la hidrólisis del grupo malonil en los picos 3, 8, 9, y 10 o del acetilo del compuesto 13,

aumentaron los flavonoides glicosilados quercetina-3-O-glucósido (1), kaempferol-3-O-

glucósido (4), luteolina-7-O-glucósido (2), isoramnetina-3-O-glucósido (7) y crisina-7-O-

glucósido (12) respectivamente (Mecanismo de reacción planteado en la Figura 4-11).

Figura 4-11: Propuesta de degradación por hidrólisis ácida. Ejemplificación de la

transformación de luteolina-7-O-(6''-malonil)-glucósido (9) a luteolina-7-O-glucósido (2).

A pesar de que no se presentara una degradación significativa en términos del CFT, sí se

observaron cambios en el perfil cromatográfico, y siendo las condiciones inicialmente

evaluadas muy severas para el extracto, se decidió clasificar su estabilidad como MUY LÁBIL

frente a hidrólisis ácida. El hecho de que no se hayan presentado cambios de degradación

significativos en la segunda condición evaluada puede explicarse ya que, bajo estas

condiciones de estrés, el ácido es quien cataliza el ataque nucleofílico (no el agua como en el

caso de la hidrólisis neutra) y por ende, la reacción se da más rápidamente y con menor energía

(temperatura).

Reportes en la literatura sobre las posibles degradaciones de los flavonoides varían de acuerdo

con el tipo de condiciones evaluadas, la matriz estudiada y las características estructurales de

los diferentes tipos de flavonoides presentes en la misma. Sin embargo, algunas similitudes

fueron encontradas con los resultados aquí presentados. Un estudio de estabilidad de Radix

hedysari, matriz con un alto contenido de isoflavonas malonil-glucósidos, reportó que estos se



transformaban fácil y completamente en las isoflavonas glicosiladas; y que éstas, a pesar de

presentar el enlace glucosídico O-C (enlace hemiacetal lábil a los ácidos) (102), no se

degradaban a las agliconas respectivas en un rango de pH 2-7 (173); comportamiento

observado para el extracto de P. ligularis.

Un comportamiento distinto se observó para los flavonoides presentes en el extracto de P.

quadrangularis, ya que los flavonoides diglicosilados como orientina-2”-O-xilósido y vitexina-

2”-O-xilósido fácilmente se hidrolizaron en sus respectivos flavonoides mono-C-glucosilados;

y estos a su vez, debido a las condiciones de temperatura y acidez, se degradaban en los

isómeros de vitexina y orientina. Aun así, dicho extracto se clasificó como lábil debido a la poca

degradación de los flavonoides totales (153).

4.2.3 Estabilidad bajo condiciones de estrés de hidrólisis básica

Similar a lo ocurrido en las condiciones de hidrólisis ácida, el porcentaje de degradación

obtenido en el extracto tras la primera prueba de estrés propuesta en el diagrama Figura 4-3,

superó el rango de 20-80% (93.08%). El nivel de condiciones más leve seguido, conllevó a la

disminución del CFT desde 47.42 ± 0.540 hasta 16.27 ± 0.212 mg-eq de isoquercetina/g de

extracto seco, es decir, 65.67% de degradación del contenido de flavonoides en el extracto;

valor que permite clasificar su estabilidad como MUY LÁBIL ante la hidrólisis básica.

Consecuente con la disminución de los flavonoides cuantificados, los perfiles cromatográficos

mostrados en la Figura 4-12, demuestran mayor degradación de los metabolitos en

comparación con las dos condiciones de pH anteriormente analizadas; ya que disminuyeron

tanto los picos esterificados en la unidad de glucosa (3, 8, 9, 10, 13) como algunos de los

flavonoides monoglucosilados respectivos (1, 2, 4 y 7). Dicho comportamiento de menor

estabilidad en medios alcalinos, se relaciona con el carácter levemente ácido aportado por los

grupos hidroxilo fenólicos en la estructura de los flavonoides, los cuales facilitan su reactividad

(174). Adicionalmente, se ha reportado que los hidroxilos, al encontrarse ionizados a alto pH,

son susceptibles a la oxidación y consecuente degradación de los núcleos de flavonoides

(175,176). Esto podría explicar la ausencia de picos nuevos en el cromatograma

correspondientes a las agliconas. Resultados similares se encontraron en un estudio de

Capítulo 4 81

degradación forzada de Ginkgo biloba, los flavonol-glicósidos y las agliconas quercetina,

isoramnetina y kaempferol, mostraron ser más inestables bajo condiciones de hidrólisis básica

que ácida, siendo la quercetina la más lábil (177).

Nuevamente, los resultados obtenidos en el estudio bajo condiciones de estrés del extracto de

P. quadrangularis, fueron más favorables respecto a P. ligularis, ya que éste fue clasificado

como lábil, presentando cambios mínimos en la cuantificación de flavonoides totales y en el

perfil cromatográfico (153). Lo anterior puede deberse a que los flavonoides mayoritarios en

el primer extracto son flavonas-8-C-diglucosiladas, y aunque no es claro el motivo, se reporta

en la literatura que la estabilidad de los flavonoides se ve influenciada por el número de

glicosilaciones, de modo que flavonoides di-glicosilados son más estables que los

monoglicósidos (178).

Figura 4-12: Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés a pH básico –

NaOH 0.01N, 8h, 40ºC- en tiempo cero (gris) y punto final (azul). Los picos numerados en


cambios. Condiciones cromatográficas descritas en la sección ¡Error! No se encuentra el

origen de la referencia..

1

3

4 8

9

12

13

6

2

1

5

7 10 11

14 15



De acuerdo con los cambios cromatográficos observados y lo encontrado en la literatura, se

plantea en la

Figura 4-13, las degradaciones dadas en los flavonoides identificados en el extracto de

granadilla. La hidrólisis inicialmente se da en el enlace tipo éster de la glucosa, para obtener

los flavonoides monoglucosilados (

Figura 4-13, A), de los cuales, crisina-7-O-glucósido (12) mostró mayor estabilidad que

quercetina-3-O-glucósido (1), luteolina-7-O-glucósido (2), kaempferol-3-O-glucósido (4) e

isoramnetina-3-O-glucósido (7), picos que sí presentaron cierta disminución, y por ende,

pudieron sufrir la hidrólisis del enlace glucosídico y consecuente degradación oxidativa de sus

agliconas (

Figura 4-13, B).

Figura 4-13: Degradación por hidrólisis básica. A. Propuesta del mecanismo de hidrólisis del

enlace tipo éster; ejemplificación de la transformación de crisina-7-O-(6”-O-acetil)-glucósido

(13) en crisina-7-O-glucósido (12). B. Mecanismo de hidrólisis del enlace glucosídico

(179,180); ejemplo de degradación de quercetina-3-O-glucósido (1). El grado de

desprotonación en la estructura depende del pH del medio y valor de pKa de cada uno de los

hidroxilos fenólicos.

4.2.4 Estabilidad bajo condiciones de estrés de oxidación

Al comparar el perfil cromatográfico de la reacción de oxidación con peróxido de hidrógeno

30% en los tiempos 0 y 24 horas (

Capítulo 4 83

Figura 4-15, A), se observaron los mismos cambios obtenidos para las condiciones de estrés

por hidrólisis, es decir, aumentaron los flavonoides glicosilados quercetina-3-O-glucósido (1),

luteolina-7-O-glucósido (2), kaempferol-3-O-glucósido (4), isoramnetina-3-O-glucósido (7), y

crisina-7-O-glucósido (12). Consecuentemente, se observa en la

Figura 4-15-B, la alta similitud entre los cromatogramas de los últimos muestreos tomados

tanto en la condición de peroxidación, como de hidrólisis neutra, lo cual puede indicar, que las

condiciones de reacción no fueron lo suficientemente fuertes como para lograr la oxidación de

los flavonoides, y por ende, los cambios observados corresponden a un proceso de hidrólisis.

Algunas características estructurales como la presencia de grupos hidroxilos libres,

especialmente en el anillo B o en la posición 3 del anillo C, y el doble enlace entre los carbonos

2 y 3 en el anillo C, facilitan la donación de átomos de hidrógeno a radicales, o la deslocalización

de los mismos dentro de la estructura del flavonoide, generando su oxidación (Figura 4-14).

Sin embargo, la presencia de sustituyentes como los azúcares en los grupos –OH, disminuyen

ese comportamiento pro-oxidante de los flavonoides (178) y por ende, el alto contenido de

flavonoides glicosilados en el extracto de P. ligularis, podría explicar la poca reactividad frente

a las condiciones oxidativas evaluadas.

De este modo, y teniendo en cuenta que no hubo una degradación significativa del contenido

de flavonoides totales (t0h: 49.215 ± 1.126; t24h: 49.67 ± 0.518 mg-eq de isoquercetina/g de

extracto seco), se puede clasificar al extracto de hojas de granadilla como PRÁCTICAMENTE

ESTABLE. Esta misma clasificación fue asignada al extracto estandarizado de hojas de P.

quadrangularis previamente estudiado bajo las mismas condiciones de estrés (153).



Figura 4-14: Ejemplo de oxidación de flavonoides (178).

Capítulo 4 85

Figura 4-15: Cromatogramas del extracto optimizado bajo condiciones de oxidación con H2O2

30%, temperatura ambiente. A. Comparación perfiles en tiempo cero (negro) y punto final 24h

(rosa). Los picos numerados en negrilla representan los flavonoides de identidad conocida

que presentaron principales cambios. B. Comparación entre el perfil de peroxidación punto

final 24h (rosa) e hidrólisis neutra a las 12h (azul). Condiciones cromatográficas descritas en

la sección ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia..

4.2.5 Estabilidad bajo condiciones de estrés fotolíticas

1

3

4 7 8

9

12

A

B

13

2

5 10 14

15



Al comparar el perfil cromatográfico del extracto optimizado antes de iniciar la exposición a la

luz y en diferentes días durante el ensayo, no se observaron cambios drásticos, tal como se

muestra en la Figura 4-16, A. Sin embargo, la cuantificación de flavonoides totales el décimo

y trigésimo día, indicó valores de degradación de 2.85% (t0: 58.34 ± 1.587; t1: 56.68 ± 2.050

mg-eq de isoquercetina/g de extracto seco) y 11.46% (t2: 51.660 ± 0.498 mg-eq de

isoquercetina/g de extracto seco) respectivamente, logrando clasificar el extracto como

FOTOESTABLE, ya que incluso en la máxima condición propuesta por la guía de Singh y Bakshi,

no se alcanzó un nivel de degradación significativo.

Teniendo en cuenta la composición de flavonoides presentes en el extracto de hojas de

granadilla -principalmente de tipo flavona, flavonol o flavonoles glicosilados- el resultado

obtenido bajo esta condición de estrés es consecuente con diferentes estudios de

fotoestabilidad de flavonoides, que demuestran que las principales características

estructurales que determinan la fotoreactividad de estos compuestos son: la presencia del

grupo enona (cetona α,β-insaturada), y especialmente el grupo 3-OH en el anillo C (Figura

4-16, B). De modo que los flavonoides que no presentan dichas características, por ejemplo:

flavanonas (ninguno de los dos grupos), flavonas (sólo cuentan con la enona); o los flavonoles

glicosilados en la posición 3, son más estables (181–183). El mismo comportamiento de

fotoestabilidad fue observado para la especie P. quadrangularis, cuya composición en

flavonoides se caracteriza por la presencia de flavonas mono y di-glucosiladas (153).

Capítulo 4 87

Figura 4-16: A. Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés fotolíticas.

En tiempo cero (negro) y punto final día 30 (azul). B. Características estructurales que

disminuyen la fotoestabilidad de flavonoides. Condiciones cromatográficas descritas en la

sección ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia..

4.3 Conclusiones

Mediante la guía de pruebas de estrés propuesta por Singh y Bakshi, se logró estudiar la

estabilidad inherente del extracto optimizado de P. ligularis respecto al contenido de

flavonoides totales. Tanto la cuantificación de éstos, como la evaluación de los cambios

generados en el perfil cromatográfico, permitieron establecer la alta estabilidad que presenta

bajo condiciones oxidativas y fotolíticas, al ser clasificado como PRÁCTICAMENTE ESTABLE

y FOTOESTABLE respectivamente. Por el contrario, demostró niveles de degradación

significativos que lo catalogaron como un extracto LÁBIL en medios de hidrólisis neutra y MUY

LÁBIL en hidrólisis ácida y básica.

Con estos resultados, fue posible identificar como principal mecanismo de degradación, la

hidrólisis del grupo malonilo o acetilo de aquellos flavonoides malonil/acetil-glucosilados, lo

cual generó un aumento en el contenido de los respectivos flavonoides monoglucosilados.

B

A

5. Caracterización biofarmacéutica del extracto optimizado de P. ligularis

La absorción es una etapa clave en la biodisponibilidad (BD) de un fármaco, entendiéndose por

BD, la velocidad y extensión a la que un ingrediente farmacéutico activo o fracción activa se

absorbe a partir de una forma farmacéutica y se encuentra disponible en la circulación

sistémica (20). Es un proceso dinámico de transferencia del fármaco desde el lumen

gastrointestinal, a través del epitelio intestinal y hacia la circulación portal; que se puede

expresar mediante la primera ley de Fick, aplicado a membranas:

𝐽𝑝𝑎𝑟𝑒𝑑 = 𝑃𝑝𝑎𝑟𝑒𝑑 ∗ 𝐶𝑖𝑛𝑡

Donde Jpared es el flujo del fármaco a través de la membrana intestinal, Ppared es la

permeabilidad efectiva; es decir, la velocidad a la que el fármaco disuelto cruzaría la pared

intestinal y Cint es la concentración en el líquido luminal en contacto con la membrana. Es decir

que, el flujo de un fármaco es producto de la permeabilidad y la solubilidad del mismo (15).

Comprender la interacción entre estos dos parámetros y su impacto en la absorción del

fármaco, es esencial para alcanzar una biodisponibilidad aceptable (184). Ambas propiedades,

constituyen la base para el sistema de clasificación biofarmacéutico (SCB), el cual tiene un

papel importante en el desarrollo y formulación de nuevos ingredientes activos.

En este capítulo, se discuten los resultados de permeabilidad y solubilidad obtenidos para los

flavonoides presentes en el extracto de P. ligularis, con el fin de proporcionar información

preliminar sobre su proceso de absorción, y poder plantear una clasificación biofarmacéutica

de los mismos.



5.1 Metodología

5.1.1 Determinación de la solubilidad

La solubilidad de los flavonoides presentes en el extracto optimizado, se evaluó en diferentes

medios de disolución (agua y buffers en un rango de pH desde 1.2 hasta 7.4) a dos

temperaturas, 25 y 37ºC ± 2ºC. Las soluciones amortiguadoras se prepararon de acuerdo con

las especificaciones de la USP 39 (185), tal como se detalla en la Tabla 5-1.

Tabla 5-1: Composición de las soluciones buffers preparadas.

Solución

amortiguadora

(I)*

Composición Cantidad Agua

destilada c.s.p

pH 1.2 (0.135) KCl 0.2M 50 mL

200 mL HCl 0.2 M 85 mL

pH 4.5 (0.05) NaC2H3O2 . 3H2O 1.5 g

500 mL

CH3COOH 2N 7 mL

pH 6.8 (0.0724) KH2PO4 0.2 M 50 mL

200 mL NaOH 0.2 M 22.4 mL

pH 7.4 (0.0891) KH2PO4 0.2 M 50 mL

200 mL NaOH 0.2 M 39.1 mL

De ser requerido se ajustó el pH utilizando ácido clorhídrico 2M o hidróxido de

sodio 2M según el caso. *I: Fuerza iónica expresada en molaridad.

Se evaluó la solubilidad de 2 solutos presentes en el extracto: isoquercetina y los flavonoides

totales (FT) como marcadores activos. La isoquercetina fue evaluada dentro del extracto (ISQ-

OPT) y como estándar (ISQ-EST), con el fin de conocer posibles cambios en la solubilidad de

los compuestos al formar parte de la matriz vegetal.

Para determinar si las soluciones saturadas de extracto y estándar se encontraban en el

equilibrio, se cuantificó el contenido de FT e isoquercetina a través del tiempo hasta no

encontrar variaciones en cada concentración. Esto sin superar el tiempo de degradación

Capítulo 5 91

previamente evaluado en las pruebas de estabilidad bajo condiciones de estrés, es decir, 12

horas para el medio acuoso y hasta 8 horas para los buffers.

Las muestras se sometieron a agitación (50 rpm) y temperatura constante en un Heidolph

Polymax 1040-Inkubator 1000, posteriormente, se centrifugaron las muestras a 18000 rpm,

los sobrenadantes se filtraron por membranas de tamaño de poro 0.45 µm, para finalmente ser

diluidos con MeOH-agua (1:1) y cuantificados mediante las curvas de calibración descritas en

el Capítulo 2, Tabla 2-2. Cada condición fue evaluada por triplicado; los resultados se

presentan como la media ± desviación estándar.

La clasificación de alta o baja solubilidad para FT, ISQ-OPT, e ISQ-EST se determinó según el

número de dosis (Do), Ecuación 5-1𝐷𝑜 =𝑀𝑜/𝑉𝑜

𝐶𝑠=

𝐶𝑖𝑛

𝐶𝑠 Ecuación 5-1.

Do es un número adimensional que se define como la relación entre la concentración inicial

(Cin) y la solubilidad de un compuesto (186).

𝐷𝑜 =𝑀𝑜/𝑉𝑜

𝐶𝑠=

𝐶𝑖𝑛

𝐶𝑠 Ecuación 5-1

Donde Mo es la dosis (mg), Cs es la solubilidad (mg/mL) y Vo corresponde al volumen de agua

recomendado para la administración de un medicamento por vía oral, 250 mL (15). Do > 1

indica baja solubilidad y Do < 1 alta solubilidad.

Es necesario tener presente que la categorización de la solubilidad según el sistema de

clasificación biofarmacéutica, se basa en la potencia máxima reportada para el producto de

liberación inmediata (16); de modo que para el caso del extracto se tuvieron en cuenta las

dosis evaluadas en el ensayo de tolerancia a la glucosa (Figura 3-9). Aunque se observó el

efecto anti-hiperglicemiante en todas las dosis evaluadas, se seleccionó la de 250 mg/kg como

la más alta ya que, como se mencionó previamente, de acuerdo con otros estudios realizados

en el grupo de investigación por Rey, et al, en la dosis máxima de 500 mg/kg, los extractos

hidroalcohólicos de las hojas de P. ligularis conllevaron a niveles de glicemia muy bajos

considerados como hipoglicemia, efecto no deseado (11). Una vez seleccionada la dosis

máxima del extracto, se calculó la dosis equivalente de FT e ISQ-OPT que se administró a los



ratones en 250 mg extracto/Kg; para cada dosis obtenida se estimó la dosis equivalente en

humanos según la conversión basada en el área de superficie corporal (187), para finalmente

poder calcular el número de dosis. En el caso de ISQ-EST, se realizó el mismo procedimiento

teniendo en cuenta la dosis máxima del flavonoide encontrada en la literatura para ensayos de

actividad hipoglicemiante/antidiabética.

Adicionalmente, se debe considerar el valor de solubilidad más bajo encontrado en el rango de

pH fisiológico (1 a 8), a excepción de que el fármaco demuestre tener solubilidad dependiente

del pH, en cuyo caso se recomienda establecer la clasificación según el pH de cada segmento

del tracto gastrointestinal (15).

5.1.2 Determinación de la permeabilidad intestinal mediante el modelo Single Pass Intestinal Perfusion (SPIP)

Reactivos, materiales y equipos

Metoprolol ≥ 98% de Alfa AesarTM, fue utilizad como marcador de alta permeabilidad. Estándar

de quercetina-3-O-β-D-glucósido, ≥ 90%, de Sigma Aldrich para evaluar la permeabilidad de la

isoquercetina pura. Se usó como anestésico inyectable pentobarbital sódico, Penthal® (64.8

mg/mL, INVET). Acetonitrilo (HoneywellTM), metanol (Merck®) grado HPLC, ácido

trifluoroacético (Sigma Aldrich), ácido fórmico (Carlo Erba) y agua purificada mediante un

sistema Milli-Q Millipore® fueron los solventes usados para el análisis por UHPLC.

Los materiales requeridos durante el procedimiento quirúrgico fueron: jeringas de 1 y 5 mL

para la preparación y administración de la anestesia, catéter Jelco calibre 24G, suero fisiológico

estéril (NaCl 0.9%), campos quirúrgicos y gasa estéril, suturas quirúrgicas de polipropileno 4-

0, y agujas pericraneales calibre 23G (Medex®) a las cuales se les cortó la aguja y el conector

hembra, para poder utilizar el tubo vinílico restante como canal de salida del intestino. La

bomba peristáltica Minipuls-3 (Gilson) con cabezal de 4 canales, requería para su instalación

dos tipos de mangueras, en el cabezal se ubicaban dos mangueras de Viton® (diámetro interno

0.6mm, diámetro externo 2.5mm) y el extremo de salida de cada una se unía mediante un

Capítulo 5 93

conector de acero inoxidable (D.I 0.8mm) a una manguera de silicona (D.I 0.6mm, D.E 2.5mm),

la cual era insertada en el segmento intestinal correspondiente.

Los análisis por cromatografía líquida de todas las muestras fueron realizados en un equipo

Thermo scientific Dionex Ultimate 3000 equipado con un detector de arreglo de diodos Dionex

Ultimate 3000, bomba cuaternaria Dionex Ultimate 3000 RS, desgasificador en línea e inyector

automático. Los datos se procesaron utilizando el software Chromeleon Client, versión 6.80

SR15.

Animales

Los animales suministrados por el Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de

Colombia, bajo el aval del Comité de ética de la Facultad de Ciencias (Acta 09 de 2018) fueron

ratas macho Wistar de 7 a 15 semanas de edad (250-370g). Se aclimataron en condiciones de

temperatura constante (22 ° C ± 1), ciclos de luz/oscuridad de 12 horas, y consumo de alimento

y agua ad libitum previo a la realización de los ensayos.

Medios de perfusión y tratamientos evaluados

En este estudio se seleccionaron los segmentos de yeyuno e íleo para evaluar la permeabilidad

de los marcadores activos en el extracto, teniendo en cuenta reportes previos de la literatura

donde, bajo el mismo modelo de permeabilidad (SPIP), se identificaron estas dos secciones del

intestino como los sitios anatómicos donde se da la mayor absorción de algunos flavonoides

(188,189).

Teniendo en cuenta los diferentes valores de pH reportados para cada uno de los segmentos

intestinales en ratas (duodeno: 5.8-6.5; yeyuno: 6.5-6.8; íleo: 6.8-7.4; (190,191)), y que se ha

demostrado que la permeabilidad de las sustancias puede verse influenciada tanto por el

segmento evaluado como por el pH intraluminal, se seleccionó la composición de los medios

de perfusión para el yeyuno e íleo reportados por Roos y colaboradores (192), en los cuales se

encontraron las mejores correlaciones entre los datos de permeabilidad en ratas y en humanos

para 4 fármacos modelo, Tabla 5-2.



Tabla 5-2: Composición de los medios de perfusión para yeyuno e íleo.

Composición Yeyuno

Buffer 67mM, pH 6.5 Íleo

Buffer 100mM, pH 7.4

NaCl (g) 5 4

KH2PO4 (g) 6,35 1,81

Na2HPO4 (g) 3,16 8,48

Agua Milli-Q c.s.p 1000 mL 1000 mL

Se evaluó la permeabilidad en yeyuno e íleo de cinco tratamientos. El grupo I, compuesto del

marcador de permeabilidad seleccionado, metoprolol (alta permeabilidad), se preparó de

acuerdo con la potencia máxima prescrita en humanos dividida en 250 mL de medio, con el fin

de representar la concentración máxima del fármaco en el intestino. Los grupos II, III y IV,

corresponden a la perfusión del extracto en 3 concentraciones diferentes, cada una

correspondiente a las 3 dosis en las cuales se ha evaluado la actividad biológica por Rey, et al

(11). En el grupo V, se preparó el estándar de isoquercetina a la concentración en la cual se

encuentra en el extracto optimizado. Se muestra en la Tabla 5-3 las concentraciones a las

cuales se prepararon los tratamientos.

Tabla 5-3: Preparación de los tratamientos a evaluar mediante el ensayo de perfusión

intestinal en yeyuno e íleo.

Grupo Tratamiento Concentración Dosis

equivalente de CFT c

Dosis equivalente

de ISQ d

Categoría dosis e

I Metoprolol a 0.4 mg/mL

II Extracto OPT 125 mg/Kg

12.5 mg/mL 7.470 1.771 Baja

III Extracto OPT 250 mg/Kg

25 mg/mL 14.94 3.543 Media

IV Extracto OPT 500 mg/Kg

50 mg/mL 29.88 7.085 Alta

V Isoquercetina 0.015 mg/mL b 0.150

aPotencia máxima prescrita del fármaco: 100 mg. bConcentración cuantificada en el extracto: 14.17 ±

0.667 mg de isoquercetina/g extracto seco, equivalente a 15.13 ± 0.609 µg isoquercetina/mL.

cExpresado en mg-eq isoquercetina/kg. dExpresado en mg de isoquercetina/kg. eCategoría de la dosis

administrada del extracto optimizado.

Capítulo 5 95

La preparación de las muestras fue la siguiente: en 50 mL de cada uno de los medios de

perfusión (pH 6.5 y pH 7.4) se disolvió la cantidad necesaria para alcanzar la concentración

descrita en la Tabla 5-3. Posteriormente se sonicaron hasta lograr la disolución completa de

las muestras (5-10 minutos) y finalmente, se ubicaron en una plancha con agitación magnética

y temperatura (37ºC) constante durante el tiempo de duración del ensayo.

Validación de metodología analítica para la cuantificación del marcador de

permeabilidad

Para el análisis de metoprolol, se utilizó la misma fase estacionaria empleada para la

cuantificación de flavonoides, columna Phenomenex® Kinetex C18 (100 × 2,1 mm; 2,6 μm),

temperatura del horno 40ºC. La fase móvil consistió de ácido trifluoroacético (TFA) al 0.1% en

agua como fase A, y TFA 0.1% en acetonitrilo como fase B, en el siguiente gradiente: 10%-30%

B (0-2 min), 30% B (2-5 min), 10% B al min 8. Un volumen de 3μL de las muestras eran

inyectadas y eluidas a un flujo de 0.5 mL/min. La longitud de onda de máxima absorbancia fue

222 ηm.

Se prepararon por triplicado soluciones que contenían el marcador de alta permeabilidad, en

un rango de concentraciones entre 10-200 μg/mL. Todas las diluciones fueron realizadas en

MeOH-agua (1:1) y las muestras filtradas por 0.22 μm previo a su inyección en el equipo. El

método fue validado de acuerdo con los parámetros de selectividad, linealidad, precisión,

exactitud, límite de detección y de cuantificación, de la guía ICH (90).

Ensayo in situ de perfusión intestinal de un solo paso (SPIP)

Los animales fueron puestos en ayuno con libre acceso a agua por 14-16 horas previo a la

realización de cada ensayo. Las ratas se anestesiaron con una dosis de 60 mg/Kg de

pentobarbital sódico por vía intraperitoneal (IP), y una vez alcanzado el estado de anestesia

profunda se procedió de la siguiente manera:

1. Se canalizó una de las vías periféricas de la cola mediante un catéter Jelco Nº 24, con el

fin de administrar por vía intravenosa refuerzos de la anestesia diluida en suero

fisiológico (al 30% de la dosis inicial), para mantener el estado de anestesia del animal

durante todo el ensayo.



2. Se rasuró el área abdominal del animal y se ubicó en la zona quirúrgica destinada para

la realización del ensayo, la cual se encontraba aclimatada mediante un calentador de

ambientes para el mantenimiento de la temperatura corporal de la rata (Ver ¡Error!

No se encuentra el origen de la referencia.). El procedimiento quirúrgico inició al

realizar una incisión de 3-4 cm en la línea media del abdomen, rodeada con el campo

quirúrgico para exponer el intestino delgado, e identificar el punto inicial y final a

canular en cada segmento. Para el yeyuno, se realizó un pequeño corte a 5 cm del

ligamento de treitz; mientras que el comienzo del íleo se ubicaba 20 cm arriba del

ciego, en cada punto de partida se conectó la manguera respectiva proveniente de la

bomba peristáltica y se aseguró cuidadosamente mediante un punto de sutura; a partir

de allí, se midió cada segmento de aproximadamente 10 cm y se canuló de igual forma

el punto de salida con las tuberías previamente obtenidas de las agujas pericraneales

(Ver ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.). El área intestinal expuesta

fue finalmente tapada con gasa estéril, y constantemente humedecida con solución

salina a 37ºC.

3. La etapa de perfusión inició realizando un lavado con el buffer respectivo de cada

segmento (pH 6.5 para el yeyuno, pH 7.4 para el íleo), a un flujo de 1 mL/min por

aproximadamente 15 min para expulsar cualquier material sólido que pudiese quedar

remanente del ayuno, posteriormente se disminuyó el caudal a 0.5 mL/min por 15

minutos más. Seguidamente, se perfundió el tratamiento a un flujo constante de 0.2

mL/min. Después de 60 min de perfusión (tiempo aproximado para alcanzar el estado

de equilibrio de la sustancia con la membrana intestinal), se colectó el perfusado de

salida de cada segmento durante intervalos de 15 minutos (0, 15, 30, 60, 75, 90, y 105

min), en viales de vidrio previamente pesados.

4. Cada vial colectado fue inmediatamente pesado. Luego, una alícuota de 1mL fue

tomada con micropipeta y pesada en un tubo de microcentrífuga para determinar la

densidad de la solución de salida; esto con el fin de realizar la corrección gravimétrica

del flujo de salida. Todas las muestras se refrigeraron hasta terminar el ensayo y

posteriormente se almacenaron a -80ºC hasta ser analizadas.

5. Transcurrido los 105 minutos de muestreo, se sacrificó el animal mediante

sobredosificación del anestésico. Finalmente, se retiró cada segmento intestinal para

medir su diámetro y longitud exacta.

Capítulo 5 97

6. Se realizó la cuantificación de los analitos de interés tanto en las muestras perfundidas

colectadas (concentración de salida) como en las soluciones preparadas de cada

tratamiento (concentración de entrada). Para el caso de los tratamientos II-IV, se

cuantificó el contenido deFT y el contenido de isoquercetina.

Teniendo en cuenta que por cada ensayo se evaluaba la permeabilidad de un único tratamiento

(un animal, dos segmentos intestinales) y que se establecieron cinco réplicas por cada uno, la

planeación de los ensayos consistió en realizar series de experimentos por réplicas de todos

los tratamientos, es decir, que en un primer ciclo se efectuaba la primer réplica de los 5

tratamientos, en el segundo ciclo la segunda réplica, y así sucesivamente hasta completar los

5 ensayos para cada grupo; esto con el fin de que la diferencia de edad de los animales entre

las 5 series de experimentos, afectara a todos los tratamientos por igual.

Figura 5-1: Montaje para ensayo de perfusión intestinal de un solo paso. A. Calentador de

ambientes. B. Zona quirúrgica. C. Cubeta para recolección de residuos y ubicación de viales

colectores. D. Bomba peristáltica. E. Plancha de calentamiento y agitación magnética con

muestras a perfundir. F. Viales de vidrio de 10 mL vacíos y pesados. G. Balanza analítica.

B

A

C

D

E

F

G



Figura 5-2: Ilustración de la canulación de los segmentos intestinales.

Tratamiento de las muestras colectadas

Para la cuantificación de los metabolitos en las muestras colectadas, éstas se centrifugaron a

6000 rpm y alícuotas de los sobrenadantes eran tomadas y diluidas con MeOH-agua (1:1) en

caso de ser necesario. Finalmente, las soluciones se filtraron por membranas de poro de 0.22

µm y se inyectaban en el cromatógrafo UHPLC.

Análisis de los datos

El ensayo SPIP se basa en el principio de que la concentración del ingrediente activo que es

perfundido disminuye hasta alcanzar el estado de equilibrio en el segmento intestinal (la tasa

de entrada general iguala la tasa de salida general). Mediante la comparación de la

concentración que entra y la concentración de la solución que sale del segmento aislado, se

puede determinar la velocidad y grado de absorción a través de la membrana intestinal (Peff)

(193).

Para determinar la absorción de una sustancia es necesario considerar que el proceso de

absorción y secreción de agua durante el ensayo de perfusión, puede afectar el flujo de la

Capítulo 5 99

solución perfundida, e introducir errores en el cálculo de la permeabilidad efectiva (Peff, cm/s),

de modo que existen diferentes métodos para corregir el flujo de salida. El método

gravimétrico consiste en convertir el peso del perfusado intestinal colectado en un periodo de

tiempo, en un parámetro volumétrico, de tal forma que se pueda corregir el flujo de salida del

segmento intestinal (Ecuación 5-2𝑄𝑆 = 𝑃𝑆 𝐷𝑆⁄

𝑡 Ecuación 5-2) y con este valor,

corregir la concentración de salida de la solución del fármaco (Ecuación 5-3𝐶𝑆(𝑐𝑜𝑟) = 𝐶𝑆 ×𝑄𝑆

𝑄𝐸

Ecuación 5-3), para finalmente calcular el coeficiente Peff (Ecuación 5-4𝑃𝑒𝑓𝑓 =

−𝑄𝐸×ln(𝐶𝑆(𝑐𝑜𝑟)

𝐶𝐸)

2𝜋𝑟𝑙 Ecuación 5-4) (194). Los cálculos descritos a continuación se aplicaron

a los 7 muestreos tomados posterior a los 60 minutos de alcanzado el equilibrio.

Corrección de la concentración de salida (Cs(cor))

𝑄𝑆 = 𝑃𝑆 𝐷𝑆⁄

𝑡 Ecuación 5-2

𝐶𝑆(𝑐𝑜𝑟) = 𝐶𝑆 ×𝑄𝑆

𝑄𝐸 Ecuación 5-3

Donde,

QS: Flujo de salida del perfusado

Ps: Peso neto del perfusado colectado

Ds: Densidad del perfusado colectado

t: Tiempo (15 minutos)

Cs(Cor): Concentración de salida corregida

Cs: Concentración de salida cuantificada

QE: Flujo de entrada (0.2 mL/min)

Cálculo del coeficiente de permeabilidad efectiva (Peff)

𝑃𝑒𝑓𝑓 =−𝑄𝐸×ln(

𝐶𝑆(𝑐𝑜𝑟)

𝐶𝐸)

2𝜋𝑟𝑙 Ecuación 5-4

En la Ecuación 5-4, CE corresponde a la concentración de entrada, es decir, la cuantificada en

las soluciones preparadas de los tratamientos; r y l, a las medidas del radio y longitud tomadas

para cada segmento intestinal.



El coeficiente de Peff se calculó para cada muestreo realizado en el respectivo segmento

intestinal, de manera que los 7 datos obtenidos por segmento se promediaron para obtener el

valor de permeabilidad de cada réplica. Posteriormente, se calculó la Peff promedio y

desviación estándar entre las 5 réplicas, reportando así, el coeficiente de permeabilidad

efectiva promedio de cada tratamiento para el yeyuno e íleo.

Se observa en la Ecuación 5-2, que para calcular el flujo de salida es necesario tener en cuenta

la densidad del perfusado; la mayoría de reportes en la literatura asumen la densidad de todas

las soluciones colectadas como 1 mg/mL. Sin embargo, hay quienes proponen que esta

suposición puede introducir errores en el cálculo de Qs y consecuentemente de Peff,

considerando que factores como la posible erosión celular de la mucosa intestinal, causada por

la canulación y el flujo de ingreso de la solución, pueden generar la salida de ciertos

componentes solubles e insolubles en el perfusado, lo que puede alterar su densidad (194).

Por tal motivo, se quiso comparar el procedimiento de cálculo de la Peff asumiendo la densidad

como 1 mg/mL (Método A), con el procedimiento considerando la densidad específica de cada

solución (Método B).

5.1.3 Análisis estadístico

Se utilizó el programa GraphPad Prism® (versión 6, San Diego, CA, EE. UU.) para aplicar la

prueba t-Student en caso de evaluar las diferencias entre dos grupos, o ANOVA de dos vías para

múltiples comparaciones. Se consideraron diferencias estadísticamente significativas a

valores de p ≤ 0.05.

5.2 Resultados y discusión

5.2.1 Solubilidad de flavonoides totales e isoquercetina en el extracto optimizado

La solubilidad puede entenderse de manera cualitativa como la interacción espontánea entre

dos o más componentes que generan una dispersión molecular homogénea en un solvente

dado (195); y en términos cuantitativos, como la cantidad máxima de un soluto que una

Capítulo 5 101

cantidad dada de solvente puede mantener en solución, el punto de equilibrio entre el soluto

sin disolver y soluto solubilizado. Dicha capacidad puede verse afectada por características

fisicoquímicas de la molécula, como su estructura química y estado cristalino, o condiciones

específicas como la composición del solvente, el pH, temperatura y presión atmosférica (196).

Es necesario aclarar que, bajo las condiciones de ensayo establecidas, es posible hablar de la

solubilidad aparente de los marcadores activos. Dos definiciones se encuentran en la literatura

respecto a este concepto: entenderse como la solubilidad dinámica o metaestable, es decir, la

concentración de una sustancia en solución en equilibrio aparente (sobresaturación) (197); o,

la solubilidad de un soluto que se determina en un sistema tamponado (buffer) a pH definido,

y omite el efecto de la producción de sales con los contraiones que existen en la fase tampón,

sobre el valor de solubilidad estimado (195). Ambas definiciones aplican para los resultados

discutidos a continuación.

Con el fin de analizar más fácilmente el efecto del pH y la temperatura del medio en la

solubilidad aparente de los flavonoides presentes en el extracto optimizado (Tabla 5-4), se

muestra gráficamente en la Figura 5-3 los resultados obtenidos. Es necesario aclarar que no

se logró alcanzar una concentración de equilibrio (constante) de los FT en los diferentes

medios a 37ºC, a pesar de haber llegado al punto máximo de saturación del sistema a una

concentración de 1g de extracto por ml de solución, en concentraciones superiores a esta no

era posible dispersar el extracto en ninguno de los medios debido a la alta viscosidad de la

mezcla.

Tabla 5-4: Solubilidad aparente de flavonoides totales e isoquercetina en el extracto

optimizado de P. ligularis, y estándar de isoquercetina, en diferentes medios acuosos.

Marcador T

(ºC) Agua pH 1.2 pH 4.5 pH 6.8 pH 7.4

CFT 25 11,40 ± 0,585 10,04 ± 0,429 11,35 ± 0,529 9,204 ± 0,025 10,28 ± 0,277

37 > 9,243 ± 0,223 > 13,02 ± 0,156 > 13,73 ± 0,032 > 10,68 ± 0,368 > 10,53 ± 0,432

ISQ-OPT

25 2,725 ± 0,130 2,136 ± 0,075 2,733 ± 0,083 2,199 ± 0,015 2,569 ± 0,006

37 2,012 ± 0,041 2,625 ± 0,016 2,858 ± 0,008 2,291 ± 0,054 2,266 ± 0,142

25 0,071 ± 0,004 0,055 ± 0,002 0,077 ± 0,005 0,144 ± 0,005 0,223 ± 0,014



ISQ-EST 37 0,160 ± 0,001 0,142 ± 0,007 0,195 ± 0,003 0,213 ± 0,016 0,349 ± 0,012

Datos expresados en mg/mL, promedio ± desviación estándar (n=3).

Figura 5-3: A. Solubilidad aparente de flavonoides totales en soluciones acuosas a diferente

pH y temperatura. B. Solubilidad de isoquercetina como componente del extracto optimizado

(ISQ-OPT) y como compuesto puro (ISQ-EST), en soluciones acuosas a diferente pH y

temperatura. Los datos se expresan como promedio ± DS (n=3); fueron analizados mediante

un ANOVA de dos vías, seguido de una prueba Sidak de múltiples comparaciones para las

solubilidades de cada solución entre las dos temperaturas, con un valor de significancia **p

<0.01, ***p <0.001 y ****p <0.0001.

Como se mencionó anteriormente, los flavonoides son ácidos débiles que presentan diferentes

valores de pKa debido a la ionización de los grupos hidroxilos fenólicos. Para la quercetina se

A

B

Capítulo 5 103

han descrito valores de pKa de los 5 hidroxilos, entre 6.38-12.82 (176), 7.49 a 11.69 para el

kaempferol (198), 7.06 para el hidroxilo 4’ en la luteolina o 7.80 en la posición 7 del núcleo

isoramnetina (199), 8.0 y 11.9 para los dos hidroxilos libres en crisina (200). De modo que, al

aumentar el grado de ionización de los flavonoides del extracto con las soluciones preparadas

a pH > 5, se esperaba un incremento en la solubilidad aparente de los mismos. Sin embargo, se

observó un cambio descendente en la solubilidad de los flavonoides totales y la isoquercetina

contenida en el extracto, a pH 6.8 y 7.4, en las dos temperaturas evaluadas, pero especialmente

en agua a 37ºC.

Dicho comportamiento podría entenderse al tener en cuenta los siguientes aspectos. Primero,

que la solubilidad es el punto final que representa la capacidad de disolución; éste último es

un proceso termodinámico que involucra el rompimiento de las interacciones soluto-soluto, la

creación de espacios entre las moléculas del solvente y la inserción en dicho espacio de la

molécula de soluto previamente aislada. Este proceso se ve favorecido entre mayor atracción

o similitudes fisicoquímicas hayan entre el soluto y el solvente (195,196). Segundo, que el

extracto optimizado de P. ligularis es un sistema multi-componente en el cual, metabolitos

altamente solubles en agua como las saponinas, se encuentran en mayor cantidad dentro del

extracto que los flavonoides (ver como referencia los picos en los tiempos de retención 37-40

min de la Figura 2-2, B, correspondientes a las saponinas). Las saponinas identificadas hasta

el momento en el extracto son de tipo lanostano con dos unidades de azúcar (78); y la

solubilidad en agua de este tipo de compuestos aumenta con el número de unidades de azúcar

presentes en la estructura (201).

Por ende, es posible que la disolución de las saponinas y otros metabolitos secundarios dentro

de la mezcla, no permita que se cuente con el agua libre suficiente para la disolución total de

los flavonoides; efecto observado tanto para los FT como ISQ-OPT en las dos temperaturas

evaluadas, pero no para el estándar de isoquercetina. En el último caso sí se obtuvo el

comportamiento esperado de mayor solubilidad aparente a mayor pH, tanto a 25º como 37ºC.

Con el fin de verificar la significancia del efecto del pH sobre la solubilidad de los solutos, se

realizó una prueba de ANOVA de dos vías, seguido de la prueba post-hoc de Tukey para

comparar los valores de solubilidad aparente entre los pH. Para FT a 37ºC, no se encontró

diferencia estadísticamente significativa en la solubilidad a pH 6.8 y 7.4; se obtuvo diferencia



significativa (p <0.01) entre los buffers a pH 1.2 y 4.5, y diferencia altamente significativa

(p<0.0001) en todas las demás comparaciones posibles entre las soluciones. Las

comparaciones bajo la condición de 25ºC sí mostraron diferencias entre los pH 6.8 y 7.4

(p<0.001) pero no entre los medios a pH 1.2 y 4.5, ni entre pH 4.5 y el agua.

En el caso de la ISQ-OPT a 37ºC, la solubilidad aparente a pH 1.2 y en el agua fue

significativamente diferente con un valor de p<0.01 y levemente significativa entre los pH 4.5-

6.8, y 4.5-7.4 (p < 0.05); se encontró mayor diferencia entre la solubilidad a pH 4.5 y el agua

(p<0.001). Por el contrario, a 25ºC, el pH de la solución no afectó significativamente la

solubilidad aparente de la isoquercetina dentro del extracto, ya que sólo se encontró diferencia

al comparar los resultados obtenidos a pH 1.2 y 4.5 (p<0.05). La solubilidad aparente tampoco

varió significativamente en función del pH para la isoquercetina pura (ISQ-EST), en ninguna

de las dos temperaturas evaluadas.

Por otro lado, al comparar el efecto de la temperatura en la solubilidad aparente de los

flavonoides en cada solución acuosa (significancia estadística detallada en la Figura 5-3), se

observó que solamente a pH 7.4 de FT, y buffers a pH 4.5 y 6.8 de ISQ-OPT, no se obtuvieron

diferencias estadísticamente significativas. Pocas explicaciones se pueden plantear al respecto

considerando que en ningún medio a 37ºC se alcanzó el equilibrio aparente de los flavonoides

dentro de la matriz del extracto. Sin embargo, en los resultados de ISQ-EST sí se observó un

aumento en la solubilidad aparente al incrementar la temperatura, aproximadamente el doble

de lo obtenido a 25ºC en todos los medios acuosos. Esto podría indicar que el proceso de

disolución de la isoquercetina es endotérmico, teniendo en cuenta que en procesos de este

tipo, las temperaturas ambientales relativamente altas aumentan la solubilidad de los solutos,

mientras que disminuyen la solubilidad de aquellos con procesos exotérmicos (196). Se

encontraron algunos datos variables en la literatura sobre la solubilidad de isoquercetina en

agua a 25ºC, como por ejemplo, 206 nmol/mL (0.095 mg/mL) (202), 0.807 mg/mL (203) y 3

mM (1.39 mg/mL) (204).

A pesar de los inconvenientes mencionados anteriormente para establecer el equilibrio

aparente de los flavonoides dentro del extracto, es evidente que la solubilidad de los mismos

aumenta considerablemente al hacer parte de la matriz vegetal, teniendo en cuenta que la

Capítulo 5 105

solubilidad de la isoquercetina ISQ-OPT fue mucho mayor, y altamente significativa

(p<0.0001), respecto a la de ISQ-EST en todas las condiciones estudiadas. Reportes similares

en la literatura han descrito efectos sinérgicos entre los componentes de los extractos

vegetales que mejoran la solubilidad de los metabolitos, como, por ejemplo, el aumento en la

solubilidad de hiperósido al ser mezclado con flavonoides característicos de extractos de

Hypericum perforatum L. (205), o la alta solubilidad de rutina determinada en un extracto de

Physalis peruviana, en comparación con la del estándar puro (41).

Algunas posibles explicaciones para tales efectos sinérgicos se han propuesto, como

considerar que los extractos cuentan usualmente con un alto contenido de metabolitos

hidrofílicos de bajo peso molecular (como los metabolitos primarios) (206) que promueven la

hidratación rápida de la matriz, lo que resulta en un aumento de la humectación (207); y

también, que otros metabolitos presentes en la matriz pueden actuar como componentes

solubilizantes, por ejemplo, surfactantes naturales como las saponinas (206).

Adicionalmente, es importante tener en cuenta que dependiendo de la cristalinidad (tipo de

estructura cristalina o polimorfo) que presente un soluto, variará su punto de fusión, un factor

determinante de la solubilidad. De este modo, es posible que la ISQ-EST se encuentre en estado

cristalino y, por ende, presente mayor punto de fusión y consecuentemente, menor solubilidad

aparente respecto a la ISQ-OPT, la cual podría encontrarse en forma amorfa dentro del

extracto. Es de esperarse que un amorfo cuente con mayor solubilidad aparente que cualquiera

de sus formas cristalinas (208).

Finalmente, se calculó el número de dosis (Do) de los marcadores activos del extracto

optimizado de P. ligularis, como criterio para establecer la alta o baja solubilidad en el marco

del SCB. Como se mencionó previamente, Do es la relación entre la concentración del fármaco

administrado en 250 mL (un vaso de agua aproximadamente) y su solubilidad por saturación

en agua, lo que también puede entenderse como el número de vasos de agua requeridos para

disolver la dosis del fármaco. Es por esto que un número de dosis menor o igual a 1 indica una

alta solubilidad y mayor a 1 indica baja solubilidad (209).

Se presenta en la Tabla 5-5 los resultados obtenidos para los flavonoides totales e

isoquercetina en el extracto y el estándar de isoquercetina. Se decidió calcular el Do con los

valores de solubilidad más bajos obtenidos a 37ºC (Tabla 5-4), ya que no se obtuvieron



diferencias estadísticamente significativas en las solubilidades a pH 6.8 y 7.4, valores de pH de

los segmentos estudiados en el ensayo de permeabilidad, yeyuno e íleo respectivamente.

Tabla 5-5: Número de dosis Do calculado para los flavonoides totales e isoquercetina

contenidos en el extracto optimizado de P. ligularis, e isoquercetina pura.

Marcador

Dosis máxima

del extracto

en ratones

(mg/kg)

Dosis

equivalente del

marcador

(mg/kg)

Dosis

estimada en

humanos, Mo

(mg) c

Solubilidad

más baja, Cs

(mg/ml)

Do

CFT 250 14.94 a 72.88 9.243 0.032

ISQ-OPT 250 3.542 a 17.28 2.012 0.034

ISQ-EST 200 b 975.6 0.142 27.48

a Dosis calculada según la concentración de FT (59.76 mg-eq isoquercetina/g extracto seco) e

isoquercetina (14.17 mg isoquercetina/g extracto seco) en el extracto. b Dosis reportada en ratones

diabéticos KK-Ay (210). c Estimación según la fórmula de conversión: dosis en ratón/12.3; ajustando al

peso de referencia en humanos 60kg (187).

De acuerdo con estos resultados, se puede catalogar a los FT y a ISQ-OPT, según el SCB como

altamente solubles (Do < 1) y a la isoquercetina estándar como poco soluble (Do > 1).

La solubilidad es uno de los parámetros biofarmacéuticos más relevantes, considerando que

con éste se busca alcanzar la concentración deseada del fármaco en la circulación sistémica,

para lograr el efecto farmacológico (195). Una alta solubilidad acuosa representa alta

concentración del fármaco en el fluido gastrointestinal, lo que promueve la permeación del

fármaco; por el contrario, baja solubilidad, conlleva a poca disponibilidad del mismo para su

absorción (201). Alrededor del 40% de los fármacos disponibles en el mercado presentan baja

solubilidad y, entre 80-90% de los candidatos a fármacos fallan en la etapa de investigación y

desarrollo debido a problemas en su solubilidad (195).

Por ende, se destaca el efecto de la matriz vegetal y las interacciones entre los componentes

del extracto de P. ligularis, que aumentaron la solubilidad de la isoquercetina y demás

Capítulo 5 107

flavonoides del extracto; una de las propiedades clave para el desarrollo de un producto

terapéutico.

5.2.2 Evaluación de la permeabilidad de los flavonoides presentes en el extracto optimizado

Aunque existen diferentes métodos para evaluar la permeabilidad intestinal de una sustancia,

de los más empleados, células Caco-2, el método de saco evertido, y SPIP (Single Pass Intestinal

Perfusion), este último presenta algunas ventajas sobre los demás. Por ejemplo, condiciones

fisiológicas más similares a las de administración oral in vivo, como la presencia de microflora

intestinal, enzimas y transportadores de membrana; además de presentar menor sensibilidad

a las variaciones de pH y la posibilidad de estudiar diferencias regionales. Todo lo anterior lo

ha catalogado como el modelo más confiable y asertivo para poder realizar predicciones de

permeabilidad en humanos (211,212)

Para la evaluación de la permeabilidad en ratas, se tuvieron en cuenta diferentes

consideraciones para el método de perfusión intestinal in situ SPIP. Se evaluó la estabilidad

(punto inicial y punto final) de las soluciones perfundidas, mantenidas a 37ºC durante el

tiempo de duración del ensayo (aproximadamente 4h) (Anexo B-a); además de la selectividad

de cada método analítico (Anexo B-b). Los resultados de la validación del método para la

cuantificación del marcador de permeabilidad se encuentran en el Anexo: Información

suplementaria capítulo 5-c).

Para calcular correctamente la concentración del soluto que es perfundido, se necesita una

medida exacta del volumen de líquido al interior del intestino. Se seleccionó el método

gravimétrico para calcular el flujo neto de agua y así corregir el flujo de salida del perfusado,

ya que, otros métodos reportados implican la co-perfusión de marcadores no absorbibles

como el rojo de fenol, o isótopos radio-marcados como 14C-PEG. El primero, puede interferir

con la absorción o cuantificación analítica de los compuestos, y el segundo, puede implicar

otros aspectos regulatorios y de seguridad en los ensayos (213). Adicionalmente, diferentes

estudios han confirmado la equivalencia y exactitud del método gravimétrico para la

corrección del flujo (213,214). Como se mencionó anteriormente, el coeficiente de Peff

calculado para cada réplica correspondió al promedio de las permeabilidades efectivas



calculadas en cada tiempo de muestreo, una vez alcanzado el equilibrio. El estado de equilibrio

se evaluó al graficar la relación de concentración de entrada sobre salida en función del tiempo

y observar una relación constante. Se muestra en la Figura S5- 3 del anexo B, un ejemplo de

dicha gráfica y de la matriz de cálculo utilizada para determinar la Peff por medio de los dos

métodos (variaciones del método gravimétrico) evaluados.

Al comparar mediante una prueba t-Student de dos vías (p<0.05), los resultados de

permeabilidad efectiva obtenidos según el método A (asumiendo densidad como 1 mg/mL) y

método B (densidad determinada para cada solución) para cada tratamiento (Tabla 5-6), no

se encontró diferencia estadísticamente significativa entre cada par de datos, de modo que

asumir como 1 mg/mL la densidad de todas las soluciones colectadas no afectó la corrección

gravimétrica del flujo. Esto podría dar razón del manejo cuidadoso y delicado que se dio al

tejido al momento de su manipulación y canulación, además de los beneficios de un tiempo de

lavado y pre-equilibrio suficientes, considerando que algunas referencias en la literatura

describen el tiempo de lavado como el suficiente hasta observar un efluente claro, y 30 minutos

en promedio para alcanzar la fase de equilibrio (188,215).

Se exponen de aquí en adelante, las diferentes comparaciones realizadas entre los

tratamientos a partir de los resultados obtenidos en el método A.

Capítulo 5 109

Tabla 5-6: Coeficiente de permeabilidad efectiva (Peff) de FT, ISQ-OPT e ISQ-EST.

Marcador

Categoría de

dosis

administrada

Peff (cm/s) - Método A Peff (cm/s) - Método B

Yeyuno Íleo Yeyuno Íleo

CFT

Baja 3,312 x 10-5

(6,502 x 10-6)

6,711 x 10-5

(1,743 x 10-5)

3,664 x 10-5

(9,266 x 10-6)

6,999 x 10-5

(1,735 x 10-5)

Media 5,105 x 10-5

(1,223 x 10-5)

5,940 x 10-5

(6,794 x 10-6)

5,060 x 10-5

(1,548 x 10-5)

6,294 x 10-5

(7,564 x 10-6)

Alta 4,704 x 10-5

(7,053 x 10-6)

4,149 x 10-5

(6,793 x 10-6)

5,204 x 10-5

(6,770 x 10-6)

4,501 x 10-5

(6,205 x 10-6)

ISQ-OPT

Baja 3,952 x 10-5

(8,469 x 10-6)

5,604 x 10-5

(1,260 x 10-5)

4,121 x 10-5

(9,848 x 10-6)

5,867 x 10-5

(1,272 x 10-5)

Media 5,255 x 10-5

(8,444 x 10-6)

5,631 x 10-5

(7,404 x 10-6)

5,704 x 10-5

(9,602 x 10-6)

5,941 x 10-5

(7,609 x 10-6)

Alta 4,535 x 10-5

(5,500 x 10-6)

3,597 x 10-5

(6,772 x 10-6)

4,852 x 10-5

(6,144 x 10-6)

3,945 x 10-5

(6,555 x 10-6)

ISQ-EST 0.15 mg/kg 1,290 x 10-4

(3,412 x 10-5)

1,055 x 10-4

(2,336 x 10-5)

1,306 x 10-4

(3,462 x 10-5)

1,079 x 10-4

(2,213 x 10-5)

Datos expresados como el promedio (Desviación estándar), n=5. Método A: Peff calculada asumiendo

densidad de todos los perfusados como 1 mg/mL. Método B: Peff calculada con la densidad determinada para cada solución.

La permeabilidad es un parámetro que permite medir la capacidad de un fármaco para

atravesar una membrana biológica, es decir caracterizar su absorción, un proceso complejo

que puede involucrar diferentes vías (201). Dentro de los mecanismos de transporte pasivo

(difusión de componentes mediado por un gradiente de concentración que no requiere ningún

gasto de energía metabólica), se encuentra el transporte paracelular, dado a través de las

uniones estrechas entre los enterocitos; el transporte transcelular (difusión desde la

membrana apical, a través del citoplasma celular, hasta llegar a la membrana basolateral) y la

difusión transcelular facilitada por transportadores, que se produce mediante el paso de un

fármaco por su gradiente electroquímico sin la utilización de energía (216,217). Por el

contrario, en el transporte activo, el cual sí necesita energía; el mecanismo transcelular activo

mediado por transportadores, requiere de un mecanismo de acoplamiento entre la proteína

de membrana y la molécula del fármaco, para que éste sea liberado hacia el lado basolateral.

Adicionalmente, se encuentran los mecanismos de eflujo, transportadores involucrados en la



expulsión de las moléculas desde el citoplasma del enterocito hacia el lumen intestinal (216)

(Figura 5-4).

Los transportadores de entrada, ya sea por el mecanismo transcelular facilitado o activo, se

caracterizan por su capacidad de saturación y especificidad; mientras que los de eflujo,

presentan baja selectividad y son altamente expresados en los enterocitos, confiriendo así una

limitante para la absorción intestinal. De los primeros se encuentran las proteínas de la

superfamilia SLC (solute carrier), por ejemplo, PEPT, OCT, OATP, entre otros; y de los

segundos, se destacan los transportadores dependientes de ATP (o transportadores ABC-ATP

binding cassette) tales como, P-gp (glicoproteína P), MRP (multidrug ressitance-associated

proteins) y BCRP (Brest cancer resistance protein) (216,217).

Figura 5-4: Principales mecanismos de permeación intestinal de fármacos. A, difusión

transcelular; B, transporte paracelular; C, transporte transcelular facilitada por

transportadores; D, transcelular activo mediado por transportadores; E, eflujo. Figura creada

en BioRender.com.

Capítulo 5 111

Es importante tener en cuenta, que adicional a estas barreras mecánicas de las células, los

principios activos deben enfrentarse a barreras biológicas que afectan su absorción, como la

posible degradación por la microflora intestinal y el metabolismo catalizado por diferentes

enzimas (201).

Con el fin de tener una idea preliminar del posible mecanismo de absorción de los flavonoides

presentes en el extracto, se evaluó la Peff de los mismos en las 3 dosis categorizadas como baja,

media y alta. Se observa en la

Figura 5-5 que tanto para los flavonoides totales como la isoquercetina en el extracto, no se

encontraron diferencias significativas en la Peff de las dosis evaluadas, en el yeyuno, lo cual

sugiere un mecanismo de transporte pasivo que no involucre un proceso de saturación (215).

Por el contrario, en el segmento del íleo, se obtuvo para ambos marcadores un

comportamiento de permeabilidad dependiente de la concentración, donde la Peff disminuyó

significativamente al aumentar la dosis administrada. Este comportamiento se ha relacionado

en reportes de la literatura, con un mecanismo de transporte pasivo transcelular que involucre

un proceso saturable, potencialmente mediante una proteína transportadora (215,218). Sin

embrago, es importante tener en cuenta que en dichos estudios se evaluó la permeabilidad

efectiva al aumentar la concentración de un único compuesto, y no una matriz compleja como

en el caso del extracto de P. ligularis. De modo que también es necesario considerar que, al

aumentar la concentración del extracto, aumentara la competencia entre los metabolitos del

mismo por los transportadores de membrana.



Figura 5-5: Coeficiente de permeabilidad efectiva de FT (A) e isoquercetina contenida en el

extracto optimizado ISQ-OPT y como estándar ISQ-EST (B), por SPIP en ratas (n=5).

Las diferencias estadísticamente significativas se analizaron mediante un ANOVA de dos vías, seguido

de un test de Tukey (*p<0.05, **p<0.01) al comparar las dosis administradas en cada segmento; o

seguido de un test de Sidak para comparar la Peff entre yeyuno e íleo (#p<0.05).

Debido a que solamente se obtuvo diferencia significativa en la permeabilidad de FT entre el

yeyuno e íleo en la dosis más baja administrada, se puede deducir que ninguno de los dos

marcadores activos del extracto optimizado de P. ligularis, presenta absorción dependiente del

sitio intestinal (en los dos segmentos evaluados).

Por otro lado, al comparar la Peff de ISQ-OPT e ISQ-EST, se observa un aumento significativo en

la permeabilidad del estándar respecto a las 3 dosis evaluadas del flavonoide en el extracto

A

B

Capítulo 5 113

(p<0,0001 respecto a todas las dosis en el yeyuno, p<0.01 y p<0.0001 comparado con las dosis

baja-media y alta respectivamente, en el íleo). De acuerdo con la literatura, se han reportado

diferentes procesos involucrados en la absorción de isoquercetina (Figura 5-6¡Error! No se

encuentra el origen de la referencia.). Algunos estudios mediante ensayos de saco intestinal

evertido han propuesto la posible interacción de la quercetina-3-O-glucósido con el co-

transportador de Na+-D-glucosa (SGLT1), que permitiría el transporte directo del flavonoide

(219,220). Sin embargo, otros estudios aclaran que aunque esta interacción se diera, no se ha

encontrado el compuesto intacto en muestras de plasma de voluntarios humanos, ni en

ensayos con ratas (221,222). Por otro lado, diferentes autores han confirmado la hidrólisis a

quercetina, mediada por la enzima lactasa-floricina hidrolasa (LPH); de este modo la aglicona

puede absorberse a través de la membrana intestinal o ser metabolizada en el interior del

epitelio intestinal, a glucurónido de quercetina por enzimas como las UGTs (uridina-difosfato

glucuroniltransferasas) (222–224); y considerando que las reacciones de conjugación (tanto

con ácido glucurónico, sulfato u O-metilación) en el intestino delgado son muy eficientes,

difícilmente se pueden encontrar las agliconas libres en el plasma u orina (225).

Figura 5-6: Posibles mecanismos de absorción reportados para isoquercetina. Q-3-gluc:

quercetina-3-O-glucósido; Q: quercetina; LPH: lactasa-floricina hidrolasa; SGLT1:

transportador de glucosa dependiente de sodio; β-G: β-glucosidasa; UGT: uridina-difosfato

glucuroniltransferasa; Q-glucA: glucurónidos de quercetina. Modificado de Gee,J; et al. 2000,

(220). Figura creada en BioRender.com.



En términos generales, se esperaría que los demás flavonoides glucosilados presentes en el

extracto, presentaran procesos de absorción y metabolismo similares debido a la poca

variabilidad estructural entre ellos (flavonoles o flavonas O-C glucosilados). Esta propuesta se

soportaría con los resultados de Németh y colaboradores, donde solamente los glucósidos de

diferentes flavonoles, flavanonas, isoflavonas y antocianinas fueron eficazmente hidrolizadas

por la enzima LPH (agliconas unidas a otro tipo de azúcares como ramnosa, arabinosa o xilosa

no fueron sustratos de la enzima) (226). Varios de los flavonoides identificados en el extracto

de P. ligularis, han sido reportados como sustratos de la LPH en el estudio mencionado,

específicamente quercetina-3-O-glucósido, quercetina-3-O-malonilglucósido, kaempferol-3-O-

glucósido, luteolina-7-O-glucósido, y apigenina-7-O-glucósido. Es decir, que se podría

considerar la hidrólisis como la etapa limitante en el proceso de absorción en este tipo de

compuestos (más que la permeación de la aglicona por el epitelio intestinal), de modo que es

posible que las enzimas LPH responsables de la hidrólisis se encontraran más disponibles para

actuar sobre la isoquercetina pura, en comparación con la perfusión del extracto optimizado,

donde al presentarse otros flavonoides glucosilados, éstos pueden competir por la cantidad de

enzimas de hidrólisis limitada en un segmento intestinal específico (224). Dando como

resultado una menor cantidad de isoquercetina hidrolizada y metabolizada y

consecuentemente, menores cambios entre la concentración de salida y entrada de ISQ-OPT.

En resumen, según los resultados obtenidos mediante el ensayo SPIP y lo reportado en la

literatura, es posible que los flavonoides del extracto optimizado de P. ligularis, al ser todos de

tipo O-glucósido, sean inicialmente hidrolizados, a sus respectivas agliconas, por la enzima

LPH en el borde de la membrana apical y que éstas posteriormente, permeen mediante

mecanismos de difusión pasiva y transporte transcelular facilitado al interior del epitelio

intestinal; dos mecanismos previamente reportados para diferentes agliconas como

quercetina, apigenina y kaempferol (188,215).

Adicionalmente, es necesario tener en cuenta el papel que pueden jugar los transportadores

de eflujo en la absorción de los flavonoides, ya que diferentes constituyentes de extractos

vegetales han sido identificados tanto como sustratos, como inhibidores de algunas proteínas

de eflujo (ejemplo, P-gp, BCRP y MRP1) entre ellos, los flavonoides (206,227).

Capítulo 5 115

5.2.3 Clasificación biofarmacéutica de los flavonoides presentes en el extracto optimizado de P. ligularis

Finalmente, se resume en la tabla Tabla 5-7, los resultados de solubilidad y permeabilidad

obtenidos para los flavonoides del extracto optimizado de P. ligularis. La determinación de alta

o baja permeabilidad se realizó comparando el valor de Peff de los marcadores activos en la

dosis media con la Peff del metoprolol (16), en el segmento del yeyuno. Se seleccionó este

segmento considerando que es la sección del intestino delgado principalmente reportada para

la clasificación biofarmacéutica (SCB) de principios activos, y además, en el que se han

propuesto correlaciones entre la Peff en ratas y Peff en humanos para poder predecir los valores

de Peff y Fa (fracción absorbida) en humanos. Por ende, se propone también, la permeabilidad

efectiva y fracción absorbida predichas para humanos (Peff-pred y Fa-pred respectivamente) de

los marcadores activos presentes en el extracto optimizado de P. ligularis. Ambos se calcularon

de acuerdo a los modelos de correlación planteados por Zakeri y colaboradores, según estudios

de permeabilidad mediante SPIP en ratas, donde; Peff-pred = 11.04 Peff (rata) – 0.0003; y Fa-pred =

1 - e-38450 Peff (rata) (212).

Tabla 5-7: Clasificación biofarmacéutica, Peff y Fa predicha en humanos de FT, ISQ-OPT e ISQ-

EST.

Marcador

activo

Solubilidad Permeabilidad Clase del

SCB

Peff-pred

Humanos

Fa-pred

Humanos Do Categoríaa Peff (cm/s) Categoríab

FT 0.032 Alta 5,10E-05 Baja III 2,64,E-04 0,86

ISQ-OPT 0.034 Alta 5,25E-05 Baja III 2,80,E-04 0,87

ISQ-EST 27.48 Baja 1,29E-04 Alta II 1,12,E-03 0,99

a Do < 1, alta solubilidad; Do > 1, baja solubilidad. b Según Peff del marcador de alta permeabilidad,

metoprolol (7.75E-05 cm/s). c De acuerdo con el SCB (15).

Aunque se han reportado diferentes estudios relacionados con la absorción de isoquercetina,

utilizando tanto modelos celulares Caco-2 como de perfusión in situ, éstos no mencionan

valores de permeabilidad efectiva del flavonoide. Se enfocan especialmente en estudiar el



mecanismo de absorción de la isoquercetina, para lo cual, sólo buscan cuantificar el compuesto

o sus productos de metabolismo (glucurónidos) en los lados basolateral/apical en el caso de

ensayos Caco-2, o en las muestras de perfusados y/o plasma en el ensayo SPIP (222–224). De

acuerdo con Zuo y colaboradores, aunque se obtuvo un valor bajo de permeabilidad aparente

para isoquercetina en Caco-2, aclaran que en los ensayos en ratas, este valor fue mucho mayor

(no lo reportan), siendo absorbida y biotransformada rápidamente (lo cual es consistente con

los resultados obtenidos para ISQ-EST); y que las diferencias entre los dos resultados pueden

deberse a la falta de expresión de enzimas y transportadores en el modelo celular (224). Otro

reporte encontrado sobre la evaluación de la permeabilidad de isoquercetina mediante el

ensayo SPIP, analizó la Peff del flavonoide siendo componente de un extracto acuoso de Amomi

fructus, sin comparar respecto al compuesto estándar. En este caso, determinaron valores de

Peff (×10-4cm/s) 0.5995 ± 1.471, 0.5268 ± 2.324 y 0.9981 ± 2.987, para duodeno, yeyuno e íleo

respectivamente (228).

Por otro lado, no se encontró información en la literatura respecto a la clasificación

biofarmacéutica de isoquercetina, de modo que los resultados obtenidos en este trabajo,

podrían considerarse como un aporte significativo a la información biofarmacéutica de este

flavonoide y cómo sus propiedades pueden cambiar al ser parte de una matriz vegetal.

Es claro que la biodisponibilidad oral de una sustancia activa, es función principalmente de la

Peff a través de la membrana intestinal, la solubilidad en el medio gastrointestinal y, la

estabilidad metabólica. Dicho de otro modo, la biodisponibilidad (F) depende principalmente

de: la fracción absorbida del ingrediente activo (Fa), la fracción que escapó del metabolismo en

la pared intestinal (Fg), y la fracción que escapó del metabolismo hepático (Fh), es decir, F = Fa*

Fg* Fh (229).

Gracias al potencial predictivo del ensayo de permeabilidad in situ SPIP, fue posible calcular

los posibles valores de Peff-pred y Fa-pred en humanos de los metabolitos de interés. Se ha

reportado que la Fa en humanos podría definir tres clases de absorción de fármacos in vivo:

baja absorción (Fa: 0-30%), intermedia (Fa: 30-90%) y completa (Fa: 90-100%) (193,211). De

manera que de acuerdo con los resultados obtenidos (Tabla 5-7), se podría decir que los

flavonoides del extracto optimizado de P. ligularis presentan absorción intermedia (86% para

FT y 87% para ISQ-OPT) y el estándar de isoquercetina, absorción completa (99%). Es

Capítulo 5 117

necesario precisar que al calcular la Fa-pred del marcador de permeabilidad empleado,

metoprolol, se obtuvo una fracción absorbida del 95%, igual a la Fa reportada para éste en

humanos (≥95%) (211,212).

Como se mencionó anteriormente, el sistema de clasificación biofarmacéutica permite analizar

el impacto de dos propiedades fundamentales en la absorción intestinal de una sustancia

activa; la solubilidad y la permeabilidad. Provee la información básica para tomar decisiones

en torno a la manipulación de las características estructurales y fisicoquímicas de un candidato

a fármaco, para mejorar sus condiciones de absorción (217).

Para el caso de los compuestos de la clase II, la solubilidad es el parámetro limitante de la

absorción, y como se mencionó previamente, es uno de los mayores retos biofarmacéuticos a

modificar efectivamente. Esto en parte porque, aunque se logre aumentar la solubilidad

aparente del fármaco mediante diferentes tipos de formulaciones, esto no necesariamente se

refleja en un aumento de la biodisponibilidad oral. Lo anterior se ha relacionado con que las

aproximaciones que se suelen llevar a cabo para aumentar la solubilidad, tienen un efecto

concomitante sobre la permeabilidad del fármaco, de hecho, ésta puede aumentar, no cambiar,

o incluso disminuir (230).

Respecto a los compuestos de la clase III, se sabe que la permeabilidad intestinal es lo que

limita la velocidad de absorción de los compuestos en esta categoría (15); como consecuencia,

la tasa de disolución suele ser menos importante que la velocidad o tiempo del tránsito

gastrointestinal, y éste suele ser sensible a los efectos de los excipientes en la formulación

(231), un aspecto importante a tener en cuenta para poder mejorar la permeabilidad. También

se sabe que las bombas de eflujo pueden jugar un papel importante sobre la absorción de este

tipo de compuestos. Sin embargo, el efecto dependerá de 3 aspectos principales, (1) la afinidad

de los compuestos por la proteína, que como se mencionó anteriormente, los flavonoides, en

caso de tener afinidad por los transportadores pueden actuar como sustratos o

moduladores/inhibidores (especialmente en el caso de matrices vegetales que son una mezcla

de diferentes estructuras químicas); (2) el nivel de expresión de los transportadores a lo largo

del intestino, de modo que la interacción con los transportadores puede ser más significativa

en unos segmentos que en otros; o incluso (3), podría no verse afectada significativamente la

absorción debido a la baja permeabilidad, ya que la baja cantidad de los metabolitos al interior



de los enterocitos podría conllevar a transportadores sub-saturados (229). Estudios más

especializados se requieren para elucidar el efecto de los transportadores en la absorción del

extracto de P. ligularis.

Dentro de las aproximaciones de tecnología farmacéutica principalmente estudiadas para el

mejoramiento de la permeabilidad de fármacos se encuentran (232):

- La formación de profármacos, que busca aumentar la lipofilicidad de los compuestos para

promover el transporte pasivo. Sin embargo, su aplicación a matrices vegetales sería compleja

debido a que implica la formación de una nueva entidad química, una aproximación cuya

especificidad sería difícil de controlar en una mezcla variada de estructuras químicas.

- Los potenciadores de la permeabilidad (permeation enhancers, PEs) pueden modificar las

propiedades reológicas del mucus, alterar la fluidez de la membrana gástrica, inhibir enzimas

como las proteasas o las bombas de eflujo, pero se debe evaluar su uso con precaución debido

a potenciales efectos adversos en humanos.

- La técnica de contraiones o ion-pairing, la cual consiste en acomplejar las moléculas de

interés con especies iónicas de carga opuesta, de manera que se neutraliza la carga del fármaco

y favorece la difusión pasiva a través de la membrana, sin embargo, presenta la limitante de

que la interacción iónica formada no sea lo suficientemente fuerte y el complejo se disocie

durante la etapa de permeación.

- Y finalmente, las aproximaciones basadas en micro y nanotecnología, son de las más

investigadas actualmente para mejorar la entrega de fármacos pues se presume que debido al

pequeño tamaño de partícula en las formulaciones, se pueden favorecer diferentes

propiedades (entre ellas la permeabilidad) y proporcionar mejoras significativas en la

biodisponibilidad (232). Técnicas como nanoemulsiones, microemulsiones, o formulaciones

basadas en lípidos (como los sistemas de entrega de fármacos autoemulsificables), han sido

aplicadas con éxito para fitoconstituyentes y extractos vegetales (233–235).

Finalmente se puede decir que, aunque la absorción es un proceso complejo de las

interacciones entre factores fisicoquímicos/biofarmacéuticos de los ingredientes activos y los

procesos biológicos dados al interior del organismo, los resultados presentados anteriormente

aportan información valiosa para comprender cómo se lleva a cabo esta etapa en los

flavonoides encontrados en el extracto optimizado de hojas de Passiflora ligularis. Se deben

Capítulo 5 119

tener en cuenta las características mencionadas para los compuestos de la clase III del SCB,

para el desarrollo de una formulación que potencialmente mejore la permeabilidad de los

flavonoides del extracto, y consecuentemente su biodisponibilidad oral.

5.3 Conclusiones

Se estableció que la matriz del extracto modifica favorablemente la solubilidad acuosa de la

isoquercetina (y probablemente la de los demás flavonoides, considerando que son todos

estructuralmente similares) desde poco a altamente soluble, pero, además, mantiene la

característica de alta solubilidad a diferentes valores de pH, lo que permite sugerir, que sea

altamente soluble a lo largo de todo el tracto gastrointestinal.

Al relacionar los resultados obtenidos en el ensayo de permeabilidad in situ SPIP, con lo

reportado en la literatura para flavonoides O-glucosilados, se logró sugerir que los flavonoides

del extracto, tras ser hidrolizados en el lumen intestinal, permean la membrana intestinal

mediante mecanismos de transporte pasivo; y que debido a la competencia de los flavonoides

por la enzima hidrolasa LPH, éstos no puedan atravesar tan rápida/fácilmente el epitelio, a

diferencia del estándar de isoquercetina.

Finalmente, la caracterización de la solubilidad (alta) y permeabilidad (baja) de los flavonoides

en el extracto, permitió catalogarlos dentro de la clase III del sistema de clasificación

biofarmacéutico, y, al estándar de isoquercetina en la clase II; de modo que es evidente el efecto

de la matriz vegetal sobre la absorción de los flavonoides. Gracias al modelo de permeabilidad

empleado, fue posible proponer valores de permeabilidad efectiva y fracción absorbida en

humanos, que permitieron identificar a los flavonoides presentes en el extracto, de absorción

intermedia, y al estándar de isoquercetina, de absorción completa.

6. Conclusiones y recomendaciones

6.1 Conclusiones

Se desarrolló y validó una metodología analítica por UHPLC-DAD para la cuantificación de los

metabolitos/marcadores establecidos como activos, los flavonoides. Gracias a la mayor

resolución obtenida para el perfil cromatográfico de extractos de las hojas de P. ligularis, se

decidió contribuir a la identificación de los flavonoides presentes en el extracto hidro-

alcohólico, mediante el análisis por UHPLC-MS/MS y la dereplicación con la literatura o

librerías disponibles en línea. De este modo, además de confirmar los flavonoides previamente

identificados para extractos polares de esta especie, se propuso la presencia de dos flavonoles

acetil-glucosilados y una flavona malonil-glucosilada.

Las condiciones de extracción asistida por ultrasonido, para la obtención de un extracto de

hojas de P. ligularis optimizado en el contenido de flavonoides, fueron, etanol al 63%, 70ºC y

33 minutos. Dicho extracto mostró mayor actividad antiglicante in vitro y efecto anti-

hiperglicemiante in vivo, que el extracto obtenido por infusión de las hojas.

Se determinó la estabilidad del extracto optimizado, en función de la degradación de los

flavonoides totales bajo diferentes condiciones de estrés. Éste se clasificó como lábil ante

hidrólisis neutra, muy lábil, en hidrólisis ácida/básica; prácticamente estable a la

peroxidación, y fotoestable.

Se describió la alta solubilidad y baja permeabilidad de los marcadores activos. De acuerdo con

esta caracterización, se catalogaron los flavonoides del extracto optimizado de P. ligularis,

dentro de la clase III del Sistema de Clasificación Biofarmacéutico.



6.2 Recomendaciones

Complementar los estudios de estabilidad realizando pruebas de estabilidad acelerada e

intermedia que permitan proponer la vida útil aparente del extracto optimizado.

Realizar ensayos de incubación del contenido intestinal con el extracto optimizado y con el

estándar de isoquercetina, con el fin de evaluar posibles degradaciones por bacterias en el

lumen intestinal.

Se recomienda realizar ensayos de permeabilidad que involucren la co-perfusión del extracto

con inhibidores de transportadores de eflujo, para poder tener mayor claridad en el efecto que

dichas proteínas pueden tener en el proceso de absorción de los flavonoides; o evaluar

posibles interacciones de los metabolitos del extracto como inhibidores de los mismos.

Desarrollar prototipos de formulación que mejoren las características biofarmacéuticas del

extracto, puntalmente la permeabilidad, con el fin de posiblemente aumentar la

biodisponibilidad del mismo.

Adelantar ensayos de biodisponibilidad en modelos animales que permitan obtener mayor

información respecto a las etapas de distribución, metabolismo y eliminación de los

flavonoides presentes en el extracto, junto con estudios de toxicidad aguda, subcrónica y/o

crónica del extracto optimizado de P. ligularis.

A. Anexo: Información suplementaria Capítulo 2 y 3

Figura S3- 1: Certificado de identificación taxonómica.

124 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas

de Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides

lo g [ In h ib id o r]

Inh

ibic

ión

de

la

fo

rm

ac

ión

de

AG

Es

(%

)

1 .5 2 .0 2 .5 3 .0 3 .5

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

In fu s ió n O p tim iza d o

Figura S3- 2: Actividad antiglicante de extractos de hojas de Passiflora ligularis. Resultados expresados

como promedio ± LC 95%.

lo g [ Is o q u e rc e t in a ]

Inh

ibic

ión

de

la

fo

rm

ac

ión

de

AG

Es

(%

)

0 1 2 3

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Figura S3- 3: Actividad antiglicante de isoquercetina. Resultados expresados como promedio ± LC 95%.

Anexo A. Información suplementaria capítulo 3 125

lo g [A s tra g a lin a ]

Inh

ibic

ión

de

la

fo

rm

ac

ión

de

AG

Es

(%

)

0 .8 1 .0 1 .2 1 .4 1 .6

0

2 0

4 0

6 0

8 0

Figura S3- 4: Actividad antiglicante de astragalina. Resultados expresados como promedio ± LC 95%.

lo g [Q u e rc e t in a ]

Inh

ibic

ión

de

la

fo

rm

ac

ión

de

AG

Es

(%

)

0 .8 1 .0 1 .2 1 .4 1 .6

0

2 0

4 0

6 0

8 0

Figura S3- 5: Actividad antiglicante de astragalina. Resultados expresados como promedio ± LC 95%.

B. Anexo: Información suplementaria capítulo 5

a) Estabilidad de las soluciones perfundidas

A

B

Anexo B. Información suplementaria capítulo 5 127

Figura S5- 1: En negro soluciones preparadas en buffer al iniciar ensayo y en rosa, perfil de la

misma solución al finalizar tiempo del ensayo. A. Perfiles del metoprolol, λ: 222 ηm. B. Perfiles

del extracto preparado a la dosis media, λ: 350 ηm. C. Perfiles de ISQ-EST, λ: 260 ηm.

b) Selectividad y especificidad de los métodos analíticos

Con el fin de evaluar la capacidad de los métodos analíticos para analizar el analito de interés

en presencia de otros componentes que pudiesen estar presentes en la matriz biológica, se

muestra la comparación de un cromatograma típico del blanco de perfusión intestinal

obtenido tras la etapa de lavado del intestino, las soluciones preparadas en buffer y el

perfundido intestinal obtenido para cada tratamiento evaluado. Se observa que no se

presentaron picos de compuestos endógenos del contenido intestinal que interfirieran con los

picos de los analitos.

C

128 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas

de Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides

Figura S5- 2: En negro, blanco de perfusión; en azul solución preparada en buffer; y rosa, la

misma solución pero colectada del intestino. A. Perfiles del metoprolol, λ: 222 ηm. B. Perfiles

del extracto preparado a la dosis media, λ: 350 ηm. C. Perfiles de ISQ-EST, λ: 260 ηm.

C

B

A

Anexo B. Información suplementaria capítulo 5 129

c) Validación método analítico para la cuantificación de metoprolol.

Tabla S5- 1: Datos de linealidad y sensibilidad de la curva de calibración de metoprolol.

Analito

Rango de

linealidad

(µg/mL)

Ecuación de

calibración (r2)a

F calculado

b

LDDc

(µg/mL)

LDCd

(µg/mL)

Metoprolol

(222 ηm) 10.00-200.0 y = 0.1297x – 0.0714 0.9993

24153.55 0.100 0.250

a Coeficiente de correlación. b Valor tabulado: F1,16 = 4.494; a un nivel de confianza del 95%. c

LDD: límite de detección. d LDC: límite de cuantificación.

Tabla S5- 2: Precisión y exactitud de curva de calibración del metoprolol.

Analito (µg/mL) Precisión Exactitud

Repetibilidad (1 día)

X ± %CV (n=3)

Precisión intermedia

(3 días) X ± %CV

(n=3)

%Recuperación X ± %CV (n=3)

Metoprolol (222 ηm)

10.00 1.264 ± 1.957 1.277 ± 0.905 103.1 ± 1.038

100.0 12.82 ± 2.480 12.97 ± 1.104 102.6 ± 0.928

200.0 25.79 ± 1.232 29.96 ± 1.404 101.1 ± 1.141

A

B

Figura S5- 3: A. Ejemplo de la matriz de cálculo para la Peff de FT-250 mg/kg en el íleo. B. Aproximación del estado estacionario CFT-250

mg/kg en el íleo.

0,00,E+00

1,00,E-01

2,00,E-01

3,00,E-01

4,00,E-01

5,00,E-01

6,00,E-01

7,00,E-01

8,00,E-01

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180

Co

ut-

cor/

Cin

min

Bibliografía

1. Cefalu WT, Stephens JM, Ribnicky DM. Diabetes and herbal (botanical) medicine.

In: Herbal medicine: Biomolecular and clinical aspects. Second. CRC

Press/Taylor & Francis; 2011. p. 405–18.

2. Shan JJ, Rodgers K, Lai C-T, Sutherland SK. Challenges in natural health product

research: The importance of standardization. Proc West Pharmacol Soc.

2007;50:24–30.

3. Organización Mundial de la Salud. Estrategia de la OMS sobre medicina

tradicional 2014-2023. Organización Mundial de la Salud. 2013. p. 1–72.

4. Kumari R. A review on the standardization of herbal medicines. Int J Pharma Sci

Res. 2016;7(02):97–106.

5. Cañigueral S, Tschopp R, Ambrosetti L, Vignutelli A, Scaglione F, Petrini O. The

development of herbal medicinal products. Pharmaceut Med. 2008;22(2):107–

18.

6. The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products. Points to

consider on the biopharmaceutical characterisation of herbal medicinal

products. 2003 p. 3–6.

7. Lee TW, Boersen NA, Hui H, Chow S, Wan K, Chow AH. Delivery of poorly soluble

compounds by amorphous solid dispersions. Curr Pharm Des. 2014;20(3):303–

24.

8. Ministerio de salud y protección social. Resolución 1156 de 2018. República de

Colombia; 2018 p. 4.

9. Monzón JG. Estudio metabólico de hojas de Passiflora ligularis Juss y su relación

con la actividad inhibitoria sobre α-amilasa y α-glucosidasa. Universidad



Nacional de Colombia; 2019.

10. Rey D, Miranda Sulis P, Alves Fernandes T, Gonçalves R, Silva Frederico MJ, Costa

GM, et al. Astragalin augments basal calcium influx and insulin secretion in rat

pancreatic islets. Cell Calcium. 2019;80(March):56–62.

11. Rey D, Fernandes T, Sulis P, Gonçalves R, Sepúlveda P, Frederico MJ, et al. Cellular

target of isoquercetin for glucose uptake in rat soleus muscle. Chem Biol

Interact. 2020;330:109198.

12. Baena Y, Ponce D´león L. Importancia y fundamentación del sistema de

clasificación biofarmacéutico, como base de la exención de estudios de

biodisponibilidad y bioequivalencia in vivo. Rev Colomb Cienc Quím Farm.

2008;37(1):18–32.

13. Waldmann S, Almukainzi M, Chacra N, Amidon G. Provisional biopharmaceutical

classification of some common herbs used in western medicine. Mol Pharm.

2012;9(4):815–22.

14. Fong SYK, Liu M, Wei H, Löbenberg R, Kanfer I, Lee VHL, et al. Establishing the

pharmaceutical quality of Chinese herbal medicine: A provisional BCS

classification. Mol Pharm. 2013;10(5):1623–43.

15. Amidon GL, Lennernäs H, Shah VP, Crison JR. A theoretical basis for a

biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product

dissolution and in vivo bioavailability. Vol. 12, Pharmaceutical Research. 1995.

p. 413–20.

16. U.S. Department of Health and Human Services, Food and drug administration,

Center for Drug Evaluation and Research (CDER). M9 Biopharmaceutics

classification system-based biowaivers. Guidance for industry. 2021 p. 1–16.

17. EMA. European Medicines Agency. Guideline on the investigation of

bioequivalence. 2010 p. 1–27.

18. WHO. World and Health Organization. WHO Expert commitee on specifications

for pharmaceutical preparations [Internet]. 2005. Disponible en:

http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/43443/1/WHO_TRS_937_eng.pdf

Bibliografía 133

19. ICH. ICH Harmonised guideline. Biopharmaceutics classification system-based

biowaivers. M9 [Internet]. [citado 2018 Diciembre 13]. Disponible en:

https://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/M

ultidisciplinary/M9/M9EWG_DraftGuideline_Step2_2018_0606.pdf

20. Ministerio de salud y protección social. Resolución 1124 de 2016. República de

Colombia; 2016 p. 1–62.

21. Wu CY, Benet LZ. Predicting drug disposition via application of BCS:

Transport/absorption/ elimination interplay and development of a

biopharmaceutics drug disposition classification system. Pharm Res.

2005;22(1):11–23.

22. Charalabidis A, Sfouni M, Bergström C, Macheras P. The biopharmaceutics

classification system (BCS) and the biopharmaceutics drug disposition

classification system (BDDCS): Beyond guidelines. Int J Pharm. 2019;566:264–

81.

23. Ku MS. Use of the biopharmaceutical classification system in early drug

development. AAPS J. 2008;10(1):208–12.

24. Davanço MG, Campos DR, Carvalho P de O. In vitro – In vivo correlation in the

development of oral drug formulation: A screenshot of the last two decades. Int

J Pharm. 2020;580:119210.

25. Zane P, Gieschen H, Kersten E, Mathias N, Ollier C, Johansson P, et al. In vivo

models and decision trees for formulation development in early drug

development: A review of current practices and recommendations for

biopharmaceutical development. Eur J Pharm Biopharm. 2019;142:222–31.

26. Butler JM, Dressman JB. The developability classification system: Application of

biopharmaceutics concepts to formulation development. J Pharm Sci.

2010;99(12):4940–54.

27. Rosenberger J, Butler J, Dressman J. A refined Developability Classification

System (rDCS). J Pharm Sci. American Pharmacists Association;

2018;107(8):2020–32.



28. Rosenberger J, Butler J, Muenster U, Dressman J. Application of a refined

developability classification system. J Pharm Sci. 2019;108(3):1090–100.

29. Tsume Y, Mudie DM, Langguth P, Amidon GE, Amidon GL. The Biopharmaceutics

Classification System: Subclasses for in vivo predictive dissolution (IPD)

methodology and IVIVC. Eur J Pharm Sci. 2014;57(1):152–63.

30. Tsume Y, Takeuchi S, Matsui K, Amidon GE, Amidon GL. In vitro dissolution

methodology, mini-Gastrointestinal Simulator (mGIS), predicts better in vivo

dissolution of a weak base drug, dasatinib. Eur J Pharm Sci. 2015;76:203–12.

31. Macheras P, Karalis V. A non-binary biopharmaceutical classification of drugs:

The ABΓ system. Int J Pharm. 2014;464(1–2):85–90.

32. Camenisch GP. Drug disposition classification systems in discovery and

development: A comparative review of the BDDCS, ECCS and ECCCS concepts.

Pharm Res. 2016;33(11):2583–93.

33. Abdel-Rahman SM, Amidon GL, Kaul A, Lukacova V, Vinks AA, Knipp GT.

Summary of the National Institute of child health and human development-best

pharmaceuticals for children act pediatric formulation initiatives workshop-

pediatric Biopharmaceutics Classification System working group. Clin Ther.

2012;34(11):S11–24.

34. Batchelor HK, Fotaki N, Klein S. Paediatric oral biopharmaceutics: Key

considerations and current challenges. Adv Drug Deliv Rev. 2014;73:102–26.

35. Elder DP, Holm R, Kuentz M. Medicines for pediatric patients-biopharmaceutical,

developmental, and regulatory considerations. J Pharm Sci. 2017;106(4):950–

60.

36. Shah V, Yacobi A, Miron D, et.al. A science based approach to topical drug

classification system (TCS). Int J Pharm. 2015;491(1–2):21–5.

37. Locvv D, Kaszkin M. Approaching the problem of bioequivalence of herbal

medicinal products. Phyther Res. 2002;16(8):705–11.

38. European Pharmacopoeia. Extracts. En: European Pharmacopoeia. 7ª ed. 2011.

p. 674.

Bibliografía 135

39. Yuan Y, Zhang H, Sun F, Sun S, Zhu Z, Chai Y. Biopharmaceutical and

pharmacokinetic characterization of asiatic acid in Centella asiatica as

determined by a sensitive and robust HPLC – MS method. J Ethnopharmacol.

2015;163:31–8.

40. Pérez-Sánchez A, Borrás-Linares I, Barrajón-Catalán E, Arráez-Román D,

González-Álvarez I, Ibáñez E, et al. Evaluation of the intestinal permeability of

rosemary (Rosmarinus officinalis L.) extract polyphenols and terpenoids in Caco-

2 cell monolayers. PLoS One. 2017;12(2):1–18.

41. Domínguez Moré GP, Feltrin C, Brambila PF, Cardona MI, Echeverry SM, Simões

CMO, et al. Matrix effects of the hydroethanolic extract and the butanol fraction

of calyces from Physalis peruviana L. on the biopharmaceutics classification of

rutin. J Pharm Pharmacol. 2020;72(5):738–47.

42. Ocampo Pérez J, Coppens d’Eeckenbrugge G, Restrepo M, Jarvis A, Salazar M,

Caetano C. Diversity of Colombian Passifloraceae: biogeography and an updated

list for conservation. Biota Colomb. 2007;8(1):1–45.

43. Hernández, R. Bernal A. Lista de Especies de Passifloraceae de Colombia. Biota

Colomb. 2000;1(3):320–35.

44. Ocampo J. Diversidad y distribución de las Passifloraceae en el departamento del

Huila en Colombia. Acta Biológica Colomb. 2013;18(3):511–6.

45. Ministerio de Agricultura. Pasifloras son buen ejemplo de aumento de

exportaciones y sustitución de importaciones [Internet]. [citado 2017 Abril 13].

Disponible en:

https://www.minagricultura.gov.co/noticias/Paginas/Pasifloras-son-buen-

ejemplo-de-aumento-de-exportaciones-y-sustitución-de-importaciones.aspx

46. Dhawan K, Dhawan S, Sharma A. Passiflora: A review update. J Ethnopharmacol.

2004;94(1):1–23.

47. Ramos FA, Castellanos L, López C, Palacios L, Duque C, Pacheco R, et al. An

orientin derivative isolated from Passiflora tripartita var. mollissima. Lat Am J

Pharm. 2010;29(1):141–3.



48. Kannan S, Devi BP, Jayakar B. In-vitro antibacterial activity of various extracts on

the leaves of Passiflora mollissima. J Chem Pharm Res. 2010;2(5):225–8.

49. Edwin E, Sheeja E, Dhanabal S, Suresh B. Antihyperglycemic activity of Passiflora

mollissima bailey. Indian J Pharm Sci. 2007;69(4):570–1.

50. Benincá JP, Montanher AB, Zucolotto SM, Schenkel EP, Fröde TS. Evaluation of

the anti-inflammatory efficacy of Passiflora edulis. Food Chem.

2007;104(3):1097–105.

51. Ayres A, Araújo L, Soares T, Costa G, Reginatto F, Ramos FA, et al. Comparative

central effects of the aqueous leaf extract of two populations of Passiflora edulis.

Rev Bras Farmacogn. 2015;25(5):499–505.

52. Deng J, Zhou Y, Bai M, Li H, Li L. Anxiolytic and sedative activities of Passiflora

edulis f. flavicarpa. J Ethnopharmacol. 2010;128(1):148–53.

53. Cazarin C, da Silva J, Colomeu T, Batista Â, Meletti L, Paschoal JAR, et al. Intake of

Passiflora edulis leaf extract improves antioxidant and anti-inflammatory status

in rats with 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid induced colitis. J Funct Foods.

2015;17:575–86.

54. Rivas Mena KE, Muñoz DL, Pino Benítez CN, Balcázar Morales N. Actividad

antioxidante, contenido fenólico total y citotoxicidad de extractos polares

obtenidos de plantas antidiabéticas colombianas. Rev Cuba Plantas Med.

2015;20(3):277–89.

55. Celso P, Hoshino A, Campos J, Fúlvio R. Possible anxiolytic effect of two extracts

of Passiflora quadrangularis L. in experimental models. Phyther Res.

2007;21:481–4.

56. Ramaiya SD, Bujang JS, Zakaria MH. Assessment of total phenolic , antioxidant ,

and antibacterial activities of Passiflora species. Sci World J. 2014;167309.

57. Yuldasheva LN, Carvalho EB, Catanho MTJA, Krasilnikov O V. Cholesterol-

dependent hemolytic activity of Passiflora quadrangularis leaves. Brazilian J Med

Biol Res. 2005;38(7):1061–70.

58. Gazola AC, Costa GM, Zucolotto SM, Castellanos L, Ramos FA, de Lima TCM, et al.

Bibliografía 137

The sedative activity of flavonoids from Passiflora quadrangularis is mediated

through the GABAergic pathway. Biomed Pharmacother. 2018;100(43):388–93.

59. Barbosa PR, Valvassori SS, Bordignon CL, Kappel VD, Martins MR, Gavioli EC, et

al. The aqueous extracts of Passiflora alata and Passiflora edulis reduce anxiety-

related behaviors without affecting memory process in rats. J Med Food.

2008;11(2):282–8.

60. Wasicky A, Hernandes LS, Vetore-Neto A, Moreno PRH, Bacchi EM, Kato ETM, et

al. Evaluation of gastroprotective activity of Passiflora alata. Brazilian J

Pharmacogn. 2015;25(4):407–12.

61. Rudnicki M, de Oliveira MR, Veiga Pereira T da, Reginatto FH, Dal-Pizzol F,

Fonseca Moreira JC. Antioxidant and antiglycation properties of Passiflora alata

and Passiflora edulis extracts. Food Chem. 2007;100(2):719–24.

62. Colomeu TC, Figueiredo D, Cazarin CBB, Schumacher N, Jr MRM, Meletti LMM, et

al. Antioxidant and anti-diabetic potential of Passiflora alata Curtis aqueous

leaves extract in type 1 diabetes mellitus (NOD-mice). Int Immunopharmacol.

2013;1–10.

63. Figueiredo D, Colomeu TC, Schumacher NSG, Stivanin-Silva LG, Cazarin CBB,

Meletti LMM, et al. Aqueous leaf extract of Passiflora alata Curtis promotes

antioxidant and anti-inflammatory effects and consequently preservation of

NOD mice beta cells (non-obese diabetic). Int Immunopharmacol. 2016;35:127–

36.

64. Kandandapani S, Balaraman AK, Ahamed HN. Extracts of passion fruit peel and

seed of Passiflora edulis (Passifloraceae) attenuate oxidative stress in diabetic

rats. Chin J Nat Med. 2015;13(9):680–6.

65. Salgado JM, Bombarde TAD, Mansi DN, Piedade SMDS, Meletti LMM. Effects of

different concentrations of passion fruit peel (Passiflora edulis) on the glicemic

control in diabetic rat. Ciência e Tecnol Aliment. 2010;30(3):784–9.

66. Zas P, John S. Diabetes and medicinal benefits of Passiflora edulis. Int J Food Sci

Nutr Diet. 2016;5(2):265–9.



67. Janebro DI, De Queiroz MDSR, Ramos AT, Sabaa-Srur AUO, Da Cunha MAL, Diniz

MDFFM. Efeito da farinha da casca do maracujá-amarelo (Passiflora edulis f.

flavicarpa Deg.) nos níveis glicêmicos e lipídicos de pacientes diabéticos tipo 2.

Brazilian J Pharmacogn. 2008;18(Supl.):724–32.

68. Birudu RB, Naik MJ, Janardhan M. Anti-Dyslipidemia effect of ethanol extract of

Passiflora foetida on dextrose induced diabetic rats. UK J Pharm Biosci.

2016;4(1):13–9.

69. Sijuade A. Effect of methanolic extract of Passiflora foetida on glucose kinetics in

alloxan-induced diabetic mice. Br J Med Med Res. 2016;14(1):1–7.

70. Montefusco-pereira CV, Carvalho MJ De, Paula A, Boleti DA, Teixeira LS, Matos

HR, et al. Antioxidant, anti-inflammatory, and hypoglycemic effects of the leaf

extract from Passiflora nitida Kunth. 2013; 170(6):1367-1378.

71. Rivera B, Miranda D, Avila LA, Nieto AM. Podas y labores complementarias en el

cultivo de granadilla. En: Manejo integral del cultivo de la granadilla (Passiflora

ligularis Juss). Primera Ed. Editorial Litoas; 2002. p. 43.

72. Ocampo J, Merlín Y. Passiflora de Colombia (Passifloraceae) [Internet]. Citado

febrero 2018. Disponible en:

https://www.researchgate.net/publication/260510981_Pasiflora_de_Colombi

a_Passifloraceae

73. Ocampo J, Arias JC, Urrea R. Colecta e identificación de genotipos de élite de

granadilla (Passiflora ligularis Juss.) en Colombia. Rev Colomb Ciencias

Hortícolas. 2015;9(1):9.

74. DANE-Departamento Administrativo Nacional de Estadística. Encuesta Nacional

Agropecuaria ENA 2015 [Internet]. 2016 [citado 2018 Abril 1]. p. 1–25.

Disponible en:

http://www.agronet.gov.co/Lists/Boletin/attachments/285/boletin_ena_2015

.pdf

75. Carvajal LM, Turbay S, Álvarez LM, Rodríguez A, Álvarez JM, Bonilla K, et al.

Relación entre los usos populares de la granadilla (Passiflora ligularis Juss) y su

Bibliografía 139

composición fitoquímica. Biotecnol en el Sect Agropecu y Agroind.

2014;12(2):185–96.

76. Chassagne D, Crouzet J, Bayonove CL, Baumes RL. Glycosidically bound eugenol

and methyl salicylate in the fruit of edible Passiflora species. J Agric Food Chem.

1997;45(7):2685–9.

77. Porto-Figueira P, Freitas A, Cruz CJ, Figueira J, Câmara JS. Profiling of passion

fruit volatiles: An effective tool to discriminate between species and varieties.

Food Res Int. 2015;77:408–18.

78. Macías CM. Saponinas y flavonoides de Passiflora ligularis y evaluación de su

actividad antiinflamatoria. Universidad Nacional de Colombia; 2015.

79. Zucolotto SM, Fagundes C, Reginatto FH, Ramos FA, Castellanos L, Duque C, et al.

Analysis of C-glycosyl flavonoids from South American Passiflora species by

HPLC-DAD and HPLC-MS. Phytochem Anal. 2012;23(3):232–9.

80. Navarro SAC, Aldana APS, Longas FF. Potencial antioxidante y antimicrobiano de

extractos acuosos e hidroalcohólicos de granadilla (Passiflora ligularis). Acta

Agron. 2014;63(3):1–11.

81. Marina L, Pabón C De, Turbay IS, Rojano IB, Lizeth II, Álvarez M, et al. Algunas

especies de Passiflora y su capacidad antioxidante. Rev Cuba Plantas Med.

2011;16(4):354–63.

82. Anusooriya P, Malarvizhi D, Gopalakrishnan VK, Devaki K. Antioxidant and

antidiabetic effect of aqueous fruit extract of Passiflora ligularis Juss. on

streptozotocin induced diabetic rats. Int Sch Res Not. 2014;130342:1–10.

83. Saravanan S, Parimelazhagan T. In vitro antioxidant, antimicrobial and anti-

diabetic properties of polyphenols of Passiflora ligularis Juss. fruit pulp. Food Sci

Hum Wellness. 2014;3(2):56–64.

84. Zang Y, Igarashi K, Li Y. Anti-diabetic effects of luteolin and luteolin-7-O-

glucoside on KK-Ay mice. Biosci Biotechnol Biochem. 2016;80(8):1580–6.

85. Muhammad A, Guerrero-analco JA, Martineau LC, Musallam L, Madiraju P,

Nachar A, et al. Antidiabetic compounds from Sarracenia purpurea used



traditionally by the Eeyou Istchee Cree first nation. J Nat Prod. 2012;75:1284–8.

86. Farkhondeh T, Samarghandian S, Roshanravan B. Impact of chrysin on the

molecular mechanisms underlying diabetic complications. J Cell Physiol.

2019;234(10):17144–58.

87. EMA. European Medicines Agency. Guideline on quality of herbal medicinal

products/traditional herbal medicinal products [Internet]. Vol. 44. 2011 [citado

2018 Abril 14]. Disponible en:

http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guidelin

e/2011/09/WC500113209

88. Costa G, Gazola A, et.al. Vitexin derivatives as chemical markers in the

differentiation of the closely related species Passiflora alata curtis and Passiflora

quadrangularis linn. J Liq Chromatogr Relat Technol. 2013;36:1697–707.

89. Tsimogiannis D, Samiotaki M, Panayotou G, Oreopoulou V. Characterization of

flavonoid subgroups and hydroxy substitution by HPLC-MS/MS. Molecules.

2007;12(3):593–606.

90. ICH. Validation of analytical procedures: Text and methodology - Q2(R1).

London; 2005.

91. Sepúlveda P, Costa GM, Aragón DM, Ramos F, Castellanos L. Analysis of vitexin

in aqueous extracts and commercial products of Andean Passiflora species by

UHPLC-DAD. J Appl Pharm Sci. 2018;8(9):081–6.

92. Vanhoenacker G, Sandra P. High temperature and temperature programmed

HPLC: Possibilities and limitations. Anal Bioanal Chem. 2008;390(1):245–8.

93. Castellanos L, Naranjo-Gaybor SJ, Forero AM, Morales G, Wilson EG, Ramos FA,

et al. Metabolic fingerprinting of banana passion fruits and its correlation with

quorum quenching activity. Phytochemistry. 2020;172(112272).

94. Costa GM, Gazola AC, Zucolotto SM, Castellanos L, Ramos FA, Reginatto FH, et al.

Chemical profiles of traditional preparations of four South American Passiflora

species by chromatographic and capillary electrophoretic techniques. Rev Bras

Farmacogn. 2016;26(4):451–8.

Bibliografía 141

95. Farag MA, Otify A, Porzel A, Michel CG, Elsayed A, Wessjohann LA. Comparative

metabolite profiling and fingerprinting of genus Passiflora leaves using a

multiplex approach of UPLC-MS and NMR analyzed by chemometric tools. Anal

Bioanal Chem. 2016;408(12):3125–43.

96. Gomes SVF, Portugal LA, dos Anjos JP, de Jesus ON, de Oliveira EJ, David JP, et al.

Accelerated solvent extraction of phenolic compounds exploiting a Box-Behnken

design and quantification of five flavonoids by HPLC-DAD in Passiflora species.

Microchem J. 2017;132:28–35.

97. Wosch L, dos Santos KC, Imig DC, Santos CAM. Comparative study of Passiflora

taxa leaves: II. A chromatographic profile. Rev Bras Farmacogn. 2017;27(1):40–

9.

98. Rotta EM, Rodrigues CA, Sales IC, Maldaner L, Visentainer JV. Determination of

phenolic compounds and antioxidant activity in passion fruit pulp (Passiflora

spp.) using a modified QuEChERS method and UHPLC-MS/MS. Lwt.

2019;100:397–403.

99. Wang M, Carver JJ, Phelan V V., Sanchez LM, Garg N, Peng Y, et al. Sharing and

community curation of mass spectrometry data with global natural products

social molecular networking. Nat Biotechnol. 2016;34(8):828–37.

100. Kajdžanoska M, Gjamovski V, Stefova M. HPLC-DAD-ESI-MS Identification of

phenolic compounds in cultivated strawberries from Macedonia. Maced J Chem

Chem Eng. 2010;29(2):181–94.

101. Feeny P, Sachdev K, Rosenberry L, Carter M. Luteolin 7-O-(6″-O-malonyl)-β-d-

glucoside and trans-chlorogenic acid: Oviposition stimulants for the black

swallowtail butterfly. Phytochemistry. 1988;27(11):3439–48.

102. Cuyckens F, Claeys M. Mass spectrometry in the structural analysis of flavonoids.

J Mass Spectrom. 2004;39(1):1–15.

103. Li ZH, Guo H, Xu W Bin, Ge J, Li X, Alimu M, et al. Rapid identification of flavonoid

constituents directly from PTP1B inhibitive extract of raspberry (Rubus idaeus

L.) leaves by HPLC-ESI-QTOF-MS-MS. J Chromatogr Sci. 2016;54(5):805–10.



104. Yao H, Chen Y, Shi P, Hu J, Li S, Huang L, et al. Screening and quantitative analysis

of antioxidants in the fruits of Livistona chinensis R. Br using HPLC-DAD-ESI/MS

coupled with pre-column DPPH assay. Food Chem. 2012;135(4):2802–7.

105. Downey MO, Rochfort S. Simultaneous separation by reversed-phase high-

performance liquid chromatography and mass spectral identification of

anthocyanins and flavonols in Shiraz grape skin. J Chromatogr A. 2008 Aug

1;1201(1):43–7.

106. Vallejo F, Tomás-Barberán FA, Ferreres F. Characterisation of flavonols in

broccoli (Brassica oleracea L. var. italica) by liquid chromatography-UV diode-

array detection-electrospray ionisation mass spectrometry. J Chromatogr A.

2004;1054:181–93.

107. Carazzone C, Mascherpa D, Gazzani G, Papetti A. Identification of phenolic

constituents in red chicory salads (Cichorium intybus) by high-performance

liquid chromatography with diode array detection and electrospray ionisation

tandem mass spectrometry. Food Chem. 2013;138:1062–71.

108. Braemer R, Tsoutsias Y, Hurabielle M, Paris M. Biotransformations of quercetin

and apigenin by a cell suspension culture of Cannabis sativa. Planta Med.

1987;53(2):225–6.

109. Sakalem ME, Negri G, Tabach R. Chemical composition of hydroethanolic

extracts from five species of the Passiflora genus. Brazilian J Pharmacogn.

2012;22(6):1219–32.

110. García-Ruiz A, Girones-Vilaplana A, León P, Moreno DA, Stinco CM, Meléndez-

Martínez AJ, et al. Banana passion fruit (Passiflora mollissima (Kunth) L.H.

Bailey): Microencapsulation, phytochemical composition and antioxidant

capacity. Molecules. 2017;22(1):1–12.

111. Yolmeh M, Jafari SM. Applications of response surface methodology in the food

industry processes. Food Bioprocess Technol. 2017;10(3):413–33.

112. Ulrich P, Cerami A. Protein glycation, diabetes, and aging. Recent Prog Horm Res.

2001;56:1–21.

Bibliografía 143

113. Aldini G, Vistoli G, Stefek M, Chondrogianni N, Grune T, Sereikaite J, et al.

Molecular strategies to prevent, inhibit, and degrade advanced glycoxidation

and advanced lipoxidation end products. Free Radic Res. 2013;47(1):93–137.

114. Arasteh A, Farahi S, Habibi-Rezaei M, Moosavi-Movahedi AA. Glycated albumin:

An overview of the in vitro models of an in vivo potential disease marker. J

Diabetes Metab Disord. 2014;13(1):1–9.

115. Sadowska-Bartosz I, Galiniak S, Bartosz G. Kinetics of glycoxidation of bovine

serum albumin by glucose, fructose and ribose and its prevention by food

components. Molecules. 2014;19(11):18828–49.

116. Derbré S, Gatto J, Pelleray A, Coulon L, Séraphin D, Richomme P. Automating a

96-well microtiter plate assay for identification of AGEs inhibitors or inducers:

Application to the screening of a small natural compounds library. Anal Bioanal

Chem. 2010;398(4):1747–58.

117. Sato N, Li W, Tsubaki M, Higai K, Takemoto M, Sasaki T, et al. Flavonoid

glycosides from Japanese Camellia oil cakes and their inhibitory activity against

advanced glycation end-products formation. J Funct Foods. 2017;35:159–65.

118. Pinelo M, Sineiro J, Núñez MJ. Mass transfer during continuous solid-liquid

extraction of antioxidants from grape byproducts. J Food Eng. 2006;77(1):57–

63.

119. World Health Organization. Quality control methods for herbal materials. 2011

p. 3.

120. Silva EM, Rogez H, Larondelle Y. Optimization of extraction of phenolics from

Inga edulis leaves using response surface methodology. Sep Purif Technol.

2007;55(3):381–7.

121. J. Mason T, Chemat F, Vinatoru M. The extraction of natural products using

ultrasound or microwaves. Curr Org Chem. 2011;15(2):237–47.

122. Lavilla I, Bendicho C. Fundamentals of ultrasound-assisted extraction. En: Water

extraction of bioactive compounds: From plants to drug development. Elsevier

Inc.; 2017. p. 291–316.



123. Both S, Chemat F, Strube J. Extraction of polyphenols from black tea -

conventional and ultrasound assisted extraction. Ultrason Sonochem.

2014;21(3):1030–4.

124. Jovanović AA, Đorđević VB, Zdunić GM, Pljevljakušić DS, Šavikin KP, Gođevac DM,

et al. Optimization of the extraction process of polyphenols from Thymus

serpyllum L. herb using maceration, heat- and ultrasound-assisted techniques.

Sep Purif Technol. 2017;179:369–80.

125. Safdar MN, Kausar T, Nadeem M. Comparison of ultrasound and maceration

techniques for the extraction of polyphenols from the mango peel. J Food

Process Preserv. 2017;41(4).

126. Wang X, Wu Q, Wu Y, Chen G, Yue W, Liang Q. Response surface optimized

ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Sparganii rhizoma and

evaluation of their in vitro antioxidant activities. Molecules. 2012;17(4):6769–

83.

127. Pingret D, Fabiano-Tixier AS, Farid C. Ultrasound-assisted extraction. En:

Rostagno MA, Prado JM, editors. Natural product extraction: principles and

applications. Royal Society of Chemistry; 2013. p. 89–112.

128. Tomaz I, Maslov L, Stupic D, Preiner D, Ašperger D, Karoglan Kontic J. Multi-

response optimisation of ultrasound-assisted extraction for recovery of

flavonoids from red grape skins using response surface methodology.

Phytochem Anal. 2016;27(1):13–22.

129. Paini M, Casazza AA, Aliakbarian B, Perego P, Binello A, Cravotto G. Influence of

ethanol/water ratio in ultrasound and high-pressure/high-temperature

phenolic compound extraction from agri-food waste. Int J Food Sci Technol.

2016;51(2):349–58.

130. Benyounis KY. Procedure of conducting an experiment using response surface

methodology for manufacturing process modelling and optimization. En:

Reference module in materials science and materials engineering. Elsevier Ltd.;

2019. p. 1–11.

Bibliografía 145

131. Mishra S, Datta-Gupta A. Experimental design and response surface analysis. En:

Applied statistical modeling and data analytics. Elsevier Inc.; 2018. p. 169–93.

132. Md Yusof AH, Abd Gani SS, Zaidan UH, Halmi MIE, Zainudin BH. Optimization of

an ultrasound-assisted extraction condition for flavonoid compounds from

Cocoa Shells (Theobroma cacao) using response surface methodology.

Molecules. 2019;24(4):1–16.

133. Lapornik B, Prosek M, Golc A. Comparison of extracts prepared from plant by-

products using different solvents and extraction time. J Food Eng. 2005;71:214–

22.

134. Hemwimol S, Pavasant P, Shotipruk A. Ultrasound-assisted extraction of

anthraquinones from roots of Morinda citrifolia. Ultrason Sonochem.

2006;13(6):543–8.

135. Yahya N, Attan N, Wahab R. An overview of cosmeceutically relevant plant

extracts and strategies for extraction of plant-based bioactive compounds. Food

Bioprod Process. 2018;112:69–85.

136. Kaymak-Ertekin F, Gedik A. Kinetic modelling of quality deterioration in onions

during drying and storage. J Food Eng. 2005;68(4):443–53.

137. Gadioli IL, Sá M De, Veras M, Carvalho O De, Costa AM, Lacerda L De, et al. A

systematic review on phenolic compounds in Passiflora plants: Exploring

biodiversity for food, nutrition, and popular medicine. Crit Rev Food Sci Nutr.

2018;58(5):785–807.

138. Liu S, Yang F, Zhang C, Ji H, Hong P, Deng C. Optimization of process parameters

for supercritical carbon dioxide extraction of Passiflora seed oil by response

surface methodology. J Supercrit Fluids. 2009;48(1):9–14.

139. Ballesteros D, Alvarez G, Ibánez E, Parada F, Cifuentes A. Integrated strategy for

the extraction and profiling of bioactive metabolites from Passiflora mollissima

seeds combining pressurized-liquid extraction and gas/liquid chromatography–

high resolution mass spectrometry. J Chromatogr A. 2019;1595:144–57.

140. de Santana FC, de Oliveira Torres LR, Shinagawa FB, de Oliveira e Silva AM,



Yoshime LT, de Melo ILP, et al. Optimization of the antioxidant polyphenolic

compounds extraction of yellow passion fruit seeds (Passiflora edulis Sims) by

response surface methodology. J Food Sci Technol. 2017;54(11):3552–61.

141. Zeraik ML, Yariwake JH. Quantification of isoorientin and total flavonoids in

Passiflora edulis fruit pulp by HPLC-UV/DAD. Microchem J. 2010;96(1):86–91.

142. Santos TRJ, Barbosa PF, Rodrigues HGA, Narain N, de Aquino Santana LCL.

Granadilla seed extract as antimicrobial and bioactive compounds source:

mathematical modelling of extraction conditions. Qual Assur Saf Crop Foods.

2019;11(2):157–70.

143. Toma M, Vinatoru M, Mason TJ. Ultrasonically assisted extraction of bioactive

principles from plants and their constituents. En: Advances in Sonochemistry.

JAI Press Inc; 1999. p. 209–47.

144. Wang L, Weller CL. Recent advances in extraction of nutraceuticals from plants.

Trends Food Sci Technol. 2006;17:300–12.

145. Biesaga M. Influence of extraction methods on stability of flavonoids. J

Chromatogr A. 2011;1218(18):2505–12.

146. Sun Y, Liu Z, Wang J. Ultrasound-assisted extraction of five isoflavones from Iris

tectorum Maxim. Sep Purif Technol. 2011;78(1):49–54.

147. Moraes MDLL, Vilegas JHY, Lan FM. Supercritical fluid extraction of glycosylated

flavonoids from Passiflora leaves. Phytochem Anal. 1997;8(February):257–60.

148. Ong ES. Extraction methods and chemical standardization of botanicals and

herbal preparations. J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci.

2004;812:23–33.

149. Ajila CM, Brar SK, Verma M, Tyagi RD, Godbout S, Valéro JR. Extraction and

analysis of polyphenols: Recent trends. Crit Rev Biotechnol. 2011;31(3):227–49.

150. Lee MH, Lin CC. Comparison of techniques for extraction of isoflavones from the

root of Radix Puerariae: Ultrasonic and pressurized solvent extractions. Food

Chem. 2007;105(1):223–8.

151. Gil-Chávez G, Villa JA, Ayala-Zavala JF, Basilio Heredia J, Sepulveda D, Yahia EM,

Bibliografía 147

et al. Technologies for extraction and production of bioactive compounds to be

used as nutraceuticals and food ingredients: An overview. Compr Rev Food Sci

Food Saf. 2013;12(1):5–23.

152. Mason TJ, Riera E, Vercet A, Lopez-buesa P. Application of ultrasound. En:

Emerging technologies for food processing: An overview. Elsevier Ltd; 2005. p.

323–51.

153. Echeverry SM, Medina HI, Costa GM, Aragón DM. Optimization of flavonoid

extraction from Passiflora quadrangularis leaves with sedative activity and

evaluation of its stability under stress conditions. Rev Bras Farmacogn.

2018;28(5):610–7.

154. Díaz L, Luna D. Productos finales de glicación avanzada en la enfermedad

cardiovascular como complicación de la diabetes. Med e Investig. 2016;4(1):52–

7.

155. Ahmed N. Advanced glycation endproducts - Role in pathology of diabetic

complications. Diabetes Res Clin Pract. 2005;67(1):3–21.

156. Singh VP, Bali A, Singh N, Jaggi AS. Advanced glycation end products and diabetic

complications. Korean J Physiol Pharmacol. 2014;18(1):1–14.

157. Da Silva Morrone M, De Assis AM, Da Rocha RF, Gasparotto J, Gazola AC, Costa

GM, et al. Passiflora manicata (Juss.) aqueous leaf extract protects against

reactive oxygen species and protein glycation in vitro and ex vivo models. Food

Chem Toxicol. 2013;60:45–51.

158. Yeh WJ, Hsia SM, Lee WH, Wu CH. Polyphenols with antiglycation activity and

mechanisms of action: A review of recent findings. J Food Drug Anal.

2017;25(1):84–92.

159. Chinchansure AA, Korwar AM, Kulkarni MJ, Joshi SP. Recent development of

plant products with anti-glycation activity: A review. R Soc Chem.

2015;5:31113–38.

160. Séro L, Sanguinet L, Blanchard P, Dang BT, Morel S, Richomme P, et al. Tuning a

96-Well microtiter plate fluorescence-based assay to identify AGE inhibitors in



crude plant extracts. Molecules. 2013;18:14320–39.

161. Matsuda H, Wang T, Managi H, Yoshikawa M. Structural requirements of

flavonoids for inhibition of protein glycation and radical scavenging activities.

Bioorganic Med Chem. 2003;11(24):5317–23.

162. Jang DS, Kim JM, Kim J, Yoo JL, Kim YS, Kim JS. Effects of compounds isolated

from the fruits of Rumex japonicus on the protein glycation. Chem Biodivers.

2008;5(12):2718–23.

163. Jang MH, Piao XL, Kim JM, Kwon SW, Park JH. Inhibiroty effect of the cree

traditional medicine Wiischichimanaanh (Vaccinium vitis-idaea) on advanced

glycation endproduct formation: Identificaction of active principles. Phyther

Res. 2010;24:741–7.

164. Ospina LF, Olarte J, Calle J, Pinzón R. Comprobacion de la actividad

hipoglicemiante y captadora de radicales libres oxigenados de los principios

activos de Curatella americana L. Rev Colomb Ciencias Químico-Farmacéuticas.

1995;24(1):6–11.

165. Alarcon Aguilara FJ, Roman Ramos R, Perez Gutierrez S, Aguilar Contreras A,

Contreras Weber CC, Flores Saenz JL. Study of the anti-hyperglycemic effect of

plants used as antidiabetics. J Ethnopharmacol. 1998;61(2):101–10.

166. Gupta RK, Kumar D, Chaudhary AK, Maithani M, Singh R. Antidiabetic activity of

Passiflora incarnata Linn. in streptozotocin- induced diabetes in mice. J

Ethnopharmacol. 2012;139(3):801–6.

167. Sudasinghe HP, Peiris DC. Hypoglycemic and hypolipidemic activity of aqueous

leaf extract of Passiflora suberosa L. PeerJ. 2018;6(2).

168. Cazarolli LH, Zanatta L, Alberton EH, Figueiredo MSRB, Folador P, Damazio RG,

et al. Flavonoids: cellular and molecular mechanism of action in glucose

homeostasis. Mini Rev Med Chem. 2008;8(10):1032–8.

169. Nicolle E, Souard F, Faure P, Boumendjel A. Flavonoids as promising lead

compounds in type 2 diabetes mellitus: Molecules of interest and structure-

activity relationship. Curr Med Chem. 2011;18(17):2661–72.

Bibliografía 149

170. Ballard CR, Roberto M, Junior M. Health benefits of flavonoids. En: Segura MR,

editor. Bioactive compounds: Health benefits and potential applications.

Elsevier Inc.; 2019. p. 185–201.

171. ICH. International Conference on Harmonization. Stability testing of new drug

substances and products 2003 p. 1–20.

172. Singh S, Bakshi M. Guidance on conduct of stress tests to determine inherent

stability of drugs. Pharm Technol. 2000;1–14.

173. Liu Y, Chen HB, Zhao YY, Wang B, Zhang QY, Zhang L, et al. Quantification and

stability studies on the flavonoids of Radix hedysari. J Agric Food Chem.

2006;54(18):6634–9.

174. Mei X, Wang Y, Liu Z, Wang S, Dong F, Wang Z, et al. The chemical

transformations for Radix Astragali via different alkaline wash conditions by

quantitative and qualitative analyses. J Pharm Biomed Anal. 2020;185:113164.

175. Graham N, Jiang CC, Li XZ, Jiang JQ, Ma J. The influence of pH on the degradation

of phenol and chlorophenols by potassium ferrate. Chemosphere.

2004;56(10):949–56.

176. Peng S, Zou L, Zhou W, Liu W, Liu C, McClements DJ. Encapsulation of lipophilic

polyphenols into nanoliposomes using pH-driven method: Advantages and

disadvantages. J Agric Food Chem. 2019;67(26):7506–11.

177. Jin Y, Zhang W yu, Meng Q fan, Li D hui, Garg S, Teng L rong, et al. Forced

degradation of flavonol glycosides extraced from Ginkgo biloba. Chem Res

Chinese Univ. 2013;29(4):667–70.

178. Plaza M, Pozzo T, Liu J, Gulshan KZ, Turner C, Karlsson EN. Substituent Effects

on in vitro antioxidizing properties, stability, and solubility in flavonoids. J Agric

Food Chem. 2014;62:3321–33.

179. Lai YZ. Kinetic evidence of anionic intermediates in the base-catalyzed cleavage

of glycosidic bonds in the methyl D-glucopyranosides. Carbohydr Res.

1972;24(1):57–65.

180. Garegg PJ. Synthesis and reactions of glycosides. En: Advances in carbohydrate



chemistry and biochemistry. 2004. p. 69–134.

181. Smith GJ, Thomsen SJ, Markham KR, Andary C, Cardon D. The photostabilities of

naturally occurring 5-hydroxyflavones, flavonols, their glycosides and their

aluminium complexes. J Photochem Photobiol A Chem. 2000;136(1–2):87–91.

182. Chaaban H, Ioannou I, Paris C, Charbonnel C, Ghoul M. The photostability of

flavanones, flavonols and flavones and evolution of their antioxidant activity. J

Photochem Photobiol A Chem. 2017;336:131–9.

183. Švehlíková V, Bennett RN, Mellon FA, Needs PW, Piacente S, Kroon PA, et al.

Isolation, identification and stability of acylated derivatives of apigenin 7-O-

glucoside from chamomile (Chamomilla recutita [L.] Rauschert).

Phytochemistry. 2004;65(16):2323–32.

184. Thomas VH, Bhattachar S, Hitchingham L, Zocharski P, Naath M, Surendran N, et

al. The road map to oral bioavailability: An industrial perspective. Expert Opin

Drug Metab Toxicol. 2006;2(4):591–608.

185. USP 39-NF 34. Soluciones. En: Farmacopea de los Estados Unidos de América.

2016. p. 2369–70.

186. Oh DM, Sinko PJ, Amidon GL. Predicting oral drug absorption in humans: a

macroscopic mass balance approach for passive and carrier-mediated

compounds. En: D’Argenio DZ, editor. Advanced methods of pharmacokinetic

and pharmacodynamic systems analysis. Nueva York: Springer; 1991. p. 3–11.

187. Center for Drug Evaluation and Research. Guidance for Industry: Estimating the

maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult

healthy volunteers. FDA 2005 p. 1–27.

188. Xin L, Liu XH, Yang J, Shen HY, Ji G, Shi XF, et al. The intestinal absorption

properties of flavonoids in Hippophaë rhamnoides extracts by an in situ single-

pass intestinal perfusion model. J Asian Nat Prod Res. 2019;21(1):62–75.

189. He X, Song ZJ, Jiang CP, Zhang CF. Absorption properties of luteolin and apigenin

in Genkwa Flos using in situ Single-Pass Intestinal Perfusion system in the rat.

Am J Chin Med. 2017;45(8):1–15.

Bibliografía 151

190. Merchant HA, Rabbie SC, Varum FJO, Afonso-Pereira F, Basit AW. Influence of

ageing on the gastrointestinal environment of the rat and its implications for

drug delivery. Eur J Pharm Sci. 2014;62:76–85.

191. Afonso-Pereira F, Dou L, Trenfield SJ, Madla CM, Murdan S, Sousa J, et al. Sex

differences in the gastrointestinal tract of rats and the implications for oral drug

delivery. Eur J Pharm Sci. 2018;115:339–44.

192. Roos C, Dahlgren D, Sjögren E, Tannergren C, Abrahamsson B, Lennernäs H.

Regional intestinal permeability in rats: A comparison of methods. Mol Pharm.

2017;1–29.

193. Dezani TM, Dezani AB, Junior JBDS, Serra CHDR. Single-Pass Intestinal Perfusion

(SPIP) and prediction of fraction absorbed and permeability in humans: A study

with antiretroviral drugs. Eur J Pharm Biopharm. 2016;104:131–9.

194. Issa C, Gupta P, Bansal AK. Implications of density correction in gravimetric

method for water flux determination using-rat single-pass intestinal perfusion

technique: A technical note. AAPS PharmSciTech. 2003;4(2):2–7.

195. Acharya PC, Fernandes C, Suares D, Shetty S, Tekade RK. Solubility and

solubilization approaches in pharmaceutical product development. En: Tekade

R, editor. Dosage Form Design Considerations. 1ª ed. Elsevier Inc.; 2018. p. 513–

47.

196. Smith BT. Solubility and Dissolution. En: Remington education: Physical

Pharmacy. 1ª ed. Pharmaceutical Press; 2016. p. 249–64.

197. Mosharraf M, Sebhatu T, Nyström C. The effects of disordered structure on the

solubility and dissolution rates of some hydrophilic, sparingly soluble drugs. Int

J Pharm. 1999;177(1):29–51.

198. Álvarez-Diduk R, Ramírez-Silva MT, Galano A, Merkoçi A. Deprotonation

mechanism and acidity constants in aqueous solution of flavonols: a combined

experimental and theoretical study. J Phys Chem B. 2013;117(41):12347–59.

199. Lemańska K, Van Der Woude H, Szymusiak H, Boersma MG, Gliszczyńska-Swigło

A, Rietjens IMCM, et al. The effect of catechol O-methylation on radical



scavenging characteristics of quercetin and luteolin - A mechanistic insight. Free

Radic Res. 2004;38(6):639–47.

200. Musialik M, Kuzmicz R, Pawlowski TS, Litwinienko G. Acidity of hydroxyl groups:

An overlooked influence on antiradical properties of flavonoids. J Org Chem.

2009;74(7):2699–709.

201. Gao S, Basu S, Yang Z, Deb A, Hu M. Bioavailability challenges associated with

development of saponins as therapeutic and chemopreventive agents. Curr Drug

Targets. 2012;13:1885–99.

202. Makino T, Shimizu R, Kanemaru M, Suzuki Y, Moriwaki M, Mizukami H.

Enzymatically modified isoquercitrin, α-oligoglucosyl quercetin 3-O-glucoside,

is absorbed more easily than other quercetin glycosides or aglycone after oral

administration in rats. Biol Pharm Bull. 2009;32(12):2034–40.

203. Lee YS, Woo J Bin, Ryu SI, Moon SK, Han NS, Lee SB. Glucosylation of flavonol and

flavanones by Bacillus cyclodextrin glucosyltransferase to enhance their

solubility and stability. Food Chem. 2017;229:75–83.

204. Makino T, Kanemaru M, Okuyama S, Shimizu R, Tanaka H, Mizukami H. Anti-

allergic effects of enzymatically modified isoquercitrin (α-oligoglucosyl

quercetin 3-O-glucoside), quercetin 3-O-glucoside, α-oligoglucosyl rutin, and

quercetin, when administered orally to mice. J Nat Med. 2013;67(4):881–6.

205. Jürgenliemk G, Nahrstedt A. Dissolution, solubility and cooperativity of phenolic

compounds from Hypericum perforatum L. in aqueous systems. Pharmazie.

2003;58(3):200–3.

206. Zhao Q, Luan X, Zheng M, Tian XH, Zhao J, Zhang WD, et al. Synergistic

mechanisms of constituents in herbal extracts during intestinal absorption:

Focus on natural occurring nanoparticles. Pharmaceutics. 2020;12(2):128.

207. Williams HD, Trevaskis NL, Charman SA, Shanker RM, Charman WN, Pouton CW,

et al. Strategies to address low drug solubility in discovery and development.

Pharmacol Rev. 2013;65(1):315–499.

208. Hyman Yalkowsky S. Physical modification of the solute. En: Solubility and

Bibliografía 153

solubilization in aqueous media. Nueva York: American Chemical Society; 1999.

p. 81–92.

209. Dahan A, Miller JM, Amidon GL. Prediction of solubility and permeability class

membership: Provisional BCS classification of the world’s top oral drugs. AAPS

J. 2009;11(4):740–6.

210. Zhang R, Yao Y, Wang Y, Ren G. Antidiabetic activity of isoquercetin in diabetic

KK -Ay mice. Nutr Metab. 2011;8(85):1–6.

211. Fagerholm U, Johansson M, Lennernäs H. Comparison between permeability

coefficients in rat and human jejunum. Pharm Res. 1996;13(9):1336–42.

212. Zakeri-Milani P, Valizadeh H, Tajerzadeh H, Azarmi Y, Islambolchilar Z, Barzegar

S, et al. Predicting human intestinal permeability using single-pass intestinal

perfusion to rat. J Pharm Pharm Sci. 2007;10(3):368–79.

213. Sutton SC, Rinaldi MT, Vukovinsky KE. Comparison of the gravimetric, phenol

red, and 14C-PEG-3350 methods to determine water absorption in the rat

single-pass intestinal perfusion model. AAPS PharmSci. 2001;3(3):1–5.

214. An T, Liu Z, Zhang Z, Zhou J, Wang M, Zou M, et al. Design, synthesis and

performance evaluation of mPEG-PR: A novel non-absorbable marker. Eur J

Pharm Sci. 2019;131:50–7.

215. Zhang J, Liu D, Huang Y, Gao Y, Qian S. Biopharmaceutics classification and

intestinal absorption study of apigenin. Int J Pharm. 2012;436(1–2):311–7.

216. Ruiz DH, Baltazar EH, Lara JCE, Martínez I de la L, Beltrán Torres AA, Martínez

Alejo JM. Técnicas de complejidad variable para evaluar la absorción de

fármacos. Rev Mex Ciencias Farm. 2012;43(1):18–32.

217. B. Shekhawat P, B. Pokharkar V. Understanding peroral absorption: regulatory

aspects and contemporary approaches to tackling solubility and permeability

hurdles. Acta Pharm Sin B. 2017;7(3):260–80.

218. Cook TJ, Shenoy SS. Intestinal permeability of chlorpyrifos using the single-pass

intestinal perfusion method in the rat. Toxicology. 2003;184(2–3):125–33.

219. Hollman PC, de Vries JH, van Leeuwen SD, Mengelers MJ, Katan MB. Absorption



of dietary quercetin glycosides and quercetin in healthy ileostomy volunteers.

Am Soc Clin Nutr. 1995;62:1276–82.

220. Gee JM, DuPont MS, Day AJ, Plumb GW, Williamson G, Johnson IT. Intestinal

transport of quercetin glycosides in rats involves both deglycosylation and

interaction with the hexose transport pathway. J Nutr. 2000;130(11):2765–71.

221. Sesink ALA, O’Leary KA, Hollman PCH. Quercetin glucuronides but not

glucosides are present in human plasma after consumption of quercetin-3-

glucoside or quercetin-4′-glucoside. J Nutr. 2001;131(7):1938–41.

222. Crespy V, Morand C, Besson C, Manach C, Démigné C, Rémésy C. Comparison of

the intestinal absorption of quercetin, phloretin and their glucosides in rats. J

Nutr. 2001;131(8):2109–14.

223. Sesink A LA, Arts IC, Faassen-Peters M, Hollman PC. Intestinal uptake of

quercetin-3- glucoside in rats involves hydrolysis by lactase phlorizin hydrolase.

J Nutr. 2003;133:773–6.

224. Zuo Z, Zhang L, Zhou L, Chang Q, Chow M. Intestinal absorption of hawthorn

flavonoids - in vitro, in situ and in vivo correlations. Life Sci. 2006;79(26):2455–

62.

225. Hollman PC. Absorption, bioavailability, and metabolism of flavonoids. Pharm

Biol. 2004;42:74–83.

226. Németh K, Plumb GW, Berrin JG, Juge N, Jacob R, Naim HY, et al. Deglycosylation

by small intestinal epithelial cell β-glucosidases is a critical step in the

absorption and metabolism of dietary flavonoid glycosides in humans. Eur J

Nutr. 2003;42(1):29–42.

227. Gonçalves BMF, Cardoso DSP, Ferreira MJU. Overcoming multidrug resistance:

Flavonoid and terpenoid nitrogen-containing derivatives as ABC transporter

modulators. Molecules. 2020;25(3364).

228. Yao Y, Mi W, Cao G, Yang R, Chen H, Liu Y, et al. The absorption characteristics of

nonvolatile components in a water extraction from amomi fructus as

determined by in situ Single-Pass Intestinal Perfusion and High-Performance

Bibliografía 155

Liquid Chromatography. Front Pharmacol. 2020;11(June).

229. Dahan A, Amidon GL. Segmental dependent transport of low permeability

compounds along the small intestine due to P-glycoprotein: The role of efflux

transport in the oral absorption of BCS class III drugs. Mol Pharm. 2009;6(1):19–

28.

230. Dahan A, Beig A, Lindley D, Miller JM. The solubility–permeability interplay and

oral drug formulation design: Two heads are better than one. Adv Drug Deliv

Rev. 2016;101:99–107.

231. Martinez MN, Amidon GL. A mechanistic approach to understanding the factors

affecting drug absorption: A review of fundamentals. J Clin Pharmacol.

2002;42(6):620–43.

232. Dave VS, Gupta D, Yu M, Nguyen P, Varghese Gupta S. Current and evolving

approaches for improving the oral permeability of BCS Class III or analogous

molecules. Drug Dev Ind Pharm. 2017;43(2):177–89.

233. Piazzini V, Monteforte E, Luceri C, Bigagli E, Bilia AR, Bergonzi MC.

Nanoemulsion for improving solubility and permeability of Vitex agnus-castus

extract: Formulation and in vitro evaluation using PAMPA and Caco-2

approaches. Drug Deliv. 2017;24(1):380–90.

234. Sermkaew N, Ketjinda W, Boonme P, Phadoongsombut N, Wiwattanapatapee R.

Liquid and solid self-microemulsifying drug delivery systems for improving the

oral bioavailability of andrographolide from a crude extract of Andrographis

paniculata. Eur J Pharm Sci. 2013;50(3–4):459–66.

235. Cardona MI, Nguyen Le NM, Zaichik S, Aragón DM, Bernkop-Schnürch A.

Development and in vitro characterization of an oral self-emulsifying delivery

system (SEDDS) for rutin fatty ester with high mucus permeating properties. Int

J Pharm. 2019;562:180–6.

contribución a la caracterización biofarmacéutica de un

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