conteo de conidias y bacterias

1

UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS GONZAGA DE ICA.

FITOPATOLOGIA GENERAL

CONTEO DE CONIDIAS DE HONGOS

INTRODUCCION

Para realizar esta práctica se hace con la ayuda de un contador de esporas llamado Hemacitómetro (Improved Neubauer). Y un microscopio biológico compuesto.

El conteo de esporas se realiza de la siguiente manera: De una o varias cajas de Petri con micelio bien desarrollado del hongo, se deposita en un matraz Erlenmeyer con agua destilada estéril. El contenido se licua y forma una solución concentrada de esporas.

Con una pipeta se toma una alícuota y se deposita en el portaobjeto graduado del Hemacitometro. Las esporas observadas se contaran en los ocho cuadros más grandes se suman y se dividen entre ocho y el resultado se multiplica por 10,000, obteniendo así la concentración de esporas por mililitro.

OBJETIVOS:

Tener nociones en técnicas de observación y conteo de conidias.

Conocer el uso de Hemacitómetro (Improved Neubauer) ,asi como su formula.

FACULTAD DE AGRONOMIA - ICA

2



REVISIÓN DE LITERATURA

Los hongos son organismos eucariotas, constituyen uno de los mayores grupos de seres vivos, hasta ahora se han descrito unas 80000 especies pero se estima que el número real llega al millón y medio de especies, hay muchas especies que no presentan diferencias morfológicas, sino que son genéticamente diferentes.

(Cubas, 2007) La micología es la ciencia que se encarga del estudio de los hongos, tradicionalmente ha sido una disciplina de la botánica, a pesar de que los análisis filogenéticos indican que los hongos están más relacionados con los animales que con las plantas.

Sin embargo, los hongos producen esporas sexuales o asexuales para su reproducción y multiplicación, lo que no ocurre en animales. (Cubas, 2007) Esporas son los elementos de perpetuación de la especie.

De acuerdo a la morfología reciben distinto nombre: alantospora con forma de banana, aleuriospora con base plana, dictiospora con septos longitudinales y transversales, didimospora con un tabique, equinulada como un erizo, escolescospora como un gusano, estaurospora como una estrella, feospora de color obscuro, fragmospora con tabiques transversales, fusiforme como un huso, helicospora como una espiral, hialospora de color claro y translúcido, planospora móvil, verrucosa con verrugas, zoospora con flagelos.

Las balistosporas son proyectadas violentamente una vez maduras. Las hipnosporas son aquéllas capaces de permanecer con vida latente por largo tiempo. (Carrillo, 2003) Las esporas pueden ser de origen asexuado (mitosporas) o sexuado (meiosporas), y por su ubicación relativa internas oexternas.

Las mitosporas seoriginan en las estructuras anamórficas y las meiosporas en las teleomórficas. (Carrillo, 2003) Esporas o conidios más bien grandes, multicelulares, con tabiques transversales y longitudinales. La forma de los conidios es característica, varía de claviforme a elipsoidal y frecuentemente presentan un apéndice apical simple o dividido (de longitud hasta 20 µm). Paredes gruesas con la superficie lisa o verrugosa, de color marrón pálido3. u oscuro.

A menudo con una pequeña cicatriz en la base. El número de células de los conidios varía según la especie. (Carrillo, 2003) La cámara de recuento o cámara de Neubauer es un apárato de precisión hecho de vidrio óptico especial.


3



Se utiliza para contar células u otras partículas en suspensiones bajo el microscopio. Las cámaras de recuento se utilizan principalmente para el análisis de sangre (recuento de leucocitos, eritrocitos, trombocitos) y recuento de células en el liquor. Además las cámaras de recuento sirven para contar bacterias, esperma y esporas de hongo. (Marienfield, 2007).

CONTEO DE CONIDIAS DE HONGOS

Para determinar el número de conidias por volumen contenidas en una determinada suspensión ,

Se utiliza un hematocimetro o cámara de Neubauer. El hematocimetro es una lamina de vidrio que tiene dos camars de 1 mm2 . la superficie cubre un área total de 9mm2 . adicionalmente ,el cuadro del centro esta subdividido en cinco por cinco cuadrados agrupados de 0.2 mm de lado y una superficie de 0.04mm2 cada uno.

Los cuadrados del centro a su ves están subdivididos en 16 cuadrados mas peueños de 0.0025mm2 cada uno. Cinco de estos cuadrados se utilizan para el conteo de conidias .

Se debe dar especial atención al hecho de que la cámara se encuentra delimitada por tres líneas blancas entre los cuadrados. Esto es importante para definir cuales son las conidias que se encuentran en el limite y que deben ser contadas .

Generalmente se cuentan las conidias que están en la primera línea de arriba y de la derecha , no asi las conidiasque se encuentran en la línea de abajo y de la izquierda.

PROCEDIMIENTO:

1. Preparar una suspensión de conidias en agua destilada con tween 80 al 0.1%.

2. Con una pipeta pasteur llenar la cámara con la suspensión de conidias y cubrirla con el cubreobjetos.

3. Observar al microscopio utilizando el aumento conveniente de acuerdo al tamaño de la estructura (40x es un aumento adecuado).Cámara NEUBAUER vista al microscopio.


4



Cuadrado 1

Área = 1 mm x 1mm = 1 mm2

Volumen = 1 mm2 x 0,1 mm = 0,1 mm3 = 1 x 10-4 ml

Cuadrado 2

Área = 0,25mm x 0,25mm = 0,0625 mm2

Volumen = 0,0625mm2 x 0,1 mm = 6,25 x 10-3 mm3 = 6,25 x 10-6 ml


Concentración =

Total Células Contadas x 10.000

Número de Cuadrados

5



Cuadrado 3

Área = 0,2 mm x 0,2 mm = 0,04 mm2 Volumen = 0,04mm2 x 0,1 mm = 4 x 10-3 mm3 = 4 x 10-6 ml

Cuadrado 4

1/16th de Cuadrado 3, sólo NEUBAUER improved – rejilla central

Área = 0,05 mm x 0,05 mm = 0,0025 mm2

Volumen = 0,0025mm2 x 0,1 mm = 2,5 x 10-4 mm3 = 2,5 x 10-7 ml

4. Contar las conidias presentes en los cuadrados elegidos (generalmente se cuentan en los cuadrados de los cuatro angulos y e centro ,o en forma diagonal empezando por el pimero de la parte superior izquierda .

también se deben contar las conidias que están ubicadas tocando la primera de las tres líneas que se encuentran circundando el cuadrado,las que se encuentran en la parte superior y la derecha del cuadrado .se cuentan en total 10 cuadrados ,cinco en cada cámara ( cinco arriba y cinco abajo).

5. Determinar el numero de conidias or ml y el numero total de conidias utilizando la siguiente formula :

Conidias/ml = de conidias contadas x 25000 x factor de dilución .Conidias total = conidias/ml x Vol . de la suspensión original de conidias .


Concentración =



Concentración =



Concentración =

Total Células Contadas x 4 x10^6


6



Sector de la cámara de NEUBAUER, que se debe contar.

CARACTERIZACION FISIOLOGICA

Esta carcaterizacion se basa en la evalucaion de rendimiento en numero de conidias y viabilidad d las mismas(porcentaje de germinación).

Numero de conidias 1. Sembrar 10 ul de suspensión de conidias con una concentración de 106

conidias /ml en medio de PDA y distribuirla uniformemente en la placa con la ayuda de una espátula de DRIGALSKI .

2. Incubas a 20°C durante 15 dias .3. Realizar diluciones seriadas con un factor de 0.1.4. Cartgar la cámara de Neubauer y contar el numero de conidias /ml.5. Realizar por los menos cuatro repeticiones por aislamiento .6. Realziar los cálculos respectivos para obtener la información.


7



Viabilidad de conidias

1. Sembrar 5 alicuotas de 5ul de una suspensión de conidias con una concentración de 106/ml en medio de PDA.

2. Incubar a 20|C durante 24hr.

3. Agregar azul de alctofenol para deterner la germinación y distribuirlo uniformemente.

4. Cortar la porción de agar conteniendo la alícuota de la suspensión de conidias y colocarlas sobre una lamina de portaobjetos . cubrir con un cubre objetos.

5. Registrar el numero de onidiad germinadas (aquellas cuyo tubo germinativo sea dos veces mayor al diámetro de la conidia.).

6. Por cada asilamiento no se dene hacer menos de cinco repeticiones.

En caso de que el rendimiento sea muy bajo, debido a la perdida de sus características por ser un aislamiento muy viejo ,se recomienda reactivarlo en el insecto hospedante.

CONSERVACION DE HONGOS

La conservación de los hongos consiste en mantenerlos viables, eliminando la necesidad de que piques frecuentes ,impidiendo así las mutaciones en general, una de cuyas consecuencias es la perdida de virulencia. En la actualidad existen varios métodos para conservar los hongos por periodos prolongados, los mismos que implican el uso de material variado.

Existen dos principios de conservación ;

1). Donde se reduce el metabolismo 2). Donde se induce la dormancia de las conidias o esporas.

La reducción del metabolismo ,incluye la conservación mediante bajas temperaturas ,uso del aceite mineral ,agua esteril ,suelo esteril ,etc.En la inducción de la dormancia ,se incluye el secado sobre sálica gel, la liofilizacio y el uso de nitrógeno liquido (la criogenia,o sea el mantenimiento a temperaturas por debajo del punto de congelación).Estos últimos métodos requieren de aparatos especiales y de insumos costosos, por ello hemos considerado en esta publicaion solo los que pueden estar al alcance de la mayoría de investigadores en regiones en vías de desarrollo. Hay otros emtodos mas económicos ,como el uso de aceite mineral ,pero no es seguro porque el hongo puede seguir creciendo en condiciones de desventaja ,además no esta garantiada su pureza.


8



CONCLUSIONES :

He podido conocer que el conteo de conidias que se da por medio de la lamina de vidrio subdividiendo los cuadros que presenta para realizar el conteo. También Utilizando el Hematocimetro o cámara de Neubauer se puede establecer un promedio de conidias en suspensión en ml de agua. El método de recuento en la caja de Neubauer es muy efectivo para establecer un promedio en este caso de conidias .

RECOMENDACIONES

Al mezclar la muestra de cultivo en el agua procurar revolverla bien para que esta libere todas las esporas que se encuentran en ella. Tener cuidado al colocar el agua en la caja Neubauer para que esta no se desborde.

Establecer qué cuadros se van a contar, preferiblemente los de las esquinas y centro para que sea al azar.

BIBLIOGRAFIA :

1. http://www.celeromics.com/es/resources/Technical%20Notes/neubauer-chamber-cell-

concentration/formula-camara-neubauer-concentracion-1.php#

2. RENATO ANDRADE CEVALLOS,2013, OBSERVACIÓN Y CONTEO DE ESPORAS DE HONGOS AISLADOS DEL AMBIENTE AIRE, SUELO, AGUA. ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO CARRERA INGENIERÍA AGROPECUARIA - SANTO DOMINGO –REPUBLICA DOMINICANA.

http://es.slideshare.net/tato762/observacin-y-conteo-de-esporas-de-hongos-aislados-del-ambiente-aire-suelo-agua

3. PDF:http://es.slideshare.net/jloveuas/manual-micologia

4. VERONICA CAÑEDO,TERESA AMES.2004.CONTEO DE CONIDIAS EN CAMARA DE NEUBAUER. Manual de Laboratorio para el Manejo de Hongos Entomopatógenos.CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA.LIMA-PERU.

https://books.google.com.pe/books?id=lFfNuqTeit8C&pg=PA40&lpg=PA40&dq=conteo+de+conidias+en+camara+de+neubauer&source=bl&ots=XAF3yKGQg2&sig=FU0-n5K9Eszcyfy_IRyBnSqmHUc&hl=es-419&sa=X&ved=0CCYQ6AEwAmoVChMI6Lyp8br3yAIVh20mCh2eoARE#v=onepage&q=conteo%20de%20conidias%20en%20camara%20de%20neubauer&f=true





http://es.slideshare.net/jloveuas/manual-micologia

http://www.celeromics.com/es/resources/Technical%20Notes/neubauer-chamber-cell-concentration/formula-camara-neubauer-concentracion-1.php#





9



CONTEO BACTERIANO

INTRODUCCION

El conteo bacteriano señala la magnitud de la población total bacteriana. En ese sentido se puede determinar por diversas técnicas que se basan en algunos de los siguientes tipos de medida: cuenta celular (directamente al microscopio o mediante un contador electrónico de partículas o indirectamente con la cuenta de colonias), masa celular (en forma directa pesando el contenido celular del nitrógeno o indirectamente por turbidimetría, proporcional al número de células) y actividad celular (indirectamente relacionando el grado de actividad bioquímica al tamaño de la población bacteriana).

Existen muchos medios diferenciales, en la práctica rutinaria se usan los siguientes:

Tipos de conteo bacteriano

Conteo en caja de Petri

Método más usado para contar bacterias. Un caldo de cultivo con microorganismos es diluido y posteriormente muestras del mismo son distribuidas en la caja de petri contenedora de agar.

Conteo por filtración

Es realizado cuando la cantidad de bacterias es muy pequeña, como en casos de lagos y arroyos relativamente puros.

Método del número más probable (NMP)

Es una técnica de estimación estadística basada en el hecho que a mayor número de bacterias en una muestra, mayor será la dilución necesitada para reducir la densidad hasta el punto en que ninguna bacteria se le permita crecer en la serie de tubos de dilución.Método de turbidezPara algunos experimentos, es necesario estimar turbidez, ya que es una forma práctica de monitorizar el crecimiento bacteriano. Como una bacteria se multiplica en un medio líquido, éste se torna turbio o de aspecto nublado por las células. El instrumento usado para medir la turbiedad es un espectrofotómetro (colorímetro.Determinación del peso seco en las célulasEs el método más directo para las mediciones cuantitativas de la masa celular y probablemente el más fácilmente realizable y reproducible, aunque se debe aplicar sólo en suspensiones celulares muy densas y las células deben ser lavadas muy bien para removerles todo material extra. Se utiliza para bacterias filamentosas y mohos.


10



OBJETIVOS:

Tener nociones de los diferentes métodos existentes para el conteo bacteriano.

Conocer y estudiar la parte literaria para que se nos haga más fácil y tranquilo ejecutarlo en práctica.

REVISION LITERARIA

Replicación bacteriana: fisión binaria o bipartición De una célula madre se originan dos células hijas idénticas.Crecimiento ordenado de todos los constituyentes y estructuras celulares.Aumento exponencial en el número de células.

Tipos de crecimiento

CRECIMIENTO INDIVIDUAL La bacteria alcanza un tamaño y peso fijo. Constituye el paso previo a la división celular.CRECIMIENTO POBLACIONALEs el incremento en el número de células como consecuencia del crecimiento y división célula.

CONTEO DE CELULAS VIABLES

La célula viable es aquella capaz de dividirse y formar una colonia en el medio de cultivo

Se basa en que cada colonia surge de una simple célula. Cada colonia contiene una sola especie bacteriana.


11



El número de bacterias viables por muestra se expresa en :

UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC).

Representa cada colonia contada y su numero total representa el numero total de bacterias viables en la muestra.

METODO EXTENDIDO DEN PLACA

Es el método de elección para anaerobios facultativos y cultivo de microaeroflos.

METODO DE VERTIDO EN PLACA

Esta técnica se usa generalmente para bacterias aerobias obligadas


12



Medición del crecimiento Microbiano (bacterias )

Determinación del número de microorganismos en una muestra.

Determinación de la actividad metabólica, biomasa y proteínas.

Útil para la técnica de vertido en placa o extensión en placa.

Se siembra volumnes conocidos de cada dilución .

Luego se incuba a 35-37°C durante 24-48 horas

TECNICAS DE RECUENTO


13



Finalizado el tiempo de incubación ,se realiza el recuentro .

Se toman en cuenta únicamente aquellas cajas de Petri que tengan entre 30 y 300 colonias.

Este numero de colonias es estadísticamente representativo.

Aquellas placas que tengan mas de 300 colonias se reportan como INCONTABLES.

PARA EL RECUENTRO BACTERIANO SE UTILIZA UN CUENTACOLONIAS.

RECUENTRO CON CUENTACOLONIA

Puede ser contada toda la placa o por cuadrantes

Cuando la carga bacteriana es alta ,se tomna en cuenta un cyadrante con carga alta ,un cuadrante con carga media y un cuadrante con carga baja.

Se realiza la sumatoria de los tres cuadrantes y se saca el promedio.

Finalmente el promedio se multiplica por 65.

N°. COLONIA =( CA + CM + CB/3)* 65


14



OBTENCION DE RESULTADOS

Terminado el conteo por cualquier método se debe aplicar siguiendo formula para obtener el N°. DE UFC/ml o UFC/g.

Cuando se realiza mas de una dilución para cada uno de los parámetros se

garantiza los resultados obtenidos. Este método disminuye el margen de error y abaliza la calidad de las

pruebas.


15



Para obtener los resultados por duplicado se aplica la siguiente formula:

EJEMPLO 1.

Dilución A: 5600.0000Dilución B: 6 000.000Resultado: 5 600.000 + 6 000.000/2= 5 800.000 UFC/ml FLORA TOTAL.

EJEMPLO 2.

Dilución A: 1 245. 647Dilución B: 2 340.500Resultado: 1 245. 647+ 2 340.500/2= 1 793.074UFC/ml FLORA COLIFORME.

MAS Métodos para el conteo de microorganismos viables

•Cuenta en placa Vaciado en placa Extendido en placa Asa calibrada Miles y Mirsa Filtración

•Número más probable (NMP)

Métodos para el conteo de microorganismos totales

•Recuento microscópico Cuenta de Breed Cámara de Neubauer Cámara de Prettof Hausser

Turbidimetría

Métodos para el conteo de microorganismos viables

Estos métodos se basan en poner en evidencia la presencia de los microorganismos vivos.


16



Requieren al menos 24 horas para el cultivo y la interpretación de resultados.

Se emplean medios de cultivo generales, enriquecidos selectivos y diferenciales dependiendo de los microorganismos a cuantificar.

Cuenta en placa

Se determina el número de microorganismos en una muestra en relación a las colonias que forman, las UFC (Unidades Formadoras de Colonias). Se emplean soluciones diluidas o diluciones de una muestra concentrada para que cada colonia formada provenga de un solo microorganismo aunque algunas agrupaciones no pueden ser separadas por las diluciones. Se utilizan principalmente para la cuantificación de bacterias, levaduras y hongos filamentosos. Se reporta como: •UFC ****/unidad de volumen o peso .


17



Diluciones y cuenta en placa

MILES Y MISRA

Involucra la preparación de diluciones seriadas de una suspensión bacteriana. Las placas son divididas en sectores separados.

Se inocula cada sector una gota empleando una Pipeta Pasteur calibrada o bien micropipetas inoculando 0.02mL. Las placas se incuban de 18 a 24 horas a la temperatura adecuada (37ºC).

Se toman en cuenta los sectores donde hay menos de 20 UFC. El número de bacterias viables se obtiene calculando la media de cada dilución en las repeticiones realizadas.


18



ASA CALIBRADA

La utilización de agujas o asas calibradas permite tomar volúmenes pequeños, que son inoculados en la superficie del agar mediante la técnica de siembra masiva.

Las colonias son contadas y se multiplican por el factor de dilución del asa empleada.

El uso más frecuente de esté método es en el urocultivo. Se determinan las UFC/g o mL de muestra.

FILTRACION

La membrana de celulosa retiene a los microorganismos en su malla con poros de 0.25-


19



0.45mm. Esta membrana se transfiere a un medio de cultivo para el desarrollo de colonias.

NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)

También llamada técnica de dilución en tubo, proporciona una estimación estadística de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado.

Número Más Probable (NMP)


20



10-19-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinación de

bacterias coliformes. Técnica del número más probable.

Cochran, W. C. (1950). Estimation of bacterial densities by means of the “most

probablenumber” Biometrics 6, 105-116.


21




22



ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA


23



Métodos para el conteo de microorganismos totales

•Estos métodos se basan en poner en evidencia la presencia de los microorganismos vivos y muertos los cuales no se pueden distinguir.

•Son rápidos pero se requiere contar en algunos casos con curvas de calibración.


24



RECUENTO MICROSCÓPICO


25



CÁMARAS DE PETROFF-HAUSSER Y DE NEUBAUER

Limitaciones:

•Es muy tedioso, no es práctico para un gran número de muestras.

•No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/mL para que sean observadas al microscopio.

•No distinguen células vivas de muertas.

CUENTA DE BREED

Muestra a evaluar (directa o diluida) Microscopio Objetivo micrométrico Asa calibrada o micropipeta Portaobjetos Colorantes de Gram u otros colorantes.


26



CUENTA DE BREED


27



EXTRA :USO DEL EQUIPO MICROMETRICO

NEFELOMETRIA (TURBIDIMETRIA)


28



La turbidez producida por el crecimiento microbiano de microorganismos unicelulares puede ser medida de acuerdo a la capacidad de absorber la luz. La muestras a determinar son generalmente translúcidas cuando no presentan crecimiento microbiano.

Longitud de onda (l)

•Bacterias 540nm

•Protozoarios 580nm

•Levaduras 600nm

TURBIDEZ

La turbidez se determina por la densidad óptica (DO) que puede ser expresada como Absorbancia, % de Transmitancia o Unidades Klett (UK).

ESCALA DE MC FARLAND

Klett-Summerson Colorimeter


29




30



PESO SECO Y DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA

El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante.

Es útil para grandes volúmenes. La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación. La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.

La proteína se relaciona al crecimiento, por lo que un incremento en la cantidad de proteína en el paquete celular indica que hay mayo concentración de células.

Curva patrón para la determinacion de proteínas por el método de Lowry

Curva de crecimiento Viables vs Totales


31



CONCLUSION:

Los diversos métodos que existen para el conteo de células bacterianas , nos ayuda y facilita en la obtención del número de bacterias viables por muestra se expresa en :UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC).Todo ello empleado para fines de investigación y análisis .

BIBLIOGRAFIA

1. NATALIA IZURIETA 2011. Laboratorio no. 4 recuento bacteriano. LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA.http://es.slideshare.net/nataliaizurieta/laboratorio-no-4-recuento-bacteriano-7723447

2. PDF.http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U4b_MedicionCrecimiento_19837.pdf

3. WIKIPEDIA .https://es.wikipedia.org/wiki/Conteo_bacteriano#Determinaci.C3.B3n_directa_por_microscopio


https://es.wikipedia.org/wiki/Conteo_bacteriano#Determinaci.C3.B3n_directa_por_microscopio

https://es.wikipedia.org/wiki/Conteo_bacteriano#Determinaci.C3.B3n_directa_por_microscopio

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U4b_MedicionCrecimiento_19837.pdf

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U4b_MedicionCrecimiento_19837.pdf

http://es.slideshare.net/nataliaizurieta/laboratorio-no-4-recuento-bacteriano-7723447

http://es.slideshare.net/nataliaizurieta/laboratorio-no-4-recuento-bacteriano-7723447

conteo de conidias y bacterias

Documents