construcciÓn y estimaciÓn del crecimiento microbiano empleando como herramienta la hoja de...

7/26/2019 CONSTRUCCIN Y ESTIMACIN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO EMPLEANDO COMO HERRAMIENTA LA HOJA DE C

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Manual de Prcticas de MicrobiologaPredictiva

Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D.

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Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento deMicrobiologa

PRCTICA No 1

CONSTRUCCIN Y ESTIMACIN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO EMPLEANDO

COMO HERRAMIENTA LA HOJA DE CLCULO DE EXCEL.

OBJETIVOS

Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de:

Emplear las hojas de clculo como herramienta para estimar el

comportamiento de una poblacin bacteriana.

Estimar los diferentes parmetros cinticos tanto de crecimiento como muerte

bacteriana.

MARCO TERICO

El desarrollo de los diversos modelos de prediccin empleados en microbiologa

descansa sobre unas bases matemticas preestablecidas con anterioridad. Ya en

1949, Monod desarroll un modelo matemtico mediante el cual se poda estimar

la poblacin final de una bacteria, sustrato o metabolito en funcin del tiempo.

Este modelo fue aplicado a la industria de la fermentacin. En aos posteriores

diversos investigadores empezaron a explicar en forma de expresiones

matemticas la relacin existente entre el nmero de bacterias finales en funcin

del tiempo y como varan estas con respecto a la aplicacin de algn factor

externo que influya sobre su crecimiento/supervivencia. En el presente

documento se describe los fundamentos matemticos que rigen el

crecimiento/supervivencia bacteriana.

Ecuaciones de crecimiento: Como es sabido el crecimiento bacteriano sigueuna relacin exponencial de primer orden, esto es, que por cada clula que se

divida se originan dos nuevas (Fig. 8.1). De esta forma se puede afirmar que el

crecimiento bacteriano se comporta de acuerdo a la siguiente relacin:

N = 2n(Ecc. 1)

donde N es el nmero de clulas y n el nmero de duplicaciones que han tenido

lugar.

Si asumimos que N = Nf en determinado tiempo Nf(t), entonces Nf(t) es

dependiente del nmero inicial de clulas (No) y del nmero de divisiones que


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haya tenido lugar en ese intervalo de tiempo n(t), de esta forma si reordenamos

la ecuacin 1, obtenemos la siguiente expresin matemtica que rige el

crecimiento bacteriano en funcin del tiempo:

Nf = No*2n(Ecc. 2)

Figura 1. Representacin grfica del crecimiento y curva de crecimientobacteriano (Tomado de Labuza, T., 20041)

Velocidad relativa de crecimiento y velocidad especfica de crecimiento: Six(t) es una variable tiempo-dependiente que describe la variacin de cierta

sustancia, como biomasa o concentracin de la clula. La velocidad instantnea

del proceso es la derivada de x(t):dx(t)/dt. La velocidad especfica, (t), se define

como:

(t) = dx/dt (Ecc. 3)

Si x(t) denota la concentracin celular entonces en un cultivo bacteriano la

velocidad de crecimiento es medida como el aumento absoluto en la

concentracin celular por unidad de tiempo de la unidad, mientras que la

velocidad de crecimiento especfica es el incremento en la concentracin celular

1Labuza, T. (2004). Predictive Microbiology Principles. Department of Food Science and Nutrition.

University of Minnesota. USA. Pp. 12.


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por unidad de tiempo por clula. Una simple ecuacin muestra que si x(t) es

positivo entonces:

(t) = d(ln x(t))/dt (Ecc. 4)

Por consiguiente, la velocidad de crecimiento especfica puede medirse como la

inclinacin de la curva de crecimiento cuando el logaritmo natural (ln) de x(t) se

traza contra el tiempo. Si el log10es usado en lugar de ln, entonces la pendiente

de log10 ser moderada = 2,3 veces menor que la velocidad de crecimiento

especfico cuando empleamos el ln.

La velocidad de crecimiento especfica () puede calcularse a travs de la

ecuacin 4.1.

= lnNf lnNo/ (tf to) (Ecc. 4.1)

La velocidad de crecimiento relativo (k) puede calcularse a travs de la ecuacin

4.2.

k = 2.303*(logNf logNo/ tf to) (Ecc. 4.2)

Tiempo de duplicacin (Td) y tiempo de generacin (Tg): En un momento fijo(tfix), el valor de (t) ser (tfix) = fix. La relacin para el tiempo de duplicacin, Td

= ln2/ fix= 0.69/fix, de tal forma que si (t) permaneciera constante, al tiempo tfix+ Td, la concentracin celular sera el doble que cuando estaba a t fix. Es

importante anotar que, en cultivos asincrnicos, Td no es equivalente al tiempo

medio de generacin. De hecho, el tiempo medio de generacin puede estimarse

por 1/ fix en lugar de la relacin 0.69/ fix, si la divisin celular puede

aproximarse por un proceso aleatorio, como el proceso de Poisson.

El tiempo de generacin puede calcularse a travs de la siguiente ecuacin:

Tg = t/n (Ecc. 5)

donde t es el diferencial de tiempo y n el nmero de generaciones.

El nmero de generaciones puede estimarse a travs de la ecuacin 6:

n = 3,3 * logNf logNo(Ecc. 6)


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Si reemplazamos la Ecc. 6 en Ecc. 5, el tiempo de generacin se puede calcular

mediante la ecuacin 7:

Tg = t/3,3*(logNf logNo) (Ecc. 7)

Curvas de crecimiento y muerte bacteriana: Como hemos comentadoanteriormente, la cintica de crecimiento bacteriana sigue una tendencia de

primer orden, lo mismo puede asumirse para la muerte bacteriana, esto es que al

graficar el Log de la poblacin en funcin del tiempo se obtiene una lnea que

representa cmo evoluciona esta poblacin. Esta lnea de crecimiento o muerte

puede entonces ajustarse a nuevas lneas de tendencia que comparan el

crecimiento real frente a una funcin matemtica definida: funcin lineal o funcin

exponencial por mtodo grfico o estimacin lineal o estimacin logartmica por

medio de frmulas Excel, de las cuales pueden obtenerse la ecuacin que

representa cada una de estas funciones, su coeficiente de correlacin R2 o los

valores de las diferentes constantes. En este caso puede asumirse que el

crecimiento o muerte bacteriana sigue una tendencia lineal o exponencial

dependiendo del valor de R2, cuando R2 se aproxima a 1 el comportamiento

bacteriano sigue esa tendencia. A manera de ejemplo, si en un estudio de

crecimiento se ajusta la grfica de los datos a una funcin lineal con un R2 =

0,955 y a una funcin exponencial con un R2= 0,985, la tendencia de crecimiento

de esa poblacin se comporta ms como una funcin exponencial que una lineal.

En el caso de un comportamiento lineal, puede obtenerse la poblacin final a un

tfixo calcularse el t a una densidad de poblacin x a travs de la ecuacin de la

recta:

Y = mx + b

donde m es la pendiente y b es la interseccin.

Si el crecimiento se ajusta a un comportamiento exponencial, puede obtenerse la

poblacin final a un tfixo calcularse el t a una densidad de poblacin x a travs

de la ecuacin exponencial:

Y = cebx

donde c y b son constantes y e es la base del logaritmo neperiano. Esta

ecuacin tambin puede ser representada como:

Y = blnmx


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donde b es una constante equivalente a c y lnm es la constante equivalente a eb.

MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS

Computador con paquete Microsoft Office 2003 o posterior y conexin a internet.

REACTIVOS

No se requieren.

PROCEDIMIENTO

Para el desarrollo de la presente gua de prcticas se empleo la hoja de clculo

Excel 2007.

Mtodo grfico: A travs de ventanas que representa la hoja de clculo Excel

desarrollaremos un ejercicio de estimacin de crecimiento.

PASO 1: En primer lugar debe realizarse una captura de datos donde

representaremos: el tiempo en horas y semanas, la densidad de poblacin, el

log10 y Ln de esa poblacin, as mismo calcularemos la tasa de crecimiento

especfica y velocidad de crecimiento especfico (Fig 2).

PASO 2:Seleccionamos en la columna D las filas correspondientes desde D2hasta D24 (D2:D24) que representa los datos de crecimiento en funcin del

tiempo, y posteriormente picamos en el icono de asistente para grficos para

seleccionar el tipo de grfico XY (dispersin) (Figura 3).

PASO 3: Posteriormente damos clic en siguiente, y seleccionamos en la

ventana de serie los valores para X (Columna A2 hasta A24 A2:A24). (Figura

4).

PASO 4: Continuamos con clic en siguiente y procedemos a completar la

informacin del grfico: nombre del grfico, nombre de la categora X y de la

categora Y, etc., y damos clic en finalizar.

PASO 5: Posteriormente nos ubicamos con el cursor sobre la lnea que

representa el crecimiento y damos clic con el botn derecho del ratn, y

seleccionamos la opcin: agregar lnea de tendencia (Figura 6)


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PASO 6:En la siguiente ventana escogemos la opcin de tendencia lineal en la

ventana tipo (Figura 7) y en la ventana opciones marcamos presentar ecuacin

en el grfico y presentar R cuadrado en el grfico (Figura 8) y posteriormente

aceptar, para obtener el grfico mostrado en la figura 9. Repetimos esta

operacin desde el paso 5 pero esta vez seleccionamos la opcin logartmica.

As obtendremos la grfica de la figura 10.

Figura 2. Cuadro de captura de datos.


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Figura 3.


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Figura 4. (Pgina anterior).


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El grfico generado es el siguiente:

Figura 5.Curva de crecimiento de S. aureus.

Curva de crecimiento de S. aureus

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

0 5 10 15 20 25

Tiempo (h)

Log10

UFC/g

Serie1


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Figura 6.


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Figura 7.


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Figura 8.


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Figura 9.


y = 0,3209x + 2,9289

R2= 0,8979

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

0 5 10 15 20 25

Tiempo (h)

Log10UFC/g

Serie1

Lineal (Serie1)

Figura 10.


y = 0,3209x + 2,9289R2= 0,8979

y = 2,967e0,0619x0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

0 5 10 15 20 25

Log10UFC/g

R2= 0,8151Tiempo (h)

Serie1

Lineal (Serie1)

Exponencial (Serie1)

Al analizar la figura 10 podemos observar que a pesar de que los R2 son bajos

(deficientes) el valor que ms se aproxima a 1 es el de la tendencia lineal. Por lo

tanto, en el caso de este ejemplo el crecimiento de S. aureus se adapta a una


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tendencia lineal ms que exponencial, de tal forma que para predecir el

comportamiento de S. aureusen funcin del tiempo escogemos la ecuacin lineal Y

= 0.3209x + 2.9289.

Mtodo de las frmulas en Excel

Para el mtodo de las frmulas emplearemos el mismo ejemplo del caso anterior.

ocedemos a calcular las estimaciones lineales y logartmicas, para

la

scribimos D2:D24 que representa el logaritmo

ro Conocido_x escribimos A2:A24 que representa el tiempo

silla correspondiente a Constante y Estadstica escribimos la

esta informacin presionamos al tiempo las teclas

inalmente obtenemos la informacin que se muestra en la figura 15.

PASO 1: igual que para el anterior (Figura 2). Posteriormente completamos la

informacin y seleccionamos 5 casillas en blanco en dos columnas seguidas

(Figura 11).

PASO 2: Prello seleccionaremos en el panel principal insertar funcin (Figura 12), y en la

ventana de seleccionar una categora buscamos la opcin todas. Posteriormente

buscamos la opcin ESTIMACION.LINEAL y damos clic en aceptar (Figura 13).

PASO 3: Posteriormente complementamos la informacin que se despliega en

ventana mostrada en la figura 14.

En el cuadro Conocido_ye

base 10 del crecimiento de la poblacin (mismos valores seleccionados en

el paso 2).

En el cuad

durante el cual crece la poblacin (mismos valores seleccionados en el

paso 3).

En la ca

palabra VERDADERO.

PASO 4: Una vez diligenciada

Control + Shif + Aceptar de la ventana anterior. La tecla Shif corresponde a

aquella que tiene la flecha:

F


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PASO 5: Volvemos con el paso 2 (Figura 16 y 17) pero esta vez seleccionamos la

opcin ESTIMACION.LOGARITMICA y continuamos con los pasos 3 y 4.

Finalmente obtenemos los datos de la figura 18.

Figura 11.


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Figura 12.


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Figura 13.


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Figura 14.



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Figura 15.

ESTIMACION LINEAL

M B

0,3209301 2,92888514

0, 0

02361197 ,30596499 0,89792845

10,80275564

84,738024 2113,53274

119,048251 88

0,3209 corsponde alEn esta ventana el valo r v lor de la pendiente. El valorr e a

m

2,9288 corresponde a la constante b y el valor de 0,897 representa el R 2. Estos

datos son los mismos obtenidos de la grfica de estimacin lineal de la figura 10.

b

R2


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Figura 16.


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Figura 17.


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Figura 18.

ESTIMCION LOGARITMICA

BM

1,06387243 2,967038240,00643519 0,08338751

0,81509383 0,2187825292,5711141 21

4,43098946 1,00518158

m

b o c

R2


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Y = bLnmx

Y = ceby, donde b = LnmEn la ventana anterior el valor 1,06387243 corresponde al valor de la pendiente. El

valor 2,96703824 corresponde a la constante b (o c, segn sea el caso) y el valor de

0,815 representa el R2. Estos datos son los mismos obtenidos de la grfica de

estimacin exponencial de la figura 10.

NIVEL DE RIESGO

Para el desarrollo de la anterior prctica se ha definido un nivel de Riesgo Bajo o

nivel 1; es decir que se requiere del uso de Bata de Laboratorio Manga Larga,Zapato Cerrado Bajo, Pantaln Largo.

BIBLIOGRAFA

Labuza, T. (2004). Predictive Microbiology Principles. Department of Food

Science and Nutrition. University of Minnesota. USA. Pp. 12.

NIES, M.L. (2006). Using Computer Spreadsheets to Solve Equations. Learning

& Leading with Technology, 3(23).

Microsoft Office Excel 2007 de Microsoft Corporation Inc. Marca registrada.

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