1 CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOG~A (CONCTT)

I FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOG/A (Fonacyt) UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QU~MICAS Y FARMACIA

I INFORME FINAL DEL PROYECTO FODECYT 47-99 Plantas con actividad antiofídica en Guatemala. l. Identificación y

I evaluación de su capacidad neutralizante

Presentado por: M.Sc. Patricia Saravia Otten

Investigadora Principal

I TEMA

lndice

I Información general

I 1 . Resumen Ejecutivo

I 2. Introducción

3. Antecedentes

Objetivos

Hipótesis

Metodología 6.1 Creación de base de datos electrónica 6.2 Creación de archivo bibliográfico 6.3 Realización de encuestas etnobotánicas 6.4 Selección de las plantas del estudio 6.5 Recolección y secado del material vegetal 6.6 Extracción de principios vegetales por percolación 6.7 Extracción de principios vegetales por infusión 6.8 Ensayos biológicos

Resultados

Discusión de resultados

Conclusiones

10. Recomendaciones

11. Bibliografía

1 12. Ejecución financiera

13. Anexos

Página

INFORME FINAL

PROYECTO FODECYT 47-99

NOMBRE DEL PROYECTO: Plantas con actividad antiofídica en Guatemala. l. Identificación y

evaluación de su capacidad neutralizante.

UNIDAD EJECUTORA: Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos

de Guatemala

EQUIPO DE INVESTIGACI~N Y TIEMPO DEDICADO AL PROYECTO:

M.Sc. Patricia Saravia Otten, Investigadora Principal (2HDl12 meses)

Lic. Armando Cáceres, lnvestigador Asociado (2HDl11 meses)

Dr. Rubén Velásquez, lnvestigador Asociado (2HDl11 meses)

M.Sc. Oscar Lara, lnvestigador Asociado (2HDl11 meses)

Br. Rosario Hernández, Asistente de investigación (4HDl7 meses)

Br. Carlos Vásquez, Asistente de investigación (1 HDI1 mes)

Br. Luisa Paredes, Asistente de investigación (4HDl4 meses)

Licda. Lidia Girón, colaboradora

Lic. Yann-Olivier Hay, colaborador

Br. Alicia López, colaboradora

Dr. José Ma. Gutiérrez, colaborador

Lic. William Tally, colaborador

1 1. RESUMEN EJECUTIVO

I Este estudio se inició con una extensa revisión bibliográfica con el fin de recopilar la información existente en la comunidad científica sobre el tema. Se realizó una encuesta etnobotánica en los Departamentos de El Petén, lzabal y Alta Verapaz con el fin de identificar

I las especies de plantas utilizadas como antídotos en el tratamiento de la mordedura de Bothrops asper, la principal especie ofídica causante de envenenamiento en la zona norte de Guatemala. Se obtuvo información sobre sus fórmulas tradicionales, modo de empleo y

I dosificación. Con esta información se creó una base de datos, de donde se seleccionaron 3 especies: Dorstenia contrajerva, Neurolaena lobata y Eupatorium odoratum. Se procedió a su recolección, secado, determinación botánica y se realizaron extractos etanólicos y acuosos. Se seleccionaron y montaron las técnicas de laboratorio necesarias para evaluar la capacidad de

1 los extractos para neutralizar los principales efectos fisiopatológicos del veneno y se hizo una prueba piloto con los extractos de las tres especies seleccionadas.

La información recopilada en la base de datos electrónica cuenta con 752 plantas reportadas a nivel mundial para el tratamiento de mordeduras de serpiente. En las encuestas etnobotánicas se obtuvo información referente al uso de 32 plantas medicinales en diversas comunidades de El Petén, lzabal y Alta Verapaz. Se procedió a la identificación y determinación de dichas plantas, sin embargo algunas de ellas están pendientes de dicho estudio, ya que la identificación completa de una planta debe hacerse en su época de floración.

Los resultados preliminares de las pruebas biológicas de los extractos etanólicos y acuosos de las 3 especies estudiadas muestran que la actividad antiofídica de D. contrajerva reside básicamente en su propiedad coagulante. Esta propiedad debe utilizarse cuidadosamente, ya que en las fases tempranas del envenenamiento, el veneno provoca coagulación sanguínea, secuestrando las proteínas de la cascada de la coagulación de la víctima, y de esta manera provoca en fases mas avanzadas del envenenamiento incoagulabilidad sanguínea. Por ello, su uso terapéutico es útil en envenenamientos moderados y severos, en donde hay desfibrinación del plasma. Su capacidad de neutralizar el efecto hemorrágico del veneno es pobre, y nula para neutralizar los demás efectos de veneno.

La actividad mas importante de N. lobata se detectó en su extracto etanólico, el cual demostró una capacidad neutralizante del efecto coagulante del veneno superior al 50%. Sin embargo, no logró neutralizar ninguno de los otros efectos del veneno. El extracto acuoso de N. lobata presentó actividad inhibidora de trombina, lo cual se traduce en incoagulabilidad sanguínea. De acuerdo al mecanismo de acción del veneno, podría ser útil en envenenamiento leve, pero contraindicado en pacientes con hemopatías o hemorragia en fases mas avanzadas del envenenamiento. El extracto acuoso de esta planta logró una inhibición pobre (27.3%) del efecto hemorrágico del veneno, y no logró neutralizar ninguno de los demás efectos toxicológicos.

De forma análoga, la principal actividad del extracto etanólico de E. odoratum demostró la capacidad de neutralizar en un 47.6% el efecto coagulante del veneno, pero no neutralizó los demás efectos del veneno. El extracto acuoso posee propiedades inactivantes de la trombina, por lo que su aplicación debe ser similar a la descrita para N. lobata. Este extracto tampoco pudo neutralizar los demás efectos estudiados.

Dado que ninguna de las plantas estudiadas neutralizó los efectos letal, fosfolipasa A, y solamente dos de ellas lograron una pobre neutralización del efecto hemorrágico del veneno de B. asper, se concluye que no es recomendable su uso aislado en el tratamiento del accidente

ofídico. Se recomienda la continuación de trabajos de esta naturaleza, que permitan detectar y posteriormente validar las plantas utilizadas como antídotos en la medicina tradicional de Guatemala.

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Los venenos de serpiente de la familia Viperidae inducen un corriplejo cuadro de alteraciones fisiopatológicas que incluyen tanto efectos locales, en el sitio de la mordedura, como sistémicos. La serpiente Bothrops asper, conocida como barba amarilla, es la que ocasiona el mayor número de accidentes en Centroamérica (Bolaños, 1984, Campbell & Lamar 1989, Gutiérrez, 1995). Su veneno provoca importantes efectos locales (hemorragia, edema, necrosis), así como diversas alteraciones sistémicas (coagulopatías, hemorragia, choque cardiovascular e insuficiencia renal aguda) (Gutiérrez, 1995). El único tratamiento científicamente validado para los envenenamientos ofídicos es la administración parenteral a tiempo, de antivenenos producidos en caballos o en ovejas (Warrell, 1996).

La serpiente B. asper se encuentra ampliamente distribuida en la zona norte del país, especialmente en el departamento de El Petén, zona norte de Alta Verapaz y la vertiente del Atlántico en lzabal (Campbell & Lamar, 1989), en donde la mayoría de accidentes ofídicos ocurren en zonas rurales lejos de hospitales y puestos de salud. Es por ello que las víctimas de mordedura de serpiente en esta región se han visto en la necesidad de buscar la ayuda de curanderos o herbolarios, quienes utilizan la medicina tradicional para contrarrestar los efectos del veneno. Durante la realización de este proyecto pudimos darnos cuenta de que las plantas empleadas se preparan y dosifican de acuerdo a recetas transmitidas de padres a hijos, su administración puede ser oral, en emplasto y10 como infusión para lavar la herida (Comunicaciones personales).

Los extractos de plantas tropicales constituyen importantes reservorios de potenciales sustancias inhibidoras de toxinas de venenos. Diversas publicaciones científicas han reportado algún tipo de actividad antiveneno en mas de 578 especies de plantas superiores (Melo, 1992). En Centroamérica, a pesar de su gran variedad y riqueza de recursos naturales, existen muy pocos estudios que validen la capacidad neutralizante de los extractos vegetales utilizados tradicionalmente para el tratamiento de mordedura de serpiente (Castro et al., 1999).

Por ello, en el presente estudio se identificó y evaluó la capacidad de 3 especies de plantas de uso etnomédico en la zona norte del país, para neutralizar los principales efectos fisiopatológicos del envenenamiento por mordedura de B. asper. Además, se inició la formación de una base de datos que registra la información publicada en artículos científicos internacionales sobre el tema, así como información recopilada en encuestas etnobotánicas sobre el uso tradicional de plantas para el tratarriiento del accidente ofídico en diversas comunidades de los departamentos de El Petén, lzabal y Alta Verapaz.

3. ANTECEDENTES

El ofidismo constituye un problema de gran importancia en los países tropicales y subtropicales (Gutiérrez, 1995). Se calcula que anualmente mueren de 50,000 a 100,000 personas a causa del envenenamiento por serpientes (Warrell & Fenner, 1993) pudiéndose suponer que otro tanto sufre secuelas permanentes que los imposibilita para desenvolverse normalmente en la sociedad (Lomonte, 1994). Se estima que en Latinoamérica el problema es relativamente mayor, debido a la falta de los recursos terapéuticos adecuados en las áreas rurales, que es donde ocurren la mayoría de accidentes ofídicos. En Centroamérica, la falta de medios de comunicación y atención médica en las áreas remotas son un problema agudo, que incide también en el subregistro de datos disponibles sobre ofidismo, por lo que la magnitud real del problema es difícil de determinar. Sin embargo, debido a que las condiciones ecológicas y socioeconómicas del área son similares en los distintos países, la situación podría representarse por la de Costa Rica, en donde se ha calculado una morbilidad de 20 por 100,000 habitantes por año y una mortalidad del 1-2% (Bolaños, 1984, Gutiérrez, 1995).

Usualmente, la administración temprana de sueros antiofídicos es el tratamiento recomendado para contrarrestar el envenenamiento (Selvanayagam et al., 1994, Sullivan, 1987, Nelson, 1989). Sin embargo, además del alto costo y poca disponibilidad en los hospitales de nuestro país, su uso presenta varias limitaciones en áreas rurales, como la necesidad de almacenamiento en refrigeración y el riesgo de ocurrencia de reacciones alérgicas en algunos individuos (Reid, 1980, Malasit etal., 1986, Nelson, 1989).

Estas limitaciones han renovado el interés de la comunidad científica en el estudio de las plantas utilizadas en la medicina tradicional como antídotos en el tratamiento de envenenamiento ofídico (Mors, 1991). El efecto curativo de varias plantas o de sus extractos ha sido estudiado en condiciones in vivo e in vitro en diferentes regiones de Asia, Africa y Sudamérica, utilizando los antídotos preparados con la fórmula tradicional (Selvanayagam et al., 1994, Alvares et al., 1996, Otero et al., 2000). En Centroamérica, los estudios de Castro et al. (1 999) demostraron que los extractos etanólicos, acuosos y en acetato de etilo de 10 plantas medicinales eran capaces de neutralizar el efecto hemorrágico del veneno de B. asper. En algunos casos se ha logrado aislar el componente activo responsable de la neutralización de uno o más efectos toxicológicos de los venenos ofídicos, como es el de la "Cabeza Negra" y la Eclipsa prostrata utilizadas en Brazil (Selvanayagam et al., 1993, Martz, W., 1992, Alam et al., 1994). Sin embargo, otros autores han encontrado poco o ningún efecto beneficioso en los antídotos tradicionales (Campbell 1976, Selvanayagam et al., 1993.).

Las especies de serpientes que más comúnmente causan envenenamiento por mordedura en Guatemala son Bothrops asper ("Barba amarilla") en el Departamento. de El Petén y Crotalus durissus durissus ("Cascabel") en la zona sur del país (Van den Brule, 1982., Campbell & Lamar, 1989). La caracterización de los efectos farmacológicos del veneno de B. asper de Guatemala demostró que induce letalidad, hemorragia, edema, mionecrosis, coagulación, defibrinación, efecto fosfolipasa Ap y hemólisis indirecta. Su perfil toxicológico similar al reportado para la misma especie costarricense (Saravia et al., 2001). Sin embargo, en el caso del veneno de C. d. durissus, los datos obtenidos indican la existencia de variaciones bioquímicas en la composición de los venenos de la especie guatemalteca comparada con la especie hondureña y costarricence (Guevara, 2000, Rojas et al., 1994).

Este tipo de variaciones, surgidas durante la evolución de las especies (Daltry et al., 1996, Rage, 1993) es un aspecto sumamente importante desde el punto devista terapéutico, ya que los antisueros preparados con mezclas de venenos de serpientes de otras regiones resultan

menos efectivos para neutralizar los efectos farmacológicos de los venenos guatemaltecos (Rojas et al., 1987, Saravia et al. 2001, Guevara 2000, Chavez, 2001). De la misma forma, los antídotos tradicionales utilizados en diversas regiones de Asia, Africa y Brazil, en donde el efecto principal de sus venenos es neurotóxico, resultarían ineficientes para neutralizar los efectos de las serpientes de Centroamérica, que son principalmente locales (Harvey & Anderson, 1991, Gutiérrez, 1980).

En la medicina popular de Guatemala existe una gran variedad de plantas que son utilizadas como antídotos contra la mordedura de serpientes (Morton, 1977). Estos antídotos son utilizados en las regiones montañosas o selváticas del país, en donde el acceso inmediato a sueros antiofídicos y atención médica es sumamente difícil. Existe además el componente tradicional de nuestros pueblos indígenas, que prefieren utilizar el servicio de herbolarios, curanderos o médicos brujos antes de buscar ayuda en hospitales y centros de salud. Por ello, es de gran importancia iniciar el estudio de las plantas utilizadas como antídotos en nuestra medicina .tradicional. .'Debe determinarse si dichas plantas o sus extractos son realmente activas en la neutralización de los principales efectos fisiopatológicos de los venenos, con lo cual podría mejorarse el tratamiento de emergencia del accidente ofídico en el país. En caso contrario, es importante también mostrar las limitaciones de dichas sustancias para prevenir que el paciente reciba un tratamiento inadecuado con hierbas sin valor curativo.

Desde 1976 el Centro Mesoamericano de Estudios sobre Tecnología Apropiada (CEMAT), inició la recolección de información sobre el uso tradicional de las plantas medicinales, habiendo detectado mas de 600 con estos usos en la población. A partir de esta actividad se tiene ya una base de datos preliminar que puede servir para organizar una base de datos especifica sobre el uso de plantas para el tratamiento del accidente ofídico en Guatemala, mediante la asociación colaborativa de diversas entidades interesadas en el tema (Girón et al., 1 991 , Comerford et al., 1996).

En esta rriisma línea, desde 1984 la Comisión Nacional para el Aprovechamiento de Plantas Medicinales -CONAPLAMED- ha impulsado la relación eritre sectores académicos, organizaciones no gubernamentales, empresas y sector público para equiparar el uso de las plantas medicinales y productos derivados en la atención de salud. La principal actividad de intercambio de experiencias la constituye el Seminario Nacional de Plantas Medicinales, de los cuales se desarrolló el X en Chimaltenango y el XI en Totonicapán. Como consecuencia de estas 2 reuniones se estableció el compromiso de colaborar con ProPetén para validar las plantas que se detectaran en el Petén con usos etnomédicos. Durante la reunión realizada en Totonicapán en 1998 se estableció que ProPetén haría una encuesta del uso de plantas para el tratamiento del accidente ofídico, que podrá enriquecer la base de datos específica.

Este proyecto es continuación a la línea de investigación iniciada hace más de 10 años por Cáceres y colaboradores, en búsqueda de bioactividad en plantas de uso etnomédico en diversas regiones de Guatemala. Estos estudios han evaluado la actividad antimicrobiana en el tratamiento de enfermedades dermatomucosas (Cáceres et al., 1987, 1991, 1 993), gastrointestinales (Cáceres et al., 1990), respiratorias (Cáceres et al., 1991), antigonorrea (Cáceres et al., 1995) y antiprotozoo (Cáceres et al., 1996). Estas investigaciones permitieron establecer los procedirriientos para evaluar dichas actividades por bioensayos in vivo, así como estandarizar los procedimientos necesarios para desarrollar pruebas científicas que permitan validar su uso popular (Cáceres et al., 1998). La realización del presente proyecto indudablemente coritribuyó al eririquecimiento del conocimiento que tenemos sobre nuestros recursos naturales y su uso como alternativas terapéuticas.

1 4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

I Identificar y evaluar la capacidad de 3 especies de plantas de uso etnomédico en la zona norte del país para neutralizar los principales efectos fisiopatológicos del envenenamiento por mordedura de Bothrops asper.

1 4.2 Objetivos específicos

4.2.1 Establecer una base de datos sobre el conocimiento existente en nuestra medicina tradicional acerca de las plantas utilizadas en el tratamiento de accidente ofidico en tres departamentos del norte del país.

4.2.2 Establecer un proyecto colaborativo con instituciones nacionales o internacionales dedicadas al estudio de la flora y fauna guatemalteca, que se encuentren trabajando en las zonas de interés.

4.2.3 Seleccionar un grupo de plantas nativas usadas en accidente ofídico, recolectarlas y preparar extractos etanólicos y acuosos.

4.2.4 Estandarizar una metodología que permita evaluar in vivo e in vitro la capacidad neutralizante de extractos de plantas sobre el veneno ofidico.

4.2.5 Determinar, bajo condiciones controladas en el laboratorio, la capacidad neutralizante de los extractos de las 3 plantas más promisorias utilizadas como antídoto para el veneno de Bothrops asper.

Al menos uno de los extractos estudiados neutralizará parcial o totalmente los principales efectos toxicológicos del veneno de B. asper.

6.1 CREACION DE BASE DE DATOS ELECTR~NICA SOBRE EL TEMA Se introdujo toda la información a la que se tuvo acceso en bases de datos que incluyen las contenidas en el Medline, Current Contents, PubMed, etc., las cuales recopilan publicaciones sobre el tema desde 1966 hasta la fecha. Se revisó literatura científica de publicación nacional e internacional, libros, memorias de congresos, seminarios y encuestas etnobotánicas realizadas en Guatemala y otras regiones tropicales o subtropicales del mundo (Anexo 1). Las variables consideradas en la base de datos fueron: nombre científico de la planta, autoridad que describe el espécimen, nombre común, persona encargada de introducir la información a la base de datos, parte o partes de la planta empleadas para contrarrestar el efecto del veneno ofídico, modo de preparación, vía de administración, país en que se emplea, otros usos y bibliografía. La información extraída se introdujo en el programa Acces de Windows 2000. Esta base se encuentra en el Departamento de Citohistología de la Facultad de CCQQ y Farmacia de la USAC, y coritinuará alimentándose periódicamente con información nueva derivada de publicaciones científicas y con los resultados de encuestas etnobotánicas futuras. Adjunto a este informe se está entregando la base de datos grabada en un disco CD. Otra copia se estará proporcionando a la biblioteca de la Facultad de CCQQ y Farmacia.

6.2 CREACION DE ARCHIVO BlBLlOGRAFlCO SOBRE EL TEMA Se recopilaron los artículos y fotocopias de los documentos especializados en el tema utilizados para el desarrollo de este proyecto (Anexo l ) , algunos de los cuales han sido colectados por los investigadores del proyecto en diferentes bibliotecas del mundo, tales como la del lnstituto Karolinska de Suecia, lnstituto de BiochemiéICHUV Hospital y Biblioteca de la WHO en Suiza, lnstituto Butantán de Brazil, etc. Se encuentra en los Departamentos de Bioquímica y Citohistología de la Facultad de CCQQ y Farmacia.

6.3 REALIZACION DE ENCUESTAS ETNOBOTANICAS Esta fase del estudio se realizó en colaboración con el Lic. Yann-Olivier Hay (CEMAT/MAPN/IRD), la Licda. Lidia Girón (CEMAT) y la bióloga Alicia López (USAC). Se diseñó la boleta de encuesta (Anexo 2) que permitiera la obtención de los datos más importantes pero también que fuera de fácil interpretación para el análisis posterior. Esta encuesta no es de tipo estadístico ya que la temática requiere cierta especialización y las personas que tienen conocimiento en el tema son escasas.

Las encuestas llevadas a cabo se efectuaron en los lugares siguientes y las personas fueron:

- Dolores, Machaquilá, (El Petén): Santos Chuc, Manuel y Jesús Aldana y Guillermo Sosa Morales.

- Chahal, Raxrujá (Alta Verapaz): Martín Yaxcal Can y Camilo Choc. - El Estor, Livingston (Izabal): Aura Pascual y Francisco Javier Arana.

En Machaquilá, se hicieron las encuestas durante una reunión con cuatro curanderos especializados en el tratamiento de las mordeduras de serpiente con plantas medicinales. Dos de ellos viven en Dolores y los demás en Machaquilá y San Luis. Por ser ésta la primera experiencia en cuanto a la dinámica que se seguiría en la realización de las encuestas, uso del documento, intercambio de experiencias con curanderos, entrevistas, etc. la actividad se realizó con la participación directa de la investigadora principal del proyecto, del Lic. Armando Cáceres (investigador asociado), de la Licda. Girón (CEMAT) y el Lic. Yann-Olivier Hay (CEMAT/MAPN/IRD), quienes colaboraron en la realización de las encuestas etnobotánicas a lo largo del proyecto.

En Chahal (municipio de Fray Bartolomé de las Casas), El Estor y Livingston, se pasaron las encuestas durante talleres organizados por CONAPIAMED. El propósito de esos talleres era intercambiar con las comunidades información sobre el uso y cultivo de las plantas medicinales. La mayoría de los participantes (comadronas, promotores de salud o curanderos) venían de los barrios cercanos de estos pueblos.

En Raxrujá, se trabajó con un promotor de salud, quien además de su conocimiento en medicina moderna, usa las plantas medicinales en el tratamiento de varias afecciones. La realización de las encuestas en Chahal y El Estor estuvo financiada por CONCYT (Fodecyt 47- 99), mientras que en Livingston y Raxrujá fue financiado por CONAPIAMED y el IRD.

Después de cada encuesta, se llevó a cabo una caminata para colectar las plantas que estaban en estado de floración. Varias plantas aun están pendientes de determinación, pues durante las misiones no estaban floreando y llevar a cabo la taxonomía no era posible. La colecta de esas especies, se hará a partir de finales del mes de febrero 2001.

6.4 SELECCIÓN DE LAS TRES PLANTAS A ESTUDIAR

Para ensayar la actividad antiofídica in vivo e in vitro, se seleccionaron dos plantas citadas en la bibliografía: Dorstenia contrajewa (Moraceae) (Girón et al., 1996) y Neurolaena lobata (Asteraceae) (Giron et al., 1991). El uso de estas plantas en el tratamiento de mordeduras de B. asper también f i ~ e reportada durante las encuestas que se hicieron en este estudio, en donde se indicaba que la parte de la planta utilizada en el tratamiento eran las hojas únicamente.

Asimismo, se seleccionó una tercera planta; Eupatorium odoratum (Asteraceae), especie reportada en encuestas en un estudio paralelo por su uso en el tratamiento de la leishmaniasis cutánea en la zona norte de Guatemala. Sin embargo, se escogió para medir su actividad antiofidica, ya que en un estudio realizado en IVigeria demostró actividad hemostática (Akah, 1990), lo que representaba una buena base de información para seguir más adelante el estudio sobre la capacidad de la planta para enfrentar los efectos de la mordedura de serpiente. La parte utilizada de ésta planta eran también las hojas. La descripción detallada de cada planta se presenta en el Anexo 3.

6.5 RECOLECCION Y SECADO DEL MATERIAL VEGETAL

Para el análisis de las tres plantas mencionadas en el inciso anterior, se colectaron 5009 de hojas de cada una. La colecta de las hojas de N. lobata y E. odoratum se llevó a cabo en Poptún Petén. Las hojas y flores de D. contrajewa (Moraceae) fueron colectadas en Samayac, Suchitepéquez. Luego, las plantas fueron secadas en el campo por un dia y luego trasladadas al herbario de FARMAYA (Laboratorio de Productos Fitofarmacéuticos, Av. Centroamérica 18- 92 zona 1) para su secado definitivo en horno a una temperatura de 35°C.

6.6 EXTRACCION DE PRINCIPIOS VEGETALES POR PERCOLACION

6.6.1 Preparación de la materia seca vegetal (MSV): Después de recolectada y secada la planta a estudiar, se molió, teniendo el cuidado de identificar cada una con nombre, fecha y parte. Se pesan 350-450 g, si la planta es poco densa se pesan únicamente 100 g (ANEXO 4).

6.6.2. Procedimiento para cargar el percolador: Se colocó en la punta del percolador un pedazo de algodón que sirvió como filtro. A su vez, se cortó un pedazo de papel filtro de forma circular, y se colocó cubriendo el fondo del percolador. Se tapó la punta del percolador con tapón plástico, se agregó la tercera parte de la cantidad pesada de MSV y se cubrió con etanol al 80%. Se chequeó que no queden burbujas. Se agregó el resto de MSV y se cubrió nuevamente con etanol al 80%, eliminando burbujas. Se dejó reposando por 24 horas para que reaccionara y luego se retiró el tapón plástico para dejar gotear todo el solvente (ANEXO 4). El solvente recogido fué agregado nuevamente al percolador. Se repitió esta operación 5 veces antes de comenzar a concentrar en rotavapor. Por último, se trasladó el solvente recolectado al balón de rotavapor y se procedió a concentrar.

6.6.3 Concentración en rotavapor: Se Ilevó el baño María a 40d°C. Se engrasaron todas las bocas esmeriladas y se armó el rotavapor. Se succionó la solución obtenida del percolador (alcohol + planta) y se Ilevó a consistencia serni solida. Se ventiló en una caja de petri de vidrio debidamente rotulada y tapada. Se colocó en una desecadora hasta que el extracto tuvo consistencia de "melcocha", se pasó a viales pre-tarados y se pesó (CYTED, 1993., Cáceres, 1996) (Anexo 4).

6.7 EXTRACCION DE PRINCIPIOS VEGETALES POR INFUSIÓN Se Ilevó a ebullición 100 ml de agua destilada y se retiró del fuego. Se agregó 10 g de la hoja seca de la planta y se dejó en reposo por 30 minutos (se "apagó1'). Seguidamente se filtró la infusión, se determinó el volumen de porción acuosa obtenida y se almacenó en un erlenmeyer con tapón de rosca a -20°C. Se procedió a liofilizar, procesó que tomó aproximadamente 3 días. Se calculó el porcentaje de rendimiento y se almacenó el liofilizado a 4OC hasta su uso (Cáceres, 1 998).

6.8 ENSAYOS BlOLOGlCOS 6.8.1 Obtención del veneno: Se colectó veneno de los especímenes de B. asper que se encuentran en el Museo de Historia Natural de la Escuela de Biología de la Facultad de CCQQ y Farmacia, en el Zoológico La Aurora y en el Museo Jorge lbarra (ANEXO 4). Para conservar intacta su actividad biológica, se procedió a centrifugar y a liofilizar inmediatamente. El stock de veneno se conservó a -20 OC hasta su uso.

6.8.2 Disolución de los extractos etanólicos y acuosos: Se pesó la cantidad requerida del extracto y se agregaron 5 ml de buffer de fosfatos pH 7.2 (PBS) con Tween 80 0.5%.(p/v). Se agitó constantemente con una varilla de vidrio en un baño de agua a 37OC hasta lograr una disolución homogénea.

6.8.3 Evaluación in vivo e in vitro de la capacidad de neutralización de los extractos: Se midió la potencia de los extractos etanólicos y acuosos de las tres plantas seleccionadas para neutralizar los principales efectos toxicológicos producidos por el veneno de la B. asper de Guatemala: efecto letal, hemorrágico, coagulante y fosfolipasa A2 (Saravia et al., 2001). Inicialmente se propuso medir también la neutralización del efecto miotóxico, sin embargo, no fue posible lograr la estandarización de la metodología.

Antes de enfrentar el veneno con los extractos vegetales, se midió la actividad letal, hemorrágica, coagulante, anticoagulante y fosfolipasa A2 de cada extracto per se, utilizando ensayos de dosis-respuesta. Esto con la finalidad de determinar los niveles de extracto que podía utilizarse sin provocar la muerte o hemorragia intradérmica en ratones, así como coagulabilidad o incoagulabilidad del plasma citratado, o bien efecto fosfolipasa A*, que invalidaran los resultados de las pruebas de neutralización.

Ensa-vos de dosis-respilesta : Actividad Letal: Diversas concentraciones de extracto, disuelto en 0.5 ml de buffer de fosfatos (PBS) pH7.2, se inyectaron por vía iri.traperitoneal a grupos de 4 ratones Swiss Webster (16-18 g). Simultáneamente, otro grupo de animales recibió únicamente 0.5 ml del buffer como control. En un ensayo clásico de determinación de letalidad, se registran las muertes ocurridas en las siguientes 48 horas y se determina la Dosis Letal Media (DLso) por el método de Spearman- Karber (WHO, 1981). En este trabajo, se probaron dosis de extractos vegetales de 1.25-20 mglratón. Se seleccionó este ámbito basándose en dos criterios: la solubilidad máxima de cada extracto (aproximadamente 5mgl0.1 ml) y en reportes de estudios similares (Otero et al., 2000).

Actividad Hemorrágica: Se utilizó el método de Kondo et al. (1960) modificada por Gutiérrez et al. (1985). Se utilizan grupos de 4 ratones, los cuales fueron inyectados intradérmicamente, en la región abdominal, con varias concentraciones de extracto, disueltas en 0.1 ml de PBS. Un grupo control fué inyectado con 0.1 ml de PBS. Dos horas después, los ratones fueron sacrificados, la piel removida y se midió el diámetro de la lesión. La dosis hemorrágica mínima (DHM) corresponde a aquella dosis que induce una lesión hemorrágica de 10mm de diámetro. En este estudio se probó la actividad de diversas dosis del extracto (1 1-2.75 mg), basándose en estudios similares realizados con veneno de B. asper de Costa Rica y B. atrox de Colombia (Castro et al., 1999, Otero et al., 2000) (Anexo 4).

Actividad Coagulante: Se determinó en sangre citratada humana (Theakston & Reid, 1983), con las modificaciones publicadas por Gené et al. (1 989). Varias cantidades de extracto, disueltas en 0.1 ml de PBS, se agregaron a 0.2 ml de plasma y se midió el tiempo de coagulación. A los sueros control se les agregó unicamente PBS. La dosis coagulante mínima (DCM) corresponde a la cantidad de veneno o extracto que induce coagulación en 60 segundos. Debido a que algunos extractos vegetales pueden presentar efectos anticoagulantes per se (José Ma. Gutiérrez, comunicación personal), se hizo una curva dosis-respuesta preincubando 30 minutos a 37 OC una dosis fija de trombina (Dade 0) con cantidades variables del extracto. Se agregó 0.1 ml de la mezcla a 0.2 ml de plasma humano citratado y se midió el tiempo de coagulación. Se usó como control una mezcla de trombina con PBS. Esta actividad se detectó mediante la determinación de la dosis de extracto incubado con trombina que induce incoagulabilidad del plasma en una hora. Para estas dos pruebas se seleccionaron niveles de extracto de 0.1 -5mg, basándose en reportes de Houghton & Skari (1 994).

Actividad Fosfolipasa AP: La actividad fosfolipasa se ensayó titrimétricamente utilizando fosfatidilcolina de yema de huevo como sustrato, según el método de Dole (1956). El sustrato se incubó con diferentes concentraciones de veneno a 37OC. Los ácidos grasos liberados se

extrajeron y fueron titrados con NaOH. La actividad se expresó como microequivalentes de ácido graso liberado por miligramo por minuto. Se seleccionaron niveles de extracto de 0.312-5mg basándose únicamente en su solubilidad máxima de los extractos, ya que no se encontraron reportes de experimentos similares utilizando el método de Dole.

Pruebas de neutralización: Para las pruebas de neutralización se utilizó el ensayo de preincubación descrito por Gutiérrez et al. (1990), que consiste en incubar un número determinado de dosis mínimas de veneno (Dosis Reto) con diferentes volúmenes de antiveneno. Para cada una de las actividades toxicológicas de la especie guatemalteca, se utilizaron los valores de "dosis mínima" (cantidad de veneno necesaria para inducir un efecto particular) reportados recientemente. DLS0=56.8 pg, DHM=11 pg y DCM=3.9 pg. Para el efecto fosfolipasa A2 se determinó que 12.5 pg de veneno inducen la liberación de 24 peqlmg.min de ácidos grasos (Saravia et al., 2001). Las razones veneno:extracto (peso:peso) utilizadas en cada experimento son las siguientes:

Neutralización del efecto letal: Se seleccionó una dosis reto de veneno que indujera una respuesta sub-máxima desde el punto de vista farmacológico, que asegurara la muerte de todos los ratones control pero que a la vez no saturara el sistema de cuantificación (Castro et al., 1999, Otero et al., 2000). Se determinó que esta dosis correspondía a 3.5 DLS0 del veneno de B. asper y se incubó con razones veneno:antiveneno de 1 :100 hasta 1:6.25. No se utilizaron niveles mas altos ya que como se mencionó anteriormente, la máxima solubilidad de los extractos fue de 5 mg1O.l ml (50mglml).

Neutralización del efecto hemorrágico: Se empleó una dosis reto de veneno correspondiente a 10 DHM. Esta cantidad constante de veneno se incubó con una cantidad de extracto a una razón veneno:extracto de 1 : 1 00 hasta 1 :6.25 (Castro et al., 1 999).

Neutralización del efecto coagulante: Se empleó una dosis reto de veneno correspondiente a 2 DCM (Gené et al., 1989). Esta cantidad de veneno se incubó con una cantidad de extracto a razón veneno:extracto de 1:400 (nivel de máxima solubilidad del extracto) hasta 1:25. Los extractos que presentaron actividad coagulante o anticoagulante per se no fueron utilizados para las pruebas de neutralización.

Neutralización del efecto fosfolipasa A?: Se empleó una dosis reto de 12.5 pg de veneno y se enfrentó a dosis variables de extracto a razón veneno:extracto de 1:400 (nivel de máxima solubilidad) hasta 1 :25.

En cada experimento utilizaron tres controles, uno conteniendo la dosis reto del veneno disuelto en PBS, otro conteniendo la cantidad máxima del extracto utilizada en las mezclas y el tercero Únicamente PBS (Castro et al., 1997, Castro & Umaña, 1990). Las mezclas y los controles se incubaron a 37OC durante 30 minutos, al cabo de los cuales se estudió su actividad neutralizante empleando el ensayo de dosis-respuesta. Todos los experimentos se repitieron 3 veces.

Los resultados de los experimentos de neutralización se expresaron en términos porcentuales, donde el 100% corresponde a una neutralización total del efecto evaluado y el 0% corresponde a un efecto de igual magnitud al inducido por el veneno solo. El registro de resultados de neutralización del efecto coagulante se hizo en porcentaje de neutralización, en donde se tomó como 100% la Dosis Eficaz (Razón veneno:extracto que coagula el plasma en un tiempo correspondiente a tres veces el tiempo de coagulación del plasma al que se le agregó veneno solo) (Theakson & Reid, 1983).

7. RESULTADOS

Los resultados de esta investigación se presentarán en tres fases: la primera concerniente a la recopilación de información sobre el tema, primero a nivel mundial y luego a nivel nacional. Se incluye el listado de los contactos y relaciones colaborativas establecidas con diferentes instituciones y personas, que permitieron llevar a cabo las encuestas etnobotánicas planificadas en el proyecto. En la segunda fase se muestra la información recopilada durante la realización de las encuestas etnobotánicas en los departamentos de El Petén, lzabal y Alta Verapaz. En la tercera fase se presentan los resultados obtenidos al evaluar la capacidad de las 3 plantas seleccionada para el estudio en la neutralización de los principales efectos toxicológicos del veneno de B. asper.

FASE 1: 7.1 CREACION DE BASE DE DATOS ELECTRONICA SOBRE EL CONOCIMIENTO EXISTENTE SOBRE EL TEMA A NIVEL MUNDIAL: Se creó una base electrónica de datos con información nacional e internacional sobre diversas especies de plantas utilizadas como antiofídicos. Hasta el momento cuenta con un registro de 752 especies de plantas con uso antiofídico. Esta base se encuentra en el Departamento de Citohistología de la Facultad de CCQQ y Farmacia de la USAC, y continuará alimentándose periódicamente con información nueva derivada de publicaciones científicas y con los resultados de encuestas etnobotánicas futuras. Adjunto a este informe se está entregando la base de datos grabada en un disco CD. Otra copia se estará proporcionando a la biblioteca de la Facultad de CCQQ y Farmacia.

7.2 CREACION DE BASE DE DATOS CON INFORMACION NACIONAL: Base de datos creada con la información derivada de las encuestas etnobotánicas realizadas en este proyecto, y de encuestas etnobotánicas de la misma naturaleza realizadas anteriormente en la misma región. Se registra el nombre científico y popular de las plantas utilizadas como antídotos en el tratamiento de envenenamiento ofídico en diversas regiones de El Petén, lzabal y Alta Verapaz, así como usos populares, recetas, dosificación y combinaciones. Se ha iniciado su determinación botánica, la cual completará la información referente a su familia, hábito, hábitat, dosificación, época de floración, etc. Dicha base de datos será alimentada en futuros trabajos de la misma naturaleza, y perrriitirá la creación de una lista priorizada de plantas utilizadas en el tratamiento del accidente ofídico en función de abundancia, época de floración y disponibilidad estacional. La información de esta base se incorporó a la información de la base general de datos electrónica mencionada en el inciso anterior, por lo que está disponible para consulta en el Departamento de Citohistología y en la biblioteca de la Facultad de CCQQ y Farmacia.

7.3 CREACION DE UN ARCHIVO BIBI-IOGRAFICO: Contiene los artículos y fotocopias de los documentos especializados en el tema utilizados para el desarrollo de este proyecto. Se encuentra como fuente de consulta en los Departamentos de Bioquímica y Citohistología de la Facultad de CCQQ y Farmacia. Se proporciona un listado de los artículos archivados en el Anexo 1

7.4 ESTABLECIMIENTO DE CONTACTOS EN LOS DEPARTAMENTOS ESTLIDIADOS: Con el fin de realizar las encuestas etnobotánicas, se realizaron contactos con líderes y curanderos de diversas comunidades de los departamentos de El Petén, lzabal y Alta Verapaz. El establecimiento de estos contactos fué indispensable para lograr la colaboración de las personas dedicadas a la medicina tradicional, ya que son bastante reservadas y renuentes a compartir sus conocimientos con personas ajenas. Se mencionan los contactos principales:

Sr. Plácido Castellanos, Machaquilá, El Petén, Daniel Peinado, Coordinador del ICTA, Fray Bartolomé de las Casas, Alta Verapaz Martín Yaxcal Can, El Cebolito, Fray Bartolomé de las Casas, Alta Verapaz Hermana Vicky, El Estor, lzabal

7.5 ESTABLECIMIENTO DE RELACIONES COLABORATIVAS CON ENTIDADES NACIONALES E INTERNACIONALES INTERESADAS EN EL TEMA: Colaboraciones establecidas con entidades como CONAPLAMED, CEMAT, la asociación Médicins aux Pieds Nus de Francia, FARMAYA y el IRD (Instituto de Investigación para el Desarrollo) de Francia. La colaboración con estas entidades fué vital para la realización de las encuestas etnobotánicas.

FASE II: 7.6 INFORMACION RECOPILADA EN ENCUESTAS ETNOBOTANICAS: La información derivada de las encuestas etnobotánicas realizadas por el equipo de trabajo en colaboración con los Licenciados Hay y Girón durante el desarrollo de este proyecto, se presenta a continuación:

Se entrevistaron 8 personas en dos localidades de cada departamento: Dolores y Machaquilá (El Petén), Chahal y Raxrujá (Alta Verapaz) y Livingston y El Estor (Izabal).

En la Tabla No.1, se brinda el listado de plantas, la cual contiene el nombre(s) comun(es), la parte usada, la forma de preparación y de aplicación, y el nombre de la persona que brindó la información. Para las plantas identificadas se precisa la familia, el nombre científico y el numero de herbario. Las muestras correspondientes están depositadas en el Herbario de CEMAT- Farmaya. Las demás especies quedan pendientes de la determinación hasta que se tenga las muestras representativas.

Para entender el uso de cada planta en esa lista, es necesario tomar en cuenta el tipo de .tratamiento que usa cada persona entrevistada, de esta forma se tiene que:

Don Martin Yaxcal Can y Doña Aura Pascual usan las hojas de las plantas machacadas en emplasto.

Don Camilo Choc puede usar las plantas de la rriisma forma, pero también prepara una bebida que el paciente debe tomar.

Don Francisco Javier Arana indicó un tratamiento auxiliar que el paciente puede usar antes de llegar al hospital. En este tratamiento, el paciente debe masticar las hojas de tabaco y mezclarlas con las hojas de Tres puntas (N. lobata) para hacer un emplasto.

Don Guillermo Sosa Morales justifica su tratamiento diciendo que el líquido tomado por el paciente sirve para "empujar" el veneno y el parche permite "jalarlo". Por ejemplo, para empezar, estruja la raíz de Guapillo (Aristolochia pilosa, Aristolochiaceae) con la raíz de Hierba del cancer (Acalypha anlensis, Euphorbiaceae), las semillas de Quequesquillo (pendiente de identificación) y unos dientes de ajo (Allium sativum, Liliaceae). El producto obtenido es diluido en agua hervida y colado. El paciente toma el liquido y el fíltrado se usa para hacer un emplasto. Entre la toma y el parche, Don Guillermo hace también un masaje con manteca de mazacuata, especie de culebra no venenosa.

Si el paciente está muy enfermo, Don Guillermo le da la toma cada 5 minutos, de lo contrario, cada 15 minutos. El tiempo de curación varia de uno a tres días. Después del tratamiento, el curandero dice que el paciente no debe tomar nada y no debe comer pescado, sólo carne asada, queso y tortilla. Además, no se debe bañar al paciente durante tres días y después de este periodo hay que bañar el paciente sin restregarle.

Don Santos Choc Suc siempre usa plantas frescas. El justifica este uso diciendo que según la cosmología maya, la mordedura de serpiente es caliente por lo que es necesario usar una planta "fresca" de acuerdo a sus creencias.

El usa solo una planta; Bajnel (pendiente de identificación) (del Q'eqchi "culebra") par curar las mordeduras de serpiente. Saca las hojas de arriba hacia abajo, pero deja las hojas tiernas de la punta. Luego, las estruja entre sus manos y las mezcla en dos vasos de agua. El paciente lo toma y Don Santos chupa el veneno y lo escupe. Dice que lo que sale de la herida tiene un sabor amargo como agua de cal. Sigue chupando la herida hasta que no se siente el sabor descrito. Al final, con las hojas estrujadas que quedan, hace un emplasto sobre la mordedura. Luego, da otra toma al paciente. Repite el tratamiento otra vez (hasta tres veces) si el paciente no mejora.

En verano cuando el Bajnel no tiene hojas, Don Santos usa el tallo de la planta, o raspa la corteza interna del cedro (Cedrela sp., Meliaceae). Usa también el Guapillo como Don Guillermo, pero, sólo las hojas, porque dice que no usa las raíces para preservar la planta.

Don Santos no prescribe dieta al paciente. Dice que si quiere tomar, le da de tomar, pero de toda manera le queda la boca seca.

Don Manuel y Don Jésus Aldana son hermanos y heredaron sus conocimientos de su papá y usan entonces las mismas plantas en sus remedios. Para curar la mordedura de serpiente, usan un cocimiento de la corteza de Bejuco guaco (Aristolochia grandiflora, Aristolochiaceae, identificación a confirmar con otra muestra). Según el estado del paciente, aumentan o disminuyen la dosis de la toma. Después de la toma, se lava la herida con la decocción de la corteza de Bejuco guaco o de otras especies. Siempre usan tres plantas juntas para preparar ese lavado que se aplica localmente de arriba hacia a bajo. Luego, se amarran las hojas del Bejuco guaco sobre la herida. A las 24 horas se sabe si se salvó el paciente.

Los hermanos Aldana nos han hablado también de plantas llamadas <<auxiliares ,> para ayudar al paciente hasta llegar al destino donde lo pueden atender.

I Tabla 1. Plantas usadas para curar las mordeduras de serpiente reportadas en encuestas realizadas en Dolores, Machaquilá (Petén), Chahal, Raxrujá (Alta Verapaz), El Estor, y

I Livingston (Izabal).

Informante

Martin Yaxcal Can Martin Yaxcal Can Martin Yaxcal Can Martin Yaxcal Can Martin Yaxcal Can Camilo Choc

Camilo Choc

Francisco Javier Arana

Aura Pascual

Guillermo Sosa Morales y Santos Choc Suc

Guillermo Sosa Morales

Guillermo Sosa Morales

Guillermo Morales

Guillermo

Sosa l Sosa

Morales Guillermo Sosa Morales

Familia, Nombre común (Etnia) Nombre científico Autor Numero de herbario Telomkehen* Ruxsa Xul* Juruch* Ixkikeen* Xcuaxul* '

Liliaceae C~~rarina* Sanseveria guineensis (L.) Willd. Planta Barba amarilla* Asteraceae Tres puntas, Guifiti* Neurolaena lobata L.

Apiaceae Bariño, Culantro de castillo* Eryngium foetidum L. Aristolochiaceae Guapillo Aristolochia pilosa H.B.K. YOH 3 Asteraceae Tres puntas Neurolaena lobata (L.) R. Br. Euphorbiaceae Hierba del cancer Acalypha arvensis Poepp. & Endl. YOH 12 Liliaceae Ajo* Allium sativum L. Camotillo*

Menispermaceae Alcotan

Parte usada

Hoja Hoja Hoja Hoja Hoja Hoja

Hoja

Hoja

Hoja

Raíz

Hoja

Raíz

Bulbo

Raíz

Raiz

Preparación

Machacada Machacada Machacada Machacada Machacada Machacada

Machacada

Machacada con agua

Machacada

Machacada

Machacada

Machacada

Machacada

Machacada

Machacada

Forma de aplicación

Emplasto Emplasto Emplasto Emplasto Emplasto Jugoloral

Jugo con agua tibia / oral Emplasto, mezclado con tabaco masticado. (tratamiento auxiliar) Emplasto

Jugoloral y fíltrado en emplasto

Jugoloral

Té con el Jugoloral y fíltrado en emplasto

Té con el Jugoloral y filtrado en emplasto

Té con el Jugoloral y fíltrado en emplasto emplasto

Cissampelos pareira L. Quequesquillo*

Papilionaceae (Fabaceae) Palo de pito* Erythrina berteroana Willd.

Bajnel* Meliaceae Cedro* Cedrela sp. Aristolochiaceae Bejuco guaco* Aristolochia. grandiflora ? LG 15 Mimosaceae Subin*

Piperaceae Cordoncillo, hoja de Piedra, pie de negro Piper curvatipes Trelease YOH 1 1 Piperaceae Cordoncillo* Piper peltatum L.? Piperaceae Cordoncillo pequeño* Ru biaceae Cafecillo, Hierba de la chinche Psychotria pleuropoda Donn. - Sm. YOH 9 Ru biaceae Ixcanan, chichipin, Sanalotodo* Hamelia patens ? Verbenaceae Alacrancillo, malva azul, verbena* Stachytarpheta jamaicensis Vahl o S. cayennensis Vahl

Semilla

Corteza Y Hoja,

Hoja y Tallo Corteza interna

Corteza y Hojas

Corteza

Hoja

Hoja

Hoja

Hoja

Hoja

Hoja

Machacada

Machacada

Machacada

Machacada

Decocción

Decocción

Decocción

Decocción.

Decocción

Decocción

Decocción

Decocción

Té con el Jugo/oral y fíltrado en emplasto Jugoloral y 'fíltrado en emplasto

Jugoloral y fíltrado en emplasto Jugoloral y fíltrado en emplasto

Oral y baño

baño

baño

baño

baño

Baño

Baño

Baño

Guillermo Sosa Morales Santos Choc Suc

Santos Choc Suc

Santos Choc Suc

Jesús y Manuel Aldana

Jesús y Manuel Aldana

Jesús y Manuel Aldana

Jesús y Manuel Aldana

Jesús y Manuel Aldana Jesús y Manuel Aldana

Jesús y Manuel Aldana

Jesús y Manuel Aldana

Zingiberaceae Caña de cristo, Costus sp. LG 17 Zingiberaceae Caña de cristo Costus ruber Grisele YOH 15 Zingiberaceae Caña de cristo Costus sanguineus Donn. Smith YOH 16 Moraceae Contra hierba Dorstenia contrajewa L.

Curarina * Sanseveria

YOH 17 Liliaceae

Hoja

Hoja

Hoja

Hoja

Cirín (solo la hembra) Miconia sp.

Vota : las plantas marcadas con un *están pendientes de I

Decocción

Decocción

Decocción

Decocción

Hoia

guineensis (L.) Willd. Hierba de los Aldana*

Masticada

Baño

Hoja y

Jesús y Manuel Aldana

Baño

Decocción

Aldana

Jesús y Manuel Aldana

Baño

auxiliar) Aldana

Jesús y Manuel Aldana

I I terminación o de confirmación.

Baño

Baño

FASE III: 7.6 EVALUACION DE LA CAPACIDAD NEUTRALIZANTE DE LOS EXTRACTOS ETANOLICOS Y ACUOSOS DE LAS TRES PLANTAS SELECCIONADAS:

Jesús y Manuel Aldana Jesús y Manuel Aldana

Se seleccionaron las 3 plantas a estudiar de acuerdo a los criterios mencionados anteriormente. Se procedió a su recolección, secado y obtención de extractos etanólicos y acuosos. Se estandarizó la metodología de liofilización y disolución de extractos vegetales para pruebas biológicas; se estandarizó la metodología de evaluación in vivo e in vitro de la capacidad de los extractos vegetales para neutralizar los efectos letal, hemorrágico, coagulante y fosfolipasa A2 del veneno ofídico según se describe en la metodología. Finalmente, se procedió a la evaluación de su capacidad para neutralizar dichos efectos.

Actividad per se de los extractos vesetales Se midió la actividad letal, hemorrágica, coagulante, anticoagulante y fosfolipasa A2 de cada extracto per se, utilizando los ensayos de dosis-respuesta, con la finalidad de determinar los niveles de extracto que podía utilizarse sin provocarar la muerte o hemorragia intradérmica en ratones, así como coagulabilidad o incoagulabilidad del plasma citratado, o bien efecto fosfolipasa A2, que invalidaran los resultados de las pruebas de neutralización. Todos los ensayos se hicieron por triplicado. Los resultados se describen a continuación:

a) Dorstenia contrajewa Extracto etanólico: No se detectaron efectos letales o hemorrágicos en los ratones a los niveles estudiados. Tampoco presentó actividad fosfolipasa A2 en los niveles probado. Sin embargo, presentó actividad coagulante en dosis de 2.5 y 5mg de extracto (Anexo 5). En el ensayo de inactivación de trombina no mostró actividad anticoagulante en los niveles estudiados

Extracto acuoso: No se detectaron efectos letales, hemorrágicos, anticoagulantes o fosfolipasa 4 a los niveles estudiados. Presentó actividad coagulante en los niveles de 2.5 y 5 mg (Anexo 5)

b) Neurolaena lobata Extracto etanólico: No presentó ninguno de los efectos tóxicos evaluados.

Extracto acuoso: No se detectaron efectos letales, hemorrágicos, fosfolipasa A2 ni coagulante en los niveles estudiados. Sin embargo, en el ensayo de preincubación con trombina presentó efecto anticoagulante en todas las dosis estudiadas (Anexo 5).

c) Eupadorium odoratum Extracto etanólico: No presentó ninguno de los efectos tóxicos evaluados.

Extracto acuoso: No se detectó efecto letal, hemorrágico, fosfolipasa A2 ni coagulante a las dosis evaluadas. Se detectó efecto anticoagulante en el ensayo de inactivación de trombina en todas las dosis analizadas (Anexo 5).

Pruebas de neutralización: Los extractos fueron enfrentados a dosis fijas de veneno (dosis reto), las mezclas fueron incubadas a 37OC y se evaluó su capacidad para neutralizar los efectos toxicológicos según la metodología descrita anteriormente. Los extractos que presentaron actividad coagulante o anticoagulante per se, no fueron evaluados en cuanto a su capacidad de neutralizar el efecto coagulante del veneno, pues obviamente la actividad propia del extracto enmascararía cualquier resultado. Todas las pruebas se repitieron al menos tres veces. Los resultados globales por planta se muestran en las Tablas No.2, No.3 y No.4. Los resultados detallados de cada prueba en donde se detectó algún efecto neutralizante se presentan en el Anexo 6.

1 TABLA No.2. Evaluación de la capacidad de los extractos etanólico y acuoso de Dorstenia contrajerva para neutralizar las actividades toxicológicas inducidas por el

I veneno de B. asper.

I

TABLA No.3. Evaluación de la capacidad de los extractos etanólico y acuoso de

I Neurolaena Iobata para neutralizar las actividades toxicológicas inducidas por el veneno de B. asper.

I PLANTA \PARTE DEIEFECTO I EXTRACTO I EXTRACTO

1

1 D. contrajerva

I

I 1 l I 1 I

a~eutralizaci~n: se preincubaron dosis variables de extractos con una dosis fija de veneno (dosis reto-DR-) para cada efecto, a 37OC por 30 minutos. Los resultados se registran como (-) ausencia de neutralización; (+) neutralización pobre (mas del 1% hasta el 50%); (++) neutralización parcial (mas del 50%, pero menos del 100%); (+++) neutralización total (100%). b~os i s reto (DR): 3.5 (198.8 pg de veneno de B. asper), 'DR: 10 DHM (1 10 pg de veneno), d ~ ~ : 12.5 pg de veneno, e ~ ~ : 2DCM (8 pg de veneno). ND: no determinados por presentar el extracto actividad inhibitoria de la trombina per se. *Los números entre paréntesis indican el porcentaje de neutralización obtenido con el mayor nivel de extracto utilizado en el ensayo. Estos resultados se presentan como el promedio + DS (n=3).

1

N. lobata

Hojas

LA PLANTA Hojas Hojas Hojas

PLANTA (PARTE DEIEFECTO NEUTRALIZACIONa

EXTRACTO I EXTRACTO LA PLANTA Hojas Hojas Hojas Hojas

a~eutralización: se preincubaron -dosis variables de extractos con una dosis fija de veneno (dosis reto-DR-) para cada efecto, a 37OC por 30 minutos. Los resultados se registran como (-) ausencia de neutralización; (+) neutralización pobre (mas del 1% hasta el 50%); (++) neutralización parcial (mas del 50%, pero menos del 100%);

I (+++) neutralización total (100%). b ~ o s i s reto (DR): 3.5 DLSO (198.8 pg de veneno de B. asper), 'DR: 10 DHM (1 10 pg de veneno), d ~ ~ : 12.5 pg de veneno, e ~ ~ : 2DCM (8 pg de veneno). ND: no determinados por presentar el extracto actividad coagulante per se. *Los números entre paréntesis indican el porcentaje de neutralización obtenido

I con el mayor nivel de extracto utilizado en el ensayo. Estos resultados se presentan como el promedio DS (n=3).

Coagulantee

LetalD Hemorrágicoc Fosfolipasa A2a

LetalD Hemorrágicoc Fosfolipasa A2a Coagulantee

ND

ETANOLICO - +(11.72%+15.9)* -

ND

ACUOSO I

- - -

ETANOLICO - - - ++(65.3%+5.4)

ACUOSO

+ (27.3%+7.8)* - ND

1 TABLA N0.4. Evaluación de la capacidad de los extractos etanólico y acuoso de Eupatorium odoratum para neutralizar las actividades toxicoiógicas lnducldas por el

I veneno de B. asper.

1 NEUTRALIZACIONa PLANTA (PARTE DEIEFECTO 1 EXTRACTO 1 EXTRACTO

j ~ o i a s j coaguiantee - j + (47.6%+4.7)* j ND a~eutralización: se preincubaron .dosis variables de extractos con una dosis fija de veneno (dosis reto-DR-) para cada efecto, a 37OC por 30 minutos. Los resultados se registran como (-) ausencia de neutralización; (+) neutralización pobre (mas del 1% hasta el 50%); (++) neutralización parcial (mas del 50%, pero menos del 100%); (+++) neutralización total (100%). b ~ o s i s reto (DR): 3.5 DLSO (198.8 pg de veneno de B. asper), 'DR: 10 DHM (1 10 pg de veneno), d ~ ~ : 12.5 pg de veneno, e ~ ~ : 2DCM (8 pg de veneno). ND: no determinados por presentar el extracto actividad inhibitoria de la trombina per se. *Los números entre paréntesis indican el porcentaje de neutralización obtenido con el mayor nivel de extracto utilizado en el ensayo. Estos resultados se presentan como el

LA PLANTA

promedio 2 DS (n=3).

ETANOLICO 0

- -

Hojas Hoias

ACUOSO

- ~emorragico~ F o s ~ o ~ ~ D ~ s ~ Asa

Fase 1: La primer fase de esta investigación es puramente descriptiva, la información colectada sirvió de base para las siguientes fases del proyecto y servirán como fuente de consulta en el futuro. Los aspectos mas relevantes desprendidos de la búsqueda bibliográfica muestran que la capacidad de extractos de plantas de inhibir algunas actividades de venenos de serpientes ha sido ampliamente documentada (Martz, 1992), aunque en muchos casos es necesario corroborar estas observaciones mediante experimentos bien controlados. Por ejemplo, extractos acuosos de Eclipta prostrata (Asteraceae) neutralizan parcialmente el efecto hemorrágico del veneno de Bothrops jararaca (Melo et al., 1994). Ferreira et. al., (1992) demostraron que la ar-tumerona, aislada de extractos de raíces de Curcuma longa (Zingiberaceae), inhibió la actividad hemorrágica del rriismo veneno. Extractos de la raíz de Hemidesmus indicus, Pluchea indica, Vitex negundo, y Aristolochia indica fueron capaces de neutralizar el efecto hemorrágico de las serpientes Vipera russelli, Echis carinatus, Naja naja y Ophiophagus hannah, el compuesto HI-RVIF, aislado del extracto de la raíz de H. Indicus, neutralizó significativamente las actividades letal, hemorrágica y desfibrinante del veneno de V. russellii (Alam & Gómez, 1994). En Latinoamérica, estudios recientes de Castro et al. (1999) encontraron que los extractos etanólicos, acuosos y en acetato de etilo de 10 plantas inhibían completamente el efecto hemorrágico de la serpiente B. asper. Otero et al. (2000) reportaron actividad neutralizante de hemorragia, letalidad y actividad fosfolipasa Ap del veneno de B. atrox. Estos hallazgos en regiones cercanas a Guatemala sugieren que las posibilidades de detectar y validar plantas efectivas para el tratamiento de la mordedura de B. asper son altas.

Fase II: En esta fase se muestran los resultados preliminares de un estudio etnobotánico sobre el uso de plantas medicinales en el tratamiento del accidente ofídico en la zona norte de Guatemala. Las encuestas se realizaron en los departamentos de El Petén, lzabal y Alta Verapaz, los cuales tienen una alta incidencia de accidentes ofídicos, especialmente causados por la serpiente B. asper (Campbell & Lamar, 1989). Los contactos establecidos con líderes de las comunidades visitadas fue determinante para el éxito de las actividades, ya que las comunidades del área son bastante cerradas a personas ajenas. Se pudo detectar que el conocimiento sobre la preparación de antídotos, lugar de recolección de plantas, dosificación, etc. no es tan común como era de esperarse. Existen personas especializadas en el tratamiento de estos accidentes, así como también lo realizan algunos herbolarios y curanderos con mayor o menor éxito. Por esta razón, solo fue posible pasar la encuesta a 8 curanderos en total. Los resultados de las encuestas etnobotánicas muestran que no existe un criterio común en cuanto a las recetas, preparación, dosificación o administración de los antídotos entre los curanderos entrevistados. Sin embargo, parece existir consenso en cuanto a la percepción de que debe usarse un antídoto (usualmente como emplasto o lavado) para "jalar el veneno", y otro (usualmente tomado) para "empujarlo".Se detectaron 32 plantas, algunas de ellas ya reportadas previamente y otras nuevas pendientes de identificación. De las ya identificadas y caracterizadas, se seleccionaron tres especies (D. contrajerva, E. odoratum y N. lobata) con el fin de medir su actividad contra los efectos del veneno de B. asper en condiciones controladas de laboratorio.

Fase III: Esta investigación representa el primer esfuerzo por validar el uso de plantas medicinales en el tratamiento del envenenamiento ofídico en Guatemala, por lo que básicamente se implementaron y estandarizaron las técnicas de tamizaje que permitirán detectar actividad anti-

1 hemorrágica, anti-letal, anticoagulante y anti-fosfolipasa A2 en extractos vegetales etanólicos y acuosos.

1 a) Extractos de D. contrajerva: Los resultados obteriidos en el análisis de los extractos de Dorstenia contrajerva muestran que

I los extractos etanólicos y acuosos de esta planta poseen actividad coagulante (hemostática) en dosis de alrededor de 5 mg (Tabla No.2). Esta característica los hace útiles en el tratamiento de envenenamiento moderado a severo, cuando el paciente presenta incoagulabilidad

I sanguínea. Sin embargo, debe comprenderse que el veneno de B. asper produce inicialmente coagulación en la víctima, provocando depleción de fibrinógeno, por lo que la sangre se torna incoagulable después de 30-60 minutos después de la mordedura (Otero et al., 1992). Por ello, la administración de dosis altas de esta planta en la fase temprana del envenenamiento podría

I potenciar el efecto defibrinante del veneno. Los factores de la planta que producen coagulación deberán ser aislados y caracterizados posteriormente.

Interesantemente, únicamente los extractos etanólico de D. contrajerva y el acuoso de N. lobata lograron una inhibición pobre del efecto hemorrágico del veneno (Tabla No.2). Esto se debe posiblemente a que el efecto hemorrágico es dependiente de la acción enzimática de metaloproteinasas dependientes de zinc (Gutiérrez et al., 1995), que no logran ser inhibidas por los extractos de esta planta. Castro et al. (1999) aislaron e identificaron compuestos de naturaleza flavonoide en las fracciones de extractos con alta actividad anti-hemorrágica. Eritre las actividades farmacológicas de los .flavonoides están la inhibición de la actividad plaquetaria, la actividad antitrombótica en general, así como capacidad para inhibir fosfolipasas A2 (Chung et al., 1993, Gil et al., 1997). Todo ello indicaría que los extractos de D. contrajerva carecen de compuestos de naturaleza flavonoide, lo que explicaría también su ineficiencia en neutralizar los demás efectos del veneno.

El efecto hemorrágico del veneno no logró ser neutralizado por ninguno de los demás extractos del estudio. Globalmente, estos resultados indican que las tres plantas carecen de factores inhibitorios de metaloproteasas y de enzimas con actividad fosfolipasa AP, los principales componentes del veneno causantes de hemorragia (Castro et al., 1999). En este estudio la dosis reto del veneno fue de 10 DHM, que es la dosis recomendada para los estudios de neutralización (WHO, 1981) y que han sido utilizadas exitosamente en estudios similares con extractos vegetales (Castro et al., 1999). Sin embargo, reportes recientes sugieren que el uso de una dosis reto de 6 DHM permitiría que los componentes inhibitorios de las plantas, posiblemente en bajas cantidades en los extractos obtenidos en el laboratorio, interaccionaran con el veneno en un sistema no saturado por la alta concentración de toxinas contenidas en una dosis reto mas alta (Otero et al., 2000). Para que la prueba sea válida disminuyendo la dosis reto, debe aumentarse sustancialniente la cantidad de ratones que se utilizan por nivel a probar.

b) Extractos de N. lobata y E. odoratum Los extractos acuosos de Neurolaena lobata y Eupadorium odoratum mostraron tener un efecto inhibidor de la trombina en todas las dosis estudiadas (Tabla NO.^), lo que se traduce en un efecto anticoagulante. De acuerdo al mecanismo de acción del veneno explicado anteriormente, el uso de la infusión acuosa de estas plantas podría ser útil en el tratamiento temprano de la mordedura de B. asper, pero coritraindicado en pacientes con hemopatías o hemorragia sistémica en fases mas avanzadas del envenenamiento.

El extracto etanólico de N. lobata logró una neu.tralizaciÓn parcial en todas las dosis probadas, del efecto coagulante del veneno (Tabla No.2). Este hallazgo es importante, ya que al inhibir el

efecto coagulante del veneno, se impide la desfibrinación, por lo que la sangre de la persona envenenada no estará incoagulada.

El extracto etanólico de E. odoratum inhibió el efecto coagulante del veneno en un 47.6%-.7, resultado que concuerda con reportes anteriores que indican actividad hemostática de esta planta (Akah, 1990). Sin embargo, a las concentraciones probadas en este estudio no resulta especialmente efectivo para neutralizar los efectos del veneno de B. asper. Interesantemente, los resultados indican la presencia de factores inhibitorios de la trombina en la fase acuosa de N. lobata y E. odoratum, y de factores coagulantes en la fracción etanólica de ambas plantas. El paso a seguir en futuros estudios será el de aislar y caracterizar los principios activos en cada una de ellas, ya que representan factores potenciales para el tratamiento del accidente of íd ico.

c) Interpretación global de los resultados: Debe ponerse especial atención en el hecho de que las tres plantas fallaron en neutralizar el efecto letal y fosfolipasa A2 del veneno (Tabla No.2). Debido a que la neutralización de la letalidad es la prueba mas relevante en el momento de determinar la capacidad neutralizante de un antiveneno (WHO, 1981; Theakston, 1986, Gutiérrez et al., 1996), estos resultados cuestionan seriamente la utilidad de usar estas plantas en el tratamiento del envenenamiento por mordedura de B. asper. Sin embargo, para futuras investigaciones debe considerarse la posibilidad de disminuir la dosis reto de veneno a 1 .5DLS0, utilizando al menos 10 ratones por dosis a ensayar (Otero et al., 2000), a manera de aumentar las posibilidades de detectar un extracto con muy bajas concentraciones de sustancias inhibitorias pero potencialmente importantes al momento de utilizar las plantas en las dosis y recetas tradicionales (Castro et al., 1 999).

Las enzimas con actividad fosfolipasa A, son componentes importantes del veneno ofídico. Son responsables de varios efectos farmacológicos importantes, tales como el miotóxico, el cardiotóxico, anticoagulante, hemorrágico, hemolítico, edematígeno, hipotensivas y de agregación plaquetaria (Gowda, 1997). El hecho de que todos los extractos fueran inefectivos para neutralizar esta actividad es otro hallazgo importante, que explica en parte su baja efectividad en neutralizar el efecto hemorrágico y vuelve a cuestionar el uso de estas plantas para el tratamiento de envenenamientos moderados y severos por mordedura de B. asper.

En conclusión, ninguna de las plantas estudiadas neutralizó los efectos letal y fosfolipasa A2 del veneno de B. asper. El efecto hemorrágico fue pobremente neutralizado por el extracto acuoso de D. contrajen/al y por el extracto etanólico de N. lobata. Aparentemente, los efectos mas importantes de los extractos estudiados se dan con respecto a la neutralización del efecto coagulante y defibrinante del veneno. Estos resultados sugieren entonces, que el uso aislado de los extractos de estas plantas no es efectivo para neutralizar el envenenamiento moderado o severo por mordedura de B. asper. Posiblemente sí sean útiles al usarse como plantas auxiliares en el tratamiento, lo cual vendría a explicar que tradicionalmente los antídotos están compuestos de la mezcla de varias plantas (Pereira et al., 1996, Martz, 1992, encuesta etnobotánica realizada en este estudio).

Las posibilidades de detectar plantas de uso etnomédico en Guatemala con una mayor capacidad neutralizante de los principales efectos toxicológicos del veneno de B. asper se verán aumentadas conforme se aumente el número de extractos a investigar. En el caso del trabajo realizado en Colombia por Otero y colaboradores (2000) se muestra que Únicamente 12 de 74 extractos investigados presentaron actividad neutralizante de la letalidad, y de ellos, solo 9 presentaban actividad anti-fosfolipasa A2. En Costa Rica, de 48 especies estudiadas, se

encontraron 10 extractos con actividad anti-hemorrágica (Castro et. al., 1999). Por ello, debe continuarse con la realización de encuestas etnobotánicas de esta naturaleza, que permitari la detección de plantas usadas tradicionalmente para el tratamiento de mordeduras de serpiente. El uso de pruebas de tamizaje como las empleadas en la presente investigación permitirán la detección de los extractos mas promisorios, los cuales deberán ser estudiados para aislar y caracterizar bioquímica y farmacológicamente sus principios activos.

La validación científica de los extractos que muestren una alta capacidad neutralizante en las pruebas de tamizaje, o bien de las fracciones que contengan las moléculas activas, deberá realizarse utilizando un diseño estadístico específico.

La presente investigación es el primer estudio de esta naturaleza realizado en Guatemala. Durante el desarrollo de la misma se logró la recopilación de información relacionada al tema, así como la creación de una base de datos específica, que permitió la detección de diversas especies vegetales con uso antiofídico en la zona norte de Guatemala. Se implementaron y estandarizaron las pruebas biológicas necesarias para probar la capacidad de extractos vegetales para neutralizar los principales efectos fisiopatológicos del veneno de B. asper, y se realizó una prueba piloto con los extractos etanólicos y acuosos de tres especies vegetales. Los resultados obtenidos muestran que el panel de pruebas es funcional para el tamizaje de extractos vegetales, por lo que se recomienda para continuar con el estudio de las otras plantas detectadas durante las encuestas etnobotánicas.

Dada la importancia del accidente ofídico en la zona norte de Guatemala, en donde la población afectada recurre principalmente al uso de antídotos tradicionales, se continuará con esta línea de investigación en los Departamentos de Bioquímica y Citohistología, así como la Escuela de Biología de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, utilizando los contactos y metodologías iniciadas durante el presente proyecto.

9. CONCLUSIONES

9.1 Se creó una base de datos sobre el conocimiento existente en nuestra medicina tradicional acerca de las plantas utilizadas en el tratamiento del accidente ofídico en los Departamentos de El Petén, Alta Verapaz e Izabal.

9.2 Se establecieron relaciones colaborativas con instituciones nacionales e internacionales dedicadas al estudio de la flora y fauna guatemalteca, que se encuentran trabajando en la zona de interés.

9.3 Los resultados de las encuestas etnobotánicas muestran que no existe un criterio común en cuanto a las recetas, preparación, dosificación o administración de los antídotos entre los curanderos entrevistados. Sin embargo, parece existir consenso en cuanto a la percepción de que debe usarse un antídoto (usualmente como emplasto o lavado) para "jalar el veneno", y otro (usualmente tomado) para "empujarlo".

9.4 Se estandarizó la metodología que permitió evaluar in vivo e in vitro la capacidad neutralizante de extractos vegetales sobre el veneno ofídico.

9.5 Los extractos etanólico y acuoso de la planta D. contrajerva mostraron tener actividad coagulante bajo las condiciones utilizadas en esta investigación. Esta propiedad la hace útil en el tratamiento de envenenamientos moderados y severos por mordedura de B. asper, en donde la sangre se ha vuelto incoagulable y puede haber ya una hemorragia sistémica.

9.6 El extracto etanólico de D. contrajerva y el acuoso de N. lobata lograron una neutralización pobre (menor del 50%) del efecto hemorrágico del veneno de B. asper.

9.7 Los extractos etanólicos de N. lobata y E. odoratum neutralizaron parcialmente el efecto coagulante del veneno de B. asper.

9.8 Los extractos acuosos de N. lobata y E. odoratum inactivan la trombina en ensayos de preincubación. Este efecto se traduce en producción de incoagulabilidad sanguínea.

9.9 Ninguna de las plantas estudiadas: D. contrajerva, E. odoratum y N. lobata, neutralizó los efectos letal y fosfolipasa A2 del veneno de B. asper.

9.10 El uso aislado de cualquiera de las tres plantas estudiadas (D. contrajerva, E. odoratum y N. lobata) resultará ineficaz para contrarrestar los efectos del envenenamiento moderado o severo por mordedura de B. asper.

1 10. RECOMENDACIONES

10.1 Las misiones de campo y entrevistas con personas de diversas comunidades de los tres departamentos en donde se realizaron las encuestas etnobotánicas de este proyecto, revelaron que el conocimiento popular en este tema es muy especifico y pocas personas tienen información, por lo que las encuestas deben ir dirigidas a conocedores en las diferentes regiones en estudio.

10.2 Continuar realizando encuestas etnobotánicas que permitan recopilar el conocimiento de curanderos y herbolarios sobre el tratamiento del accidente ofídico con antídotos preparados a base de plantas. Dado que la zona norte de Guatemala es tan extensa, deberá tomarse en consideración que se necesita ampliar el grupo de trabajo, con el fin de optimizar las reuniones con curanderos y abarcar mas regiones de los tres departamentos investigados.

10.3 Recolectar las muestras vegetales en su epoca de floración, con el fin de determinación botánica. Es realmente este tipo de seguimiento el que permitirá la detección de nuevas plantas utilizadas tradicionalmente como antiofídicos.

10.4 Divulgar los resultados obtenidos en investigaciones como esta, no solo dentro de la comunidad científica, sino que también en las comunidades de donde se extrajo la información.

10.5 Dadas las características del envenenamiento por mordedura de B. asper, debe implementarse y estandarizarse las pruebas de neutralización de los efectos miotóxico, desfibrinante y edematizante. Se recomienda revisar la metodología descrita en la literatura, la calibración de aparatos y de ser posible buscar la asesoría de un experto.

10.6 Utilizar la metodología descrita en este proyecto como pruebas de tamizaje en el estudio de plantas con posibles efectos antiofídicos. Las plantas mas promisorias deberán ser validadas en estudios que conlleven un diseño estadístico específico.

10.6 Evaluar la capacidad real de bioterio de la Facultad de CCQQ y Farmacia para proporcionar el elevado numero de ratones necesarios para realizar estudios de este tipo. En proyectos futuros deberá contemplarse la contratación de personal que colabore en la crianza y mantenimiento de los ratones.

10.7 Se recomienda probar a disminuir las dosis reto utilizadas en las pruebas de neutralización de hemorragia y letalidad.

10.8 Continuar trabajando en esta línea de investigación, ya que el análisis de un mayor número de extractos permitirá la detección de plantas con capacidad antiofídica, así como el aislamiento de principios activos.

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12. EJECUCION FINANCIERA

12.1 Recursos solicitados al FONACYT: El presupuesto se ejecutó en un 82% de acuerdo a lo autorizado. No se pudo ejecutar mas debido a problemas con agilización de compras, trámites burocráticos para poder realizar las compras, etc. Se recomienda implementar los mecanismos dentro del CONCYT que faciliten al investigador el acceso a los recursos aprobados y a la optimización del tiempo que se dispone para ejecutar el presupuesto.

12.2 Recursos financieros de contrapartida:

RUBRO Honorarios Equipo Viáticos Mantenimiento y Reparación Documentos e Información Publicación de resultados Gastos no previstos Gastos de transporte Servicios básicos (comunicación) Compra de suministros 10% de administración TOTAL

AUTORIZADO Q19,884.00 Q32,736.00 Q7,656.00 Q3,500.00

Q5,000.00

Q3,000.00

Q2,000.00

Q2,840.00

Q500.00

Q44,500.00

Q12,165.00

(2133,781 .O0

EJECUTADO Q19,884.00 Q32,119.90 Q1,260.00 Q1,685.00

(22,827.68

QOO.OO

QOO.OO

Q220.00

QOO.OO

Q39,022.54

Q12,165.00

Q109,184.12

% EJECUTADO 100.00

100.00 100.00

100.00

100.00

100.00 100.00

RUBRO Servicios personales Equipo Materiales y suministros Mantenimiento y reparaciones Documentación e información Servicios básicos TOTAL

DIFERENCIA O0

Q616.10 (26,396.00 Q1,815.00

(22172.32

Q3,000.00

Q2,000.00

Q2,620.00

Q500.00

Q5,477.46

Q12,165.00

Q24,596.88

% EJECUTADO 100.00 98.1 1 16.45 48.14

56.55

00.0

00.0

7.74

00.0

87.7

100.00

81.61

AUTORIZADO Q96,900.00

Q377,500.00 Q51,000.00

Q400.00

Q500.00

Q2000.00 Q528,500.00

EJECUTADO Q96,900.00

Q377,500.00 Q51,000.00

Q400.00

Q500.00

Q2000.00 Q528,500.00

DIFERENCIA O0

O0 O0

00

O0

O0 O0

13. ANEXOS

ANEXO 1

ARCHIVO Bl BLlOGRAFlCO

1. Abubakar, M.S., Sule, M.I., Pateh, U.U., Abdurahman, E.M. Haruna, A.K. and Jahum, B.M. 2000. In vitro snakes detoxifying action of the leaf extract of Guiera senegalensis. J. of Ethnopharmac. 69:253-257.

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ANEXO 2

ENCUESTA ETNOBOTANICA

Proyecto Fodecyt 47-99 Encuesta adoptada de Proyecto TRAMIL 1996

ENCUESTA DE CAMPO

Fecha: No. de Colecta:

A. DATOS GENERALES Nombre del informante: Edad: Ocupación: Origen:

B. USO TRADICIONAL Y ECOLOGIA DE LA PLANTA PARA EL TRATAMIENTO DE OFlDlSMO Y OTRAS PONZONAS (Pueden marcarse con un círculo varias opciones).

1. ¿Utiliza plantas medicinales? Si No -

2. Si las utiliza, indique en cuales de estas afecciones las utiliza.

I Serpientes Alacranes Arañas Gusanos Abejas Otros-

3. ¿Qué le pasa a la persona en el lugar donde fue mordida por la serpiente?

1 a. Hemorragia b. Dolor c. Edema d. Necrosis e. Infección f. Todos los anteriores

a 4. ¿Qué le pasa a todo el cuerpo de la persona cuando ha sido envenenada por la serpiente?

I a.Equimosis b.Hemóptisis c.Gingivorragia d.ExudaciÓn f.Escalofríos g.Fiebre h.Anuria i.lnflamación /Edema j.Todas las anteriores

5. 'Cuál eslson elllos nornbre(s) de las plantas utilizadas contra las afecciones?

I P1 P2 P3 P4 P5

I 6. ¿Cuál es la(s) parte(s) que utiliza de la planta?

P1 a. Raíz b. Rizoma c. Tallo d. Hojas e. Ramas f. Flor g. Fruto h. LatexISavia

I P2 a. Raíz b. Rizoma c. Tallo d. Hojas e. Ramas f. Flor g. Fruto h. LatexISavia P3 a. Raíz b. Rizoma c. Tallo d. Hojas e. Ramas f. Flor g. Fruto h. LatexISavia P4 a. Raíz b. Rizoma c. Tallo d. Hojas e. Ramas f. Flor g. Fruto h. LatexISavia

I P5 a. Raíz b. Rizoma c. Tallo d. Hojas e. Ramas f. Flor g. Fruto h. LatexISavia

1 7. ¿Cómo las usa?

8. ¿Contra qué serpiente@) o alimañas las utiliza?

9. 'Conoce otro(s) nombre(@ para la planta?

P5

10. ¿Cómo obtiene la(s) planta(@?

11. Si la(s) colecta, ¿en dónde las obtiene?

P1 a. Bosque b. Claro c. Guarnil d. Bosque de galería e. Swarnpo. f. Otro P2 a. Bosque b. Claro c. Guarnil d. Bosque de galería e. Swarnpo. f. Otro P3 a. Bosque b. Claro c. Guarnil d. Bosque de galería e. Swarnpo. f. Otro P4 a. Bosque b. Claro c. Guarnil d. Bosque de galería e. Swarnpo. f. Otro P5 a. Bosque b. Claro c. Guarnil d. Bosque de galería e. Swarnpo. f. Otro

12. ¿En qué época colecta la(s) planta@)?

P1 a. Ene-Mar b. Abr-Jun c. Jul-Sept d. Oct-Dic e. Todo el año P2 a. Ene-Mar b. Abr-Jun c. Jul-Sept d. Oct-Dic e. Todo el año P3 a. Ene-Mar b. Abr-Jun c. Jul-Sept d. Oct-Dic e. Todo el año P4 a. Ene-Mar b. Abr-Jun c. Jul-Sept d. Oct-Dic e. Todo el año P5 a. Ene-Mar b. Abr-Jun c. Jul-Sept d. Oct-Dic e. Todo el año

13. ¿Cuándo la(@ utiliza, la@) planta(s) está(n)?

P1 a. Vegetativo b. Floración c. Fructificación P2 a. Vegetativo b. Floración c. Fructificación P3 a. Vegetativo b. Floración c. Fructificación P4 a. Vegetativo b. Floración c. Fructificación P5 a. Vegetativo b. Floración c. Fructificación

14. ¿Cuál es la abundancia de la planta?

P1 a. Muy abundante b. Abundante c. Poca d. Escasa P2 a. Muy abundante b. Abundante c. Poca d. Escasa P3 a. Muy abundante b. Abundante c. Poca d. Escasa P4 a. Muy abundante b. Abundante c. Poca d. Escasa P5 a. Muy abundante b. Abundante c. Poca d. Escasa

15. ¿Conoce a otra persona que use plantas medicinales para curar estas afecciones? Si No

16. Si la respuesta es afirmativa indique el nombre y su dirección

ANEXO 3

Características de las Plantas Seleccionadas

Neurolaena lobata (Linneo) Brown R.

FAMILIA: ASTERACEAE (COMPOSITAE)

Sinónimos: Conizia lobata Linneo, Calea lobata Swartz, Neurolaena lobata (Linneo) Brown R. var. indivisa Donn. et Smith

Nombres comunes: Contragavilana, mano de tigre, salvia gavilana, yerba de cáncer (Colombia),

Capitana (Costa Rica), Árnica, hierba amarga, mano de lagarto, quina y tres puntas, k'aman, zun', guifiti (Guatemala), Conlragavilana, gavilana (Panamá)

Descripción taxonómica: Hierba perenne, erecta, de 1-4 m de alto, usualmente con ramas esparcidas, los tallos estriados, acanalados, densamente pubescentes cuando jóvenes; hojas con pecíolos cortos, pilosas en el envés, alternas acuminadas, agudas en el ápice y decurrentes en la base, con tres lóbulos dentados perfectamente definidos, 5-30 cm de largo; influorescencias corimbosa-paniculada; cabezuelas usualmente numerosas, discoides, con cerca de 20 flores; involucros de 5-6 mm de largo; filarios de 4-5 series, oblongos, redondeados en el ápice, de 1-3 nervios, a menudo contraídos y decurrentes en el pedicelo, los márgenes dentados o aserrados, escabroso-hirsutoso en la haz, con pelos cortos y densos en el envés y a menudo vetulinosos; las cabezuelas numerosas, pediceladas, discoidales; páleas lineares, obtusas, de 4-5 mm de largo; coloras de amarillo a amarillo-naranja, cerca de 4 mm de largo; aquenios negros, esencialmente glabros, alrededor de 1,5 mm de largo; vilano uniseriado, las cerdas en número de 30 o más, alrededor de 4 mm de largo, blanco amarillento (Nash, 1976).

Fitogeografía: Nativa desde el Sur de México hasta el Norte de Colombia y Venezuela, incluyendo las islas del Caribe. Se distribuye desde el nivel del mar hasta 1 450 msnm de altura. En Guatemala, se encuentra en Alta Verapaz, Chiquimula, Escuintla, Izabal, Petén, El Progreso, Quetzaltenango, Retalhuleu, San Marcos, Santa Rosa y Suchitepéquez (Nash, 1 976).

Hábitat: Crece en matorrales húmedos o muy húmedos y algunas veces en bosques de encino, comúnmente en vegetación secundaria, a menudo en campos cultivados, a orillas de ríos con arbustos, y laderas abiertas y bordes de caminos (CAB, CYTED).

1 Usos en Medicina Tradicional:

i - Usos significativos encontrados en las encuestas TRAMIL. I

Costa Rica: Diabetes: hojas en decocción por vía oral. Diarrea : hojas en decocción por vía

I oral.

Guatemala: Paludismo: hojas en decocción por vía oral; 5-8 hojas en una taza de agua hirviendo, retirar del fuego, tapar y dejar que despida. Colar y tomar bien caliente varias tazas

I al día (Girón).

- Otros usos en la cuenca del Caribe,

1 Costa Rica, Honduras: las hojas se usan para curar el paludismo y fiebre (Morton).

Antillas: las hojas se usan para curar el paludismo la fiebre y la dismenorrea (Ayensu). La planta entera sirve en el tratamiento del cancer (Manchand).

Panamá: las hojas se usan para curar la fiebre, la diabetes, el dolor de estómago, el paludismo (Gupta) y la gonorrea (Duke). La hoja y el tallo estan mezclados para el tratamiento de la hipertensión, de las afecciones hepáticas y como tónica, (Borges Del Castillo).

Guatemala: Uso de las hojas para el tratamiento de cólicos y dolor de estómago (Morton). Según Cáceres, se le atribuye propiedad antibiótica, antimalárica, aperitiva, carminativa, diurética, espamolítica, febrífuga, hipoglicémica, hipotensora y tónica. Giron et al. (1 996) han revelado también su uso en accidente ofídico.

Belice, Jamaica: Uso de las hojas como digestivas (Morton). En Jamaica, la planta se usa también como diuretica (Asprey).

Cuba: la planta entera se usa contra salpullido y varicela (Morton).

Colombia: La planta entera se usa para curar el cáncer (Manchand).

Química y actividades biológicas: Presencia de lactonas sesquiterpénicas en las partes aéreas (Ciccio). Ademas, Kerr et al. han puesto en evidencia 20 flavonoides, y Bohlmann et al. han reportado la presencia de timo1 en las raíces.

Las lactonas sesquiterpénicas, del tipo germacranolide de tipo neurolenina son activas contra P. falciparum in vitro. La fracción acuosa conteniendo las principales lactonas sesquiterpénicas mostró un IC50 de 7,2 pg/ml, mientras que las fracciones diclorometáriica y metanólica mostraron al respecto : 8,7 pglrnl y 13,8 pglml. Con una fraccion de las dos neurolenin CID, la IC50 esta de 0,236 pg/ml (Artemisinina : 0,039, y Quinina : 0,063) (Franqois).

In vivo, Franssen et al., han informado que el extracto metanólico o acuoso de N. lobata, inhibe la parasitemia de ratones infectados por P. berghei (después 7 dias de tratamiento con 750mglkg peros ; la parasitemia fue de 9,8% para el extracto acuoso (Artemisinin : 3,5%), y de 6,5% para el extracto metanólico. Además, Berger et al., han demostrado una actividad de N. lobata contra Trypanosoma cruzi.

La cantidad de lactonas sesquiterpénicas pueden cambiar en función del origen de la poblacion de N. lobata estudiada, lo que tiene consecuencias sobre su uso en medicina tradicional. Existen diferencias significativas en la cantidad de neurolenin y de furanoheliangolides entre 4 poblaciones naturales (Passreiter et al.).

Un extracto de las hojas de N. lobata administrado a ratones normoglicémicos e hiperglicémicos demuestra un efecto hipoglicemiante. En ratones normoglicémicos un efecto estadísticamente significativo se observó a 1, 2 y 4 horas después de la administración del extracto 500 mglkg peso. En ratones hiperglicémicos una dosis de 250 mglkg del extracto produjo una disminución estadísticamente significativa a las 4 horas (Gupta).

Un germacránolido aislado de N. lobata fue inactivo frente al sarcoma en ratas. De donde se deduce que es inactivo como agente antitumoral (Manchand).

El extracto de las hojas presenta una actividad insecticida (Morton). En las Indias Occidentales se emplea como barbasco (Escobar).

Eupatorium odoratum L.

FAMII-IA: ASTERACEAE (COM POSITAE)

Sinónimo: Chromolaena odorata L.

Nombres comunes: Ciguapate, curarina de monte, canutillo, mejorana, cruz de monte (Guatemala).

Rompezaraguey (Rep. Dominicana). Lang chat (Haití).

Descripción taxonómica: Arbusto muy ramoso, pubescente, erguido, de 1 a 3 m. Hojas aovadas a aovado-lanceoladas, de 5 a 15 cm, dentadas, acuminadas. Capítulos en corirnbos terminales de hasta 10 cm de ancho; brácteas del involucro imbricadas en 4 series, obtusas; flores azules o blancas (Tramil).

Fitogeografía: Se encuentra desde la Florida hasta Argentina.

Usos en Medicina Tradicional: Para los forúnculos, se aplica la hoja tibia, engrasada (grasa de oveja). Para las úlceras cutáneas, se aplica la hoja secada al fuego (Tramil). En Colombia, la plantas entera se usa para el tratamiento de tumores (Garcia-Barriga H.). En Haití, las hoja secas se usan como expectorante (Weniger et al.)

Química y actividades biológicas: en toda la planta se evidenciaron compuestos del grupo de los flavonoides; acacetina, velutina, tamarixetina, mikanina. Las partes aéreas contienen corripuestos polifenólicos, taninos, flavonoides, ácido ferúlico y terpenoides (Arene in Tramil). La hoja contiene los triterpenos beta-amirina, p y y-sitosterol, lupeol y epoxilupeol, asi como flavonoides derivados de la flavonona y de la chalcona. También contiene taninos y quercetina. El aceite esencial de la hoja contiene los derivados sesquiterpénicos (+) y (-) eupatenol (Ahmad in Tramil) .

Akah et al. demostraron en Nigeria, que la hoja tenía una actividad hemostática.

Diferentes extractos de hoja ensayados in vjtro contra Escherichia coli, Bacillus subtilis, Aspergillus nr'ger, y Staphylococcus aureus, evidenciaron que los extractos clorofórmico y acetónico presentan una actividad importante contra cepas de dichos microorganismos (Iwu in Tramil).

Dorstenia contrajetva L.

FAMILIA: MORACEAE

Nombres comunes: Contra hierba, Contra yerba.

Descripción taxonómica: Hierba acaulescente, que tiene o no un tallo muy pequeño. Las hojas numerosas tienen un pecíolo largo que puede alcanzar los 25 cm. Su forma es muy variable. El receptáhlo de la flor es de forma cuadrangular. Al madurar, las semillas son expulsadas de la flor.

Fitogeografía: En Guatemala, se encuentra de O a 1 800 msrim, en Petén, Alta Verapaz, Chiquimula, Jalapa, Santa Rosa, Escuintla, Guatemala, Sacatepéquez, Chimaltenango, Retalhuleu, Quetzaltenango, Huehuetenango. Asimismo, la planta esta presente en México y de Honduras hasta Panama en las Indias occidentales, y en el Sur de America.

Usos en Medicina Tradicional: En Guatemala, la decocción de la raíz se usa para curar cólicos (Morton), y la misma preparación se usa con las hojas para curar la diarrea (Comerford). Giron et al. (1991) reportaron el uso de las hojas en emplasto para curar la mordedura de serpiente. En Costa Rica, la raíz se usa para curar la fiebre, la diarrea y también como emenagogo (Morton). En Bolivia, las partes áreas de la planta se usan secas en infusión localmente para curar mordeduras de insectos y de serpiente (Bastien). En México la planta se usa para tratar las irregularidades menstruales (Steggerda). En las Indias Occidentales, el rizoma se usa en infusión para curar disentería, indigestión, fiebre, quemaduras y mordeduras de serpiente (Ayensu).

Química: en toda la planta, se encuentra : Bergapteno y cumarina (Terreaux et al.). En la raiz, se encuentra dorsteniol (Tovar-Miranda).

ANEXO 4

En los discos floppy adjuntos a este informe, se muestran fotografías de los procesos de extracción de principios vegetales y los ensayos biológicos realizados durante el desarrollo de esta investigación.

ANEXO 5 DETERMINACI~N DE ACTIVIDADES per se DE LOS EXTRACTOS VEGETALES

TABLA No.5. Determinación del efecto coagulante per se del extracto etanólico de D. contraien/a. - - . . . . -.

J - - - - - ( Cantidad de 1 Tiempo coagulación ( Tiempo coagulación 1 Tiempo coagulación extracto (mg) 5

2.5

* Se muestran los resultados de tres experimentos

(min-seg)* -

10 min

1.25

0.625

0.31 2

Control PBS

Control veneno B. asDer

TABLA No. 6. Determinación del efecto coagulante per se del extracto acuoso de D.

11 min

contrajetva. 1 Cantidad de 1 Tiempo coagulación 1 Tiempo coagulación 1 Tiempo coagulación

(min-seg)* -

10 min 12 seg

Coagulo débil después de 15 min lncoagulable después de 30 minutos lncoagulable después de 30 minutos lncoagulable después de 30 minutos 9 seg

(min-seg)* -

11 min

11 min 30 seg 12 min

Coagulo débil después de 15 min lncoagulable después de 30 minutos lncoagulable después de 30 minutos lncoagulable después de 30 minutos 9 seg

extracto (mg) 5

Coagulo débil después de 15 min lncoagulable después de 30 minutos lncoagulable después de 30 minutos lncoagulable después de 30 minutos 9 seg

1 l 1

(min-seg)* -

15 minutos

1.25

0.625

2.5

Control veneno B. asper

(min-seg)* 15 minutos

20 minutos 20 rriinutos

lncoagulable después lncoagulable después lncoagulable después de

de 30 minutos de 30 minutos 30 minutos

Coagulo débil a los 30 minutos lncoagulable después de 30 minutos

(min-seg)* 15 minutos

20 minutos

* Se muestran los resultados de tres experimentos

9 seg

Coagulo débil a los 30 minutos lncoagulable después de 30 minutos

Coagulo débil a los 30 minutos lncoagulable después de 30 minutos

9 seg 9 seg

TABLA No. 7. Determinación del efecto inactivante de trombina per se del extracto etanólico de N. lobata.

0.625

0.31 2

Cantidad extracto (mg) 5

2.5

1.25

0.1

TABLA No.8. Determinación del efecto inactivante de trombina per se del extracto etanólico de

Tiempo coagulación (min-seg)* lncoagulable

lncoagulable

lncoagulable

Tiempo coagulación (min-seg)* lncoagulable

lncoagulable

lncoagulable

lncoagulable

lncoagulable

Control PBS+Trombina

Tiempo coagulación (min-segs)* lncoagulable

lncoagulable

lncoagulable

Incoagulable 1 lncoagulable

I I I

2.5 1 lncoagulable ( Incoagulable ( Incoagulable 1

lncoagulable

lncoagulable

lncoagulable

* Se muestran los resultados de tres experimentos

E. odoratum.

lncoagulable

lncoagulable

6 segs 6 segs 6 segs

Cantidad extracto (mg) 5

1.25

Tiempo coagulacibn (min-seg)* lncoagulable

Tiempo coagulación (min-seg)* lncoagulable

0.625

Tiempo coagulación (min-segs)* Incoagulable

lncoagulable

0.31 2

l l I

Control ( 9 segs 18.5 segs 19 segs

lncoagulable

I I

* Se muestran los resultados de tres experimentos

lncoagulable

lncoagulable

0.1

lncoagulable

lncoagulable lncoagulable

lncoagulable

lncoagulable

lncoagulable

lncoagulable lncoagulable

ANEXO 6 DETERMINACI~N DE LA CAPACIDAD NEUTRALIZANTE DE LOS EXTRACTOS

VEGETALES

TABLA No.9, Determinación de la capacidad del extracto etanólico de D. contrajenla para neutralizar el efecto hemorrágico del veneno de B. asper.

Razónf* 1 Diámetro 1 Neutralización 1 Diámetro 1 Neutralización 1 Diámetro 1 ~ e u t r a l s ) Veneno:extracto l:lOOf** 1 :50 1 :25 1:12.5 1 :6.25 Coritrol veneno

* Se muestran los resultados de tres experimentos ** Dosis Reto: 1 ODHM (1 10 ~g de veneno) *Promedio de % neutralización: 15.93

Desviación estándar: 8.5

(1 10 vg) Control planta II 1 rna)

TABLA No.10. Determinación de la capacidad del extracto acuoso de N. lobata para neutralizar el efecto hemorrágico del veneno de B. asper.

(mm)* 1 1 1 1.39 12.6 13 13. 12.46

Razón** 1 Diámetro 1 Neutralización 1 Diámetro 1 Neutralización 1 Diámetro 1 Neutralización 1

O

(%) 11.72 8.58 O O O

O

Veneno:extracto 1:lOO 1 :50 1 :25 1:12.5 1 :6.25 Control veneno (110 VS) Control planta (1 1 mg)

(mm)* 11.17 13.2 13.18 13.9 14.1 12.46

* Se muestran los resultados de tres experimentos ** Dosis Reto: 10DHM (1 10 vg de veneno) *Promedio de % neutralización: 27.32

(Desviación estándar: 7.87)

(mm)* 11.78 13.82 17.68 17.8 17.8 16.31

O

(yo) 10.35 O O O O

("h) 27.77 15.26 O O O

(mm)* 11.11 15.0 15.3 15.15 16 14.96

(%) 25.73 O O O O

(mm)* 13.01 13.54 17.68 17.9 18 16.1 1

O

(%) 19.24 15.95 O O O

(mm)* 11.34 14.09 17.68 18 18.2 17.44

("A) 34.97 19.2 O O O

TABLA No.11. Determinación de la capacidad del extracto etanólico de N, lobata para neutralizar el efecto coagulante del veneno de B. asper.

TABLA No.12. Determinación de la capacidad del extracto etanólico de E. odoratum para neutralizar el efecto coagulante del veneno de B. asper.

* Se muestran los resultados de tres experimentos +* Dosis Reto: 2DCM (8 ~g de veneno) *Promedio: 65.31 %

(Desv. Estandar=5.4) a Dosis efectiva (DE)=I 23 seg b ~ o s i s efectiva (DE)=I 20 seg C Dosis efectiva (DE)=126 seg

Neutrali- zación

(%la 71.54 54.47 52.84 52.03 - 52.08

Tiempo Coagulación

(sea* 75 67 64 66

-1 4 O

lncoagulable

Razón* Veneno:extracto

1 :400m 1 :200 1:lOO 1 :50 1 Control veneno (8 vg) Control planta (3.2 mg)

Razónf* Tiempo Neutrali- Tiempo Neutrali- Tiempo Veneno:extracto Coagulación zación Coagulación zación Coagulación

(se9)* (%)" (seg)* ("/.lb 1 :400m 147 42.24 169 51.21

Tiempo Coagulación

(seg)* 88 67 64 64

41

lncoagulable

1:lOO 1 :50 1 :25 Control veneno (8 FLS) Control planta (3.2 mg)

Neutrali- zación

(%) 62.5 55.83 53.33 55

* Se muestran los resultados de tres experimentos +* Dosis Reto: 2DCM (8 yg de veneno) *Promedio: 47.61 %

(Desv. Estandak4.73) a Dosis efectiva (DE)=348 seg b~os ic efectiva (DE)=330 seg C ~ o s i s efectiva (DE)=324 seg

137 132 133 1 16

lncoagulable

Tiempo Coagulación

(seg)* 78 72 63 63 63 42

lncoagulable

Neutralización (%)"

61.9 57.1 4 51.21 51.21

151.21

39.36 37.93 38.2

142 141 130 110

lncoagulable

43.03 43 39.39

139 138 131 108

lncoagulable

42.9 42.7 40.43