concepto y tecnicas de ecologia

Conceptos y tcnicas en ecologa fluvial

Edicin a cargo de:

ARTURO ELOSEGI

Profesor titular de Ecologa en la Universidad del Pas Vasco

SERGI SABATER Catedrtico de Ecologa en la Universidad de Girona

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Separata del captulo 12

La biota de los ros: los microorganismos auttrofos

NORA GMEZ

JHON CHARLES DONATO ADONIS GIORGI

HELENA GUASCH PILAR MATEO

SERGI SABATER

Primera edicin: abril 2009 ISBN: 978-84-96515-87-1

los autores, 2009

de la edicin en espaol, Fundacin BBVA, 2009

CAPTULO

La biota de los ros: los microorganismos auttrofos

NORA GMEZ, JHON CHARLES DONATO, ADONIS GIORGI, HELENA GUASCH, PILAR MATEO Y SERGI SABATER

12.1. Introduccin

Las algas son organismos eucariotas o procariotas, uni o pluricelulares, sin estruc-turas de conduccin, que presentan un amplio rango de tamaos. Estos producto-res primarios habitan una gran variedad de ambientes acuticos. Algunos confor-man el plancton, que es el conjunto de organismos que viven suspendidos en la masade agua, y otros el bentos, o conjunto de organismos asociados al fondo o a plantasu objetos sumergidos (Wetzel 2001). La mayora de las algas bentnicas estn re-presentadas por cianobacterias (llamadas cianfitas en la terminologa botnica),algas verdes (clorfitas), diatomeas (bacillarifitas) y algas rojas (rodfitas). Por lacantidad de especies y la diversidad de sus formas de vida, las diatomeas son el prin-cipal grupo de algas en los ros (Sabater 2008). En relacin con el tipo de sustratoal que se asocian, distinguimos las algas epfitas (sobre la vegetacin sumergida), lasalgas epiplicas (en sedimentos blandos limoarcillosos), las algas epilticas (sobre sus-tratos duros) y las algas epipsmicas (asociadas a sustrato arenoso). En trminos ge-nerales, las algas bentnicas tienen altas tasas de renovacin y poseen estrategias vi-tales oportunistas que les permiten explotar con xito diversos hbitats (Biggs1996). Cuando los ros tienen un flujo muy lento, mayor profundidad o altas con-centraciones de nutrientes, el plancton puede alcanzar una importancia destacada.

Todos los grupos de algas fluviales presentan clorofila a como pigmento fotosin-ttico mayoritario. Las cianobacterias presentan, adems, ficocianinas y ficoeritri-

Las algas bentnicas o planctnicas son, a menudo, los msimportantes productoresprimarios en ros

219

12

na como pigmentos accesorios. Suelen frecuentar ambientes que sufren deseca-cin y aguas con altas concentraciones de nutrientes, principalmente fsforo,aunque algunas especies dominan en aguas oligotrficas. Los euglenfitos pre-sentan clorofila a y b, y suelen habitar ambientes con alto contenido de materiaorgnica disuelta. Las clorfitas comparten con los euglenfitos la presencia declorofila a y b. Algunos gneros como Oedogonium, Stigeoclonium y Cladophora pue-den observarse a simple vista, ya que alcanzan varios centmetros. Las diatomeaspresentan clorofila a y c, y fucoxantina como pigmento accesorio, que les otorgauna coloracin verde amarronada. Las rodfitas (como Batrachospermum e Hil-denbrandia) presentan clorofila a, ficocianina y ficoeritrina, siendo el predominiode esta ltima la que les otorga su caracterstica coloracin rojiza.

Tcnica 28. Muestreo y observacin de algas no diatomeas

En esta tcnica se describe cmo recolectar y acondicionar las algas bentnicaspara su observacin. Las tcnicas especficas para diatomeas se detallan en la tc-nica 29, y las especficas de cianobacterias en la tcnica 31.

MATERIAL

Viales de cristal o plstico. Esptula, cuchillo o cepillo dental. Formaldehdo al 40%. Corer de metacrilato (o jeringa sin su pice). Tijeras. Cmara Palmer-Maloney (capacidad 0,1 mL). Cmara Sedgewick-Rafter (capacidad 1 mL). Cubreobjetos y portaobjetos. Pipetas Pasteur o cuentagotas. Microscopio de investigacin.

PROCEDIMIENTOS ANALTICOS

Muestreo sobre sustratos naturalesDada la elevada variabilidad espacial de las comunidades algales, a menudo esnecesario tomar rplicas en tres puntos distintos del tramo (de tres a cincomuestras por cada punto), ubicados en zonas con similar velocidad de la co-rriente, y separados entre s por unos 50-150 m. Se recolectan muestras de sus-tratos naturales (rocas, cantos rodados o sedimentos finos) en tres puntos alo largo de un transecto longitudinal. Los puntos de muestreo deben ubicarseen la parte central del cauce o, si no es posible, cerca de los mrgenes, pero

TCNICA 28 CONCEPTOS Y TCNICAS EN ECOLOGA FLUVIAL

220

asegurando siempre que el sustrato est permanentemente sumergido. Es con-veniente realizar una caracterizacin visual del rea muestreada, reconociendola presencia de macroalgas (como Spirogyra, Batrachospermum, etc.) y de biofilmsde microalgas con distinta coloracin para asegurar un muestreo represen -tativo.

Para el muestreo de algas sobre sustratos duros de grandes dimensiones se obtie-nen las muestras de la superficie disponible ms cercana. Cuando el materialdisponible es de cantos rodados o rocas de mediana dimensin, en cada puntode muestreo se recogen al azar rocas o cantos rodados de tamao semejante. Decada roca se recolecta el material en una superficie definida, utilizando paraello una plantilla de superficie interna de 1 cm2, y anotndose la superficie to-tal muestreada. Para la remocin del material se emplean cepillos de dientes obien navajas para el caso de material incrustante. Para lavar estos utensilios seemplea agua destilada, asegurndose que queden limpios antes de ser reutiliza-dos en el prximo sitio a muestrear. El material colectado en cada muestra se in-troduce en un vial con unos 50 mL de agua del ro, preferentemente filtradapara evitar la presencia de organismos planctnicos. Posteriormente se etiquetala muestra; para su conservacin se puede utilizar formol a concentracin finaldel 4%.

Para el muestreo de sustratos blandos con predominio de limos y arcillas es acon-sejable utilizar una pipeta de 10 mL a la cual se le secciona la parte inferior, colo-cando en el extremo contrario un aspirador manual (fig. 12.1). En la parte infe-rior se le acopla un adaptador de goma o plstico que permita apoyar en lasuperficie de los sedimentos, y as asegurar que se aspire la capa superficial (pri-meros 5-10 mm), que es la fotosintticamente activa. En cada sitio de muestreo serecogen al menos 5 unidades muestrales de 1 cm2 de superficie de los sedimentos.

Las algas sobre sustratoduro se muestrean porraspado

Figura 12.1:Detalle del aspirador de sedimentos finos

LA BIOTA DE LOS ROS: LOS MICROORGANISMOS AUTOTRFICOS TCNICA 28

221

En el caso de sedimentos con predominio de arena se puede emplear un corerde metacrilato que permita la extraccin de los primeros milmetros, o bien unajeringa a la cual se le seccione la parte inferior y se mantiene el mbolo del ladocontrario para facilitar la extraccin del material.

Si dominan macrfitos o macroalgas sumergidas en el tramo, es posible muestrearla planta entera (si es pequea), o bien cortar una parte utilizando un cuchillo otijera. Se debe guardar la planta o una parte de ella en una bolsa de plstico concierre hermtico (fig. 12.2). Recolectar cinco rplicas, evitando las partes sumer-gidas de las hojas flotantes (por ejemplo, nenfares) que no reciban luz directa.Si dominan los macrfitos emergidos, las muestras se obtienen de porciones per-manentemente sumergidas, seccionndolos a partir de 2 cm de la superficie delsedimento, para as evitar que se contaminen con stos.

Para medidas cuantitativas debe secarse el macrfito o calcularse su superficiepara referir el nmero de organismos encontrados en una unidad de biomasa ode superficie. Para uniformizar el muestreo se recomienda muestrear siempre lasmismas especies de macrfitos o, en su defecto, especies de fisonoma similar.

Muestreo sobre sustratos artificialesSi la obtencin de materiales de sustratos naturales resulta inviable, se puedendisponer sustratos artificiales que imiten los naturales ms abundantes. Entreellos se cuentan cristales esmerilados, cermicos, arenas artificiales o plantasacuticas artificiales. Se debe, en todo caso, probar la eficacia de estos materialesantes de usarlos rutinariamente, para verificar que realmente sean colonizados

Figura 12.2:Acondicionamiento de tallos

de macrfitos emergentes

Las algas sobre sustratoblando se recogen de la

capa superficial

Los sustratos artificialesson una buena

alternativa al muestreode sustratos naturales


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por algas, y que su composicin se parezca a la hallada sobre sustrato natural.Cuando se utilizan pegamentos o adhesivos se debe tener especial precaucin enque no posean sustancias txicas. Dado que los sustratos artificiales suelen serms homogneos que los naturales, se puede reducir el nmero de rplicas, sien-do tres el nmero ms adecuado.

Observacin y conteo Para observar, identificar y contar las algas de la muestra se procede de diferenteforma segn se trate de diatomeas (tcnica 29) o de no diatomeas. En este ltimocaso se coloca una alcuota de muestra entre un portaobjetos y un cubreobjetos,observndolos con una magnificacin adecuada y empleando distintos tipos deiluminacin para observar mejor las estructuras (contraste interferencial, de fases,campo oscuro, etc.). Tambin se pueden emplear tinciones distintas, segn el gru-po algal, para as facilitar la identificacin (presencia de vainas, muclago, almi-dn, etc.). Asimismo, es posible elaborar preparados semipermanentes sellando elportaobjeto y cubreobjeto con esmalte para uas, lo que permitir observar lasmuestras ms tarde.

Para el conteo de las algas se pueden emplear cmaras (Palmer-Maloney o Sedge-wick-Rafter). El uso de estos utensilios depende de las caractersticas del material; sipredominan las formas filamentosas se recomienda la Sedgewick-Rafter. Se colocauna parte alcuota de la muestra previamente homogeneizada en la cmara de re-cuento. Una densidad de entre 10 y 20 clulas por campo resulta apropiada para elconteo, en caso contrario hay que diluir la muestra para facilitar la observacin. Sedeben identificar y contar 300-400 clulas. En el caso de formas filamentosas, sepuede asumir una porcin determinada, por ejemplo una longitud de 10 m, comoel equivalente a una clula; en ese caso, debe indicarse en el recuento final. Cuan-do se trata de algas muy pequeas, se recomienda colocar un volumen reducido demuestra sobre un cubreobjetos y realizar el conteo a una magnificacin de 1000X.

Para calcular la densidad de algas halladas en la cmara de recuento se debe te-ner en cuenta la cantidad de campos observados al microscopio y el volumen demuestra contenida en cada uno de ellos. Para el clculo de este ltimo se requie-re conocer la profundidad de la cmara de recuento utilizada y la superficie delcampo, que se calcula a partir del radio. Para el clculo de la densidad se empleala siguiente frmula:

donde Dspx: densidad de la especie x (clulas por unidad de superficie o volumen),Nspx: nmero de clulas de la especie x, Vt: volumen total de la muestra (mL), Vc:volumen de los campos contados (mL), y A: rea de sustrato muestreado (cm2).

Hay que identificar y contar un mnimo de 300 clulas almicroscopio


223

(12.1)DDN V

V Aspxspx t

c

=

Una alternativa al mtodo anterior consiste en utilizar una micropipeta de 50 Lpara obtener una parte alcuota de muestra, que puede montarse directamenteentre porta y cubreobjetos. Este ltimo mtodo subestima las algas de mayor ta-mao, por lo que hay que observar numerosas partes alcuotas de la muestra paraque el conteo realizado sea representativo.

Tcnica 29. Tratamiento y anlisis de diatomeas

Se describe el tratamiento de muestras de diatomeas para eliminar la materia or-gnica, y su posterior montaje en resina para su observacin al microscopio. Enla bibliografa del final del captulo pueden encontrarse ms detalles de los pro-cedimientos y protocolos, as como las principales floras recomendadas.

MATERIAL

Viales de cristal o plstico. Esptula, cuchillo o cepillo dental. Formaldehdo al 40%. Reactivos de limpieza de diatomeas: HCl diluido; H2O2 al 30% (100 vol-

menes).

Las diatomeas seclasifican en funcin de

su frstulo silceo, loque slo puede hacersetras eliminar la materia

orgnica incluida en susclulas

Figura 12.3:Secuencia de anlisis en el

estudio de diatomeas, desdeel campo hasta la

elaboracin del inventario


224

Otros reactivos de limpieza de diatomeas: H2SO4 concentrado; KMnO4 en cris-tales.

Campana de extraccin de gases adecuada para cidos. Cubreobjetos y portaobjetos. Resina artificial de alto ndice de refraccin (Naphrax, Hyrax o similar). Microscopio de investigacin con objetivo de inmersin de alta apertura nu-

mrica.

LIMPIEZA DE LAS DIATOMEAS

Para una identificacin adecuada de las diatomeas es necesario eliminar todoel contenido de materia orgnica celular o extracelular. Esto puede realizarse ex-poniendo la muestra a agentes oxidantes fuertes. En aguas ricas en carbonatoclcico se recomienda eliminar previamente los carbonatos con HCl diluido.Para limpiar los frstulos de las diatomeas se debe tratar la muestra con reactivosque permitan la digestin de la materia orgnica. Aunque hay diversas posibili-dades, se recomienda digerir la materia orgnica mediante solucin de perxi-do de hidrgeno (H2O2) al 30% (100 volmenes). En caso de materia orgnicadifcilmente digerible, como filamentosas, se puede optar por una digestinms enrgica mediante cido sulfrico concentrado (H2SO4) y permanganatopotsico (KMnO4) en cristales, aadiendo perxido de hidrgeno como catali-zador.

En los dos casos hay que limpiar los restos de reactivo mediante lavados sucesivoscon agua destilada o desionizada. Los lavados pueden realizarse mediante filtros(0,4 m de poro) o mediante centrifugacin suave.

MONTAJE DE PREPARACIONES PERMANENTES DE DIATOMEAS

Una vez digerido el material, se coloca en un vial limpio con un volumen cono-cido de agua destilada. Se agita el vial y, con una pipeta Pasteur, se deposita el ma-terial en un cubreobjetos. Una vez evaporado el lquido, se procede al montajecon resina. Se requiere de un medio de montaje con un ndice de refraccin su-perior a 1,6 (recomendado el Naphrax).

CONTEO E IDENTIFICACIN DE DIATOMEAS

Hay que contar de 300 a 500 individuos, incluyendo todas las especies previa-mente identificadas. El conteo se realiza al microscopio de luz directa o con unoque est provisto de contraste interferencial o de fases. En el anlisis de rutina esaconsejable referirse a los individuos como valvas, y no como frstulos completos,ya que, a menudo, es difcil encontrar los organismos intactos con las dos valvas.

Es conveniente realizarmontajes permanentesde diatomeas


225

Las observaciones se hacen siempre con una magnificacin de 1000X, usandoaceite de inmersin y objetivos de gran apertura numrica.

Para el conteo de las valvas se recomienda efectuar transectos a lo largo del cu-breobjeto con un desplazamiento horizontal o vertical, contando cada diatomeaque quede incluida en el campo. La identificacin de especies requiere el uso demonografas especializadas (cuadro 12.1).

Tcnica 30. Fitoplancton

En ros de bajo gradiente el fitoplancton puede alcanzar un buen desarro-llo, resultando importante su estudio. A continuacin se describe cmo debenser colectadas y acondicionadas las muestras de fitoplancton para su observa-cin.

MATERIAL

Botellas de plstico de 100 mL de volumen. Ioduro de potasio con cido actico o acetato de sodio al 70% (Lugol). Red de pesca de fitoplancton (Nytal o similar), de 25-30 m de dimetro de

poro. Columnas y cmaras de sedimentacin de Utermhl.

PROCEDIMIENTOS ANALTICOS

Para los estudios cuantitativos se extraen muestras por triplicado en el centro delcauce, sumergiendo una botella en los primeros centmetros de la columna deagua. Se recomienda que las muestras tengan un volumen de unos 100 mL de agua.La recoleccin debe evitar resuspender material del fondo. En caso de tratarse deros anchos y profundos se pueden extraer muestras del centro y de las mrgenes ya distintas profundidades. Las muestras son fijadas con dos o tres gotas de Lugol yalmacenadas en la oscuridad.

Para extraer muestras cualitativas se emplean redes de plancton con apertura deporo inferior a 35 m.

Observacin y conteo Para la identificacin taxonmica detallada se recurre a muestras cualitativas, yaque las especies raras slo aparecen de forma espordica en las muestras cuanti-tativas. Para las diatomeas se puede emplear la tcnica 29 y para las no diato-meas la tcnica 28.

Se puede muestrear elfitoplancton de formacuantitativa mediante

botellas, o de formacualitativa con el uso

de redes


226

Las muestras de fitoplancton se disponen en cmaras tubulares de sedimenta-cin que son observadas en un microscopio invertido. La eleccin del volumende la cmara de sedimentacin depende de la concentracin de fitoplancton enla muestra. Si hay ms de 10 000 cel/mL las cmaras poco profundas (< 5 mL)pueden ser adecuadas. En caso contrario, se recomienda utilizar cmaras de se-dimentacin mayores. El tiempo de sedimentacin requerido se calcula consi-derando que es necesario decantar 2 horas por cada cm de altura que tenga lacmara. La cantidad de campos que se debe contar depende de la frecuencia delas especies presentes en la muestra; es recomendable que se contabilicen al me-nos 100 individuos de la especie ms frecuente. Los datos se expresan encel/mL, de acuerdo con la ecuacin 12.2. En el caso de especies filamentosas enlas cuales las clulas sean de difcil observacin, se puede asumir que la unidadcorresponda a una porcin determinada del filamento equivalente a una clula,

Cuadro 12.1:Segundas referenciasbibliogrficas de utilidadpara identificar las algas de ambientes fluviales

Las muestras de botellase concentran porsedimentacin


227

Anagnostidis y Komrek 1985Anagnostidis y Komrek 1988Anagnostidis y Komrek 1990

Bicudo y Picudo 1970

Coesel 1987

Comas 1989aComas 1989bComas 1990Comas 1992Comas 1996

Croasdale et al. 1983

Geitler 1932

Hegewald et al. 1980

Iltis 1984

Komrek y Anagnostidis 1986Komrek y Anagnostidis 1989Komrek y Anagnostidis 1999Komrek y Anagnostidis 2005Krammer 2002Krammer y Lange-Bertalot 1986, 1991Krieger y Bourrelly 1956Lange-Bertalot 1993, 2001Parra et al. 1982aParra et al. 1982bParra et al. 1982cParra et al. 1982d

Rivera et al. 1982

Steinitz-Kankan et al. 1982

Tell y Conforti 1986

Therezien 1985

Whitton, 2002

Yacubson 1980

por ejemplo, 10 m. La magnificacin de observacin recomendable es de 400Xo superior. La densidad algal de calcula mediante la siguiente ecuacin:

donde C: nmero de organismos contados, At: rea total de la cmara de sedi-mentacin (mm2), Ac: rea de un campo (mm

2), Tc: nmero total de campos con-tados, y V: volumen de muestra sedimentado (mL).

Para la determinacin de fitoplancton se usa una gran variedad de manuales ymonografas (cuadro 12.1).

Tcnica 31. Recoleccin y anlisis de cianobacterias

En determinados ros las cianobacterias forman colonias macroscpicas (fig. 12.4a)o tapetes, pero normalmente aparecen como parte de los biofilms sobre piedras osedimentos (fig. 12.4b).

MATERIAL

Viales de cristal o plstico. Esptula, cuchillo o cepillo dental. Formaldehdo al 40%. Medios de cultivo (descritos en el texto). Campana de gases que permita condiciones de esterilidad. Autoclave. Placas de Petri. Parafilm. Cmara Neubauer. Microscopio de investigacin con contraste de fases o epifluorescencia.

Figura 12.4:Colonias de cianobacterias

(a) o cianobacteriasformando parte de un

biofilm mixto (b)


228

/mL /N cel CA A T Vt c c = (12.2)

a b

PROCEDIMIENTO

Para muestrear cianobacterias del biofilm, se recogen al menos tres piedras dellecho del ro por punto de muestreo. stas deben estar sumergidas, tener un cier-to tapiz homogneo en la cara superior, y ser de tamao suficiente como para po-der realizar el raspado del biofilm (de entre 4 y 5 cm de dimetro mnimo). Ade-ms, es necesario que el sustrato componente admita la extraccin del tapiz sinromperse, y que sea representativo de la zona. Seleccionar una parte uniforme de

Las cianobacterias semuestrean por raspadodel sustrato

Figura 12.5:Secuencia recomendable en el anlisis decianobacterias desde su recoleccin hasta su identificacin


229

la superficie rocosa, que permita un raspado fcil (4-16 cm2). Con un cepillo decerdas no muy duras se raspa la superficie elegida. Todo el material utilizadodebe ser previamente lavado con etanol para eliminar contaminaciones, y aclara-do despus con abundante agua destilada. El material extrado se resuspende en5-10 mL de agua del ro o de medio de cultivo para cianobacterias, si se quierenaislar las mismas segn se especifica ms adelante.

Para la posterior observacin al microscopio, se separa una alcuota y se fija conformol a una concentracin final del 4% (fig. 12.5).

CULTIVOS DE CIANOBACTERIAS

Los cultivos de cianobacterias son necesarios para ciertos grupos de taxonomaproblemtica, cuya identificacin depende de conocer el ciclo vital, o para la ob-servacin de caractersticas morfolgicas especficas, que se pueden propiciar enmedios artificiales.

Composicin de los medios de cultivoSe pueden encontrar muchas recetas de medios de cultivos para el crecimiento ymantenimiento de cianobacterias en laboratorio. La eleccin de un medio de cul-tivo determinado depende de los objetivos planteados. En el caso que se trate deidentificar las cianobacterias de un hbitat determinado, se cultivan en un mediode caractersticas semejantes a las encontradas en el ro estudiado. As, para cia-

Algunos grupos decianobacterias se deben

cultivar para poder seridentificados

Cuadro 12.2:Composicin del medio de

cultivo Chu No.10 Dmodificado


230

Componentes Concentracin

KH2PO4 0,032 mM

MgSO47H2O 0,101 mM

Ca(NO3)24H2O* 0,250 mM

NaHCO3 0,188 mM

FeCl36H2O 0,009 mM

Na2EDTA 0,010 mM

Microelementos

H3BO3 11,560 M

MnCl24H2O 0,229 M

ZnSO47H2O 0,193 M

Na2MoO42H2O 0,028 M

CuSO45H2O 0,079 M

CoSO47H2O 0,037 M

* Para medio sin nitrgeno, se reemplaza este componente por CaCl22H2O a una concentracin de 0,25 mM.

nobacterias de ecosistemas fluviales hay que tener en cuenta, sobre todo, la con-centracin de nutrientes.

El medio Chu No. 10 D modificado (Chu 1942) es bajo en nutrientes, muy til para di-lucidar los rasgos morfolgicos, citolgicos y fisiolgicos caractersticos de ciertaspoblaciones que viven en medios oligotrficos (por ejemplo, Rivulariaceae). Ade-ms, si no se le aade fuente alguna de nitrgeno, se consigue el crecimiento decianobacterias fijadoras de nitrgeno atmosfrico. Su composicin en sales se mues-tra en el cuadro 12.2. El medio se tampona con HEPES [cido 4-(2 hidroxietil)-1-piperacinil-etanosulfnico] a una concentracin 2,5 mM y se ajusta el pH a 7,8.

El medio BG11 (Rippka et al. 1979) utiliza concentraciones de nitrato muy altas yconcentraciones de fsforo relativamente altas, salvo en el caso del BG110 (mediosin nitrgeno), donde no se aade fuente alguna de nitrgeno, potenciando asel crecimiento de las cianobacterias fijadoras. La composicin y concentracin desales se muestran en el cuadro 12.3. El medio se tampona con HEPES a una con-centracin 2,5 mM y se ajusta el pH a 7,8.

El medio de Allen y Arnon (Allen y Arnon 1955) contiene altas concentraciones de ni-tratos y muy altas de fsforo. Este medio se ha diseado para conseguir altos crecimientoscelulares. La composicin y concentracin de sales se muestran en el cuadro 12.4.

Cuadro 12.3:Composicin del medio de cultivo BG11

En funcin de losobjetivos se pueden usardistintos medios decultivo de cianobacterias


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K2HPO43H2O 0,180 mM

Na2-EDTA 0,003 mM

MgSO47H2O 0,300 mM

CaCl22H2O 0,250 mM

NaNO3* 17,650 mM

cido ctrico 0,029 mM

Citrato frrico amnico 0,020 mM

Na2CO3 0,190 mM

Microelementos

H3BO3 46,00 M

MnCl24H2O 9,10 M

ZnSO47H2O 0,77 M

Na2MoO42H2O 1,60 M

CuSO45H2O 0,32 M

CoSO47H2O 0,17 M

* Para el medio BG110 (sin nitrgeno), se desestima este componente.

Los medios se preparan en condiciones de esterilidad, a partir de reactivos de altapureza, agua destilada y material previamente esterilizado. Para cada uno de losmedios, se puede aadir adems el antibitico cicloheximida con una concentra-cin final en el medio de 0,1 g/L. Se trata de un antibitico que afecta a clulaseucariotas, impidiendo as el crecimiento de hongos, levaduras y algas verdes, loque facilita el crecimiento de las cianobacterias, hacindolas ms competitivas. Lapreparacin de la cicloheximida requiere usar guantes y mascarilla, puesto que esnocivo para el ser humano. Se esteriliza utilizando filtros estriles de 0,2 m de di-metro de poro. La cicloheximida se deteriora fcilmente a altas temperaturas, porlo que se aade al medio una vez que est fro tras autoclavarlo.

Preparacin de medios de cultivo con agar en placas de PetriPara poder aislar las cianobacterias y estudiar sus caractersticas con fines taxo-nmicos, es necesario sembrar el material extrado del biofilm en placas de Petricon medio de cultivo agarizado, que sirve a las cianobacterias de sustrato sobre elque crecer. Para ello, se utiliza medio de cultivo lquido y se combina con agar pu-rificado (1,5% concentracin final), con el fin de que adquiera un estado slido.

Para la preparacin de medios slidos se ha de evitar esterilizar el medio de cul-tivo BG11 con el agar, ya que se producen compuestos txicos. Para otros medios

Cuadro 12.4:Composicin del medio de

cultivo de Allen y Arnon


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K2HPO43H2O 2,00 mM

NaCl 4,00 mM

MgSO47H2O 1,00 mM

CaCl22H2O 0,50 mM

Na2-EDTA 76,75 M

FeSO47H2O 69,16 M

NaNO3* 6,25 mM

KNO3* 6,25 mM

Microelementos

H3BO3 46,000 M

MoO3 1,250 M

MnCl24H2O 9,100 M

ZnSO47H2O 0,770 M

NH4VO3 0,196 M

CuSO45H2O 0,320 M

CoCl26H2O 0,170 M

* En el caso del medio sin nitrgeno, se desestiman estos componentes.

quiza no sea el caso, pero sera aconsejable esterilizar el medio de cultivo y el agaren soluciones separadas al doble de su concentracin, y mezclarlas slo despusde enfriar alrededor de 45 C.

Siembra en placas de PetriDebe sembrarse en un medio de cultivo y en condiciones lo ms parecidas al me-dio natural, o favorecer el crecimiento con unas condiciones ms idneas, paraas obtener una mayor efectividad en el aislamiento. Cuantas ms variaciones serealicen ms probable ser obtener un mayor nmero de especies. As, se reco-mienda sembrar en distintos medios de cultivo. El procedimiento se describe acontinuacin:

1. Agitar bien la muestra del material recolectado y tomar 0,3 mL que se aadenen la placa de Petri con el medio de cultivo agarizado.

2. Extender con un asa de siembra de vidrio de manera uniforme por toda la su-perficie de la placa.

3. Una vez completada la siembra, tapar cada placa, sellndola con parafilm y de-jarlas boca arriba un da hasta que no haya lquido sobre las placas. Posterior-mente, darles la vuelta y dejar crecer las cianobacterias sembradas. Los reg-menes de temperatura y luz deben acercarse a las condiciones de su hbitatnatural. Si no se dispone de un incubador se dejan a temperatura ambiente,en el laboratorio.

4. Dejar crecer durante 30-40 das. Realizar un seguimiento para que las coloniasno lleguen a solaparse.

La siembra y la preparacin de los medios de cultivos han de realizarse en cam-panas estriles de flujo continuo de aire. Si no se dispone de este material, debenrealizarse cerca de la llama de un mechero para evitar contaminaciones por bac-terias o por eucariotas.

Aislamiento de cianobacteriasUna vez transcurrido el perodo de incubacin, observar en las placas, mediantela lupa binocular, las diferentes colonias que han crecido. Seleccionar y tomarmuestras de las mismas con un capilar muy fino, fabricado estirando el extremode una pipeta Pasteur bajo la llama de un mechero Bunsen. La muestra se colo-ca en un portaobjetos, se aade una gota de agua y el cubreobjetos, y se observaal microscopio. Una vez observada la colonia y la estirpe de cianobacteria, se re-pite la operacin, sembrando el pequeo inculo obtenido en otra placa de Pe-tri con el mismo medio de cultivo. Se coloca en el incubador y se deja crecer. Unavez la estirpe crece bien en medio agarizado, se siembran esas colonias en mediode cultivo lquido, del que se podrn tomar despus muestras para estudiar suscaractersticas taxonmicas.


233

Observacin y recuento de las muestras fijadasEl anlisis cuantitativo se realiza observando al microscopio las muestras fijadascon formol. Se toma una alcuota de la muestra previamente homogeneizada y semonta en una cmara Neubauer. Se cuentan de 300 a 500 clulas de las especiespreviamente identificadas, utilizando una magnificacin 1000X y, si es necesario,contraste de fases. Es posible tambin emplear un microscopio con lmpara de epi-fluorescencia para facilitar el recuento. La autofluorescencia diferencial de las fi-cobiliprotenas (al excitarse con luz verde) permite visualizar y contar fcilmentelas cianobacterias presentes. El recuento de cada muestra se realiza por duplicado.

Tcnica 32. Pigmentos fotosintticos

La estima de pigmentos fotosintticos puede llevarse a cabo mediante espectro-fotometra (tcnica que se detalla a continuacin) y por cromatografa. La tcni-ca ms comn en este segundo caso es la cromatografa lquida de alta presin(HPLC). sta requiere un equipo adecuado (vase tcnica 23) y patrones quepermitan la identificacin de cada uno de los pigmentos que aparecen en los cro-matogramas. Su exactitud y precisin (permite la correcta identificacin de losproductos de degradacin de las clorofilas y los distintos carotenoides) hacenaconsejable las medidas con HPLC cuando se requiera distinguir los pigmentos.Se recomienda al potencial interesado que consulte las obras de Zapata et al.1987, Millie et al. (1993), y de Schmid y Stich (1995).

Tcnica 32a. Pigmentos fotosintticos por espectrofotometra

El anlisis de clorofila permite estimar la cantidad de pigmentos fotosintticos(que se estima como parte mayoritaria de la clorofila a). A la vez, este clculo esrepresentativo de la biomasa de los productores primarios (algas). Dadas las ca-ractersticas diferenciales de los compartimentos planctnico y bentnico, la me-todologa debe ser distinta, aunque el material y los procedimientos son comunesen muchos de los pasos.

MATERIAL

Cubo de plstico (2-5 L) para recoger agua del ro para clorofilas planctnicas. Jeringuilla de 60 mL y portafiltros Millipore (Swinnex-47). Papel de aluminio. Botes de plstico para recoger las muestras bentnicas. Cuadrado de superficie interna de 1 cm2 que permita definir un rea de mues-

treo sobre sustratos slidos.

Las cianobacterias seidentifican al

microscopio de contrastede fases o de

epifluorescencia

La clorofila a se utilizacomo indicador de la

biomasa algal

La macro 12.1 permitecalcular el contenido en

clorofila de muestrastanto planctnicas como

bentnicas


234

Pinzas de plstico. Filtros de fibra de vidrio (Whatman GF/F). Bao de ultrasonidos. Pipetas automticas. Acetona al 90%. Medidor de luz en el campo y en el laboratorio. Espectrofotmetro de doble haz. Cubetas de cuarzo de 1 y 5 cm. Nevera porttil.

ANLISIS DE CLOROFILAS BENTNICAS

Recoleccin de las muestrasRecolectar muestras de los sustratos naturales (piedras, rocas) en tres puntos distin-tos del ro no afectados por las condiciones litorales, y separados entre ellos unos50-150 m. Si no hay piedras o es imposible recogerlas, obtener las muestras de la su-perficie disponible ms cercana. En cada punto se recogen al azar cinco sustratos s-lidos de tamao semejante. De cada uno se recolecta el material en una superficiedefinida, utilizando para ello un cuadrado de superficie interna de 1 cm2. Hay querecoger el material suficiente que permita obtener una medida correcta de clorofi-la. Deberemos anotar el nmero de veces que se ha recogido material mediante elcuadrado. Anotar tambin la presencia de herbvoros en las muestras recogidas.

Etiquetar las muestras y guardarlas en viales de plstico en fro (nevera) y en la os-curidad (recubierto con hoja de aluminio) hasta su anlisis en el laboratorio. Unavez en el laboratorio, congelar la muestra hasta el anlisis, a ser posible a 20 C.

Para muestrear sustratos blandos y epifiton seguir la tcnica 28. Los sedimentosson sonicados durante 2 minutos para facilitar el desprendimiento de los espec-menes adheridos a los mismos, repitiendo este procedimiento por lo menos tresveces. El sobrenadante es filtrado por un filtro Whatman GF/F.

En el caso del epifiton colocar la macrfita en agua destilada y sonicarla tres ve-ces durante 2 minutos. Filtrar el lquido con material epiftico mediante un filtroWhatman GF/F.

Extraccin de la clorofilaDescribimos a continuacin un procedimiento de extraccin y lectura de pig-mentos cloroflicos sin correccin por feopigmentos. Existen otros mtodos (aci-dificacin del extracto; Lorenzen 1967) que incluyen esta correccin, aunque subaja fiabilidad en muestras naturales desaconseja su uso. Debe aclararse que la es-tima con acidificacin es aproximativa y, de buscarse una estima ms exacta de la

Las muestras parapigmentos fotosintticosse extraen igual que lasde comunidades

La tcnicaespectrofotomtrica queincluye correccin parafeopigmentos es pocofiable


235

representacin de los pigmentos derivados de la clorofila, es preciso usar croma-tografa lquida de alta presin (HPLC). El procedimiento a seguir comprendelos pasos siguientes:

1. Aadir de 5 a 10 mL de acetona al 90% en cada vial hasta cubrir totalmente lamuestra.

2. Guardar la muestra y el extracto en la nevera de 8 a 12 horas. El disolvente or-gnico extraer la clorofila de las muestras.

3. Someter las muestras a un bao de ultrasonidos durante 2 minutos.4. Efectuar una segunda adicin de 5 mL de acetona al 90% y homogenizar la

muestra mecnicamente hasta la total extraccin de la clorofila.5. Filtrar los extractos (Whatman GF/C) para disminuir la turbidez.6. Leer las absorbancias a 665 y 750 nm, mediante un espectrofotmetro. La clo-

rofila a absorbe principalmente a los 665 nm. El valor en 750 nm se utiliza paradescontar la turbidez de la muestra, que no debera ser mayor a 0,015. El va-lor de la absorbancia a 430 indica concentracin de carotenoides y otros pig-mentos accesorios.

7. Estimar las concentraciones de clorofila mediante la expresin emprica si-guiente:

donde Chl a: clorofila a (mg/m2), Ax: absorbancia a x nm, V: volumen del ex-tracto (mL), L: longitud de la cubeta del espectrofotmetro (cm), y S: super-ficie de sustrato muestreado (cm2).

ANLISIS DE CLOROFILA PLANCTNICA

El compartimento planctnico corresponde al asociado a la columna del agua.Por tanto, previo a su anlisis, debe ser filtrado o sedimentado.

Recoleccin de muestrasRecoger 2-5 litros de agua, en dos puntos distintos del ro, distantes entre ellos 50-150 m, siempre en la zona de agua libre y, si es el caso, en coincidencia con lasmuestras de fitoplancton que se recojan. Filtrar el agua recogida en el campo, conuna jeringuilla de 60 mL, un portafiltros Millipore (Swinnex-47) y filtros WhatmanGF/F. Guardar los filtros en viales, en fro (4 C) y en la oscuridad hasta su anlisis.

Extraccin y anlisis de las muestras en el laboratorio1. Poner 10 mL de acetona al 90% en los viales hasta cubrir bien el filtro.2. Guardar las muestras en la nevera de 8 a 12 horas. El disolvente orgnico ex-

traer la clorofila de las muestras.


236

A V / ( ) (11 4 665Chl a A= , -- 75 L0 (12.3)S )

3. Someter las muestras a ultrasonidos durante 2 minutos.4. Aadir 10 mL de acetona al 90%, y disponer el filtro en un homogenizador

hasta su total desintegracin.5. Filtrar las muestras (Whatman GF/F) para disminuir la turbidez de la misma.6. Leer las absorbancias a 630, 645, 665 y 750 nm, mediante un espectrofotme-

tro. La cubeta del espectrofotmetro suele ser de 1 o 5 cm de anchura; estedato es relevante y debe incorporarse a la ecuacin.

7. Estimar las concentraciones de clorofila mediante la siguiente ecuacin:

donde Chl a: clorofila a (g/L), Ax: absorbancia a x nm, Ve: volumen del ex-tracto (L), Vf: volumen filtrado (L), y L: longitud de la cubeta (cm).

ANLISIS DE FICOBILIPROTENAS BENTNICAS

Extraccin y cuantificacin Se pueden llevar a cabo dos mtodos distintos. Uno de ellos, basado en la ex-traccin con tolueno, mide la ficocianina como pigmento mayoritario de las fi-cobiliprotenas. Este mtodo es ms rpido y sencillo, pero el tolueno es un di-solvente orgnico txico, por lo que debe manipularse siempre con guantes y encampana extractora. Por este motivo, explicamos un segundo protocolo de ex-traccin y cuantificacin de ficobiliprotenas basado en el glicerol.

A. Extraccin con tolueno1. Tomar una parte alcuota de 2 mL del material en tubos Eppendorf y aadir

100 L de tolueno, agitando enrgicamente durante 90 segundos.2. Mantener en la oscuridad, a temperatura ambiente, durante 4 horas.3. Centrifugar los tubos Eppendorf a 14000 rpm durante 10 minutos para sedi-

mentar los restos celulares.4. Leer la absorbancia del sobrenadante a 620 nm, en una cubeta de 1 cm de an-

chura.5. Estimar la concentracin de ficocianina mediante la ecuacin 12.5 (Blumwald

y Tel-Or 1982):

donde PC: concentracin de ficocianina c (g/mL), y A620: absorbancia a 620 nm.

B. Extraccin con glicerol1. Tomar una alcuota de 1 mL de la muestra y centrifugar a 6-7 C, 10 000 rpm

durante 10 minutos.

La clorofila se mide conel espectrofotmetro

El mtodo del tolueno essencillo aunque debeoperarse con cuidado


237

(12.4)/ L( ),g/L 11 6 1 31-665 75Chl a A A A( ) , , = 0( ) 6645 75 63 75- -14A A A Ve Vf0 0 00( ) ( )

135 62PC = 0 (12.5)A

2. Descartar el sobrenadante, observando que el precipitado quede seco, y aa-dir 100 L de glicerol.

3. Con ayuda de un homogenizador para tubos Eppendorf, homogeneizar lamezcla, sometindola posteriormente a un bao de ultrasonidos durante 3 mi-nutos.

4. Transcurrido este tiempo, dejar reposar a 4 C y en oscuridad durante un m-nimo de 1 hora.

5. Someter las muestras a choque osmtico aadiendo 900 L de agua destilada.6. Volver a sonicar las muestras durante 1 minuto.7. Centrifugar nuevamente a 6-7 C, 10000 rpm durante 10 minutos. 8. Analizar en el espectrofotmetro el sobrenadante, midiendo a 750, 652, 615 y

562 nm, mediante cubetas de 1 cm de anchura.

Para asegurar la extraccin del total de ficobiliprotenas, al precipitado se le rea-lizan extracciones sucesivas hasta que no tenga coloracin verde azulada.

Calcular la concentracin de ficobiliprotenas mediante la frmula tricromticade Bennett y Bogorad (1973) (ecuaciones 12.6 a 12.8).

donde PC: concentracin de ficocianina c (g/mL), APC: concentracin de alo-ficocianina a (g/mL), PE: concentracin de ficoeritrina r (g/mL), A615: absor-bancia a 615 nm, A652: absorbancia a 652 nm, y A562: absorbancia a 562 nm.

Tcnica 32b. Estima de la eficiencia fotosinttica y de la biomasa algal mediante fluorimetra

En los ltimos aos se han desarrollado diversas tcnicas basadas en la fluori-metra. Este es un mtodo alternativo para estudiar la produccin primaria ydeterminar la biomasa algal. Existen fluormetros de pulsos de amplitud modulada(como Phyto-PAM de Walz) que, excitando la clorofila simultneamente con luzde distintas longitudes de onda (470, 525, 640 y 665 nm), permiten evaluar labiomasa de los distintos grupos algales presentes en una muestra. La precisinde los resultados depende de la complejidad de la muestra estudiada, y de la ca-


238

(12.6)474 /5 34 615 652PC A A= 0, ,( )

(12.7)652APC A= 0 0 0, ,2 8 /5 9 615A( )

(12.8)2 41 849 /9 62 562PE A PC APC= , , ,( ) ( ) 0

libracin previa del aparato con patrones especficos, aspectos que no se desarro-llarn aqu.

El fluormetro de pulsos de amplitud moderada (PAM) utiliza tres tipos de luzdistintos (modulada, actnica y de saturacin) que permiten analizar la cintica de in-duccin de fluorescencia en organismos fotosintetizadores. Combina as la posi-bilidad de provocar el efecto Kautsky, mediante la realizacin de pulsos de luz sa-turante, con la medida de la emisin de fluorescencia (Schreiber 2004, Schreiberet al. 2002). Dicha combinacin es posible gracias a un sistema selectivo de am-plificacin de los pulsos, con los que se registra slo la fluorescencia generada porlos pulsos de luz de medida.

El uso del PAM permite estudiar varios parmetros relacionados con la fotosntesis.Entre ellos, el rendimiento fotnico efectivo, PSII, tambin llamado eficiencia fotoqumicadel PSII por fotn absorbido, que ha sido utilizado para calcular la produccin primaria.Este parmetro proporciona una estima de la eficiencia en el transporte de electro-nes en el aparato fotosinttico. La tasa total de transporte de electrones (ETR) se obtienemultiplicando el rendimiento fotnico efectivo por el nmero de fotones absorbi-dos, y debera guardar una relacin de proporcionalidad con la tasa de fijacin decarbono. Dicha proporcionalidad se mantiene en condiciones de luz prximas a lasaturacin, pero pierde linealidad a irradiancias elevadas. En estas circunstancias seobtienen valores crecientes de tasa de transporte de electrones que no siempre co-rresponden a un incremento similar en la fijacin de carbono, hecho que desacon-seja la utilizacin del PAM como sustitutivo de otras estimas de produccin primaria.

MATERIAL

Fluormetro de pulsos de amplitud modulada. Soporte especfico de sujecin de la muestra con distancia fija al lector de

fluorescencia.

ESTIMA DE LA BIOMASA ALGAL MEDIANTE LA FLUORESCENCIA BASAL (F0)

Previa calibracin del fluormetro, se estima la biomasa algal sobre la base de losvalores de fluorescencia basal (F0), que es la que emite la clorofila sin excitacinpor la luz. Esta medida puede ser equivalente a la estima de clorofila, aunque nocompletamente en biofilms gruesos o en tejidos multicapas.

Procedimiento1. Fijar los parmetros de medida del aparato.2. Colocar un soporte que permita mantener constante la distancia entre la mues-

tra y el sensor.

El fluormetro de pulsosde amplitud moduladapermite determinar elcontenido de pigmentosde forma no intrusiva

La fluorescencia basalsirve para estimar lacantidad de clorofila


239

3. Adaptar la muestra a la oscuridad durante un mnimo de 3 minutos.4. Medir la emisin de fluorescencia a 470 nm para las algas verdes, a 520 nm

para las diatomeas y a 645 nm para las cianobacterias.

ESTIMA DE LA EFICIENCIA FOTOSINTTICA SOBRE LA BASE DEL RENDIMIENTOFOTNICO EFECTIVO: PSII

Para estimar el rendimiento fotnico es esencial controlar la temperatura y me-dir la luz incidente de forma precisa, dado que ambos parmetros afectan de ma-nera sustancial a la medida realizada. As pues, las medidas se realizan a 25 C, encondiciones de saturacin de luz, es decir, entre 80 y 350 E/m2s (segn la his-toria lumnica de las comunidades que se consideren).

Procedimiento1. Fijar los parmetros de medida del aparato.2. Colocar un soporte que permita mantener constante la distancia entre la

muestra y el sensor.3. Aplicar un pulso de saturacin sobre una muestra iluminada y obtener el ren-

dimiento fotnico efectivo. Se recomienda realizar un mnimo de tres medi-das por muestra y utilizar un mnimo de tres muestras por punto de muestreo.

4. El rendimiento fotnico efectivo se calcula mediante la ecuacin 12.9:

donde PSII: rendimiento fotnico efectivo, F: emisin de fluorescencia basal, yFm: emisin mxima de fluorescencia provocada por un pulso de luz saturantesobre una muestra iluminada.

12.2. Bibliografa

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comunidad


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= ( / PSII Fm F m (12.9)F)

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concepto y tecnicas de ecologia

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