compromisos ambientales voluntarios - snifa

Compromisos Ambientales Voluntarios

ESTUDIO DE ECOSISTEMAS EXTREMÓFILOS

Informe Técnico N°3

Actividad 4. Analizar el Metagenoma de las lagunas ubicadas en los

sistemas Aguas de Quelana, Soncor, La Punta-La Brava y Peine.

En relación con lo propuesto en la Adenda 5 Capítulo 5 del Anexo 2 del proyecto: “EIA

Modificaciones y Mejoramiento del Sistema de Pozas de Evaporación Solar en el Salar

de Atacama (RCA N°21/2016)”.


Albemarle Ltda. Planta Salar de Atacama Informe Técnico N°3. Análisis de Metagenomas. Estudio de Ecosistemas Extremófilos

i

ÍNDICE

1 RESUMEN ............................................................................................................. 1

2 INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 3

3 OBJETIVOS .......................................................................................................... 6

3.1 Objetivo General ................................................................................................ 6

3.2 Objetivos Específicos ......................................................................................... 6

4 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 7

4.1 Descripción de área de estudio .......................................................................... 7

4.2 Diseño de muestreo ........................................................................................... 9

4.3 Metodología de muestreo y análisis del metagenoma ...................................... 10

5 RESULTADOS .................................................................................................... 16

5.1 Secuenciación .................................................................................................. 16

5.2 Análisis taxonómico.......................................................................................... 16

5.3 Análisis funcional ............................................................................................. 17

5.4 Rodopsinas y comparación con otros Metagenomas ....................................... 18

6 DISCUSIÓN ......................................................................................................... 20

7 CONCLUSIONES ................................................................................................ 23

8 REFERENCIAS ................................................................................................... 24

9 ANEXOS ............................................................................................................. 28

9.1 Control de cambios del documento .................................................................. 28

9.2 Protocolo de extracción de ADN....................................................................... 28



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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 2-1 Tipos de Ecosistemas Microbianos Extremófilos (EME) identificados en el

Salar de Atacama. Fuente: Elaboración propia. ............................................................ 4

Figura 4-1 Área de estudio en el Salar de Atacama, región de Antofagasta. Se

especifican las lagunas comprendidas en el área de estudio. Área demarcada (cuadro

azul) corresponde al área del cual se presentan los análisis. Fuente: Elaboración

propia. .......................................................................................................................... 8

Figura 4-2 Izquierda: Mapa de Laguna La Brava, mostrando el sitio de recolección de

muestra. Derecha: Vista del tapete microbiano. Inset: Corte del tapete microbiano. ..... 9

Figura 4-3 Muestra de Tapete microbiano de la laguna La Brava, donde A) Detalles de

estratos funcionales, B) vista general y C) vista tipo de EME. Fuente: Elaboración

propia. ........................................................................................................................ 10

Figura 5-1 Abundancia taxonómica a nivel de filo en una muestra de Tapete

Microbiano de la laguna La Brava, en base a dos métodos. ....................................... 17

Figura 5-2 Análisis funcional de ciclos bioquímicos. A) Taxonomía de organismos

relacionados a cada proceso y B) Abundancia y asignación taxonómica de marcadores

de genes de vías de fijación de carbono. .................................................................... 18

Figura 5-3 A) Agrupamiento de metagenomas de distintos ambientes de acuerdo con

la abundancia de distintos tipos de rodopsinas y B) Variación en la proporción de

Xantorodopsinas entre distintos grupos. ..................................................................... 19



1

1 RESUMEN

El Salar de Atacama se caracteriza por ser uno de los ambientes más extremos del

planeta, con una amplia variabilidad en sus condiciones ambientales. No obstante,

estas condiciones a pesar de ser extremas para algunos organismos, resultan

apropiadas para el desarrollo de distintos tipos de Ecosistemas Microbianos

Extremófilos (EME), los que han sido identificado en los distintos sistemas hídricos del

salar y han sido agrupados en 3 grandes tipos: Tapetes Microbianos, Microbialitos y

Evaporitas, siendo estos de gran relevancia científica y patrimonial, planteándose la

necesidad de crear colecciones de muestras con sus respectivos metagenomas para

resguardar este patrimonio (CEA, 2017).

Debido a lo anterior y la relevancia que adquiere ampliar el conocimiento acerca de

estos organismos, se lleva a cabo el “Estudio de Ecosistemas Extremófilos”, como

parte de los Compromisos Ambientales Voluntarios (CAV) de la empresa Albemarle

Ltda. Dentro de este estudio se encuentra la obtención del Metagenoma, que

corresponde a una biblioteca de información de todos los genes presentes en un

ecosistema, basado en secuenciación masiva a través de la plataforma Illumina Hi-

Seq, lo que permite conocer la asignación taxonómica y relación metabólica. Esta

técnica se basa según lo realizado por Rasuk et al., 2014, Rascovan et al., 2016 y

Kurth et al., 2017 y se detalla paso a paso en el capitulo de metodología.

El presente documento corresponde a un Informe Técnico N°3 donde se presenta el

análisis metagenómico de una muestra de Tapete Microbiano extraída desde la laguna

La Brava. Se comenzó el estudio por este tipo de EME, debido a que es el tipo más

representativo del salar de Atacama y al desarrollarse en la interfase entre el agua y

sustratos no saturados, son más susceptibles a los cambios en las condiciones

ambientales, por lo que, se enfocaron los esfuerzos en obtener mayor conocimiento

científico para su conservación, así como también la importancia de laguna La Brava,

que ha sido caracterizada con un alto valor ambiental.

De la secuenciación del Tapete Microbiano analizado de la laguna La Brava se

obtuvieron 99.893 millones de lecturas pareadas (30 Gpb), mientras que para el

análisis taxonómico se utilizaron dos métodos MG-RAST y Kajju obteniéndose

resultados similares, donde se observó que el Tapete Microbiano está dominado por

organismos de los filos Proteobacteria y Bacteroidetes. A nivel de género, algunos

organismos con gran abundancia fueron Roseiflexus, Chloroflexus, Chloroflexi y

Cyanobacteria. El análisis funcional demostró que la fotosíntesis oxigénica está cargo

casi exclusivamente de Cyanobacteria, siendo éstas los productores primarios a partir

de los cuales se desarrollaría toda la comunidad, mientras que la fotosíntesis

anoxigénica es uno de los procesos alternativos que puede generar producción

primaria en estos ambientes, siendo los organismos más abundantes Chloroflexi

asociados al género Chloroflexus, que participan además en el ciclo del nitrógeno. En

cuanto a las vías de fijación de carbono, destacaron las Cyanobacterias, Chloroflexi, y

organismos no asignados para Calvin-Benson, y Deltaproteobacteria para la vía de

Wood–Ljungdahl sugiriendo que estos organismos, algunos de los cuales son

quimiolitoautótrofos, podrían participar en la producción primaria.



2

En cuanto a otros marcadores, las rodopsinas (proteínas fotorreceptoras) más

abundantes pertenecen a los Bacteroidetes, y también a Alfaproteobacterias y

Betaproteobacterias. La principal clase que se encontró fueron las Xantorodopsinas, y

también fueron abundantes las NQ rodopsinas. Al comparar el metagenoma de La

Brava y de otros tapetes microbianos de ecosistemas de Puna, contra cientos de

metagenomas disponibles en base de datos, se encontró que las abundancias de

rodopsinas son intermedias en este tipo de ambientes, sin embargo, se observó que la

muestra analizada se agrupaba a los metagenomas de la Puna, marcados como

“Grupo 1”, siendo particularmente abundantes las Xantorodopsinas, las que se

caracterizan por tener pigmentos que permitirían ampliar el rango de longitudes de

onda donde se capta energía, por lo que, su abundancia en los tapetes microbianos de

éstos ecosistemas podría estar relacionada a un mejor aprovechamiento de la luz en

un ambiente hostil.



3

2 INTRODUCCIÓN

El presente documento, corresponde al tercer informe técnico del cuarto objetivo del

“Estudio de Ecosistemas Extremófilos”, referente a la obtención del Metagenoma1 de

las lagunas ubicadas en los sistemas hidrológicos de Aguas de Quelana, Soncor, La

Brava - La Punta y Peine. Este estudio corresponde a un Compromiso Ambiental

Voluntario (CAV) presentados en el Capítulo 5 del Anexo 2 de la Adenda 5 y que

fueron adquiridos por Rockwood Lithium, actual ALBERMARLE Ltda, a través de la

aprobación ambiental de su Proyecto “EIA Modificaciones y Mejoramiento del Sistema

de Pozas de Evaporación Solar en el Salar de Atacama” (RCA N°21/2016). Estos

compromisos apuntan a la ampliación y profundización del conocimiento científico que

se tiene de las comunidades microbianas extremófilas del Salar de Atacama, con el fin

de aportar información de base de este componente, que permita nutrir nuevos

lineamientos de manejo biológico y colaborar en los esfuerzos de conservación de

estos ecosistemas.

El desierto de Atacama es el más árido del planeta y presenta una superficie que ha

sido modelada por erosión natural a lo largo de millones de años, en su interior

contiene salares, como el salar de Atacama que a su vez presenta lagunas someras

salinas e hipersalinas donde predomina la precipitación de minerales ricos en sulfatos,

cloruros y boratos (Ahumada et al., 2015), además debido a sus características

extremas (baja presión de O2, alta radiación UV, volcanes activos, ambientes

desérticos, fuertes vientos, lagunas con aguas salinas y alcalinas, etc.) y alta

heterogeneidad espacial despierta gran interés científico, ya que provee una gran

oportunidad para el estudio de los mecanismos involucrados en el desarrollo de la vida

bajo estas condiciones, ya que lejos de ser un desierto, el salar de Atacama alberga

una rica biodiversidad adaptada a estas condiciones (Farías et al., 2017), donde la

heterogeneidad espacial del propio salar hace que exista una elevada riqueza de

especies, constituyéndose como un área de concentración de la biodiversidad en la

región altiplánica (“hot spot”) (Ahumada et al., 2015).

Dentro de esta biodiversidad encontramos a los microorganismos extremófilos

formando ecosistemas microbianos que corresponden a bacterias, arqueas y

cianobacterias que ayudan a precipitar minerales y que forman parte de los

Ecosistemas Microbianos Extremófilos (EME). Estos pueden ser clasificados en a)

Tapetes Microbianos litificantes (textura dura), no litificantes (textura blanda) o

evaporíticos que se forman a partir de cristalización de sales, b) Microbialitos que

pueden ser de distintos tipos como: fitomicrobialitos, estromatolitos, trombolitos,

oncolitos o leiolitos y c) Evaporitas donde predomina la precipitación de yeso como

selenita y que son habitadas por microorganismos (Farías et al., 2014; CEA, 2017 y

MMA, 2017) (Figura 2-1).

1 Corresponde al estudio de la información genética que está contenida en todos los microorganismos que

se encuentran en una comunidad o muestra ambiental.



4

Figura 2-1 Tipos de Ecosistemas Microbianos Extremófilos (EME) identificados en el Salar de Atacama. Fuente: Elaboración propia.

Estos ecosistemas microbianos y en especial los tapetes microbianos se caracterizan

por presentar una organización vertical diferenciada por colores con distintas

funcionalidades ecosistémicas, presentando estratos con metabolismos aeróbicos y

anaeróbicos (Farías et al., 2017; Warthman et al., 2015). Existe una gran variedad de

tapetes microbianos, y muchas veces están asociados a condiciones

medioambientales “extremas”, haciendo del sistema microbiano una de las pocas

formas de vida presentes en el entorno. Así, por ejemplo, pueden encontrarse tapetes

en ambientes hipersalinos, en fuentes hidrotermales muy calientes, o en ambientes

polares (Prieto et al., 2018). Un factor fundamental para los tapetes es la luz, que

determina su estructura. Las capas superiores reciben la influencia de la luz y del

oxígeno, mientras que las inferiores son anóxicas, lo cual condiciona qué organismos

viven en cada capa. El conjunto de las diferentes actividades metabólicas de los

organismos puede llevar o no a la precipitación de minerales (Dupraz et al., 2009).

Estudios de metagenomas han entregado indicios que estos ecosistemas poseen

ciclos geoquímicos nuevos para la ciencia (Lara et al., 2012; Rasuk et al., 2014; Farías

et al., 2014; Rascovan et al., 2016). Lo anterior, plantea la necesidad de crear

colecciones de muestras de EME asociados a minerales y de sus respectivos

metagenomas, para resguardar este patrimonio de gran interés científico y

biotecnológico (CEA, 2017). El estudio de los tapetes microbianos tiene diversos

enfoques, muchas veces multidisciplinarios, ya que constituyen modelos de estudio

para entender la influencia de los organismos en la formación de estructuras

sedimentarias, que luego pueden aparecer en el registro fósil como los estromatolitos

(Dupraz, 2005; Gómez et al., 2018). Más aún, cuando las condiciones ambientales

semejan las que se encontraban en la Tierra primitiva, el estudio de los tapetes

microbianos puede permitir inferir los metabolismos presentes en los inicios de la vida

(Gutiérrez–Preciado et al., 2018). Se ha postulado que el metabolismo de arsénico

puede haber permitido obtener energía a los organismos primitivos (Sforna et al.,

2014).



5

En la Laguna La Brava fueron reportados por primera vez este tipo de ecosistemas

microbianos del Salar de Atacama (Farias y Contreras, 2013). Estudios posteriores

mostraron una enorme diversidad de tapetes microbianos y otras estructuras (Farias et

al., 2013; Farias et al., 2014) e incluso se comenzó a estudiar la influencia del arsénico

en los tapetes microbianos (Sancho-Tomás et al., 2014). En estos estudios, la

aplicación de técnicas de extracción y secuenciación de ADN permitió describir la

microbiota de cada tapete microbiano a niveles de detalle nunca reportados.

La tecnología de secuenciación de ADN se ha desarrollado continuamente en los

últimos 15 años, y ha permitido obtener enormes cantidades de datos, y conocer la

presencia de microorganismos (Pedrés-Alió, 2012). Existen distintas estrategias para

secuenciar el ADN, según lo que se quiere estudiar. Para los estudios de diversidad

microbiana, una aproximación sencilla es secuenciar un único gen marcador de cada

microorganismo que nos permita identificar quiénes están presentes en un ambiente.

Una aproximación más compleja (y costosa) es secuenciar todo el ADN extraído, lo

cual nos indica no sólo quiénes estaban en la muestra sino también qué potenciales

metabolismos existen. Los resultados de este tipo de secuenciación son lo que en la

actualidad se denominan “metagenómica”, refiriéndose a la secuencia de ADN de

todos los organismos de una muestra ambiental y que corresponde a una herramienta

útil para guiar estudios sobre la identificación y caracterización de rasgos únicos de las

comunidades microbianas desde el punto funcional, permitiendo conocer sus

diferentes procesos metabólicos (Kurth et al., 2017). Es por ello, que con la finalidad

de obtener más información sobre el funcionamiento de los ecosistemas extremófilos

presentes en el Salar de Atacama a través de la técnica de secuenciación de genomas

según lo realizado por Rasuk et al., 2014, Rascovan et al., 2016 y Kurth et al., 2017.

En este Informe se reporta la metodología utilizada y resultados de los análisis

metagenómicos de un Tapete Microbiano de la laguna La Brava.



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3 OBJETIVOS

A continuación, se presenta el objetivo general del proyecto “Estudio de Ecosistemas

Extremófilos” el cual tiene una duración de 3 años. Por su parte, los objetivos

específicos se enumeran como actividades a seguir para lograr el objetivo general del

estudio. Dichas actividades se van realizando a lo largo de todo el estudio, por lo que

el presente informe corresponde al cuarto objetivo específico referente al análisis del

metagenoma. Por lo que, como se ha señalado anteriormente el presente documento

corresponde al Informe Técnico Nº3 de esta actividad2.

3.1 Objetivo General

Caracterización de los microorganismos extremófilos presentes en las lagunas de los

sistemas Aguas de Quelana, Soncor, La Punta-La Brava y Peine del Salar de

Atacama.

3.2 Objetivos Específicos

1. Determinar a través de revisión bibliográfica el estado de conocimiento de las

comunidades extremófilas de los sistemas: Aguas de Quelana, Soncor, La Punta-

La Brava y Peine.

2. Describir las comunidades microbianas de los sistemas: Aguas de Quelana,

Soncor, La Punta-La Brava y Peine.

3. Describir las condiciones de hábitat de las lagunas ubicadas en los sistemas

Aguas de Quelana, Soncor, La Punta-La Brava y Peine.

4. Analizar el metagenoma de las lagunas ubicadas en los sistemas Aguas de

Quelana, Soncor, La Punta-La Brava y Peine.

5. Caracterizar las curvas de habitabilidad de las comunidades extremófilas.

6. Implementar un cepario microbiano.

2 Informe técnico Nº1 se presentó en Febrero 2019. Informe técnico N°2 se presentó en Octubre 2019.



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4 MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Descripción de área de estudio

El área de estudio se ubica en la cuenca endorreica del salar de Atacama, Región de

Antofagasta, 55 Km al sur de San Pedro de Atacama y corresponde al mayor depósito

salino del país. En el extremo Norte de la cuenca se encuentran los cerros del Tatio,

mientras que al Este se dispone el Altiplano o Puna de Atacama. Los límites al Sur lo

constituyen los Cerros de Lila, mientras que al Oeste se encuentra la Cordillera de

Domeyko (DGA, 2004; Risacher et al., 1999b). Esta cuenca pre altiplánica se

encuentra inserta dentro del sistema hidrográfico Pacífico Seco, caracterizado por sus

desiertos marginales costeros. El clima predominante es árido de subtipo desértico y

estepario, con temperaturas anuales que oscilan entre los -5ºC y los 28ºC (MMA,

2017).

Según su ubicación geográfica, los cuerpos de agua superficiales que componen el

área de estudio se agrupan por sistemas. En el margen oriental del salar, se ubica el

sistema Soncor, formado por las lagunas: Laguna Chaxa – Laguna Barros Negros,

Canal Burro Muerto y Puilar. Bajando por el margen este se ubica el sistema de Aguas

de Quelana, constituido por lagunas de carácter no permanente y hacia el sur oeste el

sistema de La Punta-La Brava el cual incluye el sector sur de Tilopozo y el sistema

Peine compuesto por las lagunas Salada, Saladita e Interna (Salas et al., 2010). El

Canal Burro Muerto y Laguna Chaxa – Laguna Barros Negros, son consideradas de

carácter permanente y extensas, alimentadas por el canal Burro Muerto. Mientras que

Puilar, Aguas de Quelana, La Punta–La Brava y Peine son cuerpos lacustres de

extensión menor, cuyo origen se sitúa en afloramientos de agua subterránea ligados a

cuñas salinas (Alonso & Risacher, 1983; Salas et al., 2010).

Los resultados presentados en este informe técnico contemplan a la laguna La Brava,

la cual ha presentado la mayor riqueza en términos de diversidad microbiana de

acuerdo con los resultados del segundo objetivo específico de este estudio, por lo que,

se priorizó el análisis de secuenciación y análisis bioinformáticos en una muestra de

Tapetes Microbianos de este sector (Figura 4-1).



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Figura 4-1 Área de estudio en el Salar de Atacama, región de Antofagasta. Se especifican las lagunas comprendidas en el área de estudio. Área demarcada (cuadro azul) corresponde al área del cual se presentan los análisis. Fuente: Elaboración propia.



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4.2 Diseño de muestreo

Las muestras para extracción de ADN metagenómico fueron obtenidas el día 30 de

Agosto 2018 desde la laguna La Brava localizado en las coordenadas S 23º43’48.2”,

W 068º14’48.7” (Figura 4-2). La elección de esta laguna se debe principalmente al

tiempo que se requiere para los análisis, ya que la secuenciación de ADN

metagenómico genera enormes cantidades de datos, donde la secuenciación de tan

solo una muestra genera millones de lecturas cortas pareadas, cuyo análisis

bioinformático puede tener múltiples enfoques, por lo que, en este estudio el énfasis

está en los ciclos biogeoquímicos y las rodopsinas de una muestra de Tapete

Microbiano de la laguna La Brava, laguna que presenta una amplia diversidad de

EME, se caracteriza por tener un alto valor ambiental y descrita como uno de los sitios

singulares y parte importante del patrimonio natural de Chile a preservar (MMA, 2017;

2018).

Por otro lado, los Tapetes Microbianos se encuentran ampliamente distribuidos en los

diferentes sistemas hidrológicos del salar de Atacama, y se desarrollan en la interfase

entre el agua y sustratos no saturados. Por lo que, al encontrarse generalmente en la

orilla de las lagunas son más susceptibles a los cambios en las condiciones

ambientales, por ejemplo, en relación con la disminución o aumento del agua

(Demergasso et al., 2003), por otro lado, al no ser muestras duras o litificadas el

protocolo de extracción de ADN se realiza con mayor éxito. De este modo, aun cuando

cada sector presenta particularidades en su diversidad microbiana, es el tipo de EME

con mayor representación en el área de estudio.

Figura 4-2 Izquierda: Mapa de Laguna La Brava, mostrando el sitio de recolección de muestra. Derecha: Vista del tapete microbiano. Inset: Corte del tapete microbiano. Fuente: Elaboración propia.



10

4.3 Metodología de muestreo y análisis del metagenoma

4.3.1 Obtención de muestras

Las muestras de tapete microbiano (Figura 4-3) fueron recolectadas en duplicado

utilizando una espátula de plástico y se dispusieron inicialmente en bolsas de plástico

selladas, para posteriormente ser traspasadas a tubos falcon de 50 ml y preservadas

con RNALater3. Las muestras fueron mantenidas en una nevera portátil a una

temperatura de 4ºC, para posteriormente ser trasladadas al Laboratorio Ambiental del

Centro de Ecología Aplicada Ltda donde se realizó el protocolo de extracción de ADN.

Figura 4-3 Muestra de Tapete microbiano de la laguna La Brava, donde A) Detalles de estratos funcionales, B) vista general y C) vista tipo de EME. Fuente: Elaboración propia.

4.3.2 Extracción de ADN

El ADN metagenómico fue extraído de cada núcleo de la muestra con el Kit de

Aislamiento de ADN de Power Biofilm (MO BIO Laboratories, Inc.). El detalle del

protocolo de extracción de ADN se presenta en Anexo 9.2.

Una vez finalizada la extracción de ADN la muestra fue visualizada mediante

electroforesis en un gel de agarosa al 1% en buffer electroforético TBE. El

procedimiento de extracción de ADN se realizó hasta obtener una banda lo

suficientemente intensa que indique la presencia de ADN en la muestra. Se consideró

una cantidad mínima de 60 ng/uL, con una calidad del ADN en razón de 1.8-2.0 en

relación a las absorbancias A260/280 lo que indica que el ADN tiene una pureza

óptima para ser analizado y se encuentra libre de contaminantes como sales

caotrópicas, fenoles o carbohidratos que pudiesen disminuir la pureza de la muestra.

3 RNAlater es una solución acuosa y no tóxica para el almacenamiento de tejidos que se impregna

rápidamente en los tejidos para estabilizar y proteger el ARN celular.



11

La muestra fue almacenada a -20ºC para su posterior envío al Laboratorio de NGS

(Next Generation Sequencing) de Macrogen en Korea4 el cual realizó la técnica de

secuenciación que se describe a continuación.

4.3.3 Procesamiento y análisis de secuencias

Al llegar las muestras al Laboratorio de NGS (Next Generation Sequencing) se realiza

una pirosecuenciación5, el cual es el método de elección para la secuenciación de

fragmentos cortos de ADN, detección de polimorfismos de un solo nucleótido o SNPs y

análisis de mutilación del ADN (Shen y Waterland, 2007). Las muestras fueron

secuenciadas con un instrumento Illumina HiSeq 1500. Los datos de secuencias

brutos fueron almacenados en el Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) con el

número de adhesión ERP107533.

Para ello se siguen cuatro pasos en el proceso de la secuenciación descritos a

continuación:

4.3.1.1 Preparación de la biblioteca de DNA

Para la preparación de la biblioteca requirió fraccionar el DNA genómico en

fragmentos de 300-600 pb que fueron ligados a adaptadores en sus extremos. Los

adaptadores contienen oligonucleótidos para la amplificación y secuenciación de la

biblioteca. Cada adaptador contempló una etiqueta 5’-biotina que fue utilizada para

unir la biblioteca de forma magnética a perlas de sefarosa. Se titula la biblioteca para

dejar bibliotecas de cadena sencilla (sstDNA) unidas a las perlas.

4.3.1.2 Emulsificado (emPCR)

El emPCR utilizó la biblioteca de cadena sencilla y cada perla fue emulsificada con

agentes de amplificación en una mezcla de agua y aceite. El resultado de esto fue un

enriquecimiento clonal dentro de cada perla.

4.3.1.3 Secuenciación

Las perlas de sefarosa con las bibliotecas sstDNA se agregaron a una placa (Pico

TiterPlate), junto con perlas enzimáticas (que contienen luciferasa y ATP-sulfurilasa) y

la mezcla de incubación (con DNA polimerasa). El aparato utilizado de secuenciación

454, cuenta con un sistema de fluidos que libera soluciones tampón y dNTPs a través

de la placa de una manera secuencial y ordenada, con lo que se da la secuenciación

paralela de todas las perlas contenidas en la misma. La adición de nucleótidos

complementarios al molde resulta en una señal lumínica que es captada por un

dispositivo CCD. La señal lumínica es proporcional a la cantidad de nucleótidos

incorporados.

4 http://www.macrogen.com/en/main/index.php

5 Esta técnica ha sido perfeccionada para la secuenciación de genomas completos por la compañía 454

Life Science. Hasta el momento, este es el sistema más rápido de secuenciación genómica y se puede

decir que es totalmente automatizada, fiable y precisa.

http://www.macrogen.com/en/main/index.php



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4.3.1.4 Ensamblado

Después de la captura de la señal por el aparato CCD, los datos se sometieron a

procesamiento digital, que normaliza las señales y genera un histograma de calidades

Phred6. La combinación de la señal lumínica y la posición en la placa permitieron al

software determinar la secuencia de cientos de miles de reacciones simultáneas. Esto

generó una secuencia consenso como resultado del análisis del histograma de cada

corrida, seguida por la calidad por base de la secuencia consenso.

4.3.4 Análisis bioinformático

Posterior a la llegada de los resultados generados por Macrogen, se procede con el

análisis bioinformático para la obtención de resultados de metagenoma, este

procedimiento se realizó en el Laboratorio de Investigaciones Microbiológicas en

Argentina, los pasos metodológicos se describen a continuación:

4.3.1.5 Control de calidad de las secuencias

Se utilizó el programa FasQC para visualizar el genoma y tener la idea inicial de la

calidad de las secuencias. Mediante la herramienta Trimmomatic. Se realizó el

truncado o corte de secuencias de mala calidad. Los parámetros de selección fueron:

Trimm left: 10 (prinseq), Trimm right: 10 (prinseq), Slidingwindow: 4:15 (Trimmomatic),

Min Len: 36 (Trimmomatic). Mediante el software SPades se realizó el ensamblaje de

novo de las secuencias y se eliminaron las que presentaron un largo inferior a 500 bp

(Prinseq).

4.3.1.6 Análisis taxonómicos

La afiliación taxonómica se obtuvo utilizando el servidor MG-RAST (Meyer et al., 2008)

basado en los resultados de BLAT (Kent, 2002) contra la base de datos M5nr (Wilke et

al., 2012) para las secuencias de proteínas obtenidas de los “contigs” ensamblados,

con una alineación mínima de 15, un valor e < 10-5, y una identidad > 60%. Además,

las lecturas fueron anotadas por kaiju 1.5.0 35 (programa que analiza directamente

lecturas del secuenciador) y contra la base de datos 36 de ProGenomes (Mende et al.,

2016), usando el modo de ejecución Greedy.

4.3.1.7 Identificación de genes funcionales

Se seleccionaron los siguientes marcadores para la identificación de los genes

funcionales:

- COG1850 para RuBisCO (ciclo Calvin-Benson).

- COG2301 para citrato liasa (rTCA).

- COG2368 para 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa (ciclos DH/HB-3HP/HB).

6 Phred es conocida como la escala del valor de calidad, en la cual se estima la probabilidad de que cada

uno de los nucleótidos secuenciados sean erróneos. Esta estimación del error es específica de cada

tecnología y la calcula el software del equipo, utilizando una escala normalizada.



13

- COG1152 para acetil-CoA sintasa (vía Wood-Ljungdahl).

Se asignaron las secuencias de proteínas de cada ensamblaje a identificadores KO.

Los procesos se definieron en base a los siguientes grupos de identificadores:

- Fotosíntesis anoxigénica (genes de la bacterioclorofila y del puf): K08928,

K08929, K08940, K08941, K08942, K08943, K08944).

- Fotosíntesis (genes psa y psb: K02703, K02704, K02705, K02706, K02707,

K02708), la reducción de sulfatos (genes aprAB y dsrAB: K00394, K00395,

K11180, K11181).

- Oxidación de azufre (genes sox: K17222, K17223, K17224, K17225, K17226,

K17227), fijación de nitrógeno (genes nif: K02588, K02586, K02591, K00531).

- Desnitrificación (reductasas para nitrato, nitrito, óxido nítrico y óxido nitroso:

K00370, K00371, K00374, K02567, K02568, K00368, K15864, K04561,

K02305, K15877, K00376).

- Oxidación del amoníaco (amogenes: K10944, K10945, K10946, K10535).

Las proteínas de reducción de sulfato fueron revisadas más a fondo para detectar la

presencia de genes de oxidación de azufre dsr. Para ello se obtuvieron las secuencias

de ADN de los “contigs”, se alinearon con la base de datos dsr (Müller et al., 2015) y

se colocaron en el árbol de referencia usign arb (Mitchel et al., 2017). Por su parte, los

genes marcadores de las vías de fijación del carbono también se recuperaron de la

anotación de GhostKOALA (K01601, K01648, K14534, K14138/K00193).

4.3.1.8 Detección de rodopsina/recA/rad51 en las lecturas metagenómicas

Los metagenomas se agruparon arbitrariamente en las siguientes 11 categorías:

oceánico, océano costero, estuario, lago, suelo, salina, glaciar, lago orgánico

(Antártida), Yellowstone, Microbialitos y Lagos andinos de gran altitud que por sus

siglas en ingles se identifica como HAAL (High Altitude Andean Lakes). Estas últimas,

categorías más específicas, se incluyeron para destacar los lugares de interés para

compararlos con los tapetes microbianos en estudio. Cabe señalar, que el servidor

utilizado, no acepta datos en bruto de los tapetes microbianos, por lo que se incluyó un

proceso previo que incluía el recorte del adaptador y el filtrado de calidad utilizando la

herramienta Trimmomatic (Bolger et al., 2014).

Las lecturas metagenómicas obtenidas del servidor web EBI Metagenomics (Mitchel et

al., 2017) se tradujeron a secuencias de aminoácidos en los seis marcos de lectura y

se filtraron con HMMER 3.1 (http://hmmer.org/) utilizando un perfil de MicRhoDE (MR)

(Boeuf et al., 2015). Las lecturas filtradas se ensamblaron con MEGAHIT (Li et al.,

2015), corriendo los valores k-mer de 21 a 141 con BBMap

(www.sourceforge.net/projects/bbmap/) y SAMtools (Li et al., 2009), los “contigs” que

no se alineaban con al menos una lectura con un porcentaje de identidad mayor al

75% fueron descartados. Por último, se utilizó el FragGeneScan (Rho et al., 2010) con

parámetros predeterminados para predecir los fragmentos de genes.



14

Para clasificar los fragmentos y asignarlos a la familia de la rodopsina, se implementó

un método que evalúa la longitud, la puntuación, la cobertura y la región del perfil de

RM donde cada fragmento está alineado. Basándose en un conjunto de datos de

fragmentos de rodopsina conocidos, el clasificador se definió de la siguiente manera:

Siendo X el fragmento a clasificar, se considerará rodopsina si su puntuación y

cobertura son mayores que 0,04 de la puntuación y cobertura del conjunto de

fragmentos positivos, que tienen la longitud de X y los extremos de su alineación

contienen los de X, o están contenidos por los de X.

4.3.1.9 Agrupación de metagenomas

Los fragmentos de rodopsina se localizaron en un árbol generado con secuencias de

MR. Para ello, se creó un árbol con la herramienta FastTree (Price et al., 2010) a

partir de la alineación múltiple de la RM, usando el árbol de RM como topología inicial.

Para la creación del árbol, se probaron los modelos evolutivos JTT (Jones et al., 1992)

y WAG (Whelan et al., 2001). A través de la prueba de Robinson-Foulds implementada

en ETE (Huerta-Cepas et al., 2016), se determinó que el árbol más similar a la RM era

el generado con JTT.

La función de hmmalign del HMMER se usó para alinear los fragmentos con la

alineación de la resonancia magnética múltiple. Finalmente, los fragmentos fueron

colocados en el árbol usando PPLACER (Matsen et al., 2010) con el método de

probabilidad posterior. Sólo se consideró la ubicación más probable de cada fragmento

y se descartaron los que no pudieron ser localizados en el árbol. A su vez, los

metagenomas que tenían menos de 10 fragmentos localizados en el árbol fueron

completamente excluidos. Luego se seleccionaron los 44 clados más cercanos a la

raíz (RC) del árbol de rodopsina y se calculó la proporción de lecturas por RC con la

siguiente formula:

Donde pi es la proporción en la RC ith, F es el número total de fragmentos en el árbol,

Fi es el número de fragmentos en la RC ith, h es el número de lecturas relacionadas

con un fragmento, y l es la longitud del fragmento.

Los metagenomas se agruparon según la proporción por RC, para ello se utilizó un

procedimiento recursivo que realiza una agrupación jerárquica a partir de subgrupos

no jerárquicos. En cada iteración las RC fueron eliminadas por tres criterios:

i. Más del 95% de los metagenomas tenían una proporción menor a 0.001 y el

5% restante menor a 0.02.

ii. Los metagenomas tenían la misma proporción.

iii. En el caso de la RC totalmente correlacionada, sólo quedaba uno. Luego se

determina la mejor combinación de funciones de distancia, métodos de

agregación y el número de grupos (k). Se evaluaron las funciones de distancia:

Euclidiano, Máximo, Manhattan, Canberra y Minkowski (implementado en



15

función de dist R); métodos de agregación: Ward D, Ward D2, Simple,

Completo, Promedio, Mcquitty, Mediana, Centroide y K-Means (implementado

en las funciones hclust y kmeans R); y el rango de k de 2 a 10. A través de la

biblioteca (Charrad et al., 2014) de NBClust usamos 27 índices para

determinar el valor k y 12 índices (kl, ch, ccc, cindex, db, silueta, ratkowsky ,

ptbiserial, mcclain, dunn, sdindex, sdbw) para la combinación de funciones de

distancia y métodos de agregación. La elección fue hecha por la mayoría de los

índices evaluados.

4.3.1.10 La proporción de familias RHO y abundancia de RHO

La proporción de cada familia RHO7 por metagenoma se determinó a partir de las

anotaciones de las secuencias de RM, multiplicando el porcentaje de cada familia en

cada RC por la proporción de lecturas de cada metagenoma en dicha RC.

La abundancia de RHO se determinó a partir de la abundancia de las recombinantes

(REC). Los fragmentos de REC se identificaron de forma análoga a los de RHO,

utilizando las alineaciones múltiples de las familias RecA y Rad51 Pfam (El-Gebali et

al., 2018). La abundancia de rodopsina se calculó utilizando la siguiente ecuación:

Abundancia de RHO = ∑ RLr/∑ RLe

Donde RLr es la relación del número de lecturas de rodopsina de la longitud del

fragmento y RLe es la relación del número de lecturas de recombinasa de la longitud

del fragmento.

Los resultados son presentados a través de gráficos interactivos de abundancia

jerarquizada Krona que fueron construidos mediante scripts descargados desde el sitio

oficial y ejecutados en Excel con un tipo de ordenamiento que permita su traspaso a

Krona y Primer-6. Mediante éstos, es posible examinar la taxonomía y asignación de

genes en gráficos interactivos y ordenados por niveles jerárquicos.

7 RHO es una proteína que se une al ARN y tiene la capacidad para hidrolizar ATP y otros nucleósidos.



16

5 RESULTADOS

A continuación, se presentan los resultados de ADN metagenómico en una muestra de

Tapete Microbiano de la laguna La Brava, la cual fue seleccionada por su alta riqueza

en términos de diversidad microbiana y su alto valor ambiental, como se ha señalado

en el diseño de muestreo, siendo esta laguna representativa del salar de Atacama en

cuanto a los Ecosistemas Microbianos Extremófilos, mayores antecedentes se detallan

en discusión.

5.1 Secuenciación

Luego de los controles de calidad, se obtuvieron 99.893 millones de lecturas pareadas,

que representan 30.167.729.186 pares de bases (30 Gpb). El ensamblado de estos

datos generó 1.263.318 contigs. El tamaño promedio de un gen bacteriano es de 1000

pares de bases, por lo que contigs más pequeños pueden no incluir genes completos

o dar lugar a predicciones no tan confiables. Se obtuvieron 298.099 contigs de más de

1000 pb. A partir de todos los contigs se predijeron 1.723.512 proteínas.

5.2 Análisis taxonómico

Se utilizaron dos métodos para el análisis taxonómico (MG-RAST y Kajju). En los

resultados, la variabilidad está dada por las secuencias de partida y las bases de datos

empleadas, por lo que es útil notar que partiendo de distintos subsets de datos y

usando distintas bases de datos para la asignación taxonómica, se obtienen

resultados similares (Figura 5-1).

El tapete está dominado por organismos de los filos Proteobacteria y Bacteroidetes,

siendo también importantes Chloroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, y

Spirochaetes. A nivel de género, algunos organismos con gran abundancia según los

resultados de kaiju (el programa que analiza directamente lecturas del secuenciador)

fueron Roseiflexus (6.5%) y Chloroflexus (3.5%) (filo Chloroflexi), Microcoleus (3.5%),

Cyanothece (2.7%), Nostoc (2.1%), y Oscillochloris (1.9%) (filo Cyanobacteria).



17

Figura 5-1 Abundancia taxonómica a nivel de filo en una muestra de Tapete Microbiano de la laguna La Brava, en base a dos métodos.

5.3 Análisis funcional

Los procesos biogeoquímicos que se dan en los tapetes microbianos pueden

asignarse a distintos grupos de organismos, según la asignación taxonómica de los

genes relacionados. El análisis informado pretende dar una idea general de los

procesos del tapete microbiano, por lo que, se realiza la asignación únicamente a nivel

de filo y se analiza en mayor profundidad solo algunos casos. Se muestra la

abundancia relativa ya que cada proceso está representado por distinto número de

genes, por lo que las abundancias totales no son comparables entre sí. Un proceso

con más genes daría mayor abundancia, aun cuando todos los genes estuvieran

dentro de la misma bacteria. Por otro lado, para comparar las vías de fijación de

carbono se emplea un único marcador, por lo que sí se muestra abundancia total en

transcriptos por millón (TPM) o cantidad de secuencias por millón de secuencias

totales en el metagenoma.

La fotosíntesis oxigénica está cargo casi exclusivamente de Cyanobacteria (Figura

5-2B). En la fotosíntesis anoxigénica los organismos más abundantes son los del filo

Chloroflexi, 81,5% asociados al género Chloroflexus, que también están involucrados

en fijación de nitrógeno y desnitrificación. No se encontraron genes para oxidación de

amonio. Las Deltaproteobacteria y una pequeña proporción de Firmicutes están

involucradas en la reducción de sulfato. Alfaproteobacterias de los órdenes

Rhizobiales y Rhodobacterales, y Euryarcheotas metanogénicas están relacionadas

con la oxidación de azufre.

La asignación taxonómica de los marcadores de vías de fijación de carbono más

abundantes se muestra en la Figura 5-2B, donde se destacan Cyanobacterias,

Chloroflexi, y organismos no asignados para Calvin-Benson, y Deltaproteobacteria



18

para la vía de Wood–Ljungdahl o ruta del acetil-CoA. Se encontraron muy pocos

genes para la vía reductora del ciclo del ácido cítrico (rTCA) y las vías relacionadas a 3

hidroxibutirato.

Figura 5-2 Análisis funcional de ciclos bioquímicos. A) Taxonomía de organismos relacionados a cada proceso y B) Abundancia y asignación taxonómica de marcadores de genes de vías de fijación de carbono.

5.4 Rodopsinas y comparación con otros Metagenomas

Otro de los marcadores analizados son las rodopsinas. Estas son proteínas

fotorreceptores que tendrían un rol en la generación de energía en condiciones de baja

disponibilidad de nutrientes. Son muy abundantes en los océanos, pero no tanto en el

suelo, donde los microorganismos son menos dependientes de la luz. En los tapetes

microbianos la luz tiene un rol fundamental, por lo que, podría esperarse que las

rodopsinas sean importantes. En la muestra de tapete microbiano analizado en la

laguna La Brava las rodopsinas más abundantes pertenecen a los Bacteroidetes, y

también a Alfaproteobacterias y Betaproteobacterias. La principal clase que se

encontró fueron las Xantorodopsinas, y también fueron abundantes las NQ rodopsinas.

Comparando el metagenoma de La Brava y de otros tapetes microbianos de la Puna

contra cientos de metagenomas disponibles en base de datos, se encontró que las

abundancias de rodopsinas son intermedias en este tipo de ambientes. Por otro lado,

cuando se agruparon los metagenomas, se probaron distintas formas de

agrupamiento, basadas en características de cada metagenoma, como % CG8,

8 Corresponde a Citocinas-Guaninas en la secuenciación del genoma.



19

abundancia de grupos taxonómicos, distribución de aminoácidos, pero cuando se

agruparon los metagenomas en base a la abundancia de las distintas clases de

rodopsinas, se observó que sólo esta característica agrupaba a los metagenomas de

la Puna, marcados como “Grupo 1” en la Figura 5-3. En particular, las

Xantorodopsinas parecen ser el tipo de rodopsinas dominantes y características de los

tapetes microbianos de la Puna analizadas.

Figura 5-3 A) Agrupamiento de metagenomas de distintos ambientes de acuerdo con la abundancia de distintos tipos de rodopsinas y B) Variación en la proporción de Xantorodopsinas entre distintos grupos.



20

6 DISCUSIÓN

Los Ecosistemas Microbianos Extremófilos poseen una inmensa diversidad

microbiológica, sin embargo, aun sabemos muy poco de ellos y es aun prácticamente

desconocida. Esto ha comenzado a cambiar gracias a los avances tecnológicos que

permiten la secuenciación del ADN, para así estudiar las poblaciones de

microorganismos presentes en comunidades complejas en sus hábitats naturales,

despertando así cada vez más el interés científico. Dentro de las características que

los hacen atractivos para la investigación, es que en una escala muy pequeña de

apenas unos centímetros, estos microorganismos realizan un conjunto de procesos

ecológicos como la producción de biomasa a través de mecanismos foto y

quimiosintéticos, y los procesos de respiración y/o degradación de la materia orgánica

en condiciones que además son extremas para la vida, dándole a esta diversidad

microbiológica un gran valor científico, patrimonial y biotecnológico (Des Marais, 2003;

Farías et al., 2014).

A la fecha, en ambientes similares a los del Salar de Atacama se han descrito y

publicado solo 3 metagenomas: Estromatolitos de Laguna Socompa (Kurth et al.,

2017), biofilms asociados a Evaporitas en la Laguna Diamante (Rascovan et al., 2016)

en Argentina y comunidades endoliticas de Evaporitas de yeso (bioevaporitas) en

Salar de Llamara (Rasuk et al., 2014) en Chile. Estos 3 estudios se basan

fundamentalmente en el estudio del metabolismo de las comunidades extremófilas, así

como también la resistencia al arsénico y sus mecanismos para mantenerse bajo altas

concentraciones de este este componente, el cual se encuentra de forma natural en

los ecosistemas altoandinos debido a la actividad volcánica que ha moldeado la zona

(Catalán et al., 2006; Lara et al., 2012; Farías et al., 2014), debido a estas condiciones

el salar de Atacama ha resultado ser un reservorio importante de vida microbiana, con

una alta diversidad de ecosistemas, donde cada laguna que forma parte del sistema

ha registrado la presencia de al menos un tipo de EME, siendo la laguna La Brava la

única que presenta los 3 tipos: Tapetes Microbianos, Microbialitos y Evaporitas (Farias

et al., 2014: CEA, 2017: MMA, 2017; resultados de este estudio del objetivo específico

N°2 referente a la caracterización de EME de este estudio).

En este sentido y a pesar de que los análisis metagenómicos son de alto rendimiento y

relativamente de bajo costo (al comparar con cultivos en laboratorio) (Meyer et al.,

2008) no es posible realizarlo a todas las muestras a las que se les extrajo ADN, esto

principalmente por la cantidad y calidad de las muestras y por el tiempo que conlleva

los análisis de cada resultado, por ejemplo, en el caso de los estudios de

metagenomas que se han realizado en ambientes similares a los del Salar de Atacama

(Kurth et al., 2017; Rascovan et al., 2016 y Rasuk et al., 2014) fueron trabajos de

investigación enfocados en un solo tipo de EME con una duración de más de 5 años,

desde que se toma la muestra hasta obtener resultados finales. Dado que el presente

objetivo consideró en su propuesta técnica una duración de poco menos de 2 años, los

análisis metagenómicos se priorizaron en las muestras de Tapetes Microbianos,

indicándose las razones de esta elección en el diseño de muestreo de este estudio.

En el análisis taxonómico y funcional del metagenoma de La Brava, podemos observar

una abundancia relativa de Cyanobacteria cercana al 10%. Este número es similar a lo

observado en otros sistemas de Tapetes Microbianos de sistemas hipersalinos como



21

Guerrero Negro, Shark Bay, S’Avall y Kiritimati Atoll (Wong et al., 2016). La

importancia de las cianobacterias en estos ambientes es que serían los productores

primarios a partir de los cuales se desarrollaría toda la comunidad. Fijan carbono y

nitrógeno, como puede verse en la Figura 5-2. Sin embargo, se conoce que su

crecimiento es limitado en ambientes hipersalinos, de ahí quizá su abundancia no

dimensiona su importancia. Se ha propuesto que otros organismos aportan a la

producción primaria, y en el metagenoma de la Brava se pueden ver algunos indicios

en este sentido.

La fotosíntesis anoxigénica es uno de los procesos alternativos que pueden generar

producción primaria en el ambiente. Se encuentra en todos los tapetes, ya que las

bacterias que la llevan a cabo están en capas intermedias, donde no llega el oxígeno,

pero sí la luz. En La Brava podemos ver Alfaproteobacterias de los órdenes

Rhizobiales y Rhodobacterales, que incluyen los géneros fotosintéticos, involucrados

en este proceso. Los mismos organismos también participan en la oxidación de azufre,

lo cual podría indicar que estos organismos estarían obteniendo energía de la luz y

equivalentes de reducción del azufre para sus procesos biosintéticos, siendo capaces

de aportar a la producción primaria, o bien que tienen una diversidad metabólica

importante. Las rutas de fijación de carbono no indican la participación de

Alfaproteobacterias en estos procesos, aunque sí se observan genes no asignados

que podrían corresponder a las mismas. Las que sí participan en la fijación, además

de las cianobacterias, son los Chloroflexi. Este grupo incluye a las bacterias verdes del

azufre, por ejemplo, Chloroflexus, abundante en La Brava, que son fotótrofos

anoxigénicos y que están involucrados en la fijación de carbono y nitrógeno (Figura

5-2), y además participan en la desnitrificación, lo cual indicaría que pueden utilizar las

especies oxidadas del nitrógeno, como NO3-, como aceptores de electrones (para la

fotosíntesis anoxigénica no pueden usar oxígeno).

Por otra parte, las rutas de fijación de carbono incluyen abundantes genes

relacionados a la vía de Wood–Ljungdahl, asociados a Deltaproteobacteria. De aquí

surge la idea de que estos organismos, algunos de los cuales son quimiolitoautótrofos,

podrían participar en la producción primaria. Se observa, además, que son reductores

de sulfato. La quimiolitotrofía requiere equivalentes de reducción inorgánicos, como

puede ser H2 u otros compuestos comunes en ambientes como fuentes hidrotermales

o fumarolas del fondo del océano, donde los quimiolitótrofos son productores primarios

(Gomez-Saez, 2017). Pero en los tapetes microbianos de sistemas hipersalinos, a

menos que tengan cerca alguna fuente hidrotermal rica en minerales, estos

equivalentes de reducción provienen de la actividad de otros organismos, o bien

directamente las cianobacterias u otros heterótrofos, que se alimentan de materia

orgánica generada por los productores primarios. Por lo tanto, si bien es posible que

estos quimiolitótrofos fijen carbono, su producción no sería estrictamente primaria, ya

que dependen de compuestos reducidos generados por otros miembros de la

comunidad.

Otras estrategias empleadas por organismos fotótrofos para obtener energía es el uso

de rodopsinas. En este caso, el proceso es relativamente simple y no permite fijar

carbono inorgánico, aunque se ha propuesto que la energía generada podría aportar a

este proceso (Pinhassi et al., 2016). En el caso de los tapetes microbianos de altura,

las rodopsinas podrían ser relevantes, debido a que son abundantes, si bien no tanto



22

como en ambientes acuáticos. En La Brava, la diversidad taxonómica de rodopsinas

no es tan amplia (los perfiles de diversidad no coinciden). Determinados filos

presentan mayor abundancia de rodopsinas, como Bacteroidetes y

Alfaproteobacterias. En los tapetes de lagunas de altura, y en La Brava en particular

son abundantes las Xantorodopsinas. Estas variantes se caracterizan por tener

pigmentos “antena” asociados, además del clásico retinal (Balashov, 2005). Estos

pigmentos permitirían ampliar el rango de longitudes de onda donde se capta energía,

por lo que su abundancia en los tapetes andinos podría estar relacionada a un mejor

aprovechamiento de la luz en un ambiente hostil. Además de las observaciones en los

metagenomas, esta idea también se apoya en aislamientos de los estromatolitos de

Socompa, donde también se encontraron rodopsinas funcionales (Gorriti et al., 2014;

Albarracín et al., 2016).

Una precaución necesaria para sacar conclusiones de estos análisis es recordar que

lo que estamos observando es el ADN completo de una comunidad. Esto no implica

que los genes que estamos viendo estén cumpliendo su función en el ambiente, ya

que no tenemos datos de expresión génica, sino únicamente del potencial de las

comunidades. Por ello, para la ecología microbiana es fundamental emplear técnicas

alternativas para llegar a conclusiones válidas. Sin embargo, los datos presentados

profundizan en el conocimiento científico que se tiene de las comunidades microbianas

extremófilas del Salar de Atacama, el cual es el enfoque principal de este estudio.



23

7 CONCLUSIONES

• Durante agosto 2018 se obtuvo una muestra de un tapete microbiano ubicado

en la laguna La Brava, realizándose exitosamente el protocolo de extracción de

ADN en el Laboratorio Ambiental del CEA (Chile) para posteriormente ser

secuenciado en el Laboratorio de NGS (Korea) y finalmente analizado en el

Laboratorio de Investigaciones Microbiológicas (Argentina).

• En el contexto de la ecología microbiana del sistema y sus ciclos

biogeoquímicos del Tapete Microbiano de laguna La Brava, a nivel general los

datos metagenómicos fueron similares a lo descrito en otros tapetes

microbianos de sistemas hipersalinos.

• Se utilizaron los métodos MG-RAST y Kajju para el análisis taxonómico

obteniéndose resultados similares para la asignación taxonómica con ambos

métodos, destacándo la dominancia de los filos Proteobacteria, Bacteroidetes,

Chloroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, y Spirochaetes en el

tapete microbiano. Siendo los taxa más abundantes Roseiflexus y Chloroflexus.

Este último destaca particularmente por ser abundante en La Brava y no así en

los otros tapates microbianos de sistemas hipersalinos.

• En cuanto a los procesos funcionales del tapete microbiano, la fotosíntesis

oxigénica está cargo casi exclusivamente de Cyanobacteria, mientras que la

fotosíntesis anoxigénica destaca Chloroflexi, específicamente el género

Chloroflexus, que además están involucrados en fijación de nitrógeno y

carbono, sugiriendo que estos microorganismos participan en la producción

primaria de estos ecosistemas.

• La metagenómica permite realizar análisis más detallados de metabolismos

específicos, y en este caso se presentaron algunos resultados sobre

rodopsinas, que han permitido definir una particularidad de los tapetes

microbianos andinos. Este es un caso particular, y queda lugar para estudiar

diversos sistemas.

• Cabe señalar que la actual pandemia de coronavirus (COVID-19) ha afectado

las actividades de laboratorio propuestas inicialmente (resultados de todos los

sistemas en Junio 2020). A pesar de que no fueron presentados resultados de

otros sistemas lagunares, los datos metagenómicos del Tapete microbiano de

la laguna La Brava es de alto valor científico, ya que actualmente no se

registran estudios publicados de metagenoma en el salar de Atacama. Por lo

que, la información presentada es un aporte a la información base de estos

ecosistemas.



24

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28

9 ANEXOS

9.1 Control de cambios del documento

CONTROL DEL DOCUMENTO

Versión Fecha Elaborado por Revisado Aprobado por

V0 10-07-2020

María Eugenia Farías

Elizabeth Chihuailaf

Natalia Muñoz

Natalia Muñoz

Manuel Contreras

Natalia Muñoz

Jose Maria

Peralta

V1 23-07-2020



Natalia Muñoz

Natalia Muñoz

Manuel Contreras

Natalia Muñoz

Jose Maria

Peralta

VF 27-07-2020



Natalia Muñoz

Natalia Muñoz

Manuel Contreras

Natalia Muñoz

Jose Maria

Peralta

9.2 Protocolo de extracción de ADN

A continuación, se detallan los pasos seguidos para la extracción de ADN utilizando el

kit comercial MP Biomedicals™ FastDNA™.:

1. Se añaden 400 mg de muestra del EME separadas anteriormente por estratos (A,

B, C dependiendo de la muestra a un tubo de la Matriz E de Lysing.

2. Se agregan 978 μl de Buffer de fosfato sódico.

3. Se agregan 122 μl del Buffer MT.

4. Se homogeniza la muestra en el equipo MOBIO Vortex Genie® por 10 minutos a

máxima revolución del equipo (14.00 rpm).

5. Se centrifugan las muestras a 14.000 revoluciones durante 10 minutos.

6. Se transfiere el sobrenadante a un tubo limpio de microcentrífuga de 2.0 ml, al cual

se le añade 250 μl de PPS (Solución de Precipitación de Proteínas) y se

homogeniza agitando el tubo con la mano suavemente por 5 minutos.

7. Una vez homogenizadas las muestras, se centrifugan nuevamente a 14.000

revoluciones durante 5 minutos para precipitar los pellets y se transfiere el

sobrenadante a un tubo limpio de 15 ml.

8. Se homogeniza la suspensión de la matriz de unión y se añade 1.0 ml al

sobrenadante en un tubo de 15 ml.

9. Se homogeniza suavemente con la mano durante 2 minutos, finalmente el tubo se

mantiene en un rack para tubos eppendorf durante 3 minutos para permitir el

asentamiento de la matriz de sílice.



29

10. Se retiran y desechan 500 μl de sobrenadante evitando que se asiente la matriz.

11. Se homogeniza la matriz de unión en la cantidad restante de sobrenadante. Se

trasfieren aproximadamente 600 μl de la mezcla al SPIN™, se filtran y centrifuga a

14.000 revoluciones durante 2 minuto. Se vacía el tubo de captura y se añade la

mezcla restante al filtro para ser centrifugado hasta completar la muestra.

12. Se añaden 500 μl de SEWS-M y se homogeniza suavemente el tubo usando la

fuerza del líquido de la punta de la micropipeta.

13. Se centrifuga a 14.000 revoluciones durante 2 minutos. Se vacía el tubo de captura

y se reemplaza por un tubo eppendorf.

14. Se centrifuga nuevamente a 14.000 revoluciones durante 2 minutos para "secar" la

matriz de la solución de lavado residual, una vez realizado esto se desecha el tubo

de captura y se remplaza por uno nuevo.

15. Se deja secar al aire el filtro SPIN™ durante 5 minutos a temperatura ambiente.

16. Se homogeniza suavemente la matriz de unión (por encima del filtro SPIN) en 80 μl

de DES (DNasa/ Agua sin pirógenos, agua libre de ARNasas).

17. Se centrifuga a 14.000 revoluciones durante 1 minuto para decantar el ADN en el

tubo de captura limpio desechando el filtro SPIN.

compromisos ambientales voluntarios - snifa

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