colageno en gelatina

5/16/2018 Colageno en Gelatina - slidepdf.com

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Estudio del proceso de transformación del colágeno

en gelatina

POR

M. C. Bonmatí Limorte y G. León Albert

RESUMEN

Se ha real izado un estudio del proceso de t ransformación de colágenoen gela t ina ut i l i zando la vi scos idad reducida como parámet ro de cont rol .Se ha observado una gran inf luencia de la temperatura y del t iempo decalentamiento sobre es te proceso, as í como sobre la temperatura de desnatura l ización. Se han determinado igualmente las enta lpia y ent ropía dedesnatura l ización.

SUMMARY

A study of the process of conversión of col lagen to gelat in has beencarr ied out using reduced viscosi ty as indicat ive parameter . We haveobserved an impor tant inf luence of temperature and heat ing t ime on thatprocess as wel l as on denatura l iza t ion temperature . Denatura l iza t ion en-ta lphy and ent rophy have been a l so determined.

INTRODUCCIÓN

El colágeno, el más común de los componentes orgánicos de los tej i dos conect ivos ( tej idos relacionados fundamentalmente con aspectos es-



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t ructurales y mecánicos del organismo animal) , es e l materia l estructural

dominante en e l re ino animal. Se encuentra en los te j idos de todos los

t ipos de organismos plucicelulares, desde los pluricelulares invertebrados más primit ivos hasta e l hombre. Es, sin duda, la proteína más abun

dante en los mamíferos , encontrándose en una proporc ión aproximada

del 25 % de la proteína total.

La molécula de colágeno —tropocolágeno— es una macromolécula

muy alargada, en forma de vari l la , const i tuida por t res cadenas polipep-

t ídicas, de unas 1.000 unidades aminoacídicas cada una, arrol ladas entre

sí cons t i tuyend o una tr iple hél ice estabil izada funda m entalm ente por

interacciones o enlaces por puente de hidrógeno.

Es conocido desde hace tiempo que cuando los tejidos colaginosos secal ientan a tem per atu ras m ode rada s en agua o en disoluciones acu osas

de ácidos o bases se disuelven parcialmente, dándose, a la porción de pro

teína solubilizada, el nombre genérico de gelatina.

Puesto que ese calentamiento suave solamente puede provocar la rup

tura de los enlaces de hidrógeno que estabilizan la triple hélice del colá

geno, el proceso de transformación de colágeno en gelat ina puede ser

considerado como un proceso t ípico de desnatural ización que, en este

caso, supone tan sólo e l desmoronamiento de la estructura t r iple hél ice

del colágeno nat ivo, sin afectar para nada a la estructura primaria de laproteína. La estructura de la gelat ina resulta ser , por lo tanto, a l tamente

simplificada con relación a la del colágeno, estando constituida por las

cadenas o riginarias de la molécula de aquél , pe ro en un claro ordenam ien

to al azar.

La anterior hipótesis ha sido comprobada por los autores del presente

trabajo en un estudio l levado a cabo sobre colágeno y gelat ina obtenidos

a part i r de un mismo materia l biológico, observando que las composicio

nes aminoacídicas de ambos son práct icamente idénticas, mientras que

existe una gran diferencia en las propiedades re lacionadas de a lguna manera con aspectos estru ctura les de niveles superiores de la molécula pro

teica en disolución.

En el presente t rabajo se ha estudiado este proceso de desnatural iza

ción aceptando que la t ransformación de colágeno en gelat ina está ínt i

mamente re lacionada con la variación del valor de determinadas propie

dad es fisicoquímicas, reflejo de la es tru ctu ra de la molécu la prote ica en

disolución. Como parámetro indicat ivo de este proceso de desnatural iza

ción se ha seleccionado la viscosidad reducida.



Estudio del proceso de transformación del colágeno e n gelatina 137

P A R T E E X P E R I M E N T A L

El colágeno ut i l izado en este estudio se obtuvo a par t i r de tendón deternero de la raza frisona (Holstein jrisia).

El mater ial biológico se cortaba en t rozos lo más pequeños posible

(aproximadamente cubi tos de unos 0,5 cm de lado) , lavándose éstos var ias

veces con agua dest i lada. El lavado con agua se cont inuaba prolongada

mente con el f in de el iminar los componentes solubles en el la , real izán

dose, cuando menos, t res t ratamientos de lavado sucesivos, de 4 horas

cada un o, con agi tac ión cont inua . Para e l iminar acom pañan tes prote icos

solubles en sales, el material biológico se trataba a continuación con clo

ru ro sódico al 10 % (1) (4 lavado s de 10 ho ras, con ag i tación con t inua ) .Después de lavar varias veces con agua desti lada, y con el objeto de

el iminar los componentes l ipidíeos del mater ial de par t ida, el residuo in-

soluble en la eta pa a nter ior se t rat ab a con éter de petróle o (4 lavado s d e

10 horas, con agitación continua). El rriaterial insoluble se lavaba de nue

vo var ias veces con acetona y agua, pasándose a cont inuación a extraer

select ivamente el colágeno con tampón ácido cí t r ico/ci t rato, de pH =

= 3,6 (2) . Después d e t res extracciones sucesivas de 12 ho ras de dura ción

(agi tand o cont in uam ente ) , los extracto s se un ían y se f iltraban con u n

em bu do de vidr io s inter izado núm ero 2, centr i fugando segu idam ente elfiltrado a 8.000 g, du ran te 2 h. El sobr ena dan te se dial izaba frente a fos

fato disódico 0,02 M (3) , obtenién dose el colágeno precip i tado en forma

de fibras. Con objeto de purificar este colágeno así obtenido, se extraía

de nuevo —desp ués de lavar var ias veces con agua y centr i fugar— con

tampón cí t r ico-ci t rato de pH = 3,6, repi t iendo todo el proceso antes indi

cado . Una vez vuelto a lavar y a centrifugar, se dejaba secar al aire. Todas

las etapas del proceso seguido, de obtención y purificación, así como el

secado y alm acen am iento, se real izaron a 5° C.

Porciones alícuotas de una disolución del 0,043 % de colágeno en tampón ácido cítrico-citrato, pH = 3,6, se calentaron a 30, 36, 37, 38, 39 y

41° C, dur an te 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60 y 90 m inu tos , p asá nd ose seguida

m ente a d eterm inar su viscosidad redu cida a 30° C.

La med ida de la viscosidad d e las disoluciones se real izó s iguiendo básicamente la técnica descrita por Kragh (4), con util ización de un viscosí-m etro Ostwa ld. A pa rt i r de las medida s de t iemp o y de acue rdo con laproporcional idad existente entre viscosidad y t iempo (se admite que enestas disoluciones tan diluidas la densidad de la disolución es aproxima

damente igual a la del disolvente puro) se obtiene la viscosidad reducidamediante la expresión.



1 3 8 M. C. Bonmatí Limarte y G. León Albert

t - t o''lieá •

to • C

donde t es el tiempo de flujo de la disolución, to el tiempo de flujo del disolvente puro (ambos en segundos) y c la concentración proteica (gramospor mil i l i t ro) .

No se apl icaron a las medidas real izadas las correcciones debidas aenergía cinét ica, f lujos anómalos cercanos a la pared del viscosímetro,tensión superficial y drenaje, por ser las condiciones experimentales lasadecuadas para minimizar hasta valores totalmente despreciables loserrores inherentes a es tos efectos .

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Puede apreciarse, en el examen de los resul tados obtenidos ( tabla I ) ,que el proceso de desnatural ización supone la disminución de la viscosidad reducida desde un valor inicial constante con el t iempo (para nosotro s el determ inad o a 30° G), que rep rese nta la total id ad de la pro teínaen estado nat ivo (es decir , cuando no se ha iniciado la desnatural ización)

hasta ot ro valor igualmente constante (el determinado a 41° C) , que representa la total idad de la proteína en es tado desnatural izado (es decir , cuando se ha completado el proceso de desnatural ización) . Los valores intermedios de l a v i scos idad reducida representan e tapas o es tados t ambiénintermedios en el proceso de desnatural ización, en los que coexis ten dist intas proporciones de colágeno nat ivo y colágeno desnatural izado.

TABLA I

V A L O R E S M E D I O S A D I S T I N T O S T I E M P O S Y T E M P E R A T U R A S D E L A V I S COSIDAD REDUCIDA DE UNA DISOLUCIÓN DE COLÁGENO DE TENDÓND E T E R N E R O ( C O N C E N T R A C I Ó N 0 , 0 4 3 % E N T A M P O N C I T R I C O - C I T R A T O

DE pH 3,6)

Valores de viscosidad reducida (ml/g)

Temperatura Tiempo (mir utos)

m5 10 15 20 30 45 60 90

30 1.483 1.480 1.482 1.485 1.482 1.484 1.483 1.482

36 1.410 1.296 1.154 1.071 942 829 786 715

37 1.207 923 768 685 498 386 307 248

38 552 265 205 149 89 72 68 69

39 230 77 69 68 67 69 68 67

41 70 68 69 67 68 68 69 68



Estudio del proceso de transformación del colágeno en gelatina 1 3 9

De acuerdo con lo anter ior , hemos de admit i r que el proceso de t ransformación de colágeno en gelat ina se encuentra muy inf luenciado por la

tem pe ratu ra a la que el m ismo tenga lugar (f ig. 1). Así, a tem pe ratu ras de36 a 37° C, el tránsito se realiza de forma gradual e incompleta, l legándosea un estado de equi l ibr io en el que coexisten colágeno nat ivo y colágenodesnatura l izado en determinadas proporciones {54 % de gelatina y 46 %

de co láge no a 36° C, y 87 % de g elatin a y 13 % de co lágen o a 37° C). Porel co ntra r io, a tem pe ratu ras iguales o superiore s a 38° C el t rán si to es yamuy rápido y práct icamente to ta l .

Para caracter izar de una forma completa el proceso de desnatural izac ión de una prote ína es necesar io conocer a lgunos parámet ros caracter í s

t icos, como son temperatura , enta lpia y ent ropía de desnatura l ización.Si se tiene en cuenta que la temperatura de desnaturalización de unaproteína se define como aquel la temperatura a la que se ha desnatural i zad o el 50 % de las m olécu las — l̂o qu e corr es po nd e a un 50 % de var iación de la viscosidad reducida—, es posible calcular la temperatura dedesnatural ización del colágeno representando el porcentaje de disminución de la vi scos idad reducida f rente a la temperatura y determinando,en la gráfica así ob tenida , la te m pe ratu ra a la que se ha p rod ucid o el 50 %de disminución (fig. 2).

Los resul tados así obtenidos ( tabla II) ponen de manif iesto la grandependencia entre el valor de la temperatura de desnatural ización y elt iempo de ca lentamiento, observándose que a l aumentar és te di sminuyela temperatura de desnatural ización. Se hace, pues, necesario, al hablar

'de una temperatura de desnatural ización, especif icar la temperatura decalentamiento a la que ha s ido obtenida.

TABLA II

VARIACIÓN D E LA TEM'PERATURA DE DESNATU RALIZACIÓN (TD)C O N E L T I E M P O D E C A L E N T A M I E N T O ( t )

t ( m i n ) 5 10 15 20 30 45 60 90T D C C ) 37,67 37,21 36,95 36,75 36,42 36,13 35,98 35,95

No obstante, puede también apreciarse (tabla II, f ig. 3) que las diferencias entre las temperaturas de desnatural ización disminuyen al au

mentar e l t i empo de ca lentamiento, pudiéndose cons iderar , en e l presentecaso, práct icamente cons tantes las obtenidas para t iempos de ca lenta-mieno iguales o superiores a 60 minutos.



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ISOOr

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^••c

37'C

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37'C

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0

— » — — 1 1

6f i 10

tiempo (minutos )

FIGURA 1.—Variación de la viscosidad reducida con el tiempo para distintastemperaturas de calentamiento.



100--

75

50

2 5 ••

Tiempos de calentamiento:

30 35 í,0

t e m p e r a t u r a ( ° C )

F I G U R A 2.—P orcentaje de var ia ción de la visco s idad red uc ida (% A tir.a)c o n l a t e m p e r a t u r a p a r a d i s t i n t o s t i e m p o s d e c a l e n t a m i e n t o .



142 M. C. Bonmatí Limorte y G. León Albert

Esto sugiere la posibi l idad de definir una temperatura de desnatural i-zación indepen diente de la velocidad de calentam iento p or extrapo lación

a tiempo infinito de las obtenidas a distintas velocidades de calentamien-to . Tal temperatura de desnatural ización independiente del t iempo es parael caso del colágeno de ten dó n de te rn er o 'la de 35,95° C.

El segundo parámetro de interés que caracteriza e l proceso de desna-

turalización es la entalpia de desnaturalización ( A H D ) que viene a ser una

medida de la variación energética que se produce como consecuencia de

la ruptura de las interacciones por puente de hidrógeno.

Si admit imos que el proceso de desnatural ización t iene lugar en una

sola eta pa ( pro teín a nativa 5=̂ pro teín a des natu raliza da) , pued e conside-rarse regido por la ecuación de Van't Hoff:

log K = cte.2,303 RT

donde K es da constante del equil ibrio de transic ión entre la proteína en

estado n at ivo y la pro te ína en estado desn atural izad o:

[pro te ína desna tura l izada]K =: — [p ro te ína na t iva ]

La rep rese ntac ión de log K frente a da una recta de cuya pendien-

te obtenemos la entalpia de desnatural ización.

En la tabla III se indican los porcentajes de proteína en estado nat ivo

y pro te ína en es tado desna tura l izado para cada tempera tura y t iempo de

calentamiento obtenidos a partir del porcentaje de variación de la visco-sidad reducida.



T Q { ° C )

38 ••

37

3 5 - -

3 6 - -

30 60 90

t i e m p o ( m i n u t o s )

F I G U R A 3 .—Var iac ión de l a t e m pe ra tu ra de desan tu ra l i zac ión (TD ) con e l t i emp od e c a l e n t a m i e n t o



1 4 4 M. C. Bonm atí Limorte y G. León Albert

TABLA III

P O R C E N T A J E S D E P R O T E IN A E N E S T A D O N A T IV O , ? « , Y P R O T E IN A E N E S T A

D O D E S N A T U R A LIZ A D O , P D , E X IS T E N T E S D E S P U É S D E C A L E N T A M IE N T OA L O S T IE M P O S Y T E M P E R A T U R A S Q U E S E IN D IC A N

Temperatura Tiempo (minutos)CC) 5 10 15 20 30 45 60 90

30

36

37

38

39

41

PN 100 100 99,86 100 99,86 99,72 99,79 99,86PD 0 0 0,14 O 0,14 0,28 0,21 0,14

PN 95,04 86,97 76,91 71,03 61,90 53,90 50,85 45,82P D 4,96 13,03 23,09 28,97 38,10 46,10 49,15 54,18

PN 80,67 60,55 49,58 43,70 30,45 22,52 16,93 12,75P D

19,33 39,45 50,42 56,30 69,55 77,48 83,07 87,25PN 34,28 13,95 9,70 5,74 1,49 1,35 O 0,07P D 65,72 86,05 90,30 94,26 98,51 98,65 100 99,93

PN 11,47 0,66 0,07 O O 0,07 O OP D 88,53 99,34 99,93 100 100 99,93 100 100

PN 0,14 O 0,07 0 0 0 0,07 OP D 99,86 100 99,93 100 100 100 99,93 100

El cálculo de la entalpia de desnatural ización debe hacerse ut i l izandovalores de porcenta jes de prote ína nat iva y desnatura l izada cor respon-

pondientes a l t ráns i to en es te proceso de desnatura l ización. De acuerdocon el lo, ut i l izamo s las tem pe ratu ras de 37, 38 y 39° C pa ra el t iempo decalen tam iento de 5 minu tos y de 36, 37 y 38° C pa ra los t iemp os de calentamiento de 10, 15 y 20 minutos. Para t iempos de calentamiento superiores , los porcenta jes de prote ína nat iva y desnatura l izada es tán muy cer canos al O % y 100 %, respectivamente, do que hace poco fiables los result ados ob ten idos .

Calculadas las entalpias de desnatural ización para los dis t intos t iempos de ca lentamiento ( tabla IV) , puede observarse que la enta lpia de des

natura l ización resul ta independiente de la velocidad de ca lentamiento,pudiéndose considerar como valor medio de los obtenidos el de 1,14 cal /g.

TABLA IV

E N T A L P IA S D E D E S N A T U R A L IZ A C IÓ N D E C O L Á G E N O D E T E R N E R OO B T E N ID A S P A R A L A S D IS T IN T A S V E L O C ID A D E S D E C A L E N T A M IE N T O

Tiempo (minutos) Pendiente \HD(Kcal • mot^) ¿S.HD(cal • g-') (*)

5 — 72,8 71 333,461 1,1110 — 77 ,56 2 354,927 1,18

15 — 71,6 41 327,832 1,0920 — 77,1 58 353,075 1,17(*) Va lores ca lcu lados cons ide rando un peso molecu la r medio pa ra l a mo

lécula de colágeno de 300.000.



Estudio del proceso de transformación del coló-geno en gelatina 1 4 5

El cálculo de la entropía de desnaturalización —variación entrópica

consecuencia de la mayor libertad configuracional que supone la trans

formación de una estructura t r iple hél ice en tres cadenas desordenadas—puede realizarse a partir de la ecuación AG = AH — T •A S, adm itiendo que

en el pun to de transic ión, es decir, cuando la tem per atu ra y la entalpia son

las correspondientes a la desnaturalización ( T D , AHD) la variación de ener-

AFTgía libre es cero (AG = 0) ( 5) . D e ahí que ASo = —\ , de donde se

T Dobtien e un valor de 1,108 r -r r ^ pa ra la entr op ía de desn aturaliza ción.

mol. K



1 4 6 M. C. Boiimati Limorte y G. León Albert

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