células tumorales y adn circulante, nuevos marcadores en el...

Células tumorales y ADN circulante, nuevos marcadores en el Laboratorio Clínico

Luis Francisco Sáenz Mateos. Servicio de Análisis Clínicos, Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca-IMIB/FFIS, Murcia.

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Circulante Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

ADN Circulante • Material genético liberado por las células al torrente

sanguíneo.

• En forma de fragmentos de pequeño tamaño.


• Para su detección se usa la PCR digital

ADN Circulante Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

ADN Circulante- Laboratorio Clínico

• Cáncer mama (metastásico)

• Imágenes Tumores Vs ctDNA-CA15-3-CTCs

– ctDNA detectado 29 de 30 mujeres (97%)

– CA15-3 detectado 21 de 27 mujeres (78%)

– CTCs detectadas en 26 de 30 mujeres (87%)

• Los niveles ctDNA mostraron mayor correlación con cambios en la masa tumoral.

• Biomarcador informativo, específico y muy sensible en el Cáncer de mama.


• Cáncer

• >75% ctDNA detectable Ca. AVANZADO

– Páncreas, ovario, colorrectal, vejiga, gastroesofágico, mama, melanoma, hepatocelular y de cabeza y cuello.

• 50% - 70% ctDNA detectable tumores LOCALIZADOS

– colorrectal, gastroesofágico, páncreas y mama

• <50% ctDNA detectable tumores PRIMARIOS

– cerebro, renal, próstata o de tiroides

ADN Circulante- Laboratorio Clínico Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

ADN Circulante - Laboratorio Clínico

• Cáncer-Epigenética-Metilación

• Grado de metilación es crucial en la regulación de la expresión de genes que controlan funciones celulares importantes en el desarrollo del cáncer

Grupos Metilo


Epigenetica- Metilación

• Existe mucho interés en el estudio de la metilación del ADN en el cáncer colorrectal (CCR)

• Se han descrito 50 genes con alteraciones somáticas del grado de metilación en distintos estadios del CCR identificándose así como un potencial biomarcador.

• Septina 9 metilada


Método detección mS9

Plasma EDTA Extracción

DNA Conversión

Bisulfito Purificación

Bis DNA

Amplificación

Detección

5 mL

Citosina Uracilo DNA NO metilado


Resultados - mS9

POSITIVO

NEGATIVO

POBLACIÓN RIESGO

COLONOSCOPIA

SINTOMATOLOGÍA

SANGRE HECES COLONOSCOPIA

SIGMOIDOSCOPIA

NO SINTOMATOLOGÍA

Repetir mS9

a 2 años

NO RIESGO


• Estudios prenatales • ctDNA fetal en sangre periférica materna = posibilidad de

realizar diagnósticos prenatales sin necesidad de utilizar técnicas obstétricas invasivas para la obtención de material genético fetal. – Sexo (secuencias de los genes SRY y DYS14) – RH (exones 5, 7 y, ocasionalmente, exón 10 del gen

RhD) – Aneuploidias (cromosomas X, Y, 21, 18, 13) – Enfermedades monogénicas (Huntington, distrofia

miotónica , distonía de desarrollo precoz, B-talasemia, fibrosis quística, etc)

ADN Circulante - Laboratorio Clínico Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Circulante Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Células tumorales Circulantes (CTCs)

• Descritas por primera vez por Asworth en 1869 en pacientes con cáncer

• Su presencia significaba progresión de la enfermedad neoplásica y se relacionaba directamente con la aparición de metástasis tumorales



• No existían técnicas que permitieran su aislamiento e identificación.

• Con las técnicas actuales sabemos: – Que poseen alteraciones genómicas propias de células malignas

– Rara vez se encuentran en sangre periférica de personas sanas

• Su destino: – gánglios linfáticos

– médula ósea

– sangre periférica

– finalmente órganos distales


Células tumorales Circulantes (CTCs) Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

• Se estima 1 CTC por cada 10^6-10^7 células mononucleares en sangre periférica (PBMC) en pacientes con cáncer.


Enriquecimiento “preanalítico” basado en propiedades fisicoquímicas

Técnicas de Inmunoseparación


Enriquecimiento basado en propiedades fisicoquímicas de las CTCs

Tamaño

Densidad

Tampón lisis

PBMC + CTCs

Citocentrifugación

ISET

MEMS

Ficoll

Lymphoprep

Oncoquick


• Oncoquick

Células tumorales Circulantes (CTCs) Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

CTCs – Técnicas de inmunosepación Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

• Aprobado por la FDA para cáncer de mama, colon y próstata

• Detecta en sangre periférica una CTC por cada 10^5-10^7 PBMC mediante inmunomagnetismo

• Fiable y reproducible

CTCs – Cell Search Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

CTCs – Cell Search Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

• Citoqueratinas en otros tipos celulares

• Células epiteliales en sangre periférica en determinadas condiciones fisiopatológicas:

– Inflamación

– Cirugía

– Enfermedades proliferativas epiteliales benignas

– Traumas

• Transición epitelial-mesenquimal (EMT)

CTCs – Cell Search - Objeciones Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

CTCs – Concepto EMT Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

CTCs – IsofluxTM System •Alta recuperación y pureza de CTC.

• Anticuerpos de captura definidos por

el usuario. No es una plataforma

cerrada.

• Bajo volumen de elución, <5 μl.

• Formato de elución compatible con

técnicas moleculares.

• Puede procesar hasta 4 muestras al

mismo tiempo.

• Control de temperatura a 4 ºC para

evitar uniones inespecíficas.

• Fácil transferencia de las CTC para

análisis posteriores.


CTCs – IsofluxTM System Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

CTCs – IsofluxTM System

Contaje celular Análisis de Mutaciones por qPCR (KRAS, EGFR y BRAF) Expresión génica RT-qPCR (Her2) FISH


• El número de CTCs detectadas en sangre ha sido correlacionado con: – Desarrollo de metástasis

– Supervivencia libre de progresión (PFS)

– Supervivencia general (OS)

• Su disminución o desaparición indica la respuesta favorable a un tratamiento y su persistencia resistencia al mismo

• En pacientes sin evidencia de metástasis, puede brindar un pronóstico de la evolución de la enfermedad y contribuye en la elección del tratamiento para prevenir su recidiva

CTCs – Laboratorio Clínico Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

CTCs en Hepatocarcinoma Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

• El carcinoma hepatocelular (HCC) representa el 80-90% de las neoplasias primarias del hígado y cerca del 5% de todas las neoplasias malignas. El HCC aparece en más del 90% de los casos sobre una cirrosis hepática

• La incidencia en España es intermedia (5-10 casos por 100.000 habitantes) ascenso en los últimos años, en relación con la evolución de la epidemia de VHC, principal factor de riesgo en nuestro país

CTCs en Hepatocarcinoma Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

• Cirrosis

• VHB Coinfección VHC, VHD, VIH

• VHC Coinfección VHC, VHD, VIH y fibrosis avanzada

• Exposición a aflatoxinas

• Alcoholismo

CTCs en Hepatocarcinoma- Factores de riesgo Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

• Ecografía

• Pruebas de imagen dinámicas

• Tomografía computadorizada (TC) cuatrifásica

• Angio-resonancia magnética (RM)

CTCs en Hepatocarcinoma - Diagnóstico Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

CTCs en Hepatocarcinoma - Diagnóstico

Arterial lenta venoso rápido

Otras pruebas


• Sistema BCLC (Barcelona Clinic Liver Cancer)

• Variables pronósticas:

– Tamaño tumoral

– Disfunción hepática subyacente

– Presencia de síntomas

• Vincula cada grupo pronóstico con una recomendación terapéutica

CTCs en Hepatocarcinoma - Estadificación

Detección de ctDNA y CTCs Patrones de expresión génica Nuevos marcadores bioquímicos


CTCs en Hepatocarcinoma - Estadificación Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

CTCs en Hepatocarcinoma - Tratamiento

• En el HCC es necesaria una cuidadosa selección de los candidatos para cada opción terapéutica

• Curativos:

– Resección quirúrgica

– Ablación percutánea

– Quimioterapia sistémica con sorafenib

– Trasplante

Inyección percutánea de etanol (IPE) La radiofrecuencia (RF)


CTCs - HCC – Tratamiento - Trasplante

• Ideal porque resuelve el problema tumoral y la enfermedad de base sobre la que asienta, la cirrosis hepática

• Con los criterios de Milán se han constatado supervivencias por encima del 70% a los 5 años, con una tasa de recurrencia de menos de un 15%

• Criterios de Milán:

– Lesión única igual o menor de 5 cm

– Máximo de 3 lesiones iguales o menores de 3 cm, sin invasión vascular ni enfermedad extrahepática



• Principal problema es la disminución de la supervivencia en el trasplante.

Número limitado de donaciones Incremento del número de candidatos

Aumento del tiempo de espera

Mayor progresión tumoral

Exclusión del 25% de los pacientes si la lista de espera supera los 12 meses



• ¿Soluciones?

• Aumento del número de donantes

• Escala MELD de priorización

• Tratamientos locorregionales durante el tiempo en lista de espera – Ablación por radiofrecuencia

– Quimioembolización transarterial (TACE)

Coste-efectivo si la lista de espera es superior a los 6 meses


CTCs - HCC – Tratamiento – Trasplante - TACE

• En el progresivo crecimiento tumoral del HCC el aporte sanguíneo se vuelve cada vez más dependiente de un origen arterial

• La TACE consiste en la combinación de la obstrucción arterial tumoral y la aplicación de quimioterapia local

Adriamicina Y

Cisplatino

Gelfoam coils metálicos

alcohol polivinilo


CTCs - HCC – Tratamiento – Trasplante - TACE Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014


• Indicación de la TACE

– Tumor multinodular

– Sin invasión vascular

– Ni extensión extrahepática

– Pacientes asintomáticos

– Función hepática conservada

Rendimiento de la TACE dudoso Supervivencia global El estadio intermedio abarca una población muy heterogénea No todos los pacientes de este grupo se beneficiarán de igual modo El tejido tumoral residual recupera su irrigación y el tumor continúa creciendo No está demostrado cuál es el mejor esquema de tratamiento, a intervalos regulares o “a demanda”



• Nuevo sistema DEB (drug eluting beads)-TACE

– Consiste en esferas de alcohol polivinilo cargadas de Adriamicina

– Ventajas:

• Mayor concentración de agente quimioterápico de una forma más sostenida en el tiempo

• Menor liberación del fármaco a nivel de la circulación sistémica reduciendo la toxicidad y aumentando la tolerancia

• Permite elegir el tamaño de las partículas en función del calibre del vaso que se va a embolizar (más homogéneo y reproducible)



• La DEB-TACE es mejor tolerada globalmente y genera un mayor beneficio en los pacientes con perfil más desfavorable dentro del estadio intermedio.

• Futuros estudios deben profundizar en la valoración de los efectos de la TACE en los diferentes subgrupos de pacientes dentro del estadio intermedio y seleccionar así los candidatos adecuados para optimizar los resultados.

• Es necesario el desarrollo de nuevas técnicas y la búsqueda y validación de nuevos criterios que permitan valorar fielmente la eficacia de las terapias moleculares en los pacientes con HCC.


Proyecto - CTCs - Hepatocarcinoma

Pre TACE Post TACE

Post Tx Post Tx 6 meses

CTCs Cell Search

Isoflux

CTCs Expresión génica

RT-qPCR

Marcadores bioquímicos


Proyecto - CTCs – HCC – Cell Search

CTCs Cell Search

Cell Search CTCs pre TACE /

7.5 mL

CTCs postTACE/

7.5 mL

CTCs post TOH /

7.5 mL

HCCp1 0 0 HCCp2 0 HCCp3 0 HCCp4 0 HCCP5 2 0 HCCP6 0 HCCP7 0

1/7 14.3%


Proyecto - CTCs – HCC - IsofluxTM System

CTCs Isoflux

Isoflux CTCs pre TACE /

7.5 mL

CTCs postTACE/

7.5 mL

CTCs post TOH /

7.5 mL

HCCp1 44 HCCP5 20 HCCP6 33 HCCP7 3

4/4 100%


Proyecto - CTCs – HCC – RT-qPCR

Hep G2

CTCs Expresión génica

RT-qPCR

CTCs

- 80ºC Extracción

RNA

RT- qPCR


Proyecto - CTCs - HCC - Bioquímica

• Marcadores de función hepática

• Marcadores tumorales

• Marcadores de Recidiva (Self-seeding) tras trasplante

• Marcadores de inflamación/rechazo

• Otros marcadores ADN circulante?

Biobanco

Marcadores bioquímicos

Plasma Suero ADN


Objetivos del proyecto Hepatocarcinoma

• Determinar el perfil de CTCs en sangre periférica pre y post-TACE en pacientes con hepatocarcinoma sometidos a un trasplante.

• Correlacionar estos hallazgos con la respuesta tumoral del HCC a la TACE y con la supervivencia libre de enfermedad tras el trasplante.

• Comparar y evaluar el método CellSearch, Isoflux y los métodos genéticos indirectos basados en la expresión de mRNAs específicos, para detectar las CTCs en pacientes con HCC pendientes de trasplante.


Grupo de Investigación multidisciplinar • Servicio Cirugía/Unidad de trasplantes

– Dr. Pablo Ramírez Romero

– Dr. Pascual Parrilla Paricio

– María del Rocío González Sánchez

• Servicio de Inmunología – Dr. Alfredo Minguela Puras

– María Victoria Martínez Sánchez

• Unidad de Cirugía experimental – Dr. Alberto Baroja Mazo

– Dra. Beatriz Revilla Nuin

• Servicio Análisis Clínicos – Dr. José Antonio Noguera Velasco

– María Isabel Sánchez Lorencio

– Dr. Luis Francisco Sáenz Mateos

• Servicio Análisis Clínicos Hospital Clínico San Carlos Madrid – Dra. María Luisa Maestro De Las Casas

– Silvia Veganzones De Castro

– Virginia De La Orden García

– Beatriz Mediero Valeros

[email protected]


• La estandarización de estas técnicas para la determinación de ctDNA y CTCs en los laboratorios clínicos asistenciales es hoy día relativamente sencilla.

• La detección de este tipo de células y su estudio genético en profundidad, podría ser una herramienta útil para la individualización del tratamiento del cáncer

• Esto permitiría tomar decisiones terapéuticas que aumenten la supervivencia de los pacientes con cáncer.

Conclusiones generales Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

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