cÉlulas troncales mesenquimÁticas humanas...
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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS
CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMÁTICAS HUMANAS (hMSC) ELIMINAN EFICIENTEMENTE LAS ESPECIES
REACTIVAS DE OXÍGENO (ROS) Y DE NITRÓGENO (RNS).
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Farmacología
Por
MARÍA ARACELI VALLE PRIETO
Directores de Tesis
Dra. Paulette Conget Molina
Dr. Yedy Israel Jacard
Santiago – Chile
2010
II
“I’ve learned that people will forget what you said, people will forget what you did, but people
will never forget how you made them feel”
Maya Angelou
III
UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS
INFORME DE APROBACION
TESIS DE DOCTORADO
Se informa a la comisión de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile que la Tesis de Doctorado presentada por la candidata
MARÍA ARACELI VALLE PRIETO ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito de Tesis para el Grado de Doctor en Farmacología, en el examen de defensa de Tesis rendido el …....... de........................ de 2010. Directores de Tesis: - Dra. Paulette Conget ________________ - Dr. Yedy Israel ________________ Comisión Informante de Tesis: - Dr. Hernán Lara (Presidente) ________________ - Dra. Cecilia Hidalgo ________________ - Dr. Aníbal Llanos ________________ - Dr. Francisco Pérez ________________
IV
FINANCIAMIENTO: Las siguientes instituciones contribuyeron al financiamiento de esta tesis:
• Mantención del investigador:
1) CONICYT, beca de mantención estudiante de doctorado
(marzo 2004-febrero 2008).
2) Facultad de Medicina Clínica Alemana-Universidad del Desarrollo
(marzo 2008-diciembre 2008).
• Insumos:
1) Facultad de Medicina Clínica Alemana-Universidad del Desarrollo
(marzo 2005-diciembre 2008).
2) Dirección de Investigación, Universidad del Desarrollo.
Proyecto Nº 4020203 “Células troncales mesenquimáticas humanas
(hMSC) eliminan eficientemente especies reactivas de oxígeno
(ROS) y de nitrógeno (RNS)”. Investigador a cargo: MA Valle-Prieto
(marzo 2006-mayo 2007).
3) CONICYT. Beca de apoyo a la realización de tesis doctoral
Nº 24071089 “Células troncales mesenquimáticas humanas (hMSC)
eliminan eficientemente especies reactivas de oxígeno (ROS) y de
nitrógeno (RNS)”. Investigador a cargo: MA Valle-Prieto
(octubre 2007-octubre 2008).
V
PUBLICACION:
Valle-Prieto MA, Conget P
Human Mesenchymal Stem Cells efficiently manage oxidative stress.
Stem Cells and Development (aceptado)
VI
PRESENTACIONES A CONGRESOS:
Los resultados de esta tesis han sido presentados en los siguientes congresos
científicos:
1. Valle-Prieto A, Luz P, Conget P. Células troncales mesenquimáticas humanas
(hMSC) manejan eficientemente el estrés oxidativo (Panel). XXVIII Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile.
Olmué, Chile, Agosto 20-22, 2006. 2. Valle-Prieto A y Conget P. Contribución de células troncales mesenquimáticas
(MSC) al tratamiento de diabetes mellitus tipo 2: más allá de la diferenciación”
(Oral-Simposio). XXIX Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile. Iquique, Chile, Septiembre 6-9, 2007.
3. Valle-Prieto A y Conget P. Células troncales mesenquimáticas humanas (hMSC)
eliminan eficientemente ROS y RNS (panel). XVIII Congreso de la Asociación Latinoamericana de Farmacología, III Congreso Iberoamericano de Farmacología, XXX Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile, XXIII Reunión Anual de la Sociedad Chilena de Ciencias Fisiológicas.
Coquimbo, Chile, Octubre 12-16, 2008.
VII
AGRADECIMIENTOS
A mis directores de tesis, Dra. Conget y Dr. Israel, por haber guiado este trabajo con paciencia y por haberme dado la iluminación necesaria para que éste llegara a buen término. A los miembros de mi comisión de doctorado, por haber contribuido al desarrollo de esta tesis con su experiencia y críticas constructivas.
A mi familia. Al Dr. Valle, por advertirme del duro camino de la ciencia, pero oponerse a cualquier otra profesión que hubiese querido estudiar... A la Cote, por cobijarme bajo sus alas, pero al mismo tiempo incentivarme a volar. A mis hermanos, Jopi y Pablo, por ser los mejores compañeros de vida. A la Yeya que estuvo y estará siempre apoyándome en los tiempos difíciles y celebrando mis éxitos. A mis primas Mari, Jime, Angie y, muy especialmente, a la Marre por ser tan cercana a pesar de la distancia. Y a la Manu, la locateli chica, por alegrarme la vida.
A mis amigas de infancia: Andrea y Maca. A mi Narisco familia: Fran, Jose, Castellví y Agus. A las del cole: Carito, Marce, Martínez y Julia. A los amigos de la U: Memo, Dani, Panchi, Sole, Marcia y Pao. A los chumbiqueños, en especial a Carliños y René por ser tan buenos partners. A los incondicionales de Shajatz: Kathy, Debyn, Coty, Jessy, Gordo y Juampa. A los farmacólogos, en especial a Ramón por ser tan buen amigo y colega. A mis amigas del postdoc sin doc: Elvira, Lulú, Joy y Shin, por haber sido mi apoyo emocional en tiempos difíciles.
A las dulces tentaciones de la vida: Sahne-nuss, Nutella, Snickers, PowerBar, Milky-way, Bitter-Naranja y Toblerone blanco. Gracias por apoyarme y haber calmado mi ansiedad durante el desarrollo, la redacción y corrección de esta tesis.
A mis compañeros del Instituto de Ciencias, tanto a los antiguos como a los nuevos. En especial a las brujas: Jessi, Pao y Vale, por todo el soporte emocional y por hacer los mejores y más ricos aquelarres a los que he asistido.
Por último, se viene la cebolla... Quiero agradecer muy especialmente, a mi pequeña familia por elección. Sobre todo a la vieja (Pao) y a la hija (Caro). Sin duda esta tesis nunca habría llegado a término sin el apoyo constante y diario que ustedes me dieron. Gracias por desordenarse y reírse conmigo, haciendo la vida más divertida. Gracias por ser mi Ritalin y enfocarme cuando me disperso. Gracias por compartir mis ideales y ayudarme a construir un mundo mejor. Gracias por ayudarme a recordar quien soy y lo que valgo. Siempre estaré agradecida de la vida por haber juntado nuestros caminos en el minuto y en el lugar exactos!!! ...Y arriba que el sol brilla y es un lindo día!!!
VIII
ABREVIATURAS ATZ aminotriazol BSO butirato de sulfoximina
CAT catalasa CL50 concentración letal 50 DEDTC dietilditiocarbamato DEM dietilmaleato DHR dihidrorodamina
EO estrés oxidativo GPX1 glutatión peroxidasa GSH glutatión reducido GSSG glutatión oxidado GSx glutatión total hFib fibroblastos humanos de piel
hMSC células troncales mesenquimáticas humanas
INS-1 células insulinoma de rata mMSC células troncales mesenquimáticas de ratón MSO mercaptosuccinato rMSC células troncales mesenquimáticas de rata RNS especies reactivas de nitrógeno
ROS especies reactivas de oxígeno SIN-1 3 morfolinosidnoimina
SNAP S nitroso-N-acetilpenicilamina SOD1 superóxido dismutasa citosólica SOD2 superóxido dismutasa mitocondrial
IX
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Página
1. INTRODUCCIÓN 1
1.1 ¿Que son las MSC? 1
1.2 ¿En qué patologías el trasplante de hMSC ha probado ser terapéutico?
2
1.3 ¿Por qué el trasplante de MSC se ha evaluado y tiene efectos terapéuticos en patologías con etiologías tan diversas?
6
1.3.1 MSC producen factores tróficos 7
1.3.2 MSC inducen neovascularización 7
1.3.3 MSC son hipoinmunogénicas e inmunoreguladoras 9
1.4 ¿Podrían las MSC manejar eficientemente el EO?
11
Hipótesis 17
Objetivo General 17
Objetivos Específicos 17
2. MATERIALES Y MÉTODOS 18
2.1 Obtención y cultivo de hMSC 18
2.1.1 Aislamiento de hMSC 18
2.1.2 Determinación del tiempo de duplicación poblacional 19
2.1.3 Tinción con cristal violeta 19
2.1.4 Diferenciación adipogénica 19
2.1.5 Tinción con Oil Red O 20
2.1.6 Diferenciación osteogénica 20
2.1.7 Tinción con Alizarín Red 20
2.1.8 Diferenciación condrogénica 21
2.1.9 Tinción con Safranina O 21
X
Página
2.2 Obtención y cultivo de hFib 21
2.3 Cultivo de células INS-1 clon 832/13 22
2.4 Ensayos de citotoxicidad 23
2.5 Detección de ROS y/o RNS intracelulares 23
2.6 Evaluación de la expresión génica 24
2.6.1 Extracción de RNA y obtención de cDNA 24
2.6.2 PCR cuantitativo para SOD1, SOD2, CAT, GPX1 y GADPH
24
2.6.3 Curva estándar para PCR cuantitativo 27
2.6.4 Cuantificación relativa 30
2.7 Determinación de la actividad de enzimas relacionadas al manejo del EO
30
2.7.1 Medición actividad enzimática de SOD 30
2.7.2 Medición actividad enzimática de CAT 31
2.7.3 Medición actividad enzimática de GPX1 31
2.8 Determinación de GSx total
32
2.8.1 Obtención de muestras 32
2.8.2 Determinación de GSx
32
2.9 Depleción de GSx
33
2.10 Análisis estadísticos
33
3. RESULTADOS 35
3.1 Aislamiento y caracterización de las hMSC
35
3.2 Susceptibilidad de las hMSC a la muerte inducida por ROS y/o RNS
35
3.3 Niveles intracelulares de ROS y RNS en hMSC expuestas a EO
35
XI
Página
3.4 Expresión de SOD1, SOD2, CAT y GPX1 en hMSC 39
3.5 Actividad enzimática basal de SOD1, CAT y GPX1
42
3.6 Niveles basales de GSx en hMSC
42
3.7 Resistencia a la muerte inducida por ROS y/o RNS en hMSC depletadas de GSx 46
4. DISCUSIÓN 48
5. CONCLUSIONES
54
6. PROYECCIONES
54
7. ANEXOS
58
7.1 Diferenciación de MSC a células productoras de insulina:
técnicas evaluadas a la fecha
58
7.2 Obtención de células productoras de insulina a partir de hMSC no modificadas genéticamente
61
7.2.1 Compromiso de las hMSC a linaje neural (hM(N)SC) y diferenciación a células productoras de insulina
61
7.2.2 Otros protocolos utilizados para la diferenciación de hMSC a células productoras de insulina
66
7.3 Detección de células productoras de insulina 66
7.3.1 PCR cuantitativa para INS, GLUT-2, GCK 66
7.4 Diferenciación de mMSC y rMSC a células productoras de insulina
72
7.4.1 Aislamiento de MSC de ratón (mMSC) a células productoras de insulina
72
7.4.2 Aislamiento de MSC de rata (rMSC) a células productoras de insulina
72
7.4.3 Determinación de la secreción de insulina
73
XII
Página
7.4.4 Diferenciación de mMSC a células productoras de insulina 73
7.4.5 Diferenciación de rMSC a células productoras de insulina
74
7.4.6 Discusión de los resultados obtenidos
77
7.5 Resistencia al EO de hMSC versus mMSC y rMSC
79
7.6 Cultivo Mixto de Linfocitos 81
7.6.1 Procedimiento experimental 81
7.6.2 Resultados del MLC
81
8. BIBLIOGRAFÍA 83
XIII
ÍNDICE DE FIGURAS Página
Figura 1 Esquema simplificado de las células troncales
embrionarias (ESC) y adultas derivadas de médula ósea (HSC y MSC), mostrando los linajes a los que se diferencian
3
Figura 2 Mecanismos celulares y moleculares asociados a los efectos terapéuticos de las hMSC
8
Figura 3 Esquema de los mecanismos celulares de depuración de especies reactivas
12
Figura 4 Roles del GSH en células animales 14
Figura 5 Esquematización de los objetivos específicos, los diseños experimentales y la información que se obtendrá
16
Figura 6 Curvas de melting para SOD1, SOD2, CAT y GPX1
28
Figura 7 Curva estándar para PCR cuantitativo de SOD1, SOD2, CAT y GPX1
29
Figura 8 Estandarización de la depleción de GSx en hMSC
34
Figura 9 Caracterización de hMSC aisladas de MO 36
Figura 10 Determinación de la susceptibilidad de las hMSC a la muerte inducida por SNAP
37
Figura 11 Niveles intracelulares de ROS/RNS en INS-1, hMSC y hFib expuestos a EO
40
Figura 12 Actividad enzimática basal de SOD1, CAT y GPX1 en INS-1, hMSC y hFib
43
Figura 13 Inhibición de SOD1, CAT y GPX1 en hMSC
44
Figura 14 Niveles basales de GSx en INS-1, hMSC y hFib
45
Figura 15 Resistencia a la muerte inducida por EO de hMSC depletadas de GSx
47
Figura 16 Esquema de los protocolos descritos en la literatura, hasta la fecha, para diferenciar MSC a células productoras de insulina
60
XIV
Página
Figura 17 Diseño experimental utilizado para evaluar la diferenciación de hMSC a células productoras de insulina
62
Figura 18 Morfología de las hMSC cultivadas con diferentes medios
64
Figura 19 Curvas de melting para INS, GLUT-2, y GCK
69
Figura 20 Curvas estándar para PCR cuantitativo de INS y GLUT-2
70
Figura 21 Determinación de la expresión de INS, GLUT-2 y GCK
71
Figura 22
Diferenciación de mMSC a células productoras de insulina según Tayaramma y cols. (2006)
75
Figura 23
Diferenciación de rMSC a células productoras de insulina según Chen y cols. (2004)
76
Figura 24
Resistencia al EO de rMSC, hMSC y mMSC 80
Figura 25
MLC frente a diferentes concentraciones de hMSC 82
XV
ÍNDICE DE TABLAS Página
Tabla 1 Estudios clínicos en humanos realizados hasta la
fecha utilizando hMSC
5
Tabla 2 Condiciones específicas para realizar PCR
cuantitativo
25
Tabla 3 Partidores específicos para PCR cuantitativo
26
Tabla 4 Susceptibilidad de células INS-1, hMSC y hFib a la muerte inducida por ROS y/o RNS
38
Tabla 5 Expresión de SOD1, SOD2, CAT y GPX1 en hMSC y hFib
41
Tabla 6 Síntesis y/o secreción de insulina en hMSC sometidas a diferenciación
65
Tabla 7
Partidores específicos para PCR cuantitativa para INS, GLUT-2 y GCK
67
XVI
RESUMEN El trasplante de células troncales mesenquimáticas humanas (hMSC) derivadas de
médula ósea ha mostrado ser terapéutico en patologías como osteogénesis
imperfecta, reacción del injerto contra huésped e infarto agudo al miocardio.
Además, ha permitido recuperar las funciones motoras y sensoriales en animales
con infarto cerebral, la producción de insulina en animales diabéticos y evitar la
muerte neuronal en animales con enfermedad de Parkinson. En todas estas
patologías el daño tisular se vincula a estrés oxidativo (EO).
A la fecha, los mecanismos propuestos para explicar los efectos terapéuticos de las
MSC son: i) diferenciación a células del parénquima, ii) producción de factores
tróficos que promueven proliferación y diferenciación de progenitores locales,
iii) neovascularización, iv) inmunomodulación. Nosotros proponemos que las hMSC
además actuarían como “atrapadores” de especies reactivas de oxígeno (ROS) y/o
de nitrógeno (RNS), protegiendo así a las células del parénquima del daño oxidativo.
Para evaluar esta hipótesis hemos caracterizado a las hMSC con respecto a su
capacidad de manejar el EO. Primero, se determinó si las hMSC resisten a la
muerte inducida por la exposición a ROS (H2O2), a RNS (SNAP) o a ambas (SIN-1)
y se determinaron los niveles intracelulares de ROS/RNS cuando las células son
expuestas a SIN-1. Luego, se determinaron las herramientas que las hMSC poseen
para depurar las especies reactivas. Para ello, se cuantificó la expresión (RT-PCR
tiempo real) y actividad (espectrofotometría) de enzimas asociadas a la eliminación
de ROS y/o RNS: superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión
peroxidasa (GPX1). Además, se evaluaron los niveles basales de glutatión total
(GSx). Finalmente, se determinó cual es la contribución del GSx dentro de los
mecanismos asociados al manejo del EO que poseen las hMSC. Para ello se
XVII
evaluó la resistencia a la muerte inducida por la exposición a ROS y/o RNS de
hMSC a las cuales se les depletó de GSx.
Los resultados de esta tesis muestran que las hMSC son significativamente más
resistentes a la muerte inducida por ROS y/o RNS que las células INS-1 (modelo de
células susceptibles al EO) y tan resistentes como los fibroblastos de piel (modelo
de células resistentes al EO). Las hMSC constitutivamente expresan todas las
enzimas estudiadas y tienen altos niveles de GSx. Esto se correlaciona con una
baja acumulación intracelular de ROS/RNS y una baja susceptibilidad a la muerte
inducida por EO. Dentro de las herramientas para eliminar ROS y/o RNS
encontrados en las hMSC, el GSx es central de vital importancia, ya que cuando la
producción de éste es inhibida, las hMSC pierden su capacidad para resistir a la
muerte inducida por EO.
En conjunto estos resultados permiten concluir que, al menos in vitro, las hMSC
manejan eficientemente el EO. De mantenerse esta propiedad in vivo, las hMSC
contribuirían a la regeneración tisular disminuyendo el daño producido por el EO.
XVIII
SUMMARY Bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (hMSC) transplantation is
therapeutic for osteogenesis imperfecta, graft versus host disease, and acute
myocardial infarction. Pre-clinical studies have shown that exogenous hMSC induces
recovery of motor and sensory functions after stroke, preventing neuronal death in
models of Parkinson's and promoting hyperglycemia reversion in diabetic rodents. With
these pathologies tissue damage is associated to oxidative stress (OS).
The mechanisms behind therapeutic effects of MSC are: i) differentiation into
parenchymal cells, ii) production of trophic factors that promote proliferation and
differentiation of local stem cells, iii) neovascularization, and iv) immuno modulation.
Here we propose that hMSC also might act as reactive oxygen species (ROS)
and/or reactive nitrogen species (RNS) scavenges. Hence, parenchymal cells could
be protected from oxidative damage and death.
To test this hypothesis we characterized the potential of hMSC to manage OS. First,
it was determined hMSC susceptibility to ROS (H2O2), RNS (SNAP) or both (SIN-1)
induced death. Also, intracellular levels of ROS/RNS were determined in cells
exposed to SIN-1. Then we identified hMSC tools to eliminate the reactive species.
To do this, gene expression coding enzymes associated to ROS and/or RNS
elimination (superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione
peroxidase (GPX1)) were quantified by real time RT-PCR and enzymatic activity
was measured by spectrophotometry. In addition, baseline levels of total glutathione
(GSx) were evaluated. Finally we determined the importance of the GSx for hMSC
tools associated with the management of the OS. To do this, we evaluated hMSC
without GSx resistance to ROS and/or RNS induced death.
XIX
Our results of this thesis show that hMSC are significantly more resistant to death
induced by ROS and/or RNS than INS-1 cell model (susceptible to OS) and stronger
as skin fibroblasts (cell model resistant to OS). hMSC constitutively express all the
enzymes studied and have high levels of GSx. This correlates with a low
accumulation of intracellular ROS/RNS and low susceptibility to death induced by
OS. Among the tools to eliminate ROS and/or RNS found in hMSC, GSx is critical,
because when this production is inhibited hMSC lose their resistance to the death
induced by OS.
Taken together these results allow to conclude that, at least in vitro, hMSC efficiently
managed the OS. If this property exists in vivo, hMSC could contributed to tissue
regeneration and decrease of the damage caused by OS.
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1 ¿Qué son las MSC? Las células troncales se caracterizan por su capacidad de autorrenovarse y
de diferenciarse, al menos, a un tipo de célula madura. Las células
troncales se pueden clasificar en embrionarias (ESC) o adultas (ASC)
dependiendo de la etapa de desarrollo en que se encuentra el organismo
desde el cual se aíslan.
Las ESC se obtienen desde la masa celular interna del blastocisto (día 5
después de la fecundación del cigoto) y se consideran pluripotentes, ya que
dan origen a todos los tipos de células que componen un organismo. Las
ASC se obtienen desde diferentes órganos y tejidos de un individuo adulto
como por ejemplo: piel, hígado, intestino, corazón, riñón y médula ósea (MO)
(Ratajczak y cols., 2004). Entre estas últimas se encuentran las células
troncales mesenquimáticas (MSC), actualmente llamadas células estromales
multipotentes (Horwitz y cols., 2005).
Las MSC fueron descritas por primera vez en la década de los 70’s, cuando
Friedenstein y cols. caracterizaron una población de células adherentes, no
fagocíticas, con morfología fibroblastoide que tenían la capacidad de
diferenciarse en condrocitos y osteocitos (Friedenstein y cols., 1968;
Friedenstein y cols., 1976; Friedenstein y cols., 1987). En esa época, la
principal función atribuida a las MSC fue la de dar sustento a la
hematopoyesis, ya que éstas células forman parte del estroma de la MO y
producen colágeno, fibronectina, laminina y proteoglicanos (Chichester y
cols, 1993; Pittenger y cols., 1999; Conget y Minguel, 1999). Además,
interactúan con una serie de células de linaje hematopoyético a través de
moléculas de superficie tales como ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, LFA-3,
ALCAM, HCAM e integrinas (Pittenger y cols., 1999; Conget y Minguel,
1999). Por útlimo, las MSC secretan una serie de interleuquinas y de
factores de crecimiento necesarios para la proliferación y diferenciación de
las HSC a linajes hematopoyéticos como lo son IL-1, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11,
IL-12, IL-14, IL-15, IL-27, LIF, ligando de Flt-3, SCF, M-CSF y GM-CSF
(Haynesworth y cols., 1996; Majumdar y cols., 1998; Silva y cols., 2003;
Potian y cols., 2003; Aggarwal y cols., 2005).
2
Posteriormente, se demostró que las MSC, al igual que las HSC, tenían
potencial de diferenciarse a distintos linajes celulares (Keating A, 2006).
Mientras, las HSC dan origen a las células sanguíneas, las MSC dan origen a
células mesenquimales como adipocitos, condrocitos, osteocitos y miocitos
(Pittenger y cols., 1999; Wargers y Weissman, 2004; Le Blanc y Ringdén,
2005) (figura 1). En consecuencia, las MSC son consideradas células
troncales adultas multipotentes. Recientemente, se ha demostrado que las
MSC tienen plasticidad, es decir, pueden generar células de linajes distintos a
su origen embrionario. Así a partir de las MSC se pueden generar entre otros
neumocitos (Gussoni y cols., 1999), neuronas (Jiang y cols., 2003),
hepatocitos (Petersen y cols., 1999; Schwartz y cols., 2002) y células
productoras de insulina (Chen y cols., 2004; Tang y cols., 2004; Moriscot y
cols., 2005) (figura 1).
1.2 ¿En qué patologías el trasplante de hMSC ha probado ser terapéutico? Los primeros estudios para evaluar la efectividad de la terapia celular con
hMSC, comenzaron en el año 1999. Estos estudios estaban basados
principalmente a la capacidad de las hMSC para diferenciarse a células de
linajes mesenquimáticos, como por ejemplo, la capacidad de diferenciarse a
condrocitos y/o osteocitos. Es así como en los primeros estudios se analizó
la efectividad del trasplante local de hMSC autólogas, expandidas ex vivo,
en el tratamiento de patologías donde hay un daño de cartílago o de hueso
que no se regenera normalmente (Diduch y cols., 2000; Quarto y cols.,
2001). Hoy, se sabe que las hMSC contribuyen a la regeneración tisular no
sólo por su capacidad de diferenciarse a células de linaje mesenquimático.
Es por esto, que la terapia celular con hMSC se ha expandido a patologías
de diversas etiologías. En efecto, es posible encontrar información de al
menos 80 estudios clínicos en los cuales se evalúa la seguridad y
efectividad del trasplante de hMSC (http://www.clinicaltrials.gov). Algunos
de ellos ya se han completado, como por ejemplo, los estudios fase II en los
que las hMSC se utilizan en el tratamiento de pacientes con enfermedad de
Chron moderada a severa, de pacientes con daño en la médula espinal o
de pacientes que necesitan que su tejido peridontal se regenere. O el
estudio de fase III, dónde las hMSC se utilizan para el tratamiento de
3
MPC
HSC
ESC
HPC
MSC
Figura 1. Esquema simplificado de las células troncales embrionarias (ESC) y adultas derivadas de la médula ósea (HSC y MSC), mostrando los linajes a los que se diferencian. HPC = hematopoietic precursor cell; MPC = mesenchymal precursor cell.
Blastocisto (masa celular interna)
Adulto (médula ósea)
Granulocitos Osteocito Adipocito Condrocito Miocito Eritrocito Neumocito Hepatocito Linfocitos Célula Productora
insulina
Neurona
Linajes mesenquimales Linajes no mesenquimales
4
pacientes con enfermedad de injerto contra el huésped aguda (GVH) y
refractaria al tratamiento con esteroides. Además de los estudios clínicos
antes mencionados, en la literatura podemos encontrar información sobre la
efectividad del uso de hMSC en el tratamiento de patogías tales como la
osteogénesis imperfecta (OI), el síndrome de Hurler (SH), la leucodistrofia
metacromática (LDM), el infarto agudo al miocardio (IAM), la esclerosis
lateral amiotrófica (ELA) y el infarto cerebral severo (tabla 1).
La OI es una enfermedad autosómica dominante que se manifiesta a nivel
sistémico y que es producida por mutaciones en los genes que codifican para
el colágeno Ι, principal componente de la matriz extracelular de los huesos.
Al no tener una matriz adecuada los huesos de estos niños son quebradizos.
Horwitz y cols. administraron sistémicamente hMSC alogénicas a niños con
OI y observaron que después del trasplante los pacientes tenían huesos más
densos y con un mayor contenido mineral. Además, en los pacientes
trasplantados aumentó la tasa de crecimiento y disminuyó la frecuencia de
fracturas (Horwitz y cols., 1999; Horwitz y cols., 2002).
El SH y la LDM son enfermedades hereditarias en la que los individuos que
la padecen carecen de la α-L-iduronidasa lisosómica y la arilsulfatasa A,
respectivamente, lo que provoca la acumulación de sustancias que generan
defectos esqueléticos y neurológicos que limitan la sobrevida de quienes
padecen estas enfermedades. Los estudios de Koc y cols. (2002) mostraron
que la infusión sistémica de hMSC alogénicas aumentó la densidad mineral
ósea en dos de los casos estudiados, tanto de SH como de LDM. Además,
aumentó la velocidad de conducción nerviosa de los pacientes con LDM en
forma significativa.
Por otra parte, la ELA es una enfermedad neurodegenerativa en la cual las
motoneuronas disminuyen gradualmente su funcionamiento y mueren,
provocando una parálisis muscular progresiva y mortal. En este caso, si
bien es cierto no hubo una reversión de la patología, se observó un lento
decaimiento de la capacidad vital forzada y del ALS Functional Rating Scale
(ALS-FRS) en el 50% de los pacientes trasplantados (Mazzini y cols., 2006).
En el caso del infarto agudo al miocardio, aumentó la perfusión y la
contractilidad del corazón de los pacientes trasplantados intracadiacamente
5
Tabla 1. Estudios clínicos en humanos realizados hasta la fecha utilizando hMSC.
Enfermedad Origen de las células y vía de administración Resultados Referencia
OI Alógenicas (DH), i. v.
Aumento de la tasa de crecimiento y
disminución de la frecuencia de fracturas
Horwitz y cols., 1999 Horwitz y cols., 2002
SH y LDM Alógenicas (DH), i. v.
Aumento de la velocidad de
conducción nerviosa y de la densidad mineral
ósea
Koc y cols., 2002
IAM Autólogas, i. c. Aumento de la perfusión y la
contractilidad cardiaca
Chen SL y cols., 2004 Katritsis y cols., 2007
ELA Autólogas, i. e.
Enlentecimientodel decaimiento de la
capacidad vital forzada y ALS-FRS
Mazzini y cols., 2006
Infarto cerebral Autólogas, i. v.
Leve mejora del déficit neurológico y gran
mejoría en la autonomía de los
pacientes
Bang y cols., 2005
DH = dador histocompatible; i.v. = Intravenosa; i.c. = Intracoronaria; i.e. = Intraespinal Adaptada de Tögel y Westenfelder, 2007
6
con hMSC autólogas (Chen SL y cols., 2004; Katritsis y cols., 2007). Por
otro lado, los pacientes con infarto cerebral severo, trasplantados con
hMSC autólogas mediante vía sistémica, redujeron levemente su puntaje en
la escala de infarto del NIH, que es un índice del déficit neurológico
(capacidad para contestar preguntas, obedecer órdenes, hablar, etc.). Sin
embargo, aumentaron rápidamente su índice de Barthel, que es una
medida del nivel de independencia del paciente (comer, trasladarse entre la
silla y la cama, aseo personal, uso del baño, bañarse, desplazarse, subir y
bajar escaleras, vestirse y desvestirse, control del intestino y control de
orina) y por lo tanto de recuperación funcional (Bang y cols., 2005).
1.3 ¿Por qué el trasplante de MSC se ha evaluado y tiene efectos terapéuticos en patologías con etiologías tan diversas?
Primero que todo, las MSC se obtienen en forma simple a partir de
aspirados de MO, se expanden fácilmente ex vivo y no pierden su fenotipo
ni varían su cariotipo a pesar de ser subcultivadas numerosas veces
(Pittenger y cols., 1999; Bernardo y cols., 2007). Además, son células
derivadas de individuos adultos, obviándose las discusiones éticas que se
suscitan en el caso de las células derivadas de embriones. Otras de las
ventajas del uso de las MSC, es que son capaces de migrar al tejido
injuriado, proceso denominado homing, y ya han sido utilizadas en
humanos como terapia celular sin presentarse hasta la fecha toxicidad o
efectos adversos derivados de su uso (Horwitz y cols., 2002; Koc y cols.,
2002; Fouillard y cols., 2003). Estas características han hecho que en la
actualidad las hMSC sean la herramienta más avanzada existente para
terapia celular. En efecto, hoy existen a lo menos tres productos aprobados
por la FDA: ProchymalTM, ProvacelTM y ChondrogenTM (Tögel y Westenfelder,
2007). En general, el uso de las MSC en terapias celulares está basado en
su potencial de diferenciación. Sin embargo, la principal crontroversia, es
que a pesar de observarse efectos terapéuticos e incluso regeneración del
tejido injuriado, las hMSC del donante se encuentran en un número muy
bajo o simplemente no se encuentran alojadas en el órgano blanco (Caplan
y Dennis, 2006). ¿Cómo podría haber regeneración del tejido dañado si las
hMSC del donante no se encuentran allí? La respuesta está en que el
potencial terapéutico de las hMSC no está basado únicamente en la
7
capacidad de diferenciarse a células del parénquima. Las hMSC también
promueven la regeneración del tejido al fomentar la proliferación y
diferenciación de células troncales endógenas, mediante la producción de
factores tróficos; inducen la neovascularización del tejido dañado; y/o
protegen a las células del parénquima del ataque del sistema inmune,
mediante sus propiedades inmunomoduladoras (Caplan y Dennis, 2006)
(figura 2). De este modo, las hMSC estarían permitiendo la regeneración
del tejido dañado al cambiar el balance entre las células que mueren y las
que son nuevamente generadas.
1.3.1 MSC producen factores tróficos
Tal como se mencionó anteriormente, originalmente las MSC fueron
descritas como células del estroma de la MO, ya que producen la matriz
extracelular, además de una serie de factores de crecimiento y citoquinas
que sustentan la diferenciación de las HSC. Hoy en día se sabe que los
factores secretados por las MSC pueden aumentar la proliferación y
diferenciación de distintas células troncales endógenas o bien prevenir la
muerte de las células del parénquima. Por ejemplo, en modelos de daño
neuronal, existen reportes que indican que las MSC secretan factores, tales
como el factor de crecimiento nervioso (NGF) y el factor neurotrófico
derivado de cerebro (BDNF), que inducen la neurogenesis a partir de
progenitores locales (Mahmood y cols., 2004; Yoo y cols., 2008). Estos
factores además protegen a las células, tanto remanentes como recién
diferenciadas, de la muerte por apoptosis (Kromer, 1987; Hayashi y cols.,
1998; Yoo y cols., 2008). Por último, se ha descrito que las MSC secretan otros
factores antiapoptóticos, como HGF e IGF-1, cuando son trasplantadas en
animales con infarto agudo al miocardio o con daño pancreático (Chen J y cols.,
2003; Izumida y cols., 2005).
1.3.2 MSC inducen neovascularización
Se ha demostrado que las MSC promueven neovascularización tanto in
vitro (Gruber y cols., 2005) como in vivo (Al-Khaldi y cols., 2003). A pesar
de que aún se desconoce el mecanismo de acción subyacente, existen
cada vez más datos que apoyan la idea de que, más que la diferenciación
8
Figura 2. Mecanismos celulares y moleculares asociados a los efectos terapéuticos de las hMSC.
9
de las MSC a células endoteliales, la generación de nuevos vasos
sanguíneos se debe a la liberación de factores angiogénicos en el lugar del
daño. Las MSC expresan genes que codifican para un amplio espectro de
factores angiogénicos incluyendo el factor de crecimiento endotelial
vascular (VEGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y el factor
transformador de crecimiento alfa (TGF-α) (Kinnaird y cols., 2004).
1.3.3 MSC son hipoinmunogénicas e inmunomoduladoras
Las MSC se consideran inherentemente hipoinmunogénicas, porque no
activan el sistema inmune de un organismo receptor aún cuando provengan
de un individuo que no es histocompatible (trasplante alogénico) (Ryan y
cols., 2005). En efecto, las MSC alogénicas no inducen una respuesta
proliferativa de los linfocitos, no activan linfocitos T CD4+ y no son blanco de
linfocitos T CD8+ (Le Blanc y Ringdén, 2005). Por otra parte, aunque
expresen receptor inhibitorio de muerte (KIR) incompatible, las células NK
no las eliminan (Rasmusson y cols., 2003). Además, a pesar de que
expresan constitutivamente MHC de clase Ι y de que la expresión de MHC
de clase ΙΙ se puede inducir con INF-γ (Le Blanc y cols., 2003), no
presentan en su superficie moléculas coactivadoras como B7-1, B7-2, CD40
y CD40L, y por lo tanto no son capaces de actuar como células
presentadoras de antígeno (Tse y cols., 2003). Además, inhiben la
diferenciación y función de las células dendríticas (CD) derivadas de
monocito, que son las principales presentadoras de antígeno en nuestro
organismo (Zhang y cols., 2004; Beyth y cols., 2005; Jiang y cols., 2005). La
activación de las CD es un elemento clave en la respuesta inmune, ya que
las CD inmaduras no solamente no activan a los linfocitos T, sino que
además inducen tolerancia antígeno-específica. Es por esto que decimos
que las MSC no sólo son hipoinmunogénicas sino también
inmunoreguladoras.
La inmunoregulación mediada por las MSC, se explica en parte, debido a
que la interacción de estas células con las CD impide la diferenciación de
estás últimas a un fenotipo activador, previniendo así la expansión y
activación de los linfocitos T, al igual que la capacidad citotóxica de las
células NK. Además, estimula la aparición de linfocitos T reguladores
10
(Maccario y cols., 2005). Por otra parte, cuando las MSC se cocultivan con
una mezcla de linfocitos reactivos (MLR), inhiben la proliferación de los
linfocitos T “respondedores” mediante mecanismos que involucran la
secreción de factores solubles como TGF-β1, HGF (Di Nicola y cols., 2002)
y PGE2 (Aggarwal y Pittenger, 2005) o la expresión de idolamina 2,3
dioxigenasa (IDO) (Meisel y cols., 2004; Plumas y cols., 2005).
Interesantemente, esta última ha sido asociada con la evasión de ciertos
tumores al sistema inmune (Yoshida y cols., 1988) y con la tolerancia
materno-fetal (Munn y cols., 1998). La IDO participa en el catabolismo del
triptofano, aminoácido que juega un rol esencial en la respuesta inmune.
Los linfocitos T que se encuentran en un medio carente de triptofano no son
capaces completar su proliferación y mueren por apoptosis (Lee y cols.,
2002). Además, se ha descrito que la kinurenina, un metabolito del
catabolismo del triptofano, induce la apoptosis selectiva de los linfocitos Th1
mediante un mecanismo independiente de la interacción Fas/FasL
(Fallarino y cols., 2002). De este modo, se genera un microambiente
tolerogénico alrededor de las células que expresan IDO. Recientes estudios
muestran que las MSC expresan IDO cuando son inducidas con INF-γ. In
vitro, la expresión de IDO por parte de las MSC inhibe la proliferación de
linfocitos T (Meisel y cols., 2004) y promueve la apoptosis de linfocitos T
activados (Plumas y cols., 2005).
En conjunto, estas características han llevado a los investigadores a sugerir
que las MSC son inmunosupresores universales (Maccario y cols., 2005) y
a “aventurarse” a evaluar la contribución de las MSC como alternativa
terapéutica para enfermedades autoinmunes como esclerosis múltiple en
modelos animales (Zappia y cols., 2005, Lanza y cols., 2009) y como
terapia para el rechazo agudo del injerto contra huésped en humanos (Le
Blanc y cols., 2005). En estos casos se han realizado tanto trasplantes
autólogos como alogénicos, y en ambos casos se han obtenido buenos
resultados, indicando que las propiedades hipoinmunogénicas e
inmunomoduladoras se mantienen aún cuando el dador no es
histocompatible.
11
En resumen, las hMSC aparecen como la mejor alternativa para realizar
terapia celular, ya que son células troncales adultas de fácil obtención,
pueden expandirse ex vivo, se diferencian a distintos linajes celulares,
secretan factores tróficos que promueven la diferenciación de progenitores
locales y la neovascularización en los tejidos dañados y tienen propiedades
inmunomoduladoras, por lo tanto al ser trasplantadas no son rechazadas
aunque provengan de un donante no histocompatible. Sin embargo, todos
estos mecanismos, no explican el amplio beneficio terapéutico que se
observa al utilizar las MSC para terapia celular. Probablemente existan
otros mecanismos, como por ejemplo, la capacidad de las MSC de actuar
como moduladoras del daño tisular, en particular, del daño producido por un
fuerte EO.
1.4 ¿Podrían las MSC manejar eficientemente el EO?
Las células poseen una amplia gama de enzimas para manejar el EO, tales
como SOD, CAT y GPX (figura 3). Existen 3 tipos de SOD: SOD1 (citosólica),
SOD2 (mitocondrial) y SOD3 (extracelular) (Zelko y cols., 2002). Todas
poseen la misma actividad enzimática, dismutar el anión superóxido a
oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno. Por otra parte, CAT es la
encargada de descomponer el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno
molecular. Por último, GPX también cataliza la reducción del peróxido de
hidrógeno, utilizando para ello GSx reducido (GSH) como sustrato. Existen al
menos 4 formas de GPX: una forma intracelular (GPX1), una extracelular que
se expresa sólo en células del intestino (GPX2), una extracelular que se
encuentra principalmente en plasma (GPX3) y una asociada a la membrana y
con actividad específica para los fosfolipoperóxidos (GPX4) (Brigelius-Flohé,
2006). La GPX1 es la isoforma más abundante de todas las GPXs y se
expresa en la mayoría de los tejidos de mamíferos (Lei y cols., 2007).
Además de las enzimas mencionadas anteriormente, existen otros
mecanismos para depurar ROS y RNS. Dentro de éstos destaca el GSx, un
tripéptido soluble en agua compuesto por los aminoácidos: glutamina,
cisteína y glicina (Townsend y cols., 2003). En las células, el GSx se puede
encontrar tanto oxidado (GSSG) como reducido (GSH). El reciclaje de la
forma oxidada, es muy importante para la sobrevida celular, ya que es la
12
Figura 3. Esquema de los mecanismos celulares de depuración de especies reactivas.
Xenobiótico Intermediario radicalario
GSSG GSH
G-6-P
SOD
GSH GSSG
NADP+ NADPH
GSx Reductasa
G-6-P Deshidrogenasa
6-fosfogluconato
O2 O2•_ H2O2 H2O
GPX
Fe2+/3+
CAT
H2O + O3
HO
Daño Oxidativo: • DNA • Proteínas • Lípidos
13
forma reducida la que actúa como defensa antioxidante (Townsend y cols.,
2003; Wu y cols., 2004). El GSH juega un rol fundamental en la eliminación
de H2O2 y lipoperóxidos (LPO), ya que es utilizado como sustrato en la
catálisis ejercida por GPX (figura 3). Pero el GSH no sólo es un sustrato
para GPX, sino que también es un potente agente reductor capaz de
reaccionar directamente con ROS/RNS y además ejerce otras funciones, no
relacionadas con el EO (figura 4). Por ejemplo, participa en la síntesis de
leucotrienos y prostaglandinas, en la formación de aductos glutatión-NO y la
reserva y transporte de cisteína; y como regulador del estatus redox
intracelular, de la producción de citoquinas y respuesta inmune y de la
función e integridad mitocondrial (Townsend y cols., 2003). Con tantas
funciones no es de extrañarse que una falla en la regulación de la síntesis
del GSx, o en el reciclaje del GSx oxidado, genere condiciones patológicas.
En efecto, el desbalance en la homeostasis del GSx está relacionado con
varias patologías tales como desórdenes neurodegenerativos, fibrosis
quística, HIV, enfermedades cardiacas y hepáticas, isquemia, infarto cerebral
y enfermedades metabólicas (diabetes y obesidad) (Townsend y cols., 2003;
Franco y cols., 2007).
En conjunto, estos mecanismos de manejo del EO, son sumamente
importantes para eliminar las ROS y RNS derivadas de xenobióticos u otros
agentes agresores, o bien derivadas del propio metabolismo celular. Un
ejemplo de ello es que células que son deficientes en SOD, CAT y GPX,
como lo son las células β-pancreáticas, son sensibles a la muerte inducida
por EO (Robertson y Harmon, 2007). En efecto, a modo de estrategia
terapéutica, se ha intentado aumentar la resistencia al EO de células
β-pancreáticas mediante terapia génica, incorporando genes que codifican
para SOD (Moriscot y cols., 2000), CAT (Benhamou y cols., 1998) o GPX
(Moriscot y cols., 2003).
Sorprendentemente, hasta la fecha son pocos los antecedentes sobre los
mecanismos que las MSC poseen para manejar ROS y RNS.
Recientemente se ha publicado que las hMSC-TERT (hMSC
inmortalizadas) y las MSC de rata (rMSC) expresan SOD, CAT y GPX
(Ebert y cols., 2006; Stolzing y Scutt, 2006). Sin embargo, aún no se ha
descrito si las hMSC sin modificaciones genéticas expresan estas enzimas
14
Figura 4. Roles del GSH en células animales (adaptado de Townsend y cols., 2003).
15
y tampoco se han realizado estudios que indiquen el potencial que poseen
estas células para manejar el EO. Evidencias indirectas indican que
probablemente estas células son resistentes al EO, ya que se mantienen en
cultivo in vitro y resisten la radiación γ (Plumas y cols., 2005), dos
condiciones que generan un fuerte EO (Halliwell y Whiteman, 2004).
Considerando lo hasta aquí expuesto, el objetivo de esta tesis fue
caracterizar a las hMSC con respecto al manejo del EO. Primero, se
determinó si las hMSC resisten a la muerte inducida por la exposición a
ROS (H2O2), a RNS (SNAP) o a ambas (SIN-1) y se determinaron los
niveles intracelulares de ROS/RNS cuando las células son expuestas a
SIN-1 (figura 5). Luego, se determinaron las herramientas que las hMSC
poseen para depurar las especies reactivas. Para ello, se cuantificó la
expresión y actividad de enzimas asociadas a la eliminación de ROS y/o
RNS: SOD, CAT y GPX1. Además, se evaluaron los niveles basales de
GSx. Finalmente, se determinó cual es la contribución del GSx dentro de los
mecanismos asociados al manejo del EO que poseen las hMSC. Para ello
se evaluó la resistencia a la muerte inducida por la exposición a ROS y/o
RNS de hMSC a las cuales se les depletó de GSx.
16
Figura 5. Esquematización de los objetivos específicos, los diseños experimentales y la información que se obtendrá.
Objetivo 2 Tinción con DHR y medición mediante citometría de flujo
SIN-1
Determinación actividad enzimática mediante espectrofotometría
Objetivo 3
hMSC
hMSC
Determinación de GSx mediante espectrofotometría
Objetivo 4 hMSC
Objetivo 1 H2O2 ó SNAP ó SIN-1
Tinción con cristal violeta y medición espectrofométrica
hMSC
Objetivo 5 Depleción de GSx hMSC
Capacidad para eliminar
ROS/RNS
Presencia de SOD, CAT y GPX
Niveles basales de GSx
Contribución de GSx a la
resistencia al EO
H2O2 ó SNAP ó SIN-1
RT-PCR tiempo real
Sensibilidad a la muerte inducida
por EO
Tinción con cristal violeta y medición espectrofométrica
17
Hipótesis
Las hMSC resisten a la muerte inducida por EO debido a que presentan la
maquinaria necesaria para eliminar eficientemente ROS y RNS.
Objetivo General
Caracterizar la resistencia de las hMSC a la muerte inducida por EO y la
maquinaria molecular asociada a la eliminación de ROS y RNS.
Objetivos Específicos
1. Determinar la susceptibilidad de hMSC a la muerte inducida por ROS, RNS o
ambos.
2. Determinar los niveles de ROS y/o RNS en hMSC expuestas a EO.
3. Determinar, en hMSC, la expresión y actividad de SOD1, SOD2, CAT y GPX1,
enzimas involucradas en la eliminación de ROS y RNS.
4. Determinar los niveles basales de GSx en hMSC.
5. Determinar la susceptibilidad de las hMSC depletadas de GSx a la muerte
inducida por EO.
Los resultados obtenidos para las hMSC serán comparados con los
resultados obtenidos para fibroblastos de piel humanos (hFib), modelo de
células resistentes al EO, y células de insulinoma de rata (INS-1), modelo
de células altamente sensibles al EO (Tran y cols., 2003).
18
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Obtención y cultivo de hMSC.
2.1.1 Aislamiento de hMSC
Las hMSC se aislaron desde muestras de MO de individuos jóvenes. Cada
muestra de MO se diluyó 1:5 (V/V) en PBS (Sigma, St. Louis, MO, USA) y
luego se centrifugó durante 20 min a 400 xg y temperatura ambiente (TA)
utilizando una centrífuga Eppendorf 7204 (Hamburgo, Alemania). Luego, se
descartó el sobrenadante y la pella se resuspendió en medio de cultivo α-10:
α-MEM (Sigma, St. Louis, MO, USA), SFB 10% (V/V) (Hyclone, Logan, UT,
USA) y gentamicina 80 μg/mL (Laboratorio Biosano, Santiago, Chile). Las
células mononucleadas se sembraron en placas p100 (poliestireno de área
total de cultivo 59 cm2) (Falcon, Becton Dickinson and Company, NJ, USA) a
la densidad de 1x106 células/cm2 y se cultivaron con medio α-10 en un
incubador (Thermo Forma, OH, USA) a 37ºC y atmósfera húmeda que
contenía 5% de CO2 (Indura, Santiago, Chile). Aproximadamente 48 horas
después, las placas se lavaron 2 veces con PBS para eliminar las células no
adheridas y se agregó medio α-10, el cual se renovó completamente cada
72 horas. Cuando la monocapa adherente llegó a 90-100% confluencia, las
células se lavaron con PBS y se tripsinizaron incubando con tripsina 0,25%
(P/V), EDTA 2,65 mM (Gibco, Grand Island, NY, USA) durante 5 min a 37ºC.
Luego se inhibió a la tripsina agregando 1 volumen de α-10 y se contaron
las células utilizando tinción con azul tripán 0,4% (P/V) (Gibco, Grand Island,
NY, USA), una cámara de Neubauer con mejora de línea brillante (Precicolor
HBG, Alemania) y un microscopio óptico invertido con contraste de fase
(Eclipse TS100-F, Nikon, Japón). Posteriormente, las hMSC se centrifugaron
durante 10 min a 400 xg y TA para eliminar la tripsina y se sembraron a la
densidad de 7.000 células/cm2 en placas p100 para expandirlas o bien se
criopreservaron en SFB 90% (V/V) y DMSO 10% (V/V) (Gibco, Grand Island,
NY, USA) a una densidad de 1 x 106 células/mL utilizando criotubos de
polipropileno de 1,8 mL tratados internamente (Nunc, Roskilde, Dinamarca)
y un ascensor Taylor-Wharton para nitrógeno líquido (20 min congelamiento
lento 3.5ºC/min y 20 min congelamiento medio 8ºC/min) y se almacenaron
en nitrógeno líquido (-196ºC). Las hMSC aisladas se caracterizaron según
19
morfología, tiempo de duplicación poblacional y capacidad de diferenciación
a linajes mesenquimáticos (adipo, osteo y condrogénico). Después de la
caracterización las células se denominaron hMSCx, en dónde x corresponde
a un número correlativo, y se utilizaron para los experimentos de esta tesis.
2.1.2 Determinación del tiempo de duplicación poblacional
Las hMSC se sembraron en placas p48 (poliestireno de área total de cultivo
0,75 cm2) (Falcon, Becton Dickinson and Company, NJ, USA) a una
densidad de 5.300 células/cm2 y se cultivaron en α-10. A los días 1, 3 y 8 se
determinó el número de células en cultivo mediante tinción con cristal violeta
(ver protocolo más adelante). El tiempo de duplicación poblacional se obtuvo
a partir de la gráfica de absorbancia corregida (570 nm) versus tiempo (días)
en la fase log.
2.1.3 Tinción con cristal violeta
Se preparó una solución de cristal violeta 0,2 % (P/V) (Merck, Darmstadt,
Alemania) en etanol 10% (V/V) (Merck, Darmstadt, Alemania) que luego se
filtró utilizando un filtro de 0,2 μm (Orange, Braine-L’Alleud, Bélgica) para
remover los restos de cristal violeta no disueltos. Las células se lavaron
1 vez con PBS, luego se agregó 0,25 mL/cm2 de cristal violeta 0,2 % (P/V) y
se incubó durante 5 min a TA. Posteriormente, las células se lavaron
4 veces con PBS (1,3 mL/cm2) y se solubilizó el cristal violeta adherido a las
células agregando 0,25 mL/cm2 de una mezcla 1:1 de NaH2PO4 0,1 M
pH 4,5 (Merck, Darmstadt, Alemania) y etanol absoluto. Finalmente, 150 μL
de cada pocillo se traspasaron a una placa p96 de fondo plano (Orange,
Braine-L’Alleud, Bélgica) para determinar la absorbancia a 570 nm utilizando
un lector de ELISA (Sunrise, Tecan, Austria). La absorbancia a 570 nm es
directamente proporcional al número de células que están adheridas a la
placa. Los resultados se corrigieron respecto a la absorbancia del blanco.
2.1.4 Diferenciación adipogénica
Las hMSC se sembraron en placas p24 (poliestireno de área total de cultivo
2 cm2) (Falcon, Becton Dickinson and Company, NJ, USA) a una densidad
de 25.000 células/cm2 y se cultivaron con medio α-10 (día 0). El día 1 se
cambió el medio de cultivo por el medio de diferenciación adipogénica
(0,25 mL/cm2) que contiene: dexametazona 1μM (Sigma, St. Louis, MO,
20
USA), 3-isobutil 1-metil xantina 100μg/mL (Calbiochem, San Diego, CA,
USA), insulina 0,2 U/mL (Eli Lilly, Indianapolis, IN) e indometacina 100 μM
(Sigma, St. Louis, MO, USA). El medio de diferenciación se renovó dos
veces a la semana. Al día 7, se observaró la aparición de gotas de grasa
mediante microscopía de luz invertida y tinción con una solución de Oil Red
O (Sigma, St. Louis, MO, USA).
2.1.5 Tinción con Oil Red O
Se preparó una solución Oil Red O saturado en isopropanol 60% (V/V)
(Merck, Darmstadt, Alemania). Para ello, el isopropanol se calentó a 37°C y
se agregó Oil Red O hasta generar una solución saturada, la cual se filtró
con un filtro de 0,2 µm. Las células fueron lavadas 2 veces con PBS.
Posteriormente, se agregó 0,25 mL/cm2 de Oil Red O saturado en
isopropanol y se incubó durante 1 hora a TA. A continuación, se lavó
2 veces con PBS, se observaron las gotas de grasa teñidas de color rojo en
el microscopio óptico y se realizó registro fotográfico digital (Cámara digital
Camedia C-5050 Zoom, 5 Megapixeles, Olympus, Japón).
2.1.6 Diferenciación osteogénica
Las hMSC se sembraron en placas p24 a una densidad de
25.000 células/cm2 y se cultivaron con medio α-10 (día 0). El segundo día
(día 1) se cambió el medio de cultivo por el medio de diferenciación
osteogénica que contiene: dexametazona 0,1 μM, ascorbato 2-fosfato
50 μg/mL (Sigma, St. Louis, MO, USA) y β-glicerol fosfato 10 mM (Sigma, St.
Louis, MO, USA). Cada 2 días se renovó el ascorbato 2-fosfato. El día 14 se
determinó la mineralización mediante tinción con Alizarin Red (Sigma, St.
Louis, MO, USA).
2.1.7 Tinción con Alizarín Red
Las células se lavaron 2 veces con PBS luego se fijaron con etanol 70%
(V/V) durante 30 min a TA. Posteriormente, se lavaron nuevamente con PBS
y luego se incubaron con 0,25 mL/cm2 de una solución Alizarín Red en
NaH2PO4 40 mM durante 10 min a TA. Después de lavar 5 veces con agua
bidestilada (Apiroflex®, Sanderson, Santiago, Chile) se incubaron con PBS
durante 15 min a TA. Finalmente, se observó el precipitado rojo de
21
hidroxiapatita en el microscopio óptico invertido con contraste de fase y se
realizó registro fotográfico digital.
2.1.8 Diferenciación condrogénica
Las hMSC se sembraron en placa p24 en una gota de 10 μL
(3.000 células/μL), para obtener una micromasa, y se cultivaron en medio
α-10 (día 0). Una hora después se agregó el medio de diferenciación
condrogénica (0,25 mL/cm2) que contiene: dexametazona 10 μM, ascorbato
2-fosfato 50 μg/mL, insulina 0,5 U/mL y TGF-β3 10 ng/mL (R&D Systems,
Minneapolis, MN, USA). Dos veces a la semana se renovó el medio de
diferenciación. La diferenciación condrogénica se evaluó tiñendo las
micromasas con Safranina O (Merck, Darmstadt, Alemania).
2.1.9 Tinción con Safranina O
Se preparó una solución Safranina O al 0,1% (P/V) en etanol. Las células se
lavaron 2 veces con PBS y se fijaron con 0,15 mL/cm2 de etanol al 70%
(V/V) durante 10 min, luego se agregó 0,15 mL/cm2 de Safranina O y se
incubó durante 5 min a TA. A continuación, se lavó 1 vez con agua destilada,
5 veces con 0,15 mL/cm2 de etanol 70% (V/V) y 1 vez con 0,15 mL/cm2 de
etanol absoluto. Finalmente, la micromasa y la tinción de color rojo
correspondiente a proteoglicanos se observaron al microscopio óptico
invertido con contraste de fase y se realizó registro fotográfico digital.
2.2 Obtención y cultivo de hFib. Los hFib se aislaron a partir de muestras de piel de individuos sanos. Con el
fin de que los trozos de piel se adhirieran a la placa, éstos se sembraron en
placas p100, se cubrieron con una gota de α-10 que contenía Anfotericina B
0,2 μg/mL (Gibco, Grand Island, NY, USA) y se cultivaron durante toda la
noche en incubador a 37ºC en una atmósfera húmeda que contiene 5% de
CO2. Posteriormente, se descartaron los trozos no adheridos y los adheridos
se cultivaron en 7 mL de α-10 que contenía Anfotericina B 0,2 μg/mL,
renovando la mitad del medio de cultivo dos veces a la semana. Las pieles
se cultivaron hasta observar colonias confluentes de hFib alrededor de ellas.
En este momento, las pieles se eliminaron, las placas se lavaron una vez
con PBS y los focos de hFib se disgregaron utilizando 500 μL de tripsina
0,25% (P/V), EDTA 2,65 mM e incubando durante 5 minutos a 37ºC. Una
22
vez trascurrido el tiempo de incubación, se agregaron 10 mL de α-10 a los
hFib, se cultivaron durante toda la noche y posteriormente se renovó todo el
medio de cultivo. Cuando la monocapa adherente llegó a confluencia, las
células se tripsinizaron, lavaron con PBS, resuspendieron en α-10 y
subcultivaron a la densidad de 7.000 células/cm2 para expandirlas.
Alternativamente, se criopreservaron en SFB con DMSO 10% (V/V) a una
densidad de 1 x 106 céls/mL utilizando un ascensor Taylor-Wharton para
nitrógeno líquido (20 min congelamiento lento 3,5ºC/min y 20 min
congelamiento medio 8ºC/min) y se almacenaron en nitrógeno líquido
(-196ºC).
2.3 Cultivo de células INS-1 clon 832/13.
La línea celular β-pancreática de rata INS-1 clon 832/13, fue gentilmente
donada por la Dra. Lisa Poppe (Centro Médico Universidad de Duke, Durham,
USA). Estas células poseen el gen de la insulina humana clonado en forma
estable (Hohmeier HE, 2000). Para expandir las células INS-1 clon 832/13,
éstas se sembraron en placas p100 a una densidad de 35.000 células/cm2 y
se cultivaron en medio de cultivo INS: RPMI (Gibco, Grand Island, NY, USA),
SFB 10% (V/V) (Hyclone, Logan, UT, USA), HEPES 10 mM (Sigma, St. Louis,
MO, USA), Piruvato de Sodio 1 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),
β-mercaptoetanol 50 μM (Sigma, St. Louis, MO, USA), Penicilina 100 U/mL
(Gibco, Grand Island, NY, USA) y Estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY,
USA). Cuando las células llegaron a 80-90% de confluencia se tripsinizaron,
lavaron con PBS, resuspendieron en medio INS y subcultivaron a la densidad
de 35.000 células/cm2. Alternativamente, se criopreservaron en medio
INS con DMSO 10% (V/V) a una densidad de 2 x 106 céls/mL utilizando un
ascensor Taylor-Wharton para nitrógeno líquido (20 min congelamiento lento
3,5ºC/min y 20 min congelamiento medio 8ºC/min) y se almacenaron en
nitrógeno líquido (-196ºC). Para facilitar la lectura de esta tesis, en adelante
se hará referencia a estas células como INS-1, en vez de INS-1 clon 832/13.
23
2.4 Ensayos de citotoxicidad. En placas p48 se sembraron las hMSC y los hFib a una concentración de
25.000 células/cm2 y las células INS-1 a una concentración de
60.000 células/cm2 en sus medios respectivos durante 24 horas.
Posteriormente, las células se cultivaron durante 18 horas en 0,3 mL/cm2 de
α-10 con concentraciones crecientes de 3-morfolinosidnoimina (SIN-1; Sigma,
St. Louis, MO, USA), S-nitroso-N-acetilpenicilamina (SNAP; Sigma, St. Louis,
MO, USA) o peróxido de hidrógeno (H2O2; Sigma, St. Louis, MO, USA). La
viabilidad celular se determinó mediante tinción con cristal violeta y la
concentración letal 50 (concentración de estresor a la cual la viabilidad
celular es de 50%, CL50) se determinó a partir de la ecuación de la recta de
gráficas de porcentaje de viabilidad versus concentración de agente estresor.
2.5 Detección de ROS y/o RNS intracelulares. En placas p24 se sembraron las hMSC y los hFib a una concentración de
25.000 células/cm2 y las células INS-1 a una concentración de
60.000 células/cm2. Las hMSC y los hFib se cultivaron durante 24 horas en
α-10, mientras de las células INS-1 se cultivaron en medio INS.
Posteriormente, las células se incubaron con 0,13 mL/cm2 de SIN-1 0,75 mM
(en α-10) durante 1 hora. Luego, las células se lavaron con solución salina
balanceada con Hepes (HBSS; Hohmeier y cols., 2000) y se incubaron con
0,2 mL/cm2 de dihidrorodamina (DHR, Calbiochem, San Diego, CA, USA)
5 μM en HBSS durante 1 hora. DHR al unirse a ROS/RNS emite
fluorescencia la cual se detectó mediante citometría de flujo (Citómetro CyAn,
DAKO, Carpintería, CA, USA). Tanto para las muestras como para los
controles, se calculó la intensidad de fluorescencia neta (IFN) que es el
cuociente entre la intensidad de fluorescencia media en presencia de DHR y
la intensidad de fluorescencia media en ausencia de DHR. Finalmente, los
datos se expresaron como el cuociente entre la IFN de la muestra y la IFN
del control. Así, la fluorescencia emitida es directamente proporcional a la
cantidad de ROS/RNS intracelulares.
24
2.6 Evaluación de la expresión génica.
2.6.1 Extracción de RNA y obtención de cDNA
Se extrajo RNA total de las células, utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los
remanentes de DNA genómico se degradaron utilizando DNAasa Ι (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Posteriormente, se cuantificó el RNA mediante espectrofotometría a 260 nm
utilizando un espectrofotómetro BioMate 3 (Termo Spectronic, Rochester, NY,
USA). Y se determinó la pureza del material obtenido calculando la relación
absorbancia 260nm/280nm. Se utilizaron muestras con una relación
260nm/280nm entre 1,7 y 1,9. Para la reacción de transcripción inversa (RT)
se utilizó 1 μg de RNA total, 200 U de la transcriptasa inversa M-MLV
(Promega, Madison, WI, USA) y 300 pmoles de un partidor oligo(dT) en 25 μL
totales de mezcla de reacción. La reacción se efectuó siguiendo las
instrucciones del fabricante de la enzima.
2.6.2 PCR cuantitativo para SOD1, SOD2, CAT , GPX1 y GAPDH
Las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen final de 10 μL
correspondientes a 2 μL de la reacción de RT y 8 μL de una mezcla de PCR
que contenía Taq DNA polimerasa + tampón de reacción + dATP + dUTP +
dCTP + dGTP + SYBR Green Ι (LightCycler-DNA Máster SYBR Green,
Roche, Alemania) + MgCl2 entre 3-4 mM, partidor sentido 0,5 μM y partidor
antisentido 0,5 μM en un termociclador LightCycler (Roche, Alemania). Las
concentraciones de enzima, tampón de reacción y dNTPs corresponden a
las recomendadas para el kit. Las condiciones específicas de amplificación
de los genes se resumen en la tabla 2. En la tabla 3 se muestran las
secuencias de los partidores utilizados, el tamaño y la temperatura de
denaturación teóricas (Tm) para cada amplicón. El análisis de Tm se realizó
después de la amplificación mediante un ciclo que consistió en aumentar la
temperatura a 95°C a 20°C/s para la denaturación total de la doble hebra,
luego bajando la temperatura hasta 65°C a una velocidad de 20°C/s para la
renaturación y finalmente elevando la temperatura hasta 95°C a una
velocidad de 0,1°C/s, registrando la pérdida de fluorescencia cada 0,1°C. El
tamaño empírico de los amplicones se determinó mediante electroforesis en
25
Tabla 2. Condiciones específicas para realizar PCR cuantitativo.
Denaturación Apareamiento Extensión Gen Concentración
Mg+2 (mM) T (°C) t (s) T (°C) t (s) T (°C) t (s) Número de ciclos
SOD1 3,0 95 5 56 10 72 5 30
SOD2 3,0 95 5 56 10 72 6 35
CAT 3,0 95 5 60 10 72 5 35
GPX1 3,0 95 5 65 10 72 10 35
GADPH 3,5 95 5 57 20 72 5 35
La temperatura de apareamiento se calculó utilizando la fórmula: T (ºC) = (A + T x 2) + (C + G x 4)
El tiempo de apareamiento se calculó utilizando la fórmula: t (s) = 1 segundo x (tamaño amplicón/25 pb)
26
Tabla 3. Partidores específicos para PCR cuantitativo.
Amplicón
Gen Nº acceso GenBank
Sentido (5’→3’)
Antisentido (5’→3’)
Tamaño teórico
(pb)
Tm teórica
(ºC)
Referencia
SOD1 NM_000454 GGT CCT CAC TTT AAT CCT CTA T
CAT CTT TGT CAG CAG TCA CAT T
96 83 Tajouri y cols., 2003
SOD2 NM_000636 TGA CAA GTT TAA GGA GAA GC
GAA TAA GGC CTG TTG TTC C 148 85 ------
CAT NM_001752 AAG AAA GCG GTC AAG AAC TTC
GTG TGA ATC GCA TTC TTA GGC
107 84 ------
GPX1 NM_000581 CGC CAC CGC GCT TAT GAC CG
GCA GCA CTG CAA CTG CCA AGC AG
238 93 Hamanishi y cols., 2004
GADPH AF261085 CAG CCT CAA GAT CAT CAG CA
CAT GAG TCC TTC CAC GAT AC
100 85 Millington-Ward y cols., 2002
Las Tm ajustadas a la concentración de sales del kit LightCycler-DNA Master SYBR Green Ι (Roche) (K+ 200 mM, Na+ 200 mM, Mg+2 3 mM) se calcularon utilizando el software “BioMath - Tm Calculations for Oligos” (freeware) (http://www.promega.com/biomath/calc11.htm#disc, acceso en Octubre 2006).
27
gel de agarosa al 2% (Winkler, Santiago, Chile), utilizando un estándar de
peso molecular de 100 pb (GeneRuler™ DNA Ladder 0,5 μg/μL; Fermentas
Life Sciences. Hanover, MD, EE.UU) como marcador de tamaño. Los geles se
tiñeron con bromuro de etidio (Sigma, St. Louis, MO, USA) durante 10 min,
una vez revelados se visualizaron utilizando un transiluminador de luz
ultravioleta (UVP M-20, Upland, CA, USA). Finalmente se realizó registro
fotográfico digital de los geles. En la figura 6 se resume la puesta a punto para
cada PCR cuantitativa.
2.6.3 Curva estándar para PCR cuantitativo
Una vez que se estandarizaron las condiciones de amplificación para cada gen
de interés, se obtuvieron amplicones generados a partir de cDNA de hMSC y
se precipitaron agregando 1/10 de acetato de sodio 3 M pH 5,2 (Sigma, St.
Louis, MO, USA) y 2 volúmenes de etanol absoluto a 4ºC. Esta mezcla se
incubó durante toda la noche a -20ºC y luego se centrifugó durante 15 min a
10.000 xg a 4ºC. El DNA obtenido se resuspendió en agua libre de DNAsa, se
cuantificó midiendo su absorbancia a 260 nm y se calculó la concentración
utilizando la siguiente fórmula:
DNA [ng/μL] = Abs260 x 50 ng/μL x factor de dilución
A partir de esta solución stock se generaron diluciones seriadas en base 10,
las cuales se usaron como molde para nuevas reacciones de PCR
cuantitativo. La curva estándar se construyó graficando el logaritmo de la
concentración vs. número de ciclos umbral (figura 7). A partir de la curva
estándar se determina la eficiencia de amplificación y el límite de detección
(LD) de la PCR para cada gen. Para calcular este último se consideró la
dilución menor que amplificó y luego la cantidad de DNA se transformó a
número de copias según la fórmula:
DNA [copias/μL] = DNA [pg/μL] x 6x1023 (copias/mol)
6,6x1014 (pg/molxpb) x tamaño amplicón (pb)
Dado que los estándares para generar esta curva corresponden a diluciones
de amplicones, la eficiencia de amplificación y el límite de detección,
podrían ser algo distintos a los del molde que es cDNA total.
28
CPCN
CP CN
CPCN
Figura 6. Curvas de melting para SOD1, SOD2, CAT y GPX-1. Las curvas fueron obtenidas mediante el software LigthCycler versión 3 (Roche Molecular Biochemicals). Como control positivo se utilizó cDNA de la línea celular HeLa. Los valores de Tm empírica fueron calculados a partir de 3 muestras independientes (± desviación estándar). Insertos: gel de agarosa 2%, carril 1: estándar 1 kb (Fermentas); carril 2: amplicón SOD1 o SOD2 o CAT o GPX-1. CP: control positivo, CN: control negativo.
SOD1 Tm empírica: 83,14 ± 0,42ºC
SOD2 Tm empírica: 85,72 ± 0,53ºC
CP CN
GPX-1 Tm empírica: 91,27 ± 0,18ºC
CAT Tm empírica: 85,15 ± 0,61ºC
500 pb
300 pb
100 pb
CP
500 pb 300 pb 100 pb
CP
500 pb 300 pb 100 pb
CP
500 pb
300 pb
100 pb
CP
29
Figura 7. Curva estándar para PCR cuantitativo de SOD1, SOD2, CAT y GPX-1. Las curvas y datos de intercepto, pendiente y r se obtuvieron utilizando el software LigthCycler versión 3 (Roche Molecular Biochemicals). El LD se calculó tal como se describe en la sección 2.6.3 de Materiales y Métodos.
Intercepto: 14,15 Pendiente: - 3,72 r: -1.00 LD: 4732 copias/μL
SOD1
Intercepto: 9,27 Pendiente: - 3,47 r: -1.00 LD: 31 copias/μL
SOD2
Intercepto: 9,08 Pendiente: - 1,25 r: -0,93 LD: 1 copia/μL
CAT
Intercepto: 10,70 Pendiente: - 2,98 r: -1.00 LD: 1871 copias/μL
GPX1
30
2.6.4 Cuantificación relativa
Los datos de PCR obtenidos se analizaron mediante el método comparativo
de CT, tal como sugieren Schmittgen y Livak (2008). En resumen, los CT
obtenidos para los genes de interés se relativizaron utilizando el CT
obtenido para GAPDH (gen control interno), asumiendo una eficiencia de
amplificación similar entre las PCR.
2.7 Determinación de la actividad de enzimas relacionadas al manejo del EO.
2.7.1 Medición actividad enzimática de SOD
Las hMSC y los hFib se sembraron en placas p100 a una densidad de
7.000 células/cm2 y las células INS-1 a una densidad de 35.000 células/cm2,
en sus medios respectivos. Cuando las células alcanzaron el 80-90% de
confluencia, se cosecharon utilizando una plumilla (sin utilizar tripsina), se
lavaron 2 veces con PBS y se lisaron en 1 mL de un tampón pH 7,2 que
contenía Hepes 20 mM, EGTA 1mM (Sigma, St. Louis, MO, USA), Manitol
210 mM (Sigma, St. Louis, MO, USA), Sacarosa 70 mM (Merck, Darmstadt,
Alemania) y Tritón-X 100 0,1% (Sigma, St. Louis, MO, USA), mediante 3
ciclos de congelamiento (2,5 minutos en nitrógeno líquido, -190ºC) y
descongelamiento (2,5 minutos en baño termoregulado a 37ºC). Luego, el
lisado celular se centrifugó a 1.500 xg durante 5 minutos a 4ºC y se
recuperó el sobrenadante, el cual se centrifugó nuevamente, esta vez a
10.000 xg durante 15 minutos a 4ºC. Se recuperó el sobrenadante, se
apartó una alícuota de 25 μL para cuantificar proteínas (utilizando el kit
BCA-1, Sigma, St. Louis, MO, USA) y el resto se almacenó a -80 ºC hasta la
determinación de la actividad enzimática. La actividad de SOD1 se midió
utilizando el kit Superoxide Dismutase Assay ΙΙ (Calbiochem, San Diego, CA,
USA), siguiendo las instrucciones del proveedor. Este es un método
espectrofotométrico (450 nm) que permite medir actividad de SOD en un
rango 0,025-0,25 U/mL. La actividad enzimática de SOD1 se expresó como
U/mg de proteína, en dónde 1 unidad se define como la cantidad de enzima
necesaria para dismutar el 50% de los radicales superóxido.
31
2.7.2 Medición actividad enzimática de CAT
Las hMSC, hFib y células INS-1 se sembraron, cultivaron y cosecharon
utilizando las condiciones descritas para la medición de la actividad
enzimática de SOD1 (sin utilizar tripsina). Posteriomente, las células se
lisaron en 1 mL de un tampón pH 7,0 que contenía fosfato de potasio 50 mM
(Merck, Darmstadt, Alemania), EDTA 1 mM (Merck, Darmstadt, Alemania) y
Tritón X-100 0,1%, mediante 3 ciclos de congelamiento/descongelamiento.
El lisado celular se centrifugó a 10.000 xg durante 15 minutos a 4ºC, se
recuperó el sobrenadante, se apartó una alícuota de 25 μL para cuantificar
proteínas y el resto se almacenó a -80ºC hasta la determinación de la
actividad enzimática. La actividad de CAT se medió utilizando el kit Catalase
Assay (Calbiochem, San Diego, CA, USA), siguiendo las instrucciones del
proveedor. Este es un método espectrofotométrico (540 nm) que permite
medir actividad de CAT en un rango 0,25-4 nmoles de formaldehído/min/mL.
La actividad enzimática de CAT se expresó como nmoles de
formaldehído/min/mg de proteína.
2.7.3 Medición actividad enzimática de GPX1
Las hMSC, hFib y células INS-1 se sembraron, cultivaron y cosecharon
utilizando las condiciones descritas para la medición de la actividad
enzimática de SOD1 (sin utilizar tripsina). Posteriomente, las células se
lisaron en 1 mL de un tampón pH 7,5 que contenía Tris-HCl 50 mM (Merck,
Darmstadt, Alemania), EDTA 5 mM y DTT 1 mM (Sigma, St. Louis, MO,
USA), mediante 3 ciclos de congelamiento/descongelamiento. El lisado
celular se centrifugó a 10.000 xg durante 15 minutos a 4ºC, se recuperó el
sobrenadante, se apartó una alícuota de 25 μL para cuantificar proteínas y
el resto se almacenó a -80ºC hasta la determinación de la actividad
enzimática. La actividad de GPX1 se medió utilizando el kit Glutathione
Peroxidase Assay (Calbiochem, San Diego, CA, USA), siguiendo las
instrucciones del proveedor. Este es un método espectrofotométrico
(340 nm) que permite medir actividad de GPX1 en un rango 50-344 nmoles
de NADPH oxidado/min/mL. La actividad enzimática de GPX1 se expresó
como nmoles de NADPH oxidado/min/mg de proteína.
32
2.8 Determinación de GSx total
2.8.1 Obtención de muestras
Las hMSC y los hFib se sembraron a una densidad de 25.000 células/cm2 y
las células INS-1 a una densidad de 60.000 células/cm2 en placas p6
(poliestireno de área total de cultivo 9,6 cm2) (Falcon, Becton Dickinson and
Company, NJ, USA), en medio α-10 durante 24 horas o 18 horas,
respectivamente. Esto, ya que el medio de cultivo INS, que contiene
β-mercaptoetanol, modifica los niveles basales de GSx (Janjic y Wollheim,
1992). Posteriormente, las células se colectaron mediante tripsinización y se
lavaron 2 veces con PBS. Las células se lisaron con 50 μL de
Tritón-X 100 0,4% y 3 ciclos de congelamiento/descongelamiento (1 minuto/30
segundos). Inmediatamente, se agregaron 50 μL de ácido sulfosalicílico 5%
(P/V) (Sigma, St. Louis, MO, USA) frio a 4ºC y se incubó durante 15 minutos
en hielo. Luego, el lisado celular se centrifugó a 10.000 xg durante
2 minutos a 4ºC. El sobrenadante se almacenó a -80ºC hasta la
determinación del GSx.
2.8.2 Determinación de GSx
Para medir el GSx se utilizó el protocolo descrito por Tietze (1969) adaptado
para microplaca (Baker y cols., 1990). Para ello se agregó a un pozo de
placa p96: 10 μL de lisado celular, 150 μL de una mezcla de reacción que
contenía 15 μg reactivo de Ellman (DTNB; Sigma, St. Louis, MO, USA) y
24 mU de GSx reductasa en tampón fosfato (100 mM, 3,9 mM de EDTA,
pH 7,4) (Sigma, St. Louis, MO, USA) y 50 μL de tampón fosfato que
contenían 8 μg de NADPH (Sigma, St. Louis, MO, USA). La formación de
5-tio(2-ácido nitrobenzoico) (TNB) se detectó mediante espectrofotometría a
405 nm cada 12 segundos durante 2 minutos, utilizando un lector de placa
de microplaca. La concentración de GSx se obtuvo a partir de las
pendientes de la reacción de aparición de TNB en el tiempo y la
interpolación en la curva de calibración confeccionada con distintas
concentraciones de GSH (Sigma, St. Louis, MO, USA) preparadas en
tampón fosfato con Tritón-X 100 0,2% y ácido sulfosalicílico 2,5%. Los datos
se estandarizaron por número de células y se expresaron como nmoles de
GSx/millón de células.
33
2.9 Depleción de GSx. Para determinar la contribución del GSx en las hMSC como mecanismo de
defensa ante el EO, se determinó como estas células resisten a la muerte
inducida por ROS y/o RNS cuando carecen de GSx. Las hMSC se
cultivaron en placas p48 a una densidad de 25.000 células/cm2, en α-10
durante 24 horas. Luego, las células se cultivaron durante 1 hora en
0,15 mL/cm2 de α-10 que contenía 150 mM de butirato de sulfoximina
(BSO; Sigma, St. Louis, MO, USA) y 1 mM de dietilmaleato (DEM; Sigma,
St. Louis, MO, USA). El tiempo de incubación no debe sobrepasar la hora,
ya que las hMSC mueren cuando son cultivadas con BSO y DEM por más
de este tiempo (datos no mostrados). La figura 8 muestra que en esta
condición las hMSC pierden aproximadamente el 80% del GSx endógeno,
el 70% de las células se mantienen vivas y la inhibición se revierte a las 11
horas. Posteriormente, se determinó la susceptibilidad de estas células a la
muerte inducida por EO.
2.10 Análisis estadísticos. Los resultados se muestran como la media ± el error estándar. Se usó test
de t-student para determinar las diferencias entre dos grupos
(http://www.quantitativeskills.com/sisa/statistics/t-test.htm, acceso en Julio
2008) y se usó test ANOVA de una via y post test Newman-Keuls para
determinar las diferencias entre más de dos grupos. Para realizar estos
últimos cálculos se utilizó el programa GraphPad Prism 5.0. Se trabajó con
un 95% de confianza y se consideró significativo un p <0.05.
34
Figura 8: Estandarización de la depleción de GSx en hMSC. Las hMSC se incubaron con BSO 150 μM y DEM 1 mM durante 1 hora. Transcurrido el periodo de incubación, se eliminó el BSO y el DEM, se agregó α-10 a las células y a distintos tiempos se determinó la cantidad de GSx intracelular mediante el método establecido por Baker y cols. (1990).
BSO/DEM (1 hr)
(100%)
nmol
es G
Sx /
mill
ón d
e cé
lula
s
(20%)
(40%)
(120%)
Tiempo post incubación (hrs)
Viabilidad (%) 100 70 126 144
- 0 6 11
- + + +
35
3. RESULTADOS
3.1 Aislamiento y caracterización de las hMSC. A partir de MO de individuos jóvenes se expandieron hMSC. En el
subcultivo 3, las células se caracterizaron en función de su tiempo de
duplicación poblacional (figura 9A) y de su potencial de diferenciación a
adipocitos, condrocitos y osteocitos (figura 9B, C y D). En todos los casos
las células presentaron el tiempo de duplicación esperado y se
diferenciaron a lo menos a dos de los linajes estudiados. Estas
características se mantuvieron en las hMSC criopreservadas.
3.2 Susceptibilidad de las hMSC a la muerte inducida por ROS y/o RNS. Para determinar el grado de susceptibilidad de las hMSC a la muerte
inducida por ROS y RNS, las células se cultivaron durante 18 horas con
H2O2, SNAP o SIN-1 y posteriormente se determinó la viabilidad mediante
tinción con cristal violeta. La figura 10 muestra como ejemplo los resultados
y la obtención de los datos del ensayo realizado con SNAP.
Los resultados de estos experimentos indican que las hMSC sin diferenciar
son significativamente más resistentes a la exposición a EO que las células
INS-1, modelo de alta sensibilidad al EO. No se encontraron diferencias
estadísticamente significativas al comparar la resistencia al EO de las
hMSC versus los hFib, modelo de alta resistencia al EO.
3.3 Niveles intracelulares de ROS y RNS en hMSC expuestas a EO. Para determinar los niveles de especies reactivas intracelulares en hMSC
sometidas a EO, las células se incubaron durante 1 hora en α-10 con SIN-1
0,75 mM. Posteriormente, los niveles intracelulares de peroxinitrito se
determinaron mediante citometría de flujo. Para ello las células se
incubaron con DHR, un compuesto liposoluble que difunde rápidamente a
través de la membrana plasmática. Al reaccionar con peroxinitrito, peroxido
ó hidroxilo se oxida a rodamina, que es hidrosoluble y por lo tanto, queda
atrapado al interior de la célula. La rodamina es excitable a 510 nm y emite
fluorescencia a 534 nm. Así, la fluorescencia emitida es directamente
proporcional a la cantidad de peroxinitrito, peroxido y/o hidroxilo que posean
las células en su interior en un momento determinado.
36
Osteocito (Alizarin Red)
Adipocito (Oil Red)
Condrocito(Safranina O)
B C D
Días de cultivo
X 10
3cé
lula
s
Días de cultivo
X 10
3cé
lula
sA
Figura 9. Caracterización de hMSC aisladas de MO. A) Cinética de proliferación de las hMSC. hMSC diferenciadas a: B) adipocitos teñidas con Oil Red, B) condrocitos teñidas con Safranina O, C) osteocitos teñidas con Alizarin Red.
37
Concentración SNAP (mM)
Viab
ilida
d (%
)
0
40
80
0 2 4 6 8
100
60
20CL50 = 4,48 mM
Figura 10. Determinación de la susceptibilidad de las hMSC a la muerte inducida por SNAP. Las hMSC se cultivaron durante 18 horas con distintas concentraciones de SNAP. La viabilidad se determinó mediante tinción con cristal violeta y medición espectrofotométrica (570 nm). CL50 = concentración a la cual sobrevive el 50% de las células. Experimento representativo de 3 muestras diferentes. Las barraras indican el error estándar. r2 = 0,953.
Control
8 mM SNAP
Citotoxicidad SNAP
38
Tabla 4. Susceptibilidad de células INS-1, hMSC y hFib a la muerte inducida por ROS y/o RNS.
H2O2 CL50 (mM)
SNAP CL50 (mM)
SIN-1 CL50 (mM)
INS-1 (3) 0,31 ± 0,01 0,09 ± 0,03 1,42 ± 0,35
hMSC (7) 2,10 ± 0,56* 9,14 ± 1,01** 4,28 ± 0,13*
hFib (6) 0,80 ± 0,11* 7,63 ± 0,92** 3,44 ± 0,29*
La tabla muestra la media ± el error estándar. Los números entre paréntesis indican el número de muestras independientes usadas en cada caso. CL50 = concentración a la cual sobrevive el 50% de las células ± error estándar. Comparación con respecto a las células INS-1 (t student): * p < 0.05 ** p <0.0005
39
Tal como se observa en la figura 11, luego de ser expuestas a SIN-1
0,75 mM, las hMSC presentan niveles intracelulares de peroxinitrito
significativamente menores que los de las células INS-1 y similares a los de
hFib. Esto indica que la maquinaria para depurar ROS/RNS es más
eficiente en las hMSC que en las células INS-1, ya que las primeras
eliminan en forma más rápida el peroxinitrito que se genera a partir de SIN-
1. Este resultado muestra que las hMSC, al menos in vitro, manejan
eficientemente el peroxinitrito (ROS/RNS), especie reactiva que se
encuentra entre las más tóxicas.
3.4 Expresión de SOD1, SOD2, CAT y GPX1 en hMSC. Para determinar el mecanismo enzimático asociado al eficiente manejo y la
resistencia al EO, mediante RT-PCR de tiempo real se cuantificó la
expresión génica de las enzimas SOD1, SOD2, CAT y GPX1. En todos los
casos se utilizaron partidores específicos para el mRNA respectivo, se
observó un pico único en el análisis de temperatura de melting y una única
banda que coincidió con el valor teórico esperado (ver sección 2.6.2,
figura 6).
Los resultados presentados en la tabla 5 muestran que las hMSC expresan
en forma constitutiva los genes que codifican para SOD1, SOD2, CAT y
GPX1. Estos resultados concuerdan con lo observado por Ebert y cols.
(2006), quienes recientemente describieron que una línea celular de hMSC
(hMSC-TERT) expresan dichas enzimas. Sin embargo, no muestran datos
cuantitativos para la expresión de dichas enzimas, porque realizaron PCR
convencional. Al comparar la cantidad de mRNA de las enzimas
relacionadas con el EO es evidente que los niveles expresados por ambas
células son semejantes (no existen diferencias significativas, p > 0,05).
40
Figura 11. Niveles intracelulares de ROS/RNS en INS-1, hMSC y hFib expuestos a EO. Las células INS-1, hMSC y hFib se incubaron con SIN-1 0,75 mM durante 1 hora. Posteriormente, los niveles intracelulares de ROS/RNS se determinaron mediante marcaje con DHR 5 μM y citometría de flujo. Los datos se expresan como el cuociente entre la IFN de la muestra y la IFN del control. Los números entre paréntesis indican el número de muestras independientes utilizadas en cada caso, y las barras indican el error estándar. La significancia fue analizada utilizando el análisis de ANOVA de una via y la comparación múltiple de Newman-Keuls como post test. ns = no significativo.
ns
p < 0,001
hMSC (n = 4)
INS-1 (n = 3)
hFib (n = 5)
0
5
10
15
20
25
IFN
Mue
stra
/ IF
N C
ontr
ol
41
Tabla 5. Expresión de SOD1, SOD2, CAT y GPX1 en hMSC y hFib
SOD1 SOD2 CAT GPX1
hMSC 1,11 ± 0,16 0,60 ± 0,04 0,74 ± 0,06 1,06 ± 0,11
hFib 0,78 ± 0,03 0,79 ± 0,05 0,71 ± 0,02 0,88 ± 0,02
Los resultados obtenidos para cada enzima se relativizaron respecto del gen constitutivo GAPDH. En la tabla se muestra la media ± error estándar. Se utilizaron hMSC y hFib de 3-4 diferentes individuos y la significancia se calculó utilizando el test t student. En todos los casos la significancia fue p > 0,05.
42
3.5 Actividad enzimática basal de SOD1, CAT y GPX1. Para confirmar estos resultados, se evaluó la actividad enzimática de las
enzimas estudiadas. La actividad basal de SOD1, CAT y GPX1 se
determinó en lisado celular de INS-1, hMSC y hFib.
Las hMSC poseen niveles de actividad SOD1 similares a los de células INS-1
y a los de hFib (figura 12A). Por otra parte, las hMSC poseen niveles de
actividad CAT (figura 12B) y GPX1 (figura 12C) significativamente mayores
que las células INS-1 y similares a los de hFib.
Para asegurar la especificidad de los resultados anteriores, se determinó la
actividad de las enzimas de interés en presencia de inhibidores para ellas:
dietilditiocarbamato (DEDTC) para SOD1, aminotriazol (ATZ) para CAT y
mercaptosuccinato (MSO) para GPX1. Tal como se muestra en la figura 13A, las hMSC pierden el 60% de la actividad SOD1 cuando son cultivadas
durante 1 hora en presencia de DEDTC 0,25 mM y el 80% cuando son
cultivadas en presencia de DEDTC 0,50 mM, observándose una inhibición
dependiente de la dosis. Por otra parte, las hMSC pierden el 50% de la
actividad de CAT cuando son cultivadas durante 1 hora en presencia de
ATZ 2 mM y el 80% cuando son cultivadas en presencia de ATZ 4 mM (figura 13B). En este caso también se observa una inhibición dependiente
de la dosis. Finalmente, las hMSC pierden el 20% de la actividad de GPX1
cuando son cultivadas durante 1 hora en presencia de MSO 10 mM (figura 13C). Estos resultados nos permiten concluir que los ensayos utilizados son
específicos para las enzimas estudiadas. De este modo, se concluye que las
hMSC presentan altos niveles de actividad enzimática SOD1, CAT y GPX1,
comparables a los de una célula de alta resistencia al EO (hFib).
3.6 Niveles basales de GSx en hMSC.
Para la cuantificación de GSx se estandarizó el método descrito por Tietze
(1969), modificado por Baker y cols. (1990) para su uso en microplaca, lo
que me permitió realizar este ensayo utilizando una menor cantidad de
muestra (ver sección 2.8.2).
Tal como se observa en la figura 14 las hMSC presentan niveles basales
de GSx similares a los de hFib y significativamente mayores que los de
43
Figura 12. Actividad enzimática basal de SOD1 (A), CAT (B) y GPX1 (C) en INS-1, hMSC y hFib. Los números entre paréntesis indican el número de muestras independientes utilizadas en cada caso y las barras indican el error estándar. La significancia fue analizada utilizando el análisis de ANOVA de una via y la comparación múltiple de Newman-Keuls como post test. ns = no significativo.
A
Act
ivid
ad C
AT
(nm
ol fo
rmal
dehí
do/m
in/m
g pr
ot)
C
Act
ivid
ad G
PX1
(nm
ol N
AD
PH o
xida
do/m
in/m
g pr
ot)
Act
ivid
ad S
OD
1 (U
/mg
prot
)
ns ns
p < 0,005 ns
hMSC (n = 4)
INS-1 (n = 3)
hFib (n = 3)
0
5
10
15
20
0
5
10
15
20 p < 0,005 ns
0,0
0,2
0,6
0,8
1,0
hMSC (n = 3)
INS-1 (n = 3)
hFib (n = 3)
hMSC (n = 3)
INS-1 (n = 3)
hFib (n = 3)
0,4
B
44
A
B
C
Act
ivid
ad C
AT
(nm
ol fo
rmal
dehí
do/m
in//m
g pr
ot)
0 2 4
16
12
8
4
0
Figura 13. Inhibición de SOD1, CAT y GPX1 en hMSC. A) Las hMSC se incubaron con distintas concentraciones de DEDTC durante 1h. Posteriormente, se determinó la actividad de SOD1. B) Las hMSC se incubaron con distintas concentraciones ATZ durante 1h. Posteriormente, se determinó la actividad de CAT. C) Las hMSC se incubaron con diferentes concentraciones de MSO durante 1h. Posteriormente, se determinó la actividad de GPX1.
Act
ivid
ad G
PX1
(n
mol
NA
DPH
oxi
dado
/min
//mg
prot
)
0 10
4
3
2
1
0
Act
ivid
ad S
OD
1
(U/m
g pr
ot)
0
0,2
0,4
0,6
0 0,25 0,50 DEDTC (mM)
(mM) ATZ
MSO (mM)
(100%)
(100%)
(100%)
(80%)
(50%)
(20%)
(40%)
(20%)
45
Figura 14. Niveles basales de GSx en INS-1, hMSC y hFib. Los niveles basales de GSx se cuantificaron mediante el método establecido por Baker y cols. (1990). Los números entre paréntesis indican el número de muestras independientes utilizadas en cada caso y las barras indican el error estándar. La significancia fue analizada utilizando el análisis de ANOVA de una via y la comparación múltiple de Newman-Keuls como post test. ns = no significativo.
hMSC (n = 6)
hFib (n = 6)
INS-1 (n = 3)
p < 0,05 ns
nmol
es G
Sx /
mill
ón d
e cé
lula
s
50
0
100
150
200
46
células INS-1. El GSx cuantificado corresponde en su totalidad a la forma
reducida, ya que no se detectó GSSG cuando se midió su concentración
(datos no mostrados). El GSH es el principal antioxidante natural que
poseen las células, ya que puede actuar atrapando especies reactivas en
forma directa o bien como sustrato de la GPX1 para reducir peróxidos. De
este modo, la cantidad intracelular de GSH es directamente proporcional a
la resistencia al EO. Así, estos resultados se correlacionan con la mayor
resistencia al EO que poseen las hMSC.
3.7 Resistencia a la muerte inducida por ROS y/o RNS en hMSC depletadas de GSx. Tal como se muestra en la figura 15, las hMSC depletadas de GSx resisten
menos que las hMSC con niveles normales de GSx a la muerte inducida
por H2O2, SNAP y SIN-1. En efecto, las CL50 para H2O2, SNAP y SIN-1 de
las hMSC sin GSx son significativamente menores que las CL50 de las
hMSC con GSx y similares a las CL50 observadas para el modelo de alta
sesibilidad al EO, las células INS-1 (no hay cambios significativos).
De este modo podemos decir que las hMSC depletadas de GSx pierden su
capacidad para resistir a la muerte inducida por ROS, RNS o por
peroxinitrito. Así, GSx parece ser un elemento central en el eficiente manejo
del EO realizado por las hMSC.
47
CL 5
0 (m
M)
Figura 15: Resistencia a la muerte inducida por EO de hMSC depletadas de GSx. Las hMSC se incubaron con BSO 150 μM y DEM 1 mM durante 1 hora para depletarlas de GSx. Transcurrido el periodo de incubación, se eliminó el BSO y el DEM y las hMSC se cultivaron durante 18 horas con los generadores de ROS y RNS: SIN-1, SNAP y H2O2. La viabilidad se determinó mediante tinción con cristal violeta y medición espectrofotométrica (570 nm). Con los datos obtenidos se confeccionó una curva de citotoxicidad a partir de la cual se obtuvieron los valores de CL50. Los números entre paréntesis indican el número de muestras independientes utilizadas en cada caso y las barras indican el error estándar. La significancia fue analizada utilizando el análisis de ANOVA de una via y la comparación múltiple de Newman-Keuls como post test. ns = no significativo.
H2O2 SNAP SIN-1
ns
0
2
4
6
8
10 hMSC (7)
hMSC depl GSx (3)
INS-1 (3)
p < 0,05
ns
p < 0,05
ns
p < 0,05
48
4. DISCUSIÓN
En la literatura se ha reportado que el trasplante de hMSC tiene beneficios
terapéuticos en el tratamiento de patologías relacionadas con EO como lo
son infarto cerebral (Kurozumi y cols., 2005), infarto cardiaco (Chen SL y
cols., 2004), diabetes (Chen LB y cols., 2004; Ezquer y cols., 2008) y
Parkinson (Park y cols., 2008). Lo que sugiere que las hMSC podrían
modular el daño provocado por el EO en los tejidos dañados protegiendo
así a las células del parénquima. Sin embargo, existen escasos
antecedentes directos sobre la capacidad de las hMSC de manejar el EO.
En esta tesis por primera vez se realiza una caracterización sistemática
respecto de la capacidad de las hMSC de manejar el EO in vitro. Se
demostró que las hMSC resisten a la muerte inducida por ROS y/o RNS.
Esto relacionado a la expresión de las enzimas involucradas en la depuración
de las especies reactivas: SOD1, SOD2, CAT y GPX1. Finalmente, se
demostró que la presencia de GSx es fundamental para que las hMSC
manejen eficientemente el EO. Todas las propiedades descritas para hMSC
son cuantitativamente semejantes a las observadas para hFib, modelo de
alta resistencia al EO y muy superior a las de INS-1, modelo de alta
sensibilidad al EO.
En esta tesis se utilizó como modelo de baja resistencia al EO la línea
celular INS-1, ya que las células β-pancreáticas (CβP) poseen bajos niveles
de SOD1, SOD2, CAT y GPX (Lenzen y cols., 1996). Debido a esto, las
CβP son especialmente vulnerables a ROS y RNS (Fauci y cols., 1998;
Hohmeier y cols., 2003). No existe una línea celular de CβP humanas o la
disponibilidad es poco factible (dificultad para procurar páncreas,
rendimiento de aislamiento bajo, CβP no proliferan in vitro) en esta tesis se
utilizó la línea celular INS-1 (Tran y cols., 2003) como modelo de
susceptibilidad a EO. Desafortunadamente, en la literatura no hay
antecedentes que comparen directamente la resistencia al EO de CβP
humanas versus células INS-1. Sólo hay un reporte que sugiere que los
islotes humanos son más resistentes al EO que los murinos (Eizirik, 1996).
Por esta razón, se estudió la susceptibilidad al EO de MSC de rata (rMSC)
y se compararon los resultados con los de hMSC. Las hMSC manejan el
EO mejor que las rMSC (datos presentados anexos de esta tesis),
49
sugiriendo que las células de rata son más susceptibles al EO que las
humanas. Tomando en cuenta este resultado podríamos decir que nuestros
resultados para las hMSC podrían estar sobreestimados, ya que los
comparamos con los resultados obtenidos para las células INS-1 que
provienen de rata al igual que las rMSC. Sin embargo, nuestros resultados
también indicaron que las rMSC siguen siendo más resistentes que las
células INS-1 al EO generado por SIN-1 (datos no mostrados). De este
modo, a pesar de que provengan de especies distintas, es correcto
comparar los resultados obtenidos para hMSC con los obtenidos para
células INS-1.
Una vez que se seleccionaron los modelos de alta y baja resistencia, se
evaluó la susceptibilidad de hMSC sin diferenciar a la muerte inducida por
ROS y RNS. Para ello estas células se cultivaron con concentraciones
crecientes de SIN-1 (ROS + RNS), SNAP (RNS) y H2O2 (ROS) evaluando su
sobrevida mediante tinción con cristal violeta. Estos experimentos mostraron
que las hMSC sin diferenciar son significativamente más resistentes a la
muerte inducida por ROS/RNS que las células INS-1. Por otra parte, no se
encontraron diferencias significativas entre las hMSC y hFib.
La resistencia de las hMSC a la muerte inducida por ROS y/o RNS, podría
deberse a que estas células eliminan más eficientemente las especies
reactivas que las células INS-1. Para evaluar esta posibilidad, las hMSC se
fueron expuestas a SIN-1 (generador de peroxinitrito) y posteriormente se
determinó la cantidad de especies reactivas al interior de las células
utilizando marcación con DHR y detección de la fluorescencia mediante
citometría de flujo. Los resultados indican que las hMSC efectivamente
presentan niveles intracelulares de ROS/RNS significativamente menores
que los de las células INS-1 y similares a los de hFib. Lo observado se
correlaciona con los resultados de citotoxicidad. El peroxinitrito es una de
las especies reactivas más tóxicas y ha sido asociada con varias patologías.
Por ejemplo, esta especie reactiva se ha asociado con la progresión de
aterosclerosis en ratones deficientes (knockout) de GPX-1. La GPX1 reduce
el peroxinitrito a nitrito, especie que es menos tóxica y menos reactiva
(Brivida y cols., 1996). La deficiencia de esta enzima en el modelo murino
de aterosclerosis se correlaciona con un aumento de la nitración de tirosina,
50
un marcador de producción de peroxinitrito, y con una rápida progresión de
la enfermedad (Torzewski y cols., 2007).
Nuestros resultados revelan que las hMSC eliminan eficientemente el
peroxinitrito. Pero, ¿cuales son los mecanismos que están involucrados en
la depuración eficiente de ROS/RNS en las hMSC? Tal como se mencionó
anteriormente, las células poseen una amplia gama de mecanismos para
manejar el EO. Dentro de éstos se incluyen enzimas, tales como SOD, CAT
y GPX. En la presente tesis, mediante RT-PCR de tiempo real, se ha
comprobado que las hMSC sin diferenciar expresan en forma basal de
SOD1, SOD2, CAT y GPX1. Estos resultados concuerdan con los obtenidos
recientemente por otros investigadores tanto para hMSC-TERT (Ebert y
cols., 2006), que son células inmortalizadas, como para rMSC (Stolzing y
Scutt, 2006). La diferencia entre los resultados aquí presentados y los
obtenidos por Ebert y cols., es que durante esta tesis se trabajó con células
que no han sido manipuladas genéticamente. Si se plantea el uso de las
hMSC para realizar terapia celular, los resultados aquí expuestos tienen
una mayor proyección que los obtenidos por Ebert y cols.
Al hacer el estudio comparativo, se demostró que las hMSC poseen niveles
de actividad SOD1 discretamente mayores que las células INS-1 y similares
a los de hFib. Por su parte, los niveles de actividad CAT y GPX1 son
significativamente mayores que los de células INS-1 y similares a los de
hFib. Estos resultados potencian el uso de las hMSC en la terapia de
patologías relacionadas con la deficiencia de una o varias de estas enzimas.
Varias patologías han sido asociadas a la deficiencia de SOD. Algunas de
ellas relacionadas con isquemia y reperfusión (McCord, 1985), otras
neurodegenerativas (Reiter, 1995), pulmonares (Kinnula y Krapo, 2003) y
diabetes (Maritim y cols., 2003). Por otra parte, la deficiencia de CAT esta
relacionada con la aparición de diabetes (Maritim y cols., 2003; Góth y cols.,
2004), hipertensión y vitiligo (Góth y cols., 2004). Anormalidades en la
expresión de GPX1 se han asociado con la etiología de patologías
cardiovasculares, neurodegenerativas, autoinmunes y metabólicas (Lei y
cols., 2007). Finalmente, los altos niveles de GSx que las hMSC poseen,
hacen proyectar el uso de estas células en la terapia celular de
enfermedades relacionadas con el EO.
51
En esta tesis se demuestra que las hMSC sin diferenciar poseen niveles de
GSx similares a los de hFib y significativamente mayores que los de células
INS-1. Como se mencionó anteriormente, GPX1 utiliza GSH como sustrato
para catalizar la reducción de peróxidos. Las hMSC son más resistentes
que las células INS-1 al EO generado por SIN-1, no sólo porque poseen
niveles de actividad enzimática GPX1 mayor, sino también porque tienen
una mayor cantidad de sustrato para que esta enzima actúe. Además, el
GSH no sólo es sustrato para GPX1, sino que también para otras enzimas
relacionadas con el manejo del EO y, además, es capaz de actuar
directamente como secuestrador de especies reactivas (Franco y cols.,
2007). En efecto, el rol fundamental del GSx en la resistencia al EO queda
de manifiesto al observar que las hMSC pierden por completo su capacidad
de resistir a la muerte inducida por ROS y/o RNS cuando carecen de GSx.
Así, el GSH podría constituir un mecanismo importante mediante el cual las
hMSC para manejan el EO. Recientemente, Kuo y cols., reportaron que in
vitro, la viabilidad y proliferación de hepatocitos sometidos a EO es
significativamente mayor cuando se cocultivaron con hMSC que cuando se
cocultivaron con hMDH (hepatocitos diferenciados a partir de hMSC). Por
otra parte, los estudios in vivo de Kuo y cols. indican que el trasplante con
hMSC en ratones con daño hepático agudo, es más efectivo que el
trasplante con hMDH debido a que las primeras manejan mejor el EO propio
de un hígado dañado con CCl4. El efecto terapéutico observado se
correlaciona la relación GSH/GSSG en sangre total. Esta es mayor en
ratones con daño hepático trasplantados con hMSC que en ratones
trasplantados con hMDH. De este modo, se sugiere que el trasplante de
hMSC efectivamente modifica el manejo del EO in vivo y que este manejo
del EO se correlaciona con el efecto terapéutico observado.
La depleción de GSx se asocia con la aparición y progresión de patologías
tales como cáncer, diabetes, enfermedades pulmonares y enfermedades
hepáticas. Dentro de estas patologías destacan las enfermedades
neurodegenerativas, tales como Parkinson, Alzeheimer y Huntington (Franco
y cols., 2007). Todas estas patologías podrían ser potencialmente tratadas
con terapia celular utilizando hMSC sin diferenciar, tanto para controlar su
progresión como para revertir el proceso.
52
Los antecedentes reportados por Kuo y cols., muestran que la resistencia al
EO efectivamente es un mecanismo que da cuenta de los efectos
terapéuticos de las hMSC. De este modo, se abre un nuevo área de debate
concerniente a la manipulación in vitro de las células y como las diferentes
condiciones afectan los niveles de GSx. Evidentemente, condiciones que
contribuyan a que las hMSC tengan niveles elevados de GSx serán óptimas
para los efectos terapéuticos de las hMSC, sobre todo cuando se utilicen
como terapia celular de patologías cuyo origen este relacionado con el EO.
Las hMSC podrían ser cultivadas con bajo porcentaje de O2, en condiciones
de temperatura reducida y en medios de cultivo suplementados con selenio,
condiciones que aumentan la capacidad de las hMSC para manejar el EO
(Stolzing y Scutt, 2006a). Por ejemplo, se sabe que el cultivo de rMSC en
condiciones de baja temperatura aumenta actividad de enzimática de SOD,
CAT y GPX. Además, aumenta la expresión de proteínas de shock térmico
tales como HSP27, HSP70 y HSP90 contribuyendo a la resistencia al EO
que estas células poseen (Stolzing y Scutt, 2006a). Por otra parte, el cultivo
de las hMSC en medios de cultivo suplementados con selenio podría
contribuir a su defensa antioxidante. Los estudios de Ebert y cols., han
demostrado que el cultivo de hMSC-TERT en cultivo suplementado con
selenito (100 nM) aumenta la defensa contra oxidantes (Ebert y cols., 2006).
Por otra parte, se debe tener una especial preocupación sobre los individuos
desde los cuales se aislarán las hMSC para los trasplantes. Cada vez son
más los antecedentes que respaldan el uso terapéutico de trasplantes
alogénicos de hMSC. De este modo, en un futuro cercano, cualquier
individuo podrá ser donante de células para trasplantes. Sin embrago, para
poder asegurar células donadas son de buena calidad, será necesario
considerar que tratamientos farmacológicos han recibido los posibles
donantes y si han sido expuestos recientemente a radiación, metales
pesados u otros xenobióticos que puedan afectar el balance oxidativo de
sus células. Otro punto importante a considerar será la edad de los
donantes. En la literatura se ha reportado que las rMSC aisladas de
individuos mayores, presentan una capacidad disminuida para formar
colonias y, además, las colonias formadas son más pequeñas (Stolzing y
Scutt, 2006b). Esto se debe al mayor número de replicaciones que han
53
experimentado las células de individuos mayores, que se traduce en células
más senescentes. En efecto, Stolzing y Scutt, observaron un aumento del
tiempo de duplicación poblacional, de la senescencia y de la apoptosis.
Estos resultados se correlacionaron con un aumento en los niveles
intracelulares de ROS, en los de proteínas y lípidos oxidados y en una
disminución de las actividades enzimáticas de SOD y GPX (Stolzing y Scutt,
2006b).
Si bien es cierto en esta tesis se muestra que las hMSC eliminan
eficientemente ROS y/o RNS y que en ello participan las enzimas SOD,
CAT, GPX y el GSX, no se descarta que mecanismos, tales como,
reparación eficiente del daño oxidativo o resistencia a la apoptosis puedan
también estar involucrados. Con respecto a la reparación del daño oxidativo,
las hMSC expresan el gen que codifica para MsrA en forma similar a los
hFib (datos no mostrados). Esta enzima cataliza la reducción de proteínas
oxidadas y por lo tanto, este resultado sugiere que las hMSC son capaces
de recuperar las proteínas que se han oxidado al ser sometidas al EO del
mismo modo que los hFib. Por otra parte, en un estudio del transcriptoma de
las hMSC, mostró que las hMSC expresan enzimas de reparación de DNA
(Silva y cols., 2003). Finalmente, con respecto a la resistencia a la apoptosis,
se ha descrito que en rMSC tratadas con 2 mM de β-mercaptoetanol
aumenta la expresión de HSP72 (Císková y cols., 2006) y que las hMSC sin
diferenciar cuando son sometidas a EO expresan genes antiapoptóticos
como los que codifican para bcl-2 y bcl-xl (Kuo y cols., 2008). No obstante,
tal como indican nuestros resultados, si las hMSC no poseen GSx, no son
capaces de resistir a la muerte inducida por ROS y/o RNS.
54
5. CONCLUSIONES
Las hMSC son significativamente más resistentes a la muerte inducida por
SIN-1, SNAP y H2O2 que las células INS-1 y tan resistentes como los hFib.
Las hMSC expuestas a SIN-1 presentan niveles intracelulares de ROS/RNS
significativamente menores que las células INS-1 y similares a los de hFib.
Las hMSC poseen niveles de actividad enzimática CAT y GPX1 basales
significativamente mayores que los de células INS-1 y similares a los de hFib.
Las hMSC poseen niveles de GSx basales mayores que los de células
INS-1 y similares a los de hFib.
Dentro de los mecanismos para eliminar ROS y/o RNS encontrados en las
hMSC, el GSx es muy importante, ya que las hMSC depletadas de él,
resisten significativamente menos que las hMSC con niveles normales de
GSx a la muerte inducida por SIN-1, SNAP y H2O2.
6. PROYECCIONES
En esta tesis se ha demostrado que las hMSC poseen la maquinaria
enzimática necesaria para manejar el EO, acumulan menos especies
reactivas que células sensibles al EO cuando son expuestas a generadores
de ROS/RNS y resisten al cultivo con SIN-1, SNAP y H2O2. Además, se ha
demostrado que el GSx es de vital importancia para la resistencia al EO que
poseen las hMSC, ya que al depletar a las células de GSx, éstas se vuelven
sensibles al cultivo con SIN-1, SNAP y H2O2, a pesar de que la maquinaria
enzimática para depurar a la célula de las especies reactivas no ha sido
modificada. De este modo, se concluye que in vitro las hMSC manejan
eficientemente el EO.
Sin embargo, en este trabajo se ha realizado una caracterización de sólo los
mecanismos intracelulares que las hMSC poseen para manejar las ROS y/o
RNS. Queda por determinar si estas células poseen mecanismos
exportables, que les permitan manejar el EO del medio extracelular.
Recientemente, Lanza y cols. (2009), mostraron que las células de una línea
celular de neuroblastoma, expuestas a peróxido de hidrógeno y cultivadas
55
con medio condicionado por mMSC, expresan bajos niveles de enzimas del
manejo del EO (SOD1 y CAT). Las mismas células expuestas a peróxido de
hidrógeno, pero cultivadas con medio sin condicionar, aumentan la
expresión de SOD1 y CAT con el fin de proteger a las células. Esto indicaría
un rol protector del medio condicionado por mMSC, ya que las células
presentan el mismo porcentaje de viabilidad sin la necesidad de aumentar la
expresión de enzimas que depuren ROS y/o RNS.
¿Que podría haber en el medio condicionado por MSC que proteja a las
células del parénquima del daño oxidativo? Por ejemplo, las hMSC podrían
exportar SOD3, GPX3, que son versiones extracelulares de estas enzimas
(Zelco y cols., 2002; Brigelius-Flohé, 2006) y/o glutatión (Townsend y cols.,
2003). Para determinar si las hMSC poseen estos mecanismos, se podría
detectar la expresión basal de SOD3 y GPX3, y si esta es positiva, luego se
podría medir la actividad enzimática SOD y GPX en el medio condicionado
por hMSC. Además, se podría determinar la concentración de glutatión en el
medio condicionado por hMSC. Probablemente, las hMSC exporten
glutatión, ya que Kuo y cols. (2008) observaron un aumento en la
concentración de glutatión en sangre total de ratones a los cuales se les
había inyectado hMSC.
Otra pregunta que surge a partir de los resultados de esta tesis, es porque
las hMSC a poseen altos niveles de glutatión. Sería de gran interés estudiar
que pasa en estas células con los pasos involucrados en el trasporte de los
precursores, la síntesis y el reciclaje de glutatión. Dentro del trasporte de
precursores podríamos determinar el rol que en las hMSC tienen los
diferentes sistemas de transporte. Entre ellos el sistema alanina-serina-
cisteína (ASC; transporte de membrana de cisteína), el sistema Xc
(transporte de cistina) y el sistema L (transporte de metionina), así como
también las vías de transulfuración (Kilberg, 1982; Bannai y Tateishi, 1986;
Takada y Bannai, 1984).
Una vez establecido como las hMSC internalizan los precursores para la
síntesis de GSH, podríamos determinar el funcionamiento y regulación de
las enzimas que catalizan esta síntesis. El primer paso en la síntesis de
GSH es catalizado por la glutamato cisteína ligasa (GCL), también llamada
γ-glutamilcisteína sintasa, y es el paso limitante de la síntesis. Esta enzima
56
esta constituida por dos subunidades: la catalítica (GCLC) y la modificadora
(GCLM). Los cambios en la actividad de la GCL pueden resultar de la
regulación a diferentes niveles que afectan sólo a GCLC o ambas
subunidades. El segundo paso en la síntesis de GSH es catalizado por la
GSH sintasa (GS). La actividad de ambas enzimas puede ser regulada
mediante regulación transcripcional y post-transcripcional. Mediante
RT-PCR podríamos evaluar los niveles de expresión de GCL y GS. Además,
podríamos determinar diferentes modificaciones post-transcripcionales, tales
como estabilización/desestabilización de mRNA y modificaciones
post-traduccionales.
Por último, podríamos determinar la capacidad que las hMSC tienen para
reciclar el glutatión. La γ-glutamiltranspeptidasa (GGT) es la enzima
encargada de la degradación del GSH. Esta enzima se encuentra presente
sólo en la superficie externa de algunos tipos de células (Meister y Anderson,
1983). Mediante RT-PCR podríamos determinar la expresión de la GGT en
las hMSC y mediante inmunoflorescencia podríamos detectar la presencia
de esta enzima en la superficie de estas células.
Finalmente, sería interesante determinar como el glutatión se relaciona con
los efectos terapéuticos que las hMSC han demostrado tener. Por ejemplo,
en el modelo de diabetes tipo I montado en nuestro laboratorio (Ezquer y
cols., 2008) se podrían trasplantar hMSC a las cuales se les ha depletado el
glutatión y observar si la reversión de la hiperglicemia y la protección del
daño renal disminuye. En efecto, sabemos que el glutatión aportado por las
hMSC podría ser de utilidad en la diabetes, ya que se ha descrito que los
eritrocitos de pacientes diabéticos presentan un bajo contenido de GSH.
Esto se debería, principalmente, a una baja tasa de síntesis de GSH, ya que
los bajos niveles de insulina producirían una disminución de la expresión de
la GCLC (Lu, 2009). Además, se ha determinado que los altos niveles de
glucosa reducen la expresión de GCLC en células endoteliales de ratón
(Urata y cols., 1996). Finalmente, Masahiro y cols. (2006), reportaron que la
hiperglicemia crónica aumentó el nivel de apoptosis de células endoteliales
de cerebro humano. Sin embargo, este nivel de apoptosis disminuyó al
aumentar la insulina. Esto se debería a que la insulina induciría la expresión
de GCLC y por tanto aumentaría la síntesis de GSH (Masahiro y cols., 2006).
57
Es decir, el aumento de GSH disminuiría la apoptosis de células sometidas
a hiperglicemia crónica.
Estas y otras futuras investigaciones, permitirán apoyar el hecho que las
hMSC contribuyen a la regeneración tisular gracias a su capacidad de
manejar el EO, constituyendo un nuevo mecanismo asociado al efecto
terapéutico de las hMSC y permitiendo enfocar la terapia celular con hMSC
a pacientes que presenten enfermedades cuya etiología esté relacionada
con un fuerte EO, tales como infarto cerebral, diabetes, Parkinson,
Alzheimer y aterosclerosis, entre otras.
58
7. ANEXOS
Inicialmente el objetivo de esta tesis era a partir de hMSC, obtener células
productoras de insulina que respondan a cambios en la concentración de
glucosa, que no mueran por apoptosis inducida por linfocitos T y/o sean
resistentes a la apoptosis inducida por radicales hidroxilo, NO y peroxinitrito.
A pesar de que no se pudo obtener células productoras de insulina, en esta
sección se deja registro de los protocolos probados para diferenciar a las
hMSC y las técnicas utilizadas para detectar a las células productoras de
insulina. Por otra parte, durante el desarrollo de esta tesis tuve la
oportunidad de familiarizarme con la técnica de cultivo mixto de linfocitos
(MLC), realizando una pasantía en el Instituto Karolinska, Estocolmo, Suecia,
en la División de Inmunología Clínica del Hospital de Huddinge con la Dra
Katarina LeBlanc. En esta sección también se deja registro de los resultados
obtenidos durante esta pasantía.
7.1 Diferenciación de MSC a células productoras de insulina: técnicas evaluadas a la fecha. En general, se habla de diferenciación a células productoras de insulina, ya
que el fenotipo de las células generadas se asemeja a las células
β-pancreáticas (CβP) en que sintetizan insulina y la secretan en respuesta a
cambios en la concentración de glucosa, pero en ningún caso se ha
determinado que su fenotipo sea totalmente idéntico a las CβP. Hasta la
fecha, las estrategias para obtener células productoras de insulina a partir
de MSC se basan en la utilización de medios definidos para cultivar las
células troncales, cocultivo con islotes β-pancreáticos, cultivo con extracto
pancreático, cultivo con medio condicionado por islotes β-pancreáticos y/o
en la transducción de las MSC con algunos genes involucrados en la
embriogénesis de CβP, como por ejemplo: FOXA2, HLBX9 y PDX-1
(Schwitzgebel y cols., 2000; Moriscot y cols., 2005; Li Y y cols., 2007; Li L
y cols., 2008) o en la manipulación genética de las MSC con genes que
codifican para insulina (Lu y cols., 2006; Kim y cols., 2007).
Como se muestra en la fig. 16A, Tang y colaboradores (2004) obtuvieron
células que expresan insulina a partir de MSC de ratón (mMSC). Para ello,
obtuvieron clones de mMSC que expusieron a un medio con baja
concentración de glucosa y luego a un medio con alta concentración de
59
glucosa cultivándolos durante 2-4 meses. Durante este periodo las células
se agruparon formando racimos. Posteriormente las mMSC se sometieron a
un proceso de “maduración” que consistió en cultivar las células en un
medio con baja concentración de glucosa, nicotinamida y exendina-4
durante 7 días. Al inyectar las células en un modelo de ratón con diabetes
inducida por estreptozotocina (STZ), estás células lograron reestablecer los
niveles normales de glicemia, por lo tanto, se consideró que estas células
secretan insulina fisiológicamente. Recientemente, Tayaramma y cols.
(2006) reportaron una nueva forma de diferenciar mMSC a células
productoras de insulina utilizando tricostatina A (TSA), un inhibidor de
desacetilasas de histona y por ende, remodelador de la cromatina. Para ello
cultivaron las células durante 3 días en medio de cultivo con baja
concentración de glucosa sin SFB y TSA, y posteriormente durante 7 días
en un medio de “inducción específica” que con alta concentración de
glucosa y péptido tipo glucagón (GLP-1) (fig. 16B). Finalmente, obtuvieron
células que sintetizaban y secretaban insulina en respuesta a cambios en la
concentración de glucosa. Por otra parte, Jahr y Bretzel (2003) obtuvieron
células que sintetizan insulina al cultivar MSC de rata (rMSC) en un medio con
bajo porcentaje de SFB (1%) que contenía 10 mM de nicotinamida y 1,7 mM de
glucosa. Sin embrago, la eficiencia de este método de diferenciación fue muy
baja. A fines del año 2004, Chen y sus colaboradores lograron diferenciar
MSC de rata (rMSC) a células productoras de insulina cultivando dichas
células en un medio de cultivo con baja concentración de glucosa durante
24 horas y realizando un proceso denominado por ellos como “reinducción”
que consiste en cambiar las rMSC a un medio de cultivo con una alta
concentración de glucosa y cultivarlas durante 10 horas. Además de glucosa,
los dos medios de cultivo contenían sumplemento B27, nicotinamida y
β-mercaptoetanol. Las rMSC diferenciadas de este modo se agregan
formando racimos y sintetizan insulina. Al inyectar las células diferenciadas
en un modelo de rata con diabetes inducida con STZ, estás células lograron
reestablecer los niveles normales de glucosa (fig. 16C). En este caso los
autores no hacen referencia a la eficiencia de la diferenciación.
Posteriormente, Choi y cols. obtuvieron células que expresan el gen de la
insulina, al cultivar rMSC con un extracto pacreático obtenido del páncreas
60
26 días
Tang y cols., Transplantation 75(3): 389-397 (2004).
mMSC
Glucosa 5,5 mMNicotinamida 10 mM Exendina-4 10 mM
Glucosa 5,5 mM Glucosa 23 mM
7 días 2-4 meses
Diabetes (STZ) HIPERGLICEMIA NORMOGLICEMIA
mMSC insulina +
Figura 16. Esquema de los protocolos descritos en la literatura, hasta la fecha,para diferenciar MSC a células productoras de insulina.
Glucosa 4,5 mM Nicotinamida 10 mM
β-mercaptoetanol 1 mM
Glucosa 23 mMNicotinamida 10 mM
β-mercaptoetanol 1 mM
Productoras insulina Diabetes (STZ)
HIPERGLICEMIA
rMSC 24 horas 10 horas
NORMOGLICEMIA
1 semana
Chen y cols., World Journal of Gastroenterology 10(20): 3016-3020 (2004).
mMSC
DMEM s/SFB TSA 55 nM
DMEM:DMEM/F12 (1:1) SFB 10%
Glucosa 25 mM
Estímulo de glucosa ELISA
3 días 7 días
Tayaramma y cols., Stem Cells 24(12): 2858-2867 (2006).
mMSC insulina +
Moriscot y cols., Stem cells 23: 594-604 (2005).
hMSC
7 días Ad HLXB9
(50:1) Ad FOXA2
(50:1)
+Cocultivo islotes
Ad PDX-1 (100:1) 7 días
Ad PDX-1 (40:1)
7 días Medio
Condicionado islotes
hMSC insulina +
hMSC insulina +
hMSC insulina +
Ad PDX-1 (20:1)
7 días Cocultivo islotes
hMSC insulina +
E
200 μg/mL extracto de páncreasDMEM-LG 10% SFB
Células agrupadas
rMSC 2-3 días
Choi y cols., Biochemical and Biophysical Research Communications 330: 1299-1305 (2005).
rMSC insulina +
2 semanas D
C
B
A
61
de ratas que habían sido parcialmente pancreotomizadas (60%) 48 horas
antes (fig 16D). Moriscot y cols. (2005) obtuvieron células que expresan el
gen de la insulina a partir de MSC humanas (hMSC). Las hMSC fueron
transducidas con vectores adenovirales que codifican para PDX-1, HLXB9 y
FOXA2 y luego se cultivaron por 7 días con medio condicionado por islotes
pancreáticos humanos, o bien se cocultivaron con islotes pancreáticos. En
ambos casos se observó que las hMSC transcribían el gen que codifica para
insulina (fig. 16E).
7.2 Obtención de células productoras de insulina a partir de hMSC no modificadas genéticamente. Nuestra propuesta inicial fue generar eficientemente células productoras de
insulina a partir de hMSC comprometidas al linaje neural (hM(N)SC), ya que
se ha descrito que existen muchos factores en común entre la diferenciación
neuronal y la pancreática (Hori y cols., 2005). En efecto, datos no publicados
de nuestro laboratorio indican que cuando las hMSC son cultivadas durante 3
días en un medio definido libre de suero usado para diferenciar al linaje neural,
las células expresan niveles mayores de NEUROD1, un factor importante en
la diferenciación β-pancreática (Schwitzgebel y cols., 2000), y aumenta el
porcentaje de células que expresan nestina, una proteína de los filamentos
intermedios del citoesqueleto que comúnmente se expresa durante el
desarrollo neuronal. Posteriormente las hM(N)SC serían diferenciadas a
células productoras de insulina cultivándolas en alta concentración de glucosa
y en presencia de nicotinamida y β-mercaptoetanol (Chen y cols., 2004).
7.2.1 Compromiso de las hMCS a linaje neural (hM(N)SC) y diferenciación a
células productoras de insulina:
Se sembraron 8 placas p35 (nombradas de la A a la H) con hMSC a una
densidad de 15.000 células/cm2 en medio α-10 (día 0). La figura 17 muestra
el programa de diferenciación que se siguió. El día 1 se cambió el medio de
cultivo α-10 por: i) medio α-MEM sin suero (placas A/B/D/F/H); ii) medio
inductor neural (MIN) que contiene: DMEM:F12 (1:1) suplementado con N2
62
Figura 17. Diseño experimental utilizado para evaluar la diferenciación de hMSC a células productoras de insulina.
Dí 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Siembra placas A-H d = 15000 céls/cm2
en α-10
Δ α-MEM (A/B/D/F/H) Δ MIN (G) Δ β1 (C/E) Δ β1 (B/D) Δ β2 (C/B/D/E)
11
Δ β1 (F/G) Δ β2 (F/G) Δ MIN (F)
Extracción RNA Placas B/C
Extracción RNA Placas A/D/E
Extracción RNA Placas F/G/H
Placa A 3 días α-MEM Placa B 1 día α-MEM + 1 día β1 + 10h β2 Placa C 2 días β1 + 10h β2 Placa D 1 día α-MEM + 1 día β1 + 1 día β2 Placa E 2 días β1 + 1 día β2 Placa F 5 días α-MEM + 3 días MIN + 1 día β1 + 10h β2 Placa G 8 días MIN + 1 día β1 + 10h β2 Placa H 9 días α-MEM
63
y B27, BSA 1%, de bFGF 10 ng/mL y de EGF 10 ng/mL (placa G); y iii)
medio de diferenciación β1 que contiene: α-MEM sin suero, glucosa
4,5 mmoles/L, nicotinamida 10 mmoles/L, β-mercaptoetanol 1 mmol/L
(placas C y E). Las hMSC en medio β1 se cultivaron durante 24 horas y
posteriormente se les cambió el medio β1 por el medio de diferenciación β2
que contiene: α-MEM sin suero, glucosa 23 mmoles/L, nicotinamida
10 mmoles/L y β-mercaptoetanol 1 mmol/L (Chen y cols., 2004). Las células
se cultivaron en este medio durante 10 o 24 horas.
En primera instancia se decidió probar las condiciones utilizadas por Chen y
cols. (2004) para diferenciar rMSC a células productoras de insulina (fig. 18 B,
C, D y E), variando los tiempos de incubación con los medios β1 y β2. En
paralelo las hMSC se cultivaron con MIN por 3 y 8 días y posteriormente con
los medios β1 y β2 (fig. 18 G y H). A modo de control, las hMSC se cultivaron
en α-MEM durante 3 y 8 días y en MIN durante 3 días (fig. 18 A, F e I) Cuando
las hMSC son cultivadas con MIN, las células presentan una morfología
alargada y agrupadas entre si (fig. 18 F). Independientemente del cultivo con
MIN, las hMSC cultivadas con medios de cultivo β1 y β2 presentan una
morfología corta y agrupadas entre si similar a la línea celular β-pancreática
INS-1 (fig. 18 B, C, D, E, G y H). Sin embargo, los medios con
β-mercaptoetanol y nicotinamida (β1 y β2) fue citotóxico para las células
humanas y probablemente los cambios morfológicos se deban a esta toxicidad.
Además de observar la morfología, se determinó si las células sometidas a
los diferentes protocolos de diferenciación fueron capaces de sintetizar y
secretar insulina. En la tabla 6 se observan los resultados obtenidos para la
síntesis de insulina, determinada mediante RT-PCR, y secreción de insulina,
determinada mediante ELISA. A pesar de observarse cambios morfológicos,
en ninguno de los casos se observó expresión y/o secreción de insulina. Los
detalles de los protocolos utilizados para la detección de insulina se
describen en la sección 6.3.
64
Figura 18. Morfología de las hMSC cultivadas con diferentes medios. Las fotografías se obtuvieron mediante microscopía de luz invertida. Experimento representativo de 3.
β1 (24 h) + β2 (10 h)
β1 (24 h) + β2 (24 h)
α-MEM (3 días)
MIN (3 días)
MIN (3 días) + β1 (24 h) + β2 (10 h)
β1 (48 h) + β2 (10 h)
β1 (48 h) + β2 (24 h)
MIN (8 días) + β1 (24 h) + β2 (10 h)
α-MEM (8 días)
A B C
D
G
E
H
F
I
65
Tabla 6. Síntesis y/o secreción de insulina en hMSC sometidas a diferenciación.
Condición n RT-PCR insulina
ELISA insulina
MIN (8 días) + β1 (24 h) + β2 (10 h) 2 - -
β1 (24 h) + β2 (10 h) 2 - -
β1 (24 h) + β2 (24 h) 2 - -
β1 (48 h) + β2 (10 h) 2 - -
β1 (48 h) + β2 (24 h) 2 - -
Cocultivo con INS-1 (4d) 2 - -
Medio condicionado por INS-1 (4d) 2 - -
Medio condicionado por INS-1 (5d) 2 - -
Medio condicionado por INS-1, 10 nM GLP-1, 25 mM Glucosa (7d) 2 NE -
MIN (3d) + Medio condicionado INS-1, 25 mM Glucosa (7d) 2 NE -
MIN (3d) + Cocultivo con INS-1 (4d) 2 - -
MIN (3d) + Medio condicionado por INS-1 (4d) 2 - -
MIN (3d) + Medio condicionado por INS-1 (5d) 2 - -
β1 (24 h) + β2, 10 nM GLP-1 (24 h) 2 NE -
β1 (24 h) + β2 (24 h) + 10 nM GLP-1 (7d) 2 NE -
Tricostatina A (3d) + 10 nM GLP-1, 25 mM Glucosa (7d) 2 NE -
66
7.2.2 Otros protocolos utilizados para la diferenciación de hMSC a células
productoras de insulina:
Dado que no se logró obtener células productoras de insulina con los
protocolos propuestos, se probaron una serie de nuevas condiciones. Entre
ellas se probó el cocultivo con células INS-1, el cultivo con medio
condicionado por células INS-1, cultivo con la hormona incretina GLP-1 y el
protocolo utilizado por Tayaramma y cols. (2006) para diferenciar mMSC. En
la tabla 6 se muestran los diferentes protocolos utilizados y los resultados
obtenidos para síntesis y secreción de insulina. En ninguno de los casos se
observó síntesis y/o secreción de insulina.
7.3 Detección de células productoras de insulina. Con el fin de determinar la diferenciación de las hMSC a células productoras
de insulina que responden a cambios en la concentración de glucosa, se
montó la técnica de RT-PCR de tiempo real para detectar la expresión de
los genes que codifican para insulina y los componentes importantes para
censar la glucosa: el transportador de glucosa Glut-2 y la enzima GCK. A
modo de control positivo se utilizó cDNA de islotes β-pancreáticos humanos.
Por otra parte, para determinar la secreción de insulina en respuesta a
cambios en la concentración de glucosa, se utilizó el kit de ELISA
ultrasensible para insulina (Mercodia, límite de detección 0,07 mU/L).
7.3.1 RT-PCR cuantitiva para INS, GLUT-2 y GCK:
Se extrajo RNA total las células hMSC, sometidas a los medios de
diferenciación, utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) y siguiendo las
instrucciones del fabricante. Los restos de DNA genómico se degradaron
utilizando DNAasa Ι (Invitrogen). Posteriormente, se cuantificó el RNA
mediante espectrofotometría (260 nm). Para la reacción de RT se utilizó
1 μg de RNA total, 200 U de transcriptasa inversa M-MLV (Promega) y aprox.
300 pmoles de un partidor oligo(dT) en 25 μL totales de mezcla de reacción.
La reacción se efectuó siguiendo las instrucciones del fabricante de la
enzima. Posteriormente, se realizó una PCR de tiempo real utilizando 2 μL
de la reacción de RT, 0,5 μM de cada uno de los partidores específicos
(tabla 7) y el kit LightCycler-DNA Master SYBR Green Ι (Roche), siguiendo
67
Tabla 7. Partidores específicos para PCR cuantitativa para INS, GLUT-2 y GCK.
Amplicón Gen Sentido (5’→3’) Antisentido (5’→3’) Tamaño
(pb) Tm (ºC)
Referencia Nº acceso GenBank
INS GGA CCT GAC CCA GCC GC TCC ACC TGC CCC ACC TGC 124 90 ---- NM_000207
GLUT-2 CTG TCT CTG TAT TCC TTG TGG CAA GAG AAC TTA TTC AGC AGC 124 83 ---- AH002747
GCK GAA TAC CCC CCA GAG ACC TTT TC GGT TTC TTC CTGA GCC AGC G 182 90 Hori y cols., 2005 M90299
GADPH CAG CCT CAA GAT CAT CAG CA CAT GAG TCC TTC CAC GAT AC 100 85 Millington-Ward y cols., 2002 AF261085
Utilizando el programa programa “BioMath - Tm Calculations for Oligos” (http://www.promega.com/biomath/calc11.htm#disc, acceso Octubre 2006) se calcularon las Tm de los amplicones ajustadas a la concentración de sales del kit LightCycler-DNA Master SYBR Green I (Roche) (K+ 200 mM, Na+ 200 mM, Mg+2 3 mM).
68
las instrucciones del fabricante. Los productos correspondientes se
analizaron de acuerdo a su temperatura de fusión mediante LightCycler
(Roche) y de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis en geles de
agarosa, tinción con bromuro de etidio y exposición a luz UV. Para evaluar
la calidad del cDNA obtenido se evaluó la amplificación del gen constitutivo
GAPDH mediante PCR.
Tal como se observa en la figura 19, en todos los casos se observa un pico
único de temperatura de melting y una única banda que coinciden con los
valores teóricos esperados, indicando que la reacción es específica.
Posteriormente se confeccionaron las curvas estándar para INS y GLUT-2
con el fin de determinar el límite de detección y la eficiencia de amplificación
(figura 20). A partir de estas curvas se puede concluir que las reacciones
son lo suficientemente sensibles como para detectar 1 copia de INS y de
GLUT-2. Con respecto a la eficiencia de la reacción podemos decir que
tanto la amplificación de INS como la de GLUT-2 es bastante eficiente
(pendiente cercana a -2).
Una vez establecidos los métodos para la determinación de la expresión de
INS, GLUT-2 y GCK mediante RT-PCR, se pesquisó la expresión de estos
genes en las hMSC cultivadas con los diferentes medios de cultivo. En la
figura 21 se muestra un ejemplo de la determinación y en la tabla 6 se
resumen los resultados obtenidos. A pesar de que en ninguna de las
condiciones estudiadas las hMSC expresan INS o GLUT-2, se logró
determinar que las hMSC indiferenciadas expresan en forma basal GCK y
que esta expresión es similar a la expresión en islotes β-pancreáticos
(inserto figura 21).
Dado que no se ha podido obtener las células productoras de insulina, se
decidió probar la reproducibilidad de los protocolos descritos por Chen y cols.
(2004) y Tayaramma y cols. (2006) para diferenciar MSC murinas a células
productoras de insulina, para así poder concluir que estos protocolos, descritos
para rata y ratón respectivamente, no son efectivos para células humanas.
69
INS Tm empírica = 89,63 ± 0,46 ºC
CP CN
GLUT-2 Tm empírica = 83,00 ± 0,23 ºC
CP CN
GCK Tm empírica = 89,05 ± 0,83 ºC
CP CN
Figura 19. Curvas de melting para INS, GLUT-2 y GCK. Las curvas fueron obtenidas mediante el software LigthCycler versión 3 (Roche Molecular Biochemicals). Como control positivo se utilizó cDNA de islotes β-pancreáticos. Los valores de Tm empírica fueron calculados a partir de 3 muestras independientes (± desviación estándar). Insertos: gel de agarosa 2%, carril 1: estándar 1 kb (Fermentas); carril 2: amplicón INS o GLU-2 o GCK. CP: control positivo, CN: control negativo.
500 pb
300 pb
100 pb
500 pb
300 pb
100 pb
500 pb
300 pb
100 pb
70
Figura 20. Curva estándar para PCR cuantitativo de INS y GLUT-2. Las curvas y datos de intercepto, pendiente y r se obtuvieron utilizando el software LigthCycler versión 3 (Roche Molecular Biochemicals).
Intercepto: 16.13 Pendiente: -1,831 r: -0,98
Intercepto: 16.64 Pendiente: -2,162 r: -0,97
GLUT-2 INS
71
INS CP GLUT-2
GCK
Figura 21. Determinación de la expresión de INS, GLUT-2 y GCK. Las curvas fueron obtenidas mediante el software LigthCycler versión 3 (Roche Molecular Biochemicals). La calidad del cDNA se testeó mediante la amplificación del gen constitutivo GAPDH. Como control positivo se utilizó cDNA de islotes β-pancreáticos. Inserto: expresión de GCK relativizada con la expresión del gen constitutivo GAPDH según el método de Schmittgen y Livak (2008). Experimento representativo de 2. CP = control positivo.
GCK/GAPDH: hMSC α-MEM 3 días = 0,5
hMSC + MIN 3 días + β1 1 día + β2 10 horas = 0,5
IβP = 0,7
CP
CP
72
7.4 Diferenciación de mMSC y rMSC a células productoras de insulina.
7.4.1 Aislamiento y diferenciación de MSC de ratón (mMSC) a células productoras
de insulina: Las mMSC se aislaron según el protocolo descrito por Tayaramma y cols.
(2006). En resumen, la MO de ratón se obtuvo partir de lavados con medio
DMEM 10% SFB de tibia y fémur de ratones C57BL/6 hembras sanas.
Luego, el extracto de MO se centrifugó a 400 xg durante 5 minutos, se
descartó el sobrenadante, la pella se resuspendió en medio DMEM 10%
SFB, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 μg/mL y glutamina 100 U/mL
y las células se sembraron en placas p6 a una densidad de 1x106 céls/cm2.
Luego de 12 horas de cultivo, las células no adherentes se descartaron
mediante lavado con DMEM sin SFB y se agregó medio de cultivo DMEM
sin SFB que contenía TSA 55 nM (preparación fresca). Después de 3 días
de cultivo se eliminó el TSA y las células se cultivaron durante 7 días en un
medio de “inducción específica” que contenía DMEM:DMEM/F12 en una
razón 1:1, SFB 10%, alta concentración de glucosa (25 mM) y péptido tipo
glucagón (GLP-1) 10 nM. Finalizada la diferenciación, mediante ELISA se
determinó si las mMSC sometidas a estímulo de diferenciación eran
capaces de secretar insulina.
7.4.2 Aislamiento y diferenciación de MSC de rata (rMSC) a células productoras de
insulina:
En resumen, la MO de rata se obtuvo partir de lavados, con medio α-MEM, de
tibia y fémur de ratas Sprague Dawley hembras sanas. Luego, el extracto de
MO se centrifugó a 400 xg durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante, la
pella se resuspendió en medio α-10 y las células se sembraron en placas p6
a una densidad de 1x106 céls/cm2. Después de 48 horas de cultivo, se
descartaron las células no adherentes y se agregó medio de cultivo α-10.
Después de 10 días, o cuando la placa alcanzó el 80-90% de confluencia, las
células se tripsinizaron (tripsina 0,25% p/v, EDTA 2,65 mM), lavaron,
resuspendieron en α-10 y subcultivaron a la densidad de 7.000 células/cm2.
Cuando se alcanzó el subcultivo 3, las rMSC se sometieron al protocolo de
diferenciación descrito por Chen y cols. (2004). En resumen, las rMSC se
sembraron placas p6 a una densidad de 15.000 células/cm2, se cultivaron en
73
medio bajo en glucosa (α-MEM, Glucosa 4,5 mM) y la diferenciación se indujo
cuando se llegó a un 70-80% de confluencia. Para ello las células fueron
preinducidas cultivándolas durante 24 horas en medio α-10 que contenía
suplemento B27 2%, nicotinamida 10 mM y β-mercaptoetanol 1 mM. Luego,
durante las 10 horas siguientes, las células se cultivaron en medio DMEM con
alta concentración de glucosa (23 mM), suplemento B27 2%, nicotinamida
10 mM y β-mercaptoetanol 1 mM. Finalizada la diferenciación, mediante ELISA
se determinó si las rMSC sometidas a estímulo de diferenciación eran capaces
de secretar insulina.
7.4.3 Determinación de la secreción de insulina:
Primero se estimuló la secreción de insulina y luego, mediante test de ELISA
Ultrasensible para insulina de ratón (Mercodia; limite de detección ≤ 0,025 μg/L),
se determinó la presencia de insulina en el medio de cultivo. Para el estímulo
de secreción de insulina, las células se lavaron una vez con una solución salina
balanceada con Hepes (HBSS; Hohmeier y cols., 2000) en forma rápida y
luego se incubaron durante 2 horas en HBSS sin glucosa. Posteriormente, las
células se cultivaron durante 3 horas con HBSS con alta concentración de
glucosa (15 mM). Finalmente se recolectó el medio de cultivo, se centrifugó a
400 xg durante 5 minutos, se recuperó el sobrenadante y se almacenó
a -20ºC hasta la determinación de insulina mediante ELISA. El test de
ELISA se realizó siguiendo las indicaciones del fabricante. Si bien es cierto
este test está confeccionado para determinar insulina de ratón, posee
reactividad cruzada con insulina de rata (146%) y por lo tanto puede ser
utilizado para detectar insulina de rata (ensayo cualitativo). Como control
positivo se utilizó la línea celular β-pancreática de rata, INS-1 (Asfari y cols.,
1992) y como control negativo se utilizaron MSC murinas que no fueron
cultivadas en medios de diferenciación.
7.4.4 Diferenciación de mMSC a células productoras de insulina:
Para diferenciar las mMSC se utilizó el protocolo descrito por Tayaramma y
cols. (2006) (figura 22A). En resumen, las células se cultivaron durante
3 días en medio DMEM sin SFB que contenía TSA 55 nM y posteriormente,
7 días en medio DMEM:DMEM/F12 (1:1), SFB 10%, glucosa 25 mM y
GLP-1 10 nM. Finalizada la diferenciación, se analizó la morfología de las
74
células mediante microscopia y se determinó la capacidad para secretar
insulina en respuesta a estímulo de glucosa mediante ELISA.
En la figura 22C se pueden observar los cambios morfológicos de las
mMSC sometidas a diferenciación. Tal como se observa en el inserto de la
figura 22C las mMSC, cultivadas en las condiciones anteriormente descritas,
se agruparon entre si al igual que las mMSC de Tarayamma y cols., pero en
nuestro caso la agrupación tenía un número menor de células. Las mMSC
que no fueron sometidas a diferenciación (figura 22B), se ven redondeadas,
pero no se observan agrupaciones celulares. En ambos casos, se observa
una menor confluencia de las mMSC que la descrita por Tarayamma y cols.
Luego del estímulo de glucosa, no se detectó presencia de insulina en los
sobrenadantes de las mMSC sometidas a diferenciación.
7.4.5 Diferenciación de rMSC a células productoras de insulina:
Para diferenciar las mMSC se utilizó el protocolo descrito por Chen y cols.
(2004) (figura 23A). En resumen, las rMSC se cultivaron en medio bajo en
glucosa (α-MEM, Glucosa 4,5 mM) y se indujo la diferenciación cuando las
células estaban confluentes en un 70-80%. Para ello, las células se
cultivaron durante 24 horas en medio α-10, suplemento B27 2%,
nicotinamida 10 mM y β-mercaptoetanol 1 mM. Luego, durante las 10 horas
siguientes, las células se cultivaron en medio DMEM con alta concentración
de glucosa (23 mM), sin SFB, suplemento B27 2%, nicotinamida 10 mM y
β-mercaptoetanol 1 mM. Finalizada la diferenciación, se analizó la
morfología de las células mediante microscopia y se determinó la capacidad
para secretar insulina mediante ELISA.
En la figura 23C se pueden observar los cambios morfológicos de las rMSC
sometidas al protocolo de diferenciación establecido por Chen y cols. (2004).
Tal como se observa en el inserto de la figura 23C las rMSC, cultivadas en
las condiciones anteriormente descritas, se agruparon entre si al igual que
las rMSC de Chen y cols. Las rMSC que no fueron sometidas a
diferenciación (figura 23B) tienen forma fibroblastoide y no se agrupan entre
si. Luego del estímulo de glucosa, no se detectó presencia de insulina en los
sobrenadantes de las rMSC sometidas a diferenciación.
75
7 días
Figura 22. Diferenciación de mMSC a células productoras de insulina según Tayaramma y cols. (2006). A) Esquema del protocolo utilizado para diferenciar las mMSC. B) Morfología de las mMSC sin ser sometidas al protocolo de diferenciación. C) Morfología de las mMSC sometidas al protocolo de diferenciación. Experimento representativo de 3.
mMSC
DMEM s/SFB TSA 55 nM
DMEM:DMEM/F12 (1:1) SFB 10%Glucosa 25 mM
GLP-1 10 nM
Estímulo de glucosa ELISA
3 díasA
Análisis morfología
B C
76
α-10 B27 2%Glucosa 4,5 mM
Nicotinamida 10 mM β-mercaptoetanol 1 mM
DMEMs/SFB B27 2%Glucosa 23 mM
Nicotinamida 10 mM β-mercaptoetanol 1 mM
rMSC 24 horas Estímulo de glucosa ELISA
10 horas
Figura 23. Diferenciación de rMSC a células productoras de insulina según Chen y cols. (2004). A) Esquema del protocolo utilizado para diferenciar las rMSC. B) Morfología de las rMSC sin ser sometidas al protocolo de diferenciación. C) Morfología de las rMSC sometidas al protocolo de diferenciación. Experimento representativo de 3.
Análisis morfología
B C
A
77
7.4.6 Discusión de los resultados obtenidos:
En los últimos años se han reportado variados protocolos para diferenciar
MSC, de distintas especies, a células productoras de insulina. Algunos de
ellos están basados en la manipulación genética y otros en el cultivo de las
células con medios definidos. Dado que, existe una gran discusión sobre el
uso terapéutico que puedan tener las células manipuladas genéticamente,
nuestro principal objetivo era obtener MSC diferenciadas utilizando protocolos
basados en el cultivo con medios definidos. Dentro de los protocolos
establecidos en la literatura se eligieron los descritos por Tarayamma y cols.
(2006) y por Chen y cols. (2004) para diferenciar mMSC y rMSC
respectivamente, ya que son más rápidos, simples y utilizan un menor
número de reactivos.
Desafortunadamente, no se pudieron obtener mMSC diferenciadas a células
productoras de insulina utilizando el protocolo establecido por Tarayamma y
cols. (2006). Una de las diferencias observadas entre este trabajo y el de
Tarayamma y cols., es la menor confluencia de las mMSC que se obtuvo
luego de seguir el protocolo para aislar las mMSC. Datos obtenidos por otros
investigadores de nuestro laboratorio indican que al remover las células no
adherentes a las 24 horas después de haber sembrado la MO, se obtiene un
menor número de mMSC que cuando las células no adherentes son
removidas a las 48 o 72 horas. En el protocolo descrito por Tarayamma y
cols., las células no adherentes son removidas luego de 12 horas lo que
explicaría el menor número de células observado en mis resultados. Sin
embargo, aumentar el número de horas a la cual se remueven las células no
adherentes tal vez no sería una solución, ya que al aumentar las horas
también el cultivo celular es más heterogéneo y la troncalidad de la población
celular puede ser distinta a la obtenida por Tayaramma y cols. Otra diferencia
entre el protocolo de Tayaramma y el nuestro puede estar dada por el tipo de
GLP-1 utilizado, ya que existe una gran variedad de GLP-1 en el mercado. Yo
utilicé preproglucagon (fragmento 72-108; Sigma G3265) mientras que
Tayaramma y cols. no explicitan que tipo de GLP-1 utilizaron. Estas
diferencias quizás expliquen porque no se logró diferenciar mMSC a células
productoras de insulina utilizando el protocolo descrito por Tayaramma y cols.
Por último, tal vez algunas células produjeron insulina, pero como el número
78
total de células era menor, no se logró detectarla, ya que el limite de
detección del kit de ELISA utilizado es ≤ 0,025 μg/L.
Por otra parte, tampoco se obtuvieron resultados positivos cuando se utilizó el
protocolo descrito por Chen y cols. (2004) para diferenciar rMSC a células
productoras de insulina. En este caso quizás la principal diferencia es la cepa
de rata utilizada para aislar las rMSC. Chen y cols., utilizaron ratas Wistar,
mientras que, debido a la falta de disponibilidad, yo en este trabajo se
utilizaron ratas Sprague Dawley. A pesar de esta diferencia, se observó un
cambio morfológico similar tanto en el control como en la rMSC sometidas a
la diferenciación. Sin embargo, no se detectó insulina en el medio de cultivo
luego del estímulo con glucosa. Chen y cols. no explicitan si sometieron las
células diferenciadas a estímulo con glucosa o si utilizaron agentes
secretagogos en el medio de cultivo antes de obtener el medio en donde
cuantificaron la concentración de insulina. Además, Chen y cols. determinaron
la concentración de insulina mediante RIA, ensayo que generalmente es
mucho más sensible que el de ELISA. Recientemente, Wu y cols. (2007)
describieron un protocolo para obtener células productoras de insulina a partir
de rMSC de ratas Sprague Dawley. En este caso, los autores reportan que
luego de cultivar las células en medio con alta concentración de glucosa,
nicotinamida y exendina-4 (análogo de GLP-1), sólo el 19,8% de las células
expresaron insulina. Este último antecedente refuerza la idea de que es baja
la eficiencia de diferenciación de rMSC a células productoras de insulina. Por
lo tanto, tampoco puedo descartar que el número de células diferenciadas sea
tan discreto que no logren secretar suficiente insulina como para ser
detectada con el kit de ELISA utilizado.
Finalmente, quisiera comentar que la Dra. Conget tuvo la posibilidad de
comentar nuestros resultados en dos oportunidades con expertos
internacionales en células troncales, y en particular MSC, los que también
han repetido los experimentos reportados por los equipos de Tayaramma y
Chen, sin poder aún obtener células productoras de insulina. Además, llama
potentemente la atención que en la literatura no existan otros grupos de
investigación que utilicen los protocolos descritos por Tayaramma o por
Chen, sobre todo en este último caso, ya que es un protocolo establecido en
el año 2004.
79
Finalmente, podemos concluir que en nuestro laboratorio no se han podido
reproducir los protocolos descritos en la literatura para inducir la
diferenciación de MSC murinas a células productoras de insulina.
Dado que no se pudieron obtener hMSC diferenciadas a células productoras
de insulina, el trabajo de esta tesis se centró principalmente en la
caracterización de las hMSC con respecto al manejo del EO. Sin embrago,
luego de observar que las hMSC resistían a la muerte inducida por EO,
nuestra pregunta fue si las MSC murinas se comportan de forma similar a
las hMSC. Para ello comparamos la resistencia de las mMSC y rMSC a la
muerte inducida por SIN-1, SNAP y H2O2.
7.5 Resistencia al EO de hMSC versus mMSC y rMSC. Para determinar la susceptibilidad de las MSC de distintas especies a la
exposición a ROS y/o RNS, se compararon los resultados obtenidos para
hMSC, rMSC y mMSC entre ellos y versus los obtenidos para células INS-1
(Tran y cols., 2003). Tal como se observa en la figura 24, las rMSC tienen
una viabilidad similar a las hMSC cuando son cultivadas con SNAP 4 mM y
H2O2 0,5 mM, pero significativamente menor cuando son cultivadas con
SIN-1 4 mM. Estos resultados indican que las rMSC manejan eficientemente
ROS y RNS por separado, pero no lo hacen tan eficientemente como las
hMSC con ROS+RNS (peroxinitrito). Sin embargo, estas células continúan
siendo más resistentes a SIN-1 que las células INS-1, ya que el porcentaje de
viabilidad de las rMSC frente a SIN-1 4 mM es de 15% versus el 1% de
viabilidad que presentan las células INS-1. Por otra parte, las mMSC tienen
una viabilidad similar a las hMSC cuando son cultivadas con SIN-1 4 mM y
H2O2 0,5 mM, pero significativamente menor cuando son cultivadas con
SNAP 4 mM. Estos resultados nos indican que las mMSC manejan
eficientemente ROS y peroxinitrito, pero no manejan las RNS tan
eficientemente como las hMSC. Sin embargo, estas células continúan siendo
más resistentes a SNAP que las células INS-1, ya que el porcentaje de
viabilidad de las mMSC frente a SNAP 4 mM es de 51% versus el 3% de
viabilidad que presentan las células INS-1. Independiente de la especie de la
cual sean derivadas las MSC, éstas son menos susceptibles que las CβP a la
muerte inducida por EO.
80
0
20
40
60
100
120
SNAP 4 mM H2O2 0,5 mM
% V
iabi
lidad
(CV)
ns ns rMSC (3) hMSC (6) mMSC (3)
ns p<0,01
p<0,05 ns
Figura 24. Resistencia al EO de rMSC, hMSC y mMSC. La resistencia frente a diferentes agentes generadores de ROS y/o RNS (SIN-1 4mM, SNAP 4mM y H2O2 0,5mM) se determinó mediante ensayos de citotoxicidad. Para ello las células se cultivaron durante 18 h con los agentes generadores de estrés y posteriormente la viabilidad celular se determinó utilizando cristal violeta y medición espectrofotométrica a 570 nm. Los números entre paréntesis indican el número de muestras independientes utilizadas en cada caso, y las barras indican el error estándar. La significancia fue analizada utilizando el análisis de ANOVA de una via y la comparación múltiple de Newman-Keuls como post test. ns = no significativo.
81
7.6 Cultivo Mixto de Linfocitos.7.6.1 Procedimiento experimental:
Para aislar los linfocitos de sangre periférica (PBL), se colectó sangre en tubos heparinizados y los PBL se purificaron mediante centrifugación en gradiente de Ficoll (Ficoll-Paque Plus; Amersham Bioscience) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los PBL (25x106/tubo) se criopreservaron en suero humano 10% DMSO. El pool consistió en criopreservar en un mismo tubo 5x106 PBL de 5 individuos diferentes.
Para la MLC, los PBL descongelados se lavaron dos veces con medio de cultivo RPMI 1640 10% suero humano. L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/mL y estreptomicina 100 μg/mL. Posteriormente se irradiaron con 20 Gy el pool de PBL, una alícuota de los PBL respondedores (como control negativo) y las hMSC. En placas de 96 pocillos de fondo curvo se sembraron los PBL respondedores (100.000 por pocillo) y el pool de PBL irradiados (100.000 por pocillo). A cada pocillo se le agregó diferentes concentraciones de hMSC irradiadas (0,01, 0,1, 1 y 10%). Los cocultivos se cultivaron durante cinco, seis y siete días. Veinticuatro horas antes de medir la radioactividad, se agregó una alícuota de timidina tritiada (1 Cu) a los cocultivos. Las células se cosecharon en papel filtro y la incorporación de timidina tritiada se cuantificó en un contador de centelleo MicroBeta TRILUX 1450 (Perkin Elmer). Los cálculos se realizaron en base a la estimulación del sistema inmune (% estimulación) que tiene relación directa con la proliferación de los PBL y la incorporación de timidina tritiada.
7.6.2 Resultados del MLC: Como se observa en la figura 25, las hMSC inhiben la proliferación de los PBL
en MLC. Esta inhibición depende del tiempo de cultivo y de la concentración de hMSC utilizada. A mayor tiempo y concentración de hMSC, mayor inhibición de la proliferación de PBL. De este modo, se concluye que la inhibición de la respuesta inmune depende del tiempo de cocultivo y de la concentración de hMSC. La mayor inhibición de la respuesta inmune alogénica en un MLC se observa a los 7 días y a una alta concentración de hMSC (10%).
Finalmente, la técnica de MLC permite estudiar las propiedades inmulógicas de las hMSC. Durante la estadía en el Instituto Karolinska se logró reproducir los resultados obtenidos por otros investigadores, confirmando las características inmunoreguladoras de las hMSC.
82
Cinética MLC hMSC
0
20
40
60
80
100
120
(Px+A)-(Ax+A) 10% MSC 1% MSC 0,1% MSC 0,01% MSC
% e
stim
ulac
ión
d5d6d7
Figura 25. MLC frente a diferentes concentraciones de hMSC.
83
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