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Tema 4:Estructura y Funcin de las Protenas (4)Prof. Vanessa Miguelvanessa.miguel@ucv.ve@bioquitipsDiciembre 2012

Universidad Central de VenezuelaFacultad de MedicinaEscuela de Medicina Luis RazettiCtedra de Bioqumica 1Cmo se estudian las protenas?

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3Aislando fracciones subcelulares

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6Mtodos de purificacinSe basan en las propiedades fisicoqumicas de las protenas:

Tamao SolubilidadCargaAdsorcinAfinidad 7Caracterstica

Procedimientos

Tamao

Dilisis ultrafiltracinElectroforesis en gelCromatografa de exclusin molecularUltracentrifufacin

Solubidad

Precipitacin con Sales Solventes orgnicos por pH

Polaridad

Cromatografia de absorcinC. En papelC. En fase reversaC. De interaccion hidrofbica

Carga

Cromatografia de intercambio inicoElectroforesisIsoelectroenfoque

Selectividad

Cromatografia de afinidad

8CentrifugacinUtiliza la fuerza centrfuga (fuerza-g) para aislar partculas suspendidas. Los componentes de la mezcla se separan por: peso, tamao, densidad y forma.Se utiliza para la separacin de organelos subcelulares y para el aislamiento de macromolculas, tales como ADN, ARN, protenas o lpidosSe separan es sucoeficiente de sedimentacin(s); medido en Svedbergs(1 S = 10-13segundos), depende de la forma y el tamao de la molcula o partcula.9

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11CentrifugacinCentrifugacin en gradientes de densidad Gradientes continuos de sacarosa tubo de centrfuga

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Aplicacin de fuerza centrfuga13

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15Muestra:tres componentesmezcladosFase mvilFaseestacionariaSe hace fluir una fasemvil sobre la estacionariaDependiendo de la afinidadrelativa por ambas fases, loscomponentes de la mezcla se separanSe dispone una mezclasobre una fase estacionariaFundamento de la cromatografa16CromatografaExclusin molecular:Separa segn tamao molecularFase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzadosFase mvil: solucin buffer Intercambio inico:Separa segn carga elctricaFase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insolubleFase mvil: gradiente de sal o de pH

17Exclusin molecularSepara mezclas de protenas por tamao Las columnas rellenas de polmeros inertes insolubles pero muy hidratados:

Sephadex: polimeros de dextranoSepharose: agarosaSuperose: agarosa entrecruzadaSephacryl: dextrano-bisacrilamida Superdex: agarosa y dextrano18Exclusin MolecularResina porosaFase estacionariaAmortiguadorFase mvilResinaBAA: Pasa slo por fuera de las perlasMenos recorrido, sale primeroB: Pasa por dentro y por fuera de las perlasMayor recorrido, Sale despus

19Exclusin molecular20Protenas de gran tamao no penetran los poros permaneciendo en el volumen de exclusin de la columna Vo

Volumen de exclusin21

.

1.La columna se equilibra con el buffer de corrida2. Aplicacin de la muestra (0.5 - 5% volumen de columna)3. Elucin.

Exclusin Molecular22Cromatografa en columna La salida de las protenas se detecta normalmente por absorcin de la luz, en una longitud de onda de 280nm. Los aminocidos de las protenas absorben tal luz y se cuantifica utilizando unespectrofotmetro, Los datos se registran en un diagrama de elucinque indica la posicin de las protenas que se han separado.Despus pueden realizarse estudios de actividad biolgica, enzimtica, etc. de las protenas fraccionadas 23

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Cromatografa deintercambio inico25Un intercambiador inico consiste en una matriz porosa con grupos cargados unidos covalentemente.Estos grupos se asocian con iones de la fase mvil (contraines), estos pueden intercambiarse por otros iones de las misma carga sin alterar la matriz.La matriz generalmente es un compuesto inorgnico, resinas sintticas o polisacridos. Matriz Nombre

DextranoSephadex

AgarosaSepharose CL-6B

CelulosaSephacel

26Intercambio InicoLos grupos funcionales cargados son una propiedad fundamental del intercambiador.Determinan el tipo y la fuerza del intercambiadorEl nmero total y su disponibilidad, determinan la capacidad del intercambiadorLos de carga negativa adsorben cationes (intercambiadores catinicos) mientras que los de carga positiva adsorben aniones (intercambiadores aninicos)

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Intercambiadores aninicos28

Intercambiadores catinicos29 Mecanismo de separacin

Separa a molculas por carga neta.

Grupos cargados unidos a la matriz unen las muestras de carga opuesta(reversible) La elucin se logra a travs el cambio del pH o aumentando la concentracin de sal del eluyente.

Fig 1.1. Charged sample molecules adsorb to ion exchangers of the opposite sign. The interaction is a dynamic equilibrium that can be influenced by pH or salt concentration.

Intercambio inico30

Resina carga (-)Atrae cationes

A: (+)B: (-)Retenidas por la resinaPara separar A de la resina es necesario cambiar el pH por arriba del pICromatografa de intercambio inico31+++++++++-----------+++++++++-------------------+++++++++--------------------Protenas adsorbidasal intercambiadorinicoA baja concentracinde sal, se desprenden las protenas menoselectronegativasA mayor concentracinde sal se desprenden las protenas mselectronegativasIntercambio inico32

33ElectroforesisMtodo de separacin de sustancias cargadas al aplicar un campo elctrico, de modo que se diferencian en el diferente comportamiento en un campo elctrico. Aquellas partculas cargadas positivamente (cationes) migrarn hacia el ctodoy las cargadas negativamente (aniones) hacia el nodo. 341. Se realiza sobre un soporteslido o semislido, para minimizar efectos de difusin2. Se somete el conjunto aun campo elctrico constante, a un pH fijo; las protenas migranconforme a su carga elctrica3. Terminada la electroforesis, las protenas se tien con un colorante adecuado (ej., Azul de Coomassie)Muestra+-nodoCtodoElectroforesis35Electroforesis de zonaPapel de filtro o acetato de celulosaRevela la presencia de protenas con colorantes especficosNo existe interaccin con el soporteResolucin muy bajaRpido36

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38Electroforesis en geles de poliacrilamidaSepara por carga y tamaoEl material soporte interacciona con las protenas actuando como matriz retardando a las protenas ms grandesUtiliza geles de poliacrilamidas.Condicion nativa (PAGE) o desnaturalizante(SDS-PAGE) 39

Electroforesis40SDS-Page Las protenas se separan slo por su PMEl SDS interacciona con las protenas por interacciones hidrofbicas Recubre las protenas con carga negativa proporcional a su PMDesnaturaliza la estructura nativa de la protena -mercaptoetanol rompe los puentes disulfuros

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Electroforesis45Electroforesis bidimensional

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47Separar protenas de una mezcla Determinacin de PI y PM Fraccionamiento de las hemoglobinas Diferenciacin de la hemoglobina fetalDiagnstico de talasemias, anemias falciformes, etcProtenas sricasProtenas urinariasLipoprotenascidos nucleicosEnzimasInmunoelectroforesisEtc.

Electroforesis: Aplicaciones48SolubilidadMuy utilizados en los primeros pasos de la purificacinMantiene nativa a la proteinaRedisolucin sin prdida de actividadCada protena tiene una composicin de aa diferente y diferente solubilidad49SolubilidadDepende de:pHFuerza inicaDisolventeTemperatura50Solubilidad-pHLa carga neta de las protena depende del contenido de aa cidos y de aa bsicosCuando el valor del pH donde la carga neta de la protena es cero pI

Solubilidad es mnina

Ej: contenido de aa cidos pI bajo (4-5) 51Solubilidad: disolventesAdicin de disolventes neutros miscibles en agua (ACETONA, ETANOL)Se usan en distintas proporcionesDisminuyen la solvatacin de las protenas en soluciones acuosas

52Solubilidad-Fuerza inicaSalting in

Salting out

53Salting in (salado)Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 0.02 M) aumenta con la [ sales] Salting in

Al aumentar la [sales] protena se rodea de contraiones ms soluble por > interaccin protena-solvente54Salting out (precipitacin por salado)La solubilidad a alta fuerza inica (mayor a 0,02M) disminuye con la [sales] Salting out La alta [sal] remueve la esfera de solvatacin de la protena y stas precipitan

55Solubilidad- Temperatura0-40 oC >T > solubilidad.40-50oC aumenta la inestabilidad y DESNATURALIZAN ( solubilidad)56