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IN G . L A UR A V Z QUE Z

CROMATOGRAFA

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CROMATOGRAFA

Fase estacionaria: slido o lquido fijado a un slido

Fase mvil: fludo (lquido o gas) que arrastra la muestra a travs de lafase estacionaria

Los distintos componentes de la mezcla interaccionan demanera diferente con las dos fases establecindose un reparto

entre ambas

Se establece un equilibrio entre partculas adsorbidas desorbidas

! " #molculas adsorbidas$

#mol% adsorbidas$ & #mol% desorbidas$coeficiente de reparto

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F'SS'*+,-'.+'

F'S /01+L

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*lasificaciones de cromatografa

2%Seg3n como se encuentre la fase estacionaria

a%columna

b%plana cromatografa en papel en capa fina

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4%Seg3n el tipo de fase estacionaria fase mvil

Fase estacionaria

Lquido adsorbido

Fase mvil

Slida Lquida o gaseosa

Lquida o gaseosa

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5%Seg3n el tipo de flujo empleado

a%6ravedad

b%*apilaridad (papel7 capa fina)

c%Fludo a presin (89L*)

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89L* (ig performance liquid cromatograp)

Se basa en los mismos principios que la cromatografa a baja presin

iene mejor resolucin7 tiempos menores7 mejor reproducibilidad

l material empacado en las columnas est; formado por peque

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FPLC (fast protein liquid cromato!rap"#

s una variante del 89L* con columnas equipamiento especialmente dise

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>%Seg3n la finalidad del e=perimento

Separacin purificacin 9reparativa

Separacin7 cuantificacin caracterizacin

'naltica

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>%Seg3n la interaccin entre la fase mvil el soluto

a%*romatografa de intercambio inico carga?carga

b% *romatografa de interaccin idrofbica efecto idrofbico

c% *romatografa de afinidad variada pero especfica

d%*romatografa de afinidad por metalesinmovilizados (+/'*)

e%*romatografa de fase normal reversa dipolos

enlaces covalentes

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*romatografa de intercambio inico

La separacin se basa en diferencias de carga a un p8 dado

Las interacciones son electrost;ticas

@os tipos

lucin: puede llevarse a cabo mediante cambios de p87 fuerza inica oambos

+ntercambio aninico: matriz cargadapositivamente (@'7 '7 A')

+ntercambio catinico: matriz cargadanegativamente (carbo=imetilos7sulfonatos7 fosfatos)

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*romatografa de afinidad

Se basa en una interaccin biolgica especfica:

nzima?sustrato

'nticuerpo?antgeno

nzima?coenzima9rotena?ligando especfico

La elucin se puede lograr agregando el ligando (el que est; unido a la

columna) en solucin o mediante cambios en el buffer que seancapaces de debilitar la interaccin

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+/'* (immobilized metal affinit cromatograp)

Se basa en la formacin de enlaces de coordinacin entre iones

met;licos inmovilizados grupos b;sicos en protenas (istidinas)9rincipalmente a los iones divalentes de metales de transicincomo Fe7 *o7 $i7 *u Bn

La elucin se lleva a cabo adicionando quelantes m;s fuertes como elimidazol a distintas concentraciones o cambios en el p8

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s mu utilizada para la purificacin de protenas recombinantes

6eneralmente se adicionan C istidinas en el e=tremo -to en el *t

*ola de (8istidina)C

-i4&

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*romatografa de interaccin idrofbica

l soporte est; sustitudo con cadenas alif;ticas de 4 a 2D carbonos u otros

grupos idrofbicos

La interaccin es de tipo idrofbica

La fase mvil debe tener una alta concentracin de sales((-8>)4S,54 E > /)

Salting out

9ara la elucin se disminue la concentracin de sales en la fase mvil

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*romatografa de fase reversa

st; mu relacionada con la cromatografa de interaccin idrofbica

pero son diferentes

l soporte est; sustitudo por alif;ticas pero m;s largas ( ?2 carbonos) la densidad de sustituentes es maor

La unin es m;s fuerte por eso requiere mezclas con solventes nopolares para la elucin

@esnaturaliza protenas

Se utiliza en 89L*

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6el filtracin (cromatografa de e=clusin molecular)

-o es una cromatografa

La separacin se da por tama

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l gel debe ser inerte7 de tama

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Resultado final% cromato!rama

1elucin(mL) 1elucin(mL)

" unidades de absorbancia7 unidades de fluorescencia relativa7 intensidad

del pico (espectrometra de masa)7 entre otras

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La pregunta m;s importanteG

Hn qu son distintas las sustancias que deseo separarI

*oncluendoG%