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Tesis Doctoral

Cinética y mecanismos del edema celular isosmótico producido por amoníaco y amonio en células de

neuroblastoma

Presentada al Programa de Doctorado en Neurociencias y Biología del Comportamiento de la Universidad

Pablo de Olavide por

Víctor Martín Blanco

Licenciado en Genética por la Universidad Nacional de Misiones, Argentina.

Director: Dr. Francisco Javier Álvarez-Leefmans Tutor: Dr. José María Delgado García (Universidad Pablo de Olavide) Realizada en: -Laboratorio de Neurofisiología, Depto. de Farmacología y Toxicología, Wright State University, Dayton, Ohio, Estados Unidos. -Unidad del CINVESTAV en el Instituto Nacional de Psiquiatría, México D.F., México.

a Pau y Jere,

a mis padres,

Aჟrâdēcịლịĕռţöა Al Dr. Francisco J. Alvarez-Leefmans, por su apoyo y su estímulo. Por descubrir, para mí, la ciencia. A los Dres. Agnés Gruart Masso y José M. Delgado García, por su confianza y aliento constantes. A mis compañeros del Laboratorio de Neurobiología en México, Sergio Márquez, José Fernández, René Garduño, Jaime Herrera Pérez, Andrés Nani y Alicia Maldonado, por su ayuda invaluable en la realización de esta tesis, y su solidaridad en todo momento. Al Dr. Robert W. Putnam, por su enorme generosidad, humana y científica. Al Dr. Mel Goldfinger, por el estímulo y la ayuda brindados. A Alejandro Múnera y a Elena Domínguez, por estar allí, y dejarme encontrarlos. A mis viejos, porque este paso es también de ellos. A Paula, por los sueños compartidos, por acompañarme, alentarme y sostenerme todos estos años. Թ víctor

I

. INDICE Resumen 1 Abstract 2 Abreviaturas 3 1. Introducción 4 Parte I. 1.1. Aspectos fisiológicos del amoníaco y del amonio 5 1.2. Metabolismo del amonio en el cerebro 8 1.3. Efectos del par NH3/NH4

+ sobre el volumen celular acuoso y el pH intracelular 10 1.3.1. Modelo teórico de los cambios de volumen celular acuoso y de pH intracelular

inducidos por la exposición a NH3/NH4+ 12

1.3.2. Vías de transporte de NH4+ a través de la membrana plasmática 14

1.4. Regulación del pH intracelular y su relación con el volumen celular 15 1.5. Homeostasis del volumen en células neurales 17

1.6. Alteraciones del volumen celular en el sistema nervioso central producidas por hiperamonemia 18

1.6.1. Fisiopatología del edema cerebral inducido por NH3/NH4+. 19

Parte II 1.7. Control del volumen celular 23

1.7.1. Estrategias para el estudio de los procesos de regulación del volumen celular 25 1.7.2. Cambios en el volumen celular acuoso en medios isosmóticos 27 1.7.3. Elementos celulares que intervienen en las respuestas de osmoregulación 29

1.7.3.1. Mecanismos de detección de los cambios de volumen 29 1.7.3.2. Transducción intracelular de los estímulos osmóticos 31 1.7.3.3. Mecanismos efectores de la regulación del volumen celular 32

1.7.4. DRV y ARV: paradigmas experimentales en el estudio de los fenómenos de osmoregulación 32 1.7.4.1. Disminución reguladora del volumen, DRV 32 1.7.4.2. Aumento regulador del volumen, ARV 34

2. Objetivos 36 3. Materiales y Métodos 37

3.1. Células 37 3.2. Cultivo celular 37 3.3. Soluciones experimentales 38 3.3.1. Sustitución de iones 39 3.3.2. Bloqueadores de canales y transportadores 40 3.4. Fundamentos de la técnica de microscopía de fuorescencia para la medición del volumen celular 40 3.5. Carga de las células con indicadores fluorescentes 43 3.6. Registro de las señales fluorescentes 44 3.7 Calibración osmótica de las células y conversión de la señal fluorescente

II

en unidades de volumen celular acuoso relativo 48 3.8. Protocolo experimental 50 3.9. Evidencia de que los cambios de fluorescencia producidos por el par NH3/NH4

+

no son espurios 51 3.10. Corrección de la deriva y análisis de las señales fluorescentes 52

3.10.1. Análisis de los cambios en el VCA 52 3.10.2. Análisis de los cambios en el pHi 53

3.11. Calibración del pHi 54 3.12. Criterio de selección de las células para el análisis de los cambios en el VCA y en el pHi 55 3.13. Ventajas y desventajas de las técnicas fluorescentes 56 3.14. Detección de la enzima glutamina sintetasa por el método de Western Blot 57 4. Resultados 58 4.1. Cambios paralelos en el volumen celular acuoso y en el pH intracelular producidos por el par amonio/amoníaco en células de neuroblastoma 58 4.1.1. ¿Es posible explicar el aumento inicial del VCA por la acumulación intracelular de NH4

+? 61 4.1.2. El volumen celular cambia en función de la concentracion externa de NH4Cl 64

4.1.3. Efectos diferenciales del NH3 y el NH4+ sobre el VCA y el pHi 65

4.2. Estimación del flujo y de la permeabilidad al NH3 68 4.3. Reproducibilidad de la respuesta celular a los pulsos de NH3/NH4

+ 71 4.4. Otros posibles factores determinantes del aumento inicial del volumen celular acuoso en células N1E-115 expuestas al NH3/NH4

+ 74 4.4.1. Síntesis y acumulación de glutamina 75 4.4.2. Influjo neto de iones 77

4.4.2.1. Substitución del Cl- externo por gluconato 78 4.4.2.2. Sustitución de Na+ externo por n-metil-d-glucamonio 80

4.5. Factores determinantes de la disminución reguladora del volumen en células expuestas a soluciones isosmóticas conteniendo NH3/NH4

+ 82 4.5.1. Cambios en la tensión mecánica de la membrana celular 4.5.1.1. Efectos de la inhibición de canales no selectivos a cationes, activados por aumentos en la tensión de membrana plasmática, sobre la DRVi 83 4.5.2. Magnitud de la expansión inicial: relación entre la amplitud del aumento inicial del VCA y la DRVi 84 4.5.3. Alteraciones osmóticas resultantes del influjo de NH4

+ 85 4.5.4. Cambios en el pH intracelular 87 4.5.5. Posible eflujo electrodifusional de Cl- y K+ durante la DRVi 88 4.5.5.1. Efectos de los inhibidores de conductancias al Cl- y al K+ sobre el pHi 90 4.6. Posibles vías de transporte del NH4

+ 91 5. Discusión 93 5.1. El método mide cambios fidedignos en el pHi y en el volumen celular acuoso de células individuales 93 5.2. Cambios de pH y volumen en células expuestas al par conjugado amoníaco/amonio 93 5.2.1. La permeabilidad de la membrana plasmática al NH3 y al NH4

+ determina

III

la cinética de los cambios de pHi y VCA 95 5.2.1.1. Gradiente electroquímico y permeabilidad de la membrana celular al NH4

+ 97 5.3. Factores determinantes del aumento del VCA mediado por el par NH3/NH4

+ 98 5.3.1. Acumulación intracelular de NH4

+ y un anión acompañante 99 5.3.2. Síntesis y acumulación de glutamina 99 5.3.3. Influjo de Cl- y Na+ 101 5.3.3.1. Cambios en el pHi basal inducidos por la remoción del Cl- o del Na+ externos 102 5.4. Factores determinantes de la DRVi en células expuestas a soluciones conteniendo NH3/NH4

+ 103 5.4.1. Cambios en la tensión de la membrana plasmática 103 5.4.1.1. Activación de canales catiónicos activados por aumentos en la tensión de la membrana 104 5.4.1.2. Expansión inicial del volumen 105 5.4.2. Efectos osmóticos del NH4

+ 105 5.4.3. Posible influencia del pHi sobre la DRVi 106 5.4.4. Activación de vías electrodifusionales (canales iónicos) durante la DRVi 107 5.5. Probables vías de influjo del NH4

+ 110 5.6. Posibles implicaciones fisiopatológicas 111 6. Conclusiones 112 7. Perspectivas 114 8. Referencias 116

1

. RESUMEN

La base neutra amoníaco (NH3) y su ácido conjugado, el ión amonio (NH4+), juegan un

papel central en el metabolismo del nitrógeno en los seres vivos. A pesar de su importancia fi-siológica, el par NH3/NH4

+ es potencialmente tóxico. Por ejemplo, los aumentos en la concen-tración plasmática de NH3/NH4

+ (hiperamonemia) juegan un papel importante en la génesis del edema cerebral característico de la encefalopatía hepática. Desde hace más de un siglo se sabe que la exposición transitoria de células al par NH3/NH4

+ produce cambios característicos en el pH intracelular (pHi), siendo ésta una maniobra experimental común para el estudio de los mecanismos reguladores del pHi. A partir de consideraciones teóricas se ha hipotetizado, pero no demostrado, que la acumulación intracelular de NH4

+ tras la exposición al par NH3/NH4

+ debe producir, además, un aumento en el volumen celular. En el presente trabajo se estudian, mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa, los efectos del NH3/NH4

+ sobre el volumen celular acuoso (VCA) y el pHi en células individuales y diferenciadas de neuro-blastoma (N1E-115) in vitro, cargadas con el indicador fluorescente BCECF. El VCA se estu-dia registrando la fluorescencia emitida por el indicador al excitarlo en su punto isosbéstico (PI) intracelular (~438 nm), que es insensible al pH, pero sensible a cambios en su concentra-ción intracelular, a partir de los cuales se calculan los cambios en el VCA. El pHi se midió utilizando el cociente de fluorescencias excitando a 495nm (frecuencia sensible al pH) y al PI.

Se encontró que la exposición y remoción de soluciones isosmóticas conteniendo NH3/NH4

+ (NH4Cl 0,5-30 mM) produce cambios paralelos en el pHi y en el VCA, que constan de cuatro fases: 1) un aumento inicial del pHi, que precede en pocos segundos a un aumento en el VCA. 2) Una fase lenta de acidificación intracelular, concomitante con una disminución reguladora del volumen (en medio isosmótico; DRVi). La remoción del pulso de NH4Cl pro-duce 3) una caída pronunciada y simultánea del pHi y del VCA, tras lo cual se observa 4) una fase de recuperación parcial o total del pHi y del VCA. Al variar de manera independiente las concentraciones de NH3 y NH4

+ en las soluciones experimentales, se observa que el aumento inicial del pHi y del VCA dependen de la concentración externa de NH3 y no de la de NH4

+. La alcalinización intracelular inicial resulta de la protonación del NH3 que ingresa rápidamen-te a las células formando NH4

+ (NH3 + H+ → NH4+). Aproximadamente el 60% del aumento

inicial del VCA puede explicarse por la acumulación intracelular de NH4+ y de un anión acom-

pañante (no identificado), necesario para preservar la electroneutralidad. La fracción restante del aumento de VCA no parece resultar del influjo de Cl- o de Na+, ni de la acumulación intracelular de glutamina, osmolito sintetizado por la glutamina sintetasa a partir del NH3 y el glutamato y postulado como factor causal del edema cerebral observado en las hiperamo-nemias agudas. La fase 2 (de acidificación gradual) resulta principalmente de la entrada de NH4

+ a las células, siguiendo su gradiente electroquímico. Este influjo de NH4+ ocurre, en

parte, a través de canales de K+ sensibles al Ba2+, y posiblemente a través del cotransportador de Na+,K+,2Cl-. La DRVi que procede paralelamente se bloquea con Gd3+ ó NPPB, sugiriendo que en la misma participan canales catiónicos activados por aumentos en la tensión de la membrana y canales aniónicos. Un bloqueo parcial de la DRVi se observa también en presen-cia de Ba2+, lo cual sugiere la participación de canales de K+ en este proceso. La DRVi podría estar modulada, además, por los cambios paralelos que ocurren en el pHi. Se concluye que el par NH3/NH4

+ induce, a través de efectos osmóticos directos, cambios en el volumen celular. Aún cuando las implicaciones fisiopatológicas de este modelo in vitro son limitadas, creemos que el mismo constituye una herramienta valiosa para el estudio de los cambios asociados con la hiperamonemia en células neurales.

2

ABSTRACT

The neutral base ammonia (NH3), and its conjugated acid, the ammonium ion (NH4+) play

a pivotal role in nitrogen metabolism in living organisms. In spite of its importance, the pair NH3/NH4

+ is toxic when present in high concentrations. For instance, an increase in plasma levels of NH3/NH4

+ (i.e. hyperammonemia) is a key element in the development of brain edema associated with hepatic encephalopathy. For over a century it has been known that transient cell exposure to NH3/NH4

+ induces characteristic changes in intracellular pH (pHi). This maneuver is commonly used nowadays to study pH regulatory mechanisms. Based on theoretical considerations, it has also been hypothesized, but not demonstrated, that intracel-lular NH4

+ accumulation following NH3/NH4+ exposure must result in cell swelling.

In this work we used the intracellular fluorescent indicator BCECF and quantitative fluorescence microscopy to study the effects of NH3/NH4

+ on cell water volume (CWV) and pHi in single, differentiated neuroblastoma cells (N1E-115) in vitro. CWV is determined from the emitted fluorescence after exciting BCECF at its intracellular isosbestic point (IP; ~438 nm), which is insensitive to pH but sensitive to changes in the dye’s concentration, and from which changes in CWV are estimated. pHi was measured from the ratio of collected fluores-cence when exciting BCECF at 495 nm (i.e. the pH-sensitive wavelength) and at its IP.

We found that short exposure to isosmotic solutions containing NH3/NH4+ (NH4Cl 0.5-30

mM) induces parallel changes in pHi and CWV, which can be defined as having four phases: 1) an initial increase in both pHi and CWV. 2) A slow intracellular acidification, paralleled by a regulatory volume decrease (in isosmotic media; iRVD). NH4Cl removal produces 3) a marked, simultaneous fall in both pHi and CWV, followed by 4) a partial or complete recovery phase of both pHi and CWV. By independently varying the NH3 and NH4

+ concentrations in the experimental solutions, we found that both the pHi increase and the cell swelling depend on external NH3 concentration, rather than on external NH4

+ concentration. The initial alkalinization can be readily explained by the protonation of rapidly entering NH3, forming intracellular NH4

+ (NH3 + H+ → NH4+). About 60% of the initial CWV increase can be

accounted for by intracellular accumulation of NH4+ and an unidentified accompanying anion,

the latter being required to preserve electroneutrality. The remaining of the swelling does not seem to be due to influx of Cl- or Na+, or intracellular accumulation of glutamine, an osmolyte synthesized by the enzyme glutamine synthetase from NH3 and glutamate and proposed to mediate the brain edema seen during acute hyperammonemia. The gradual acidification following the initial increase in pHi (phase 2) is mainly due to NH4

+ influx governed by its electrochemical gradient. NH4

+ influx is mediated, at least in part, by Ba2+-sensitive K+ channels, and possibly by the Na+,K+,2Cl- cotransporter. Both Gd3+ and NPPB block the iRVD that develops in parallel with this acidification, suggesting that stretch-activated cation channels, as well as anion channels, play a role in the iRVD. The iRVD is also partially blocked by Ba2+, suggesting the involvement of K+ channels in this regulatory process. In addition, our findings indicate that the iRVD may be modulated by changes in pHi. We conclude that the pair NH3/NH4

+ induces changes in cell volume, which are the consequence of direct osmotic effects. Although the pathophysiological implications of this in vitro model are clearly limited, we believe that this model represents a valuable tool to study the changes produced by hyperammonemia in neural cells.

3

Abreviaturas empleadas: VCA: volumen celular acuoso; pHi: pH intracelular; DRV: disminución reguladora del volumen; DRVi: disminución reguladora del volumen en medio isosmótico; ARV: aumento regulador del volumen; ARVi: aumento regulador del volumen en medio isosmótico. BCECF: 2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-6-carboxifluoresceina; HE: encefalopatía hepática; GS: glutamina sintetasa; BHE: barrera hematoencefálica. LCR: líquido cefalorraquídeo.

4

1. INTRODUCCIÓN El objetivo general del presente trabajo es estudiar los mecanismos y la dinámica de los

cambios de volumen y de pH que ocurren en células nerviosas al ser expuestas a medios

conteniendo amoníaco (NH3) y amonio (NH4+). Para ello se utiliza una nueva metodología de

microscopía de fluorescencia cuantitativa, desarrollada y validada en nuestro laboratorio, que

permite el registro continuo y simultáneo del volumen celular acuoso (VCA) y del pH intrace-

lular (pHi) en células individuales mantenidas in vitro, mediante el uso de marcadores fluores-

centes. Como modelo de neurona se utilizó una línea celular, N1E-115, proveniente de un

neuroblastoma de ratón.

Estos estudios son importantes desde dos puntos de vista: uno eminentemente biofísico, el

otro fisiopatológico. Desde la perspectiva biofísica, la exposición transitoria al par amonía-

co/amonio (NH3/NH4+) constituye una maniobra experimental comúnmente usada para alterar

de manera predecible y controlada el pHi y poder estudiar sus mecanismos de regulación, así

como toda función celular que sea a su vez modulada por cambios en el pHi. Como veremos,

estos cambios en el pHi se acompañan de cambios significativos en el volumen celular acuoso

cuya ocurrencia, sospechada desde hace muchos años, nunca ha sido objeto de estudio cuanti-

tativo y sistemático. Desde la perspectiva fisiopatológica, el modelo experimental y la metodo-

logía empleados constituyen una nueva estrategia para estudiar, in vitro y a nivel celular y

molecular, la fisiopatología de las hiperamonemias agudas. Estas últimas se caracterizan por

generar trastornos en el equilibrio osmótico y metabólico de las neuronas y las células gliales

como consecuencia, en la mayoría de los casos, de una insuficiencia hepática aguda, que pue-

de culminar con la muerte del individuo por edema cerebral. Los mecanismos a escala celular

y molecular subyacentes a estas alteraciones del equilibrio osmótico celular se desconocen.

Esta Introducción consta de dos partes. En la primera se abordan aspectos básicos de la

homeostasis del gas NH3 y del ión NH4+ en los vertebrados, así como los fundamentos teóricos

y empíricos de la presente investigación. Asimismo, se consideran en cierto detalle los meca-

nismos fisiopatogénicos del edema cerebral por hiperamonemia. En la segunda parte se revi-

san los fundamentos básicos del control del volumen celular.

5

Parte I

1.1 Aspectos fisiológicos del amoníaco y del amonio. La base neutra NH3 y su ácido conju-

gado, el ion NH4+, juegan un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis del nitróge-

no en los organismos vivos. No obstante su importancia fisiológica en el metabolismo, estas

sustancias son tóxicas a concentraciones extracelulares elevadas. El par NH3/NH4+

se genera

principalmente a partir del catabo-

lismo proteico, resultando además

de otros procesos como el metabo-

lismo de los ácidos nucleicos (pu-

rinas), de las metilaminas y de la

creatina. Si bien el par NH3/NH4+

es muy soluble en agua, los ani-

males requieren de grandes canti-

dades de agua para mantener la

concentración de estas sustancias

por debajo de los niveles tóxicos.

La disponibilidad de agua es, por

lo tanto, uno de los factores deter-

minantes de la forma bajo la cual

se excretan los productos finales

del metabolismo del nitrógeno. La

mayoría de los organismos acuá-

ticos excreta principalmente NH3.

Los vertebrados terrestres (y algu-

nos acuáticos), por el contrario, incorporan el NH3 a dos productos metabólicos principales: el

ácido úrico y la urea (Fig. 1). Estas sustancias pueden existir en concentraciones mayores que

el NH3/NH4+ en los fluidos corporales, con la ventaja de ser menos tóxicas y de requerir

menos agua para su eliminación. A través de la formación de ácido úrico y urea se favorece a

un mismo tiempo la retención de agua y la eliminación de desechos nitrogenados

Figura 1. Metabolismo del nitrógeno en los animales. Los animales utilizan el nitrógeno (proveniente de la dieta) para la síntesis de proteínas y ácidos nucleicos, principalmente. La degradación de estas moléculas resulta en la producción de NH3/NH4

+. En los diversos grupos de animales, estas sustancias se eliminan bajo tres formas principales: NH3, urea y ácido úrico.

6

(NH3/NH4+) potencialmente tóxicos1,2. El ácido úrico resulta del metabolismo de los ácidos

nucleicos (purinas). A diferencia del resto de los mamíferos, los primates no tienen la enzima

urato oxidasa (uricasa), por lo que eliminan, por vía renal, ácido úrico además de urea. En el

hombre, varios gramos de NH3/NH4+ pasan diariamente por las venas del sistema portal

hepático3,4, siendo metabolizados en el hígado a través de dos procesos secuenciales: la sínte-

sis de urea y, en menor grado, de glutamina5,6 (Fig. 2A).

Figura 2. Metabolismo del par amoníaco/amonio en varios órganos. A) Hígado. El NH3/NH4+ producido

por la degradación de proteínas en los intestinos se metaboliza en el hígado a través de la síntesis de urea en los hepatocitos periportales, y en menor grado de glutamina (Gln), en los hepatocitos perivenosos7,8. La forma-ción de glutamina está catalizada por la enzima glutamina-sintetasa (GS). B) Riñón. La mayor parte del NH4

+

renal se genera en los túbulos contorneados proximales (TCP) de las nefronas9,10. El NH4+ se produce a partir

de la conversión de glutamina a glutamato y a α-cetoglutarato, a través de reacciones secuenciales mediadas por las enzimas glutaminasa (G) y glutamato dehidrogenasa (GDH)12,13. En condiciones fisiológicas, aproxima-damente dos tercios del NH4

+ derivado de la glutamina es eliminado en la orina11. El metabolismo del α-ceto-glutarato resulta en la producción de 2 moléculas de HCO3

-, que son cotransportadas con Na+, hacia el intersticio, a través de la membrana basolateral. Esto contribuye a la eliminación neta de ácido en la orina. A través de dicha membrana, el NH4

+ ingresa a la células vía la bomba de Na+/K+14 y por intercambio con K+10. Todo esto resulta en una tendencia al acúmulo intracelular de NH4

+, generándose un gradiente para la salida de este ión, que es transportado apicalmente hacia el lumen tubular por el intercambiador de Na+/H+, principalmente15. De esta manera se secreta amonio en el TCP para su posterior absorción y eliminación a través del resto del sistema tubular renal. Así, en los túbulos ascendentes del asa de Henle (TA) se lleva a cabo el transporte de NH4

+ desde la luz tubular hacia el espacio intersticial de las nefronas, desde donde es a su vez transportado hacia los túbulos colectores (TC). En los TA, el transporte de NH4

+ a través de la membrana apical está mediado principalmente por el triple cotransportador de Na+,K+(NH4

+),2Cl- (NKCC2), y por los intercambiadores de K+/NH4

+ (H+) y de Na+/H+(NH4+), así como por una vía electroconductiva no selectiva a

cationes16,17. El transporte de NH4+ desde las células del TA hacia el intersticio ocurre a través de la membra-

na basolateral de éstas, y está mediado principalmente por el intercambiador de Na+/H+(NH4+), y en menor

grado por la bomba de Na+/K+(NH4+), el cotransportador de K+ (NH4

+),Cl- y una vía electroconductiva17. Lasalida pasiva de NH3, para el cual la membrana basolateral de las células del TA presenta una permeabilidad mayor que la exhibida por la apical, contribuye al eflujo de NH4

+. Este último es incorporado a las células del TC a través de al menos dos sistemas de transporte, el cotransportador de Na+,K+(NH4

+),2Cl- (NKCC1) y la bomba de Na+/K+(NH4

+), localizados en la membrana basolateral18. Previo a su eliminación por la orina, la secreción de NH4

+ hacia el lumen tubular ocurre, según el modelo más aceptado, a través de la difusión pasiva de NH3 por la membrana apical, paralelamente a la secreción de H+ por medio de una bomba19. Estudios recientes postulan que el NH4

+ podría ser transportado selectivamente a través de esta membrana por medio de la glucoproteína RhCG20. C) Músculo esquelético. En el músculo esquelético el NH4

+ se utiliza principalmente en la generación de alanina, a partir de glutamato y piruvato, en una reacción mediada por la enzima alanina aminotransferasa (AAT)21. Además, el glutamato junto con el NH3(NH4

+) forma glutamina por medio de una reacción catalizada por la GS. D) Ciclo de la glutamina y el glutamato en el cerebro. Parte del glutamato libe-rado por las neuronas en las terminales sinápticas excitadoras es captado por los astrocitos, en donde es con-vertido a glutamina por la enzima GS, en una reacción que consume NH3(NH4

+). La glutamina liberada por los astrocitos al espacio extracelular es a su vez captada por las neuronas, en donde es convertida a glutamato por la enzima glutaminasa, en una reacción que produce NH3(NH4

+)22,23.

7

8

1. 2 Metabolismo del amonio en el cerebro. Las evidencias experimentales indican que el

par NH3/NH4+ entra al cerebro principalmente como NH3, y que lo hace por vías difusivas

antes que por sistemas de transporte saturables24-28. Para un amplio margen de concentraciones

(hasta 25 mM), el índice de incorporación de NH3/NH4+ en el cerebro es independiente de la

concentración de NH3/NH4+ en la sangre29. En un estudio realizado en primates, utilizando

trazadores de nitrógeno (13N), se propuso que la permeabilidad de la barrera hematoencefálica

(BHE) al NH4+ representa apenas ~0.5% de la permeabilidad al NH3

30. Sin embargo, debido a

que la concentración de NH4+ en la sangre es considerablemente mayor que la de NH3, y dado

que las células endoteliales que conforman la BHE presentan diversos mecanismos de trans-

porte iónico capaces de mediar el transporte de NH4+, se considera que una fracción

importante (~20%) del NH3/NH4+ ingresa al cerebro como NH4

+31,32. Es importante destacar

aquí, con relación a una de las hipótesis centrales del presente trabajo, que la entrada pasiva de

NH3 al cerebro resulta en una rápida generación de NH4+ en el parénquima nervioso, supo-

niendo que existen, inicialmente, diferencias entre el pH del cerebro y el de la sangre (ver

abajo).

En condiciones normales, el contenido de NH3/NH4+ en el cerebro duplica aproximada-

mente al de la sangre, que es de ~40-50 µM en los seres humanos33. Esto se debe principal-

mente a que la proporción relativa de NH3 y NH4+ en los líquidos biológicos está determinada

por el pH, siendo éste más ácido en las células cerebrales que en la sangre. De manera

consistente, una serie de estudios muestra que los efectos tóxicos del NH3/NH4+ son mayores

cuanto mayor es el pH de la sangre 24,34.

Al igual que en otros órganos extrahepáticos, la remoción del NH3/NH4+ en el cerebro

(proveniente de la sangre ó generado por el propio tejido) tiene lugar, principalmente, a través

de la formación de glutamina, un aminoácido neutro, en una reacción mediada por la enzima

glutamina sintetasa (GS) 27,35:

NH3 + glutamato + ATP → glutamina + ADP + Pi (Rx. 1)

La enzima GS se expresa principalmente en los astrocitos36,37 y en menor proporción en las

neuronas38, células en donde se ha estimado que podría residir ~20% de la actividad total de la

9

GS en el cerebro de rata39. La presencia de la enzima GS se demostró además en oligodendro-

citos40,41 y en células de neuroblastoma Neuro-2a42, NG-108 y N1E-115, modelo, este último,

utilizado en el presente trabajo (resultados propios, no publicados).

La glutamina sintetizada en los astrocitos y liberada al medio extracelular puede ser

transportada a la sangre a través de la BHE43, puede ser recaptada por los astrocitos, o puede

ingresar a las neuronas, en donde es convertida a glutamato en una reacción mediada por la

enzima glutaminasa (G), que resulta en la producción de NH3/NH4+:

glutamina + H2O → glutamato + NH3 (Rx. 2)

Parte del glutamato liberado por las neuronas durante la neurotransmisión es captado por

los astrocitos, estableciéndose así lo que se conoce como el “ciclo de la glutamina y el

glutamato” (Fig. 2D). A pesar de que la existencia de este ciclo es ampliamente reconocida,

tanto en organismos invertebrados como en vertebrados, su importancia fisiológica es aún

incierta, pues tanto en astrocitos como en neuronas, diversas reacciones enzimáticas, además

de aquellas catalizadas por las enzimas GS y G, utilizan como substratos a la glutamina y al

glutamato mediando así la transferencia de NH3/NH4+. Por ejemplo, en ambos tipos celulares,

el glutamato puede ser desaminado produciendo α-cetoglutarato y NH3/NH4+, en una reacción

reversible mediada por la enzima glutamato dehidrogenasa (GDH):

glutamato + NAD(P)+ + H2O ⇆ α-cetoglutarato + NAD(P)H + NH4+ (Rx. 3)

La glutamina puede ser también utilizada por los astrocitos como sustrato energético, ó

puede ser convertida a α-cetoglutarato y NH3 por la acción de la glutamina aminotransferasa y

la ω-amidasa, enzimas cuya actividad es muy marcada en los plexos coroideos44. Interesan-

temente, los niveles de α-cetoglutaramato, metabolito intermediario entre una y otra reacción

enzimática, se ven aumentados en el LCR de pacientes en coma hepático45. Finalmente, otra

reacción generadora de NH3/NH4+ en el cerebro es la mediada por la AMPdeaminasa, enzima

que interviene en el ciclo de las purinas y utiliza como sustrato al aspartato46.

10

1.3. Efectos del par NH3/NH4+ sobre el volumen celular acuoso y el pH intracelular. La

exposición de células al par NH3/NH4+ es una maniobra experimental común para inducir

cambios en el pHi y estudiar los mecanismos celulares que median el transporte de ácidos y

bases a través de las membranas47,48.

En la mayoría de las células, la exposición a sales de amonio (comúnmente cloruro de

amonio, NH4Cl) induce una alcalinización intracelular, de amplitud y curso variado, que

refleja característicamente cuán permeables son sus membranas plasmáticas al NH349-51. El

NH3 es un gas de bajo peso molecular qué, con notables excepciones52-55, atraviesa con

facilidad la membrana plasmática. En células de mamiferos, la permeabilidad de esta última al

NH3 varía, de acuerdo con el tipo celular estudiado, entre ~10 y 1000 µm/s56. Por otro lado, el

NH4+ es un catión, que al igual que otros iones, puede cruzar la membrana a través de vías

electrodifusivas (canales), y/o sistemas de transporte primario (ej: la Na+/K+ ATPasa) o

secundario (ej: cotransportador Na+,K+,2Cl-) (véase Fig. 2B y Ref. 56. La tasa de difusión del

NH4+ a través de las membranas celulares es, por lo general, de cuatro a cinco órdenes de

magnitud menor que la del NH357. Algunas excepciones son los astrocitos cerebrales de ratón

neonato58 y los ovocitos de Xenopus59, que exhiben una alta permeabilidad relativa al NH4+.

En solución acuosa, la base libre NH3 está en equilibrio con su ácido débil conjugado

NH4+:

NH3 + H+ ⇆ NH4+ (Rx. 4)

y de acuerdo con la ecuación de Henderson-Hasselbalch,

pH = pKa + log ([NH3]/[NH4+]) (1)

El pK de esta reacción (es decir, el pH al cual las concentraciones de NH3 y NH4+ son

iguales, [NH3] = [NH4+]), es de ~9.25 a 25 ºC y de ~9.0 a 37 ºC60,61. La conversión entre NH3

y NH4+ es extremadamente rápida: la constante de protonación del NH3 es 4,3 x 1010 M-1.s-1,

con un tiempo de relajación de ~12 µs62. A pH fisiológico (~7,1-7,4), el equilibrio de la

reacción NH3 + H+ ⇆ NH4+ (con un pK de ~9,25 a 25 ºC) se halla desplazado hacia la

11

formación de NH4+, de tal manera que la [NH4

+] excede a la [NH3] en ~100 veces. En estas

circunstancias, un influjo de NH3 que exceda en ~1% al influjo de NH4+ bastará para inducir

una alcalinización intracelular, resultante de la protonación del NH3 en el interior de las

células. La consecuente formación de NH4+ implica una ganancia neta de osmolitos, es decir,

partículas osmóticamente activas. La magnitud de esta acumulación puede estimarse si se

conoce la concentración extracelular de NH3/NH4+, el pH intracelular y el pH extracelular:

[NH4+]i = [NH4

+]o x 10 pHo – pHi (2)

La acumulación intracelular de osmolitos favorece el influjo osmótico de agua y por tanto,

el aumento en el volumen acuoso de las células.

Los cambios de pHi resultantes de la exposición de las células a medios conteniendo

NH3/NH4+, así como los mecanismos que les subyacen, se conocen con gran detalle. En con-

traste, los mecanismos y la cinética del aumento de volumen neuronal y glial durante episo-

dios de hiperamonemia (ver sección 1.6), o durante la exposición experimental al par

NH3/NH4+, se desconocen. Más aún, la posibilidad de que la acumulación de NH4

+ contribuya

al aumento del volumen acuoso de neuronas y células gliales, y que estos cambios a escala

unitaria subyazcan al edema cerebral que acompaña a las hiperamonemias, no ha sido, extra-

ñamente, considerada. Una de las hipótesis planteadas en este trabajo sostiene que la acumula-

ción de NH4+, en conjunto con otros factores (entre ellos un probable aumento en la concentra-

ción de glutamina), es responsable del aumento inicial de volumen observado en células

nerviosas expuestas al par NH3/NH4+.

Experimentos preliminares realizados en nuestro laboratorio permitieron identificar, por

vez primera y en “tiempo real”, la ocurrencia de cambios paralelos de volumen y de pHi en

células nerviosas individuales expuestas al par NH3/NH4+63-65. En el presente trabajo se expone

una caracterización detallada de estas respuestas y se exploran los mecanismos que les

subyacen.

12

1.3.1 Modelo teórico de los cambios de volumen celular acuoso y de pH intracelular

inducidos por la exposición a NH3/NH4+. Cuando una célula animal es expuesta a una

solución que contiene NH3/NH4+, bajo la forma de NH4Cl (cloruro de amonio), por ejemplo, la

base neutra NH3, liposoluble, ingresa rápidamente a la célula (flecha 1, Fig. 3, izq.) y se asocia

con un protón, formando NH4+. La caída resultante en la concentración de protones libres

ocasiona un incremento en el pHi, que se conoce como "carga alcalina" (segmento 1→2, trazo

de pHi). Esta alcalinización ocurre a expensas de una ganancia de partículas osmóticamente

activas (NH4+), que de acuerdo con nuestra hipótesis, contribuiría al aumento inicial de

volumen celular acuoso observado durante la exposición de las células a NH3/NH4+ (véase el

trazo de volumen celular acuoso, VCA, en la Fig. 3). La ocurrencia de cambios en el VCA

ante la exposición a NH3/NH4+

fue propuesta hace muchos años por Jacobs (1940)50, a partir

de consideraciones teóricas y experimentos en lo que observó que soluciones conteniendo

NH3/NH4+

producen hemólisis en suspensiones de eritrocitos. No obstante su importancia

biofísica y fisiopatológica, estos cambios en el VCA no habían sido estudiados hasta el

presente.

13

Tras la exposición al par NH3/NH4+, la fase de alcalinización intracelular inicial se prolon-

gará, teóricamente, hasta que el NH3 alcance un estado de equilibrio (es decir, hasta que

[NH3]i = [NH3]o), lográndose así un nuevo estado estacionario en el pHi, alcalino con respecto

al pHi previo. La magnitud y la tasa de incremento del pHi dependen, al menos, de cinco

factores66: 1) ambos parámetros están inversamente relacionados con el poder de tampona-

miento celular (β; véase Sección 1.4); 2) la magnitud del cambio será mayor cuanto menor sea

el pHi inicial. Esto se debe a que, en estas condiciones, el pHi se aparta más del pK del

NH3/NH4+, y existe una mayor disponibilidad de protones para formar NH4

+; 3) la magnitud

del cambio alcalino es función de la concentración de NH3; 4) La tasa y la magnitud del

aumento del pHi serán menores cuanto mayor sea la permeabilidad relativa de la membrana

plasmática para el NH4+, pues la entrada de este catión tiende a acidificar el interior celular; 5)

ambos parámetros se verán disminuidos y aún invertidos de signo, en células provistas de

mecanismos activos de transporte de cargas ácidas, cuya acción contrarrestaría, en grado

diverso, los efectos alcalinizantes del influjo de NH3.

En el presente trabajo se hipotetiza que si el aumento inicial de volumen se debe a una

acumulación rápida de NH4+, como resultado de la entrada de NH3, su magnitud debería

depender asimismo de β, del pHi inicial, y de la [NH3]o. En células con una alta permeabilidad

al NH4+, la magnitud del aumento debería además depender de la [NH4

+]o.

A la alcalinización inicial mediada por el influjo de NH3 le sigue, por lo común, una fase

de descenso lento y gradual del pHi (Fig. 3, trazo de pHi). Esta fase, conocida comúnmente

como “acidificación del plateau,” puede resultar, en parte, de la activación de mecanismos de

regulación del pHi (ej: intercambiador Cl-/HCO3-), pero está determinada básicamente por la

Figura 3. Modelo hipotético de los cambios inducidos por el par NH3/NH4+ en el volumen celular acuoso

y en el pHi. Cuando una célula es expuesta a una solución conteniendo NH4Cl se observa una alcalinizacióninicial, que se acompaña de un aumento del volumen celular (VCA) y una despolarización de la membrana celular (parte derecha, trazos de pHi, VCA y Em, respectivamente). Los cambios de pHi y VCA resultan del influjo pasivo de NH3 y la formación subsecuente de NH4

+ en el interior de las células (flechas 1 y 2, respectivamente, en el esquema de la izquierda). En el esquema de la célula (parte izquierda de la figura) se ilustran los sistemas de transporte que pueden mediar la entrada directa de NH4

+ a las células (etiquetados con el número 3), así como los principales sistemas de transporte de ácidos y bases que podrían activarse por cambios en el pHi y que en su operar, también producen cambios en el VCA (etiquetados con el número 5).

14

continua acumulación intracelular de protones provenientes de la entrada y posterior

disociación del NH4+. Como consecuencia de este proceso, la [NH3]i supera ligeramente a la

[NH3]o, originán-dose un gradiente que favorece el eflujo del NH3. Cada molécula de NH3 que

sale de la célula determina una acumulación neta de un protón intracelular. De este modo se

establece un circuito dinámico en el que el NH4+ entra y el NH3 sale de las células (Fig. 3,

flechas 3 →2 →1 →4). El influjo y el eflujo netos de NH4+ y NH3 respectivamente,

determinan la acumulación continua de NH4+ en el citosol, favoreciendo la entrada osmótica

de agua con el consecuente aumento del volumen celular. La formación de NH4+ se verá más

favorecida cuanto más ácida se torne la célula.

No obstante la acumulación progresiva de partículas osmóticamente activas (NH4+ y

probablemente un anión acompañante, necesario para mantener la electroneutralidad), en

paralelo con la acidificación del plateau las células disminuyen de volumen. Esta respuesta

osmótica indica que el eflujo neto de osmolitos y agua durante este período contrarresta y

supera a los influjos correspondientes. Dado que esta respuesta reguladora ocurre en un medio

isosmótico, en este trabajo se la denominará disminución reguladora del volumen isosmótica

(DRVi), para diferenciarla de la DRV, que es la respuesta osmótica comúnmente estudiada

ante la exposición de células a un medio hiposmótico. Uno de los objetivos del presente trabajo

es estudiar la cinética y los mecanismos de la DRVi.

1.3.2 Vías de transporte de NH4+ a través de la membrana plasmática. La identificación, por

homología de secuencia, de proteínas que transportan NH4+ con alta afinidad en levaduras

(Mep) y plantas (Amt) condujo a la caracterización de una familia de proteínas transportadoras

de NH4+67,68, representada en el hombre por las proteínas Rh de los antígenos sanguíneos69,70.

Aún cuando faltan pruebas definitivas, recientemente se postuló que estas proteínas (v.g.

RhCG y RhBG) podrían mediar el transporte específico de NH4+ en los túbulos renales20,71. En

éstos últimos se identificó, además, un intercambiador selectivo de NH4+/K+72. Con la posible

excepción de estos sistemas, no se conocen mecanismos específicos del transporte de NH4+ en

los vertebrados. Este ión comparte con el K+ ciertas propiedades fisicoquímicas; por ejemplo,

ambos tienen un radio iónico hidratado y un coeficiente de difusión similares. Es por esto que,

en diversos tipos de células animales, el transporte de NH4+ a través de las membranas ocurre,

15

con preferencia, a través de canales o transportadores acoplados que median el transporte de

K+ (ver Fig. 3). Dada la importancia del par NH3/NH4+ en el equilibrio ácido-base de los

organismos, el transporte de NH4+ se estudió, básicamente, en los diferentes segmentos que

conforman los túbulos renales (Fig. 2B). Entre las vías que median el transporte de NH4+ en el

epitelio renal y en otros tipos celulares se cuentan: 1) canales de K+58,73; 2) canales catiónicos

no selectivos74; 3) el intercambiador de Na+/H+(NH4+)75; 4) el triple cotransportador de

Na+,K+(NH4+),2Cl-58,73,76,77 y 5) la Na+/K+(NH4

+) ATPasa 73,76.

1.4 Regulación del pH intracelular y su relación con el volumen celular. Las actividades

metabólicas de las células eucariotas se desarrollan en un medio interno que presenta un pH

óptimo y controlado. La actividad de enzimas claves del metabolismo celular, la estabilidad

del citoesqueleto, la conductancia de ciertos canales iónicos y los niveles de algunas moléculas

de transducción de señales, por ejemplo, dependen críticamente del pH intracelular78-81. El ión

H+ puede considerarse, de hecho, como un “segundo mensajero” más, de mucha importancia,

entre aquellos que participan en la señalización y el metabolismo celular81-85. Con relación al

pH que presentan, en condiciones normales, el plasma y el medio extracelular (pHe), los

valores de pHi registrados en la mayoría de las células in vivo e in vitro (generalmente entre

7.0-7.4) son más altos de lo que cabría esperar si existiese una distribución pasiva de H+ a

través de la membrana plasmática. Esto se debe a que, en condiciones fisiológicas, el pHi es

regulado de manera activa a través de mecanismos de transporte que median la expulsión de

equivalentes ácidos, ó la incorporación de equivalentes básicos, alcalinizando el interior

celular. Estos sistemas, que mantienen al pH fuera de equilibrio termodinámico, incluyen

canales y bombas de protones (H+-ATPasas), intercambiadores iónicos (v.g. K+/H+, Na+/H+,

Cl-/HCO3-) y cotransportadores (Na+-HCO3

-)81,86.

A nivel organísmico, el control primario del pH tiene lugar en los pulmones (o en estructu-

ras análogas, dependiendo de la especie animal), lugar donde se regula, a través de la respira-

ción, la presión parcial de CO2 de la sangre. Los riñones, asimismo, contribuyen de manera

importante al equilibrio ácido-base al controlar, principalmente, la generación y la eliminación

de NH4+ y HCO3

-. A nivel celular, la regulación y el mantenimiento del pHi dependen, por otro

lado, de la capacidad de las células de amortiguar los cambios de pHi. Este poder ó capacidad

16

de tamponamiento del pHi (“buffering power”) está en parte determinado por la presencia de

aniones intracelulares capaces de unirse a protones libres, y “adsorber”, ó neutralizar, de este

modo, cambios eventuales del pHi87. A la capacidad de tamponamiento del pHi contribuye

también la presencia de HCO3- en las células, el cual se combina con H+ formando ácido car-

bónico, que es a su vez convertido en CO2 y H2O a través de una reacción reversible catalizada

por la enzima anhidrasa carbónica. Así, en la práctica es posible distinguir dos sistemas inde-

pendientes pero aditivos de tamponamiento del pHi: a) un sistema de tamponamiento “intrín-

seco” (βI), que no incluye los efectos del tampón CO2/HCO3-, y comprende tanto a los proce-

sos fisicoquímicos que afectan a las bases y los ácidos intracelulares, como a aquellos deriva-

dos de procesos metabólicos y de las propiedades específicas de los organelos celulares, y b)

un sistema de tamponamiento dependiente de la presencia de CO2/HCO3- (βCO2)88. La suma de

las capacidades de tamponamiento parciales (βI + βCO2) da lugar al poder de tamponamiento

‘total’ de las células (βT). La mayoría de los diseños experimentales (incluyendo aquellos que

conforman el presente trabajo) incluyen la medición del pHi en ausencia virtual de CO2/HCO3-

usando, generalmente, tampones como el TRIS o el HEPES. Los resultados obtenidos en estos

casos deben ser interpretados con cautela al tratar de correlacionarlos con lo que ocurre en el

organismo vivo, en donde el tampón βCO2 influye de manera importante en las respuestas de

pHi.

Existe una relación estrecha entre el volumen celular y el pHi que queda manifiesta al

evaluar la actividad de ciertos sistemas de transporte, como los intercambiadores Na+/H+ y Cl-

/HCO3-, tanto durante perturbaciones osmóticas como ante cambios del pHi. La activación de

estos mecanismos altera el balance intracelular de equivalentes ácidos y básicos, así como las

concentraciones de Na+ y Cl- dentro de las células, afectando de este modo el volumen y el pH

celular89-91. Más aún, la actividad de numerosos canales iónicos, entre ellos algunos de K+,

Na+ y Ca2+, está modulada por el pH80,92,93, por lo que la composición iónica y la osmolaridad

intracelular pueden variar como consecuencia de las variaciones en el pH intra o extracelular.

En el sistema nervioso, el pH de las neuronas, las células gliales y el espacio extracelular

está sujeto a cambios transitorios debidos a la actividad neuronal mediada por neurotransmiso-

res u hormonas94,95. Los cambios patológicos en el pH cerebral son comunes, por otro lado, en

17

condiciones de isquemia, anoxia, hipoxia y epilepsia96,97. En estos casos, la activación de

mecanismos reguladores del pHi, especialmente de los intercambiadores Na+/H+ y Cl-/HCO3-,

puede contribuir al establecimiento de edema98.

Hasta el momento no existen medidas simultáneas del pHi y del volumen acuoso celular

que permitan correlacionar el curso temporal e investigar los mecanismos específicos que

median los cambios producidos en uno y otro parámetro durante fenómenos fisiológicos ó

patológicos. La técnica experimental presentada en el presente trabajo permite tales medicio-

nes, y constituye por lo tanto una herramienta valiosa para estudiar estos aspectos básicos de la

fisiología celular.

1.5 Homeostasis del volumen en células neurales. El cerebro de los vertebrados superiores

difiere notablemente de los órganos periféricos en cuanto a las propiedades físicas y dinámicas

que gobiernan la homeostasis del volumen celular. Dado que el cerebro se encuentra contenido

en un estuche óseo rígido, su volumen total debe permanecer constante99,100. Esta imposición

física implica que, en el tejido nervioso, las alteraciones del volumen intra o extracelular

deban ser acompañadas de cambios compensatorios recíprocos en los fluidos que lo irrigan y

lo drenan, es decir la sangre y el líquido cefalorraquídeo (LCR). En circunstancias extremas,

los aumentos de la presión intracraneal a consecuencia de aumentos en el volumen cerebral

(edema), ó de alteraciones hemodinámicas en el sistema cerebrovascular, conducen a un

desplazamiento caudal del parénquima nervioso a través del foramen magnum que puede

ocasionar la muerte por paro cardio-respiratorio101. Si bien la actividad neuroendócrina, repre-

sentada por la acción de hormonas como la vasopresina y el factor natriurético auricular, y de

modo general, la función renal, regulan de manera eficiente el equilibrio osmótico sistémico y

cerebral, es a través del transporte regulado de agua y solutos en la barrera hematoencefálica

(BHE), donde se ejerce el control primario del balance osmótico entre los compartimientos

cerebrales en que se distribuye el volumen acuoso cerebral (sangre, LCR, espacios intra y

extracelular). En situaciones de desequilibrio osmótico del plasma, el ajuste inicial del volu-

men cerebral acuoso es amortiguado pasivamente por la BHE, mediante los gradientes osmóti-

cos inmediatos generados en el lumen capilar y el espacio perivascular, que distribuyen el

18

flujo de agua a través de la misma y previenen correcciones desmedidas del volumen

celular102,103.

En condiciones fisiológicas, las neuronas enfrentan un riesgo potencial e importante de

sufrir un desbalance osmótico a raíz de los continuos trasvases de solutos y agua a través de

sus membranas, que resultan de la actividad eléctrica y de la formación y el consumo metabó-

lico de solutos orgánicos. Este riesgo se acentúa porque las neuronas poseen un cociente volu-

men/superficie bajo y porque el espacio extracelular, en el sistema nervioso central, es caracte-

rísticamente restringido. Durante la actividad eléctrica, sináptica o axónica, por ejemplo, el

balance iónico entre los medios intra y extracelular, y por lo tanto el volumen celular, se ven

alterados a causa de los fenomenos de despolarización y repolarización neuronal104-106. Se cree

que los astrocitos actúan, tanto en este caso, como a nivel de la BHE y en general, durante

otros procesos que alteran el balance hidrosmótico cerebral, como amortiguadores (“buffers”)

qué, al modificar su volumen, restablecen y preservan el equilibrio osmótico en el entorno

neuronal107. De acuerdo con esta hipótesis, el K+ que se acumula en el espacio extracelular tras

la repolarización neuronal es captado por los astrocitos y distribuido por la red astrocitaria a

traves de uniones comunicantes (“gap junctions”). De esta manera, los efectos sobre la excita-

bilidad y el volumen que resultarían en células individuales a causa de un aumento en el K+

externo, se “disipan” a lo largo del sincicio astroglial.

1.6 Alteraciones del volumen celular en el sistema nervioso central producidas por

hiperamonemia. Uno de los ejemplos más relevantes de alteración osmótica que pueden

sufrir las células cerebrales durante ciertos procesos patológicos lo constituye el aumento del

volumen celular provocado por la presencia de niveles incrementados de amoníaco (NH3) y

amonio (NH4+) en la sangre. Esta condición, conocida como hiperamonemia, se observa con

frecuencia en varios trastornos crónicos o agudos de la función hepática tales como la hepatitis

viral aguda, el sindrome de Reye, la enfermedad de Wilson, o algunas reacciones tóxicas

frente a ciertos fármacos, como el acetaminofén108.

La encefalopatía hepática (EH) es un sindrome neurosiquiátrico complejo que caracteriza a

los transtornos hepáticos agudos aunque puede presentarse, ocasionalmente, durante disfun-

ciones crónicas del hígado109-112. La EH resultante de transtornos crónicos de la función hepá-

19

tica presenta un desarrollo lento, caracterizado por alteraciones del sueño y cambios en la

personalidad. En estadios avanzados, la EH puede desembocar en la muerte por coma hepático

y se observa una disfunción astroglial generalizada, caracterizada por cambios morfológicos

(astrocitosis de tipo II) y metabólicos113. La EH derivada de fallas hepáticas agudas, por el

contrario, presenta un curso rápido y tras la aparición de sígnos característicos (agitación

psicomotora, convulsiones, etc.) puede derivar en estupor y coma en el transcurso de horas o

días109. El desarrollo de edema cerebral eminentemente citotóxico* es característico de los

estadíos avanzados de esta EH 114,115. La opinión generalizada indica, como se verá en mayor

detalle en los párrafos siguientes, que el aumento de volumen del cerebro es debido a un

edema predominantemente astroglial116-118.

La alta tasa de mortalidad de los transtornos hepáticos agudos resulta principalmente de la

hipertension intracraneal generada por el edema cerebral masivo, que puede culminar con la

herniación del tallo cerebral. Si bien, como se dijo, la hiperamonemia acompaña tanto a los

transtornos hepáticos crónicos como a los agudos, el edema cerebral como factor de mortali-

dad es preponderante en estos últimos. Esta circunstancia podría deberse a que las células,

constituidas en tejidos y órganos, no son completamente capaces de adaptarse a, ó revertir,

cambios súbitos en el equilibrio osmótico intra y extracelular.

1.6.1 Fisiopatología del edema cerebral inducido por NH3/NH4+. Investigaciones recientes

demuestran que los niveles sanguíneos de NH3/NH4+ se correlacionan significativamente con

la gravedad de la encefalopatía hepática119-121 y con la intensidad del edema cerebral33. La Fig.

4 muestra el resultado de uno de estos estudios, en donde se observa que la concentración

arterial de NH3/NH4+ está significativamente aumentada en pacientes con herniación cerebral

causada por edema33. Consistente con esta observación, otros estudios han demostrado que la

incorporación neta de NH3/NH4+ al cerebro aumenta durante los transtornos hepáticos, tanto

crónicos como agudos122,123. Esto podría deberse a un aumento en la permeabilidad de la BHE

* Según su origen, el edema cerebral se divide en dos categorías: citotóxico, cuando resulta de un incremento patológico en el contenido de solutos intracelulares, ó vasogénico, cuando se produce como consecuencia de un aumento en la osmolalidad del líquido extracelular126x. Diversos trastornos cerebrales, como traumatismos, hipoxia ó isquemia, resultan por lo común en un edema citotóxico; en esta última categoría se ubica el edema observado en condiciones hiperamonémicas. Algunos ejemplos del edema vasogénico están dados por las hiper-natremias agudas y las disfunciones renales con uremia, que conducen a cambios en la osmolalidad del plasma.

20

Figura 4. Concentración total de NH3/NH4+

en el plasma arterial de pacientes con falla hepática aguda. La [NH3/NH4

+] arterial fue significativamente mayor en pacientes que desarrollaron hernia cerebral (HC) que en aquellos que no presentaron esta condición (No HC). Los círculos verdes representan los va-lores registrados en pacientes que recibieron transplante hepático. Modificado de Clemmesen y col., Hepatology 29: 648-653, 1999.

al NH3/NH4+124, a un aumento en el flujo sanguíneo cerebral125 y a episodios de alcalosis

respiratoria, que aparecen con frecuencia asociados al coma hepático y determinan un aumen-

to en la concentración relativa de NH3 en la sangre126. Mientras que en los transtornos crónicos

del hígado la relación cerebro/sangre de NH3/NH4+ puede alcanzar valores de 3 a 4, durante

las fallas hepáticas agudas dicho valor puede llegar a ser de 833,127. En animales con anastomo-

sis portocava (un modelo experimental de insufi-

ciencia hepática crónica) a los que se les indujo, a

través de la inyección de sales de amonio, un coma

hepático, los niveles de amonio total registrados en

el cerebro fueron de 2-5 mM128,129,149.

Si bien estas evidencias permiten suponer un

papel importante del NH3/NH4+ en la patogénesis

del edema cerebral inducido por hiperamonemia,

los mecanismos específicos que median la apari-

ción de dicho edema no han sido esclarecidos. Las

investigaciones en torno a este tema sugieren que el

mismo tiene una etiología multifactorial; altera-

ciones bioenergéticas y metabólicas, cambios en la

excitabilidad neuronal y variaciones en el pHi, en-

tre otros factores, han sido ponderados por diversas

investigaciones113,130-134.

A semejanza del edema cerebral precipitado

por isquemia, el edema concurrente con la EH está

asociado con alteraciones en el sistema de neuro-

transmisión mediado por glutamato, siendo común en ambos casos la sobreactivación de

receptores glutamatérgicos de tipo NMDA, el aumento en la concentración de Ca2+ intrace-

lular, la disfunción mitocondrial y el estress oxidativo133-137.

La hipótesis más aceptada en torno a los mecanismos que median el desarrollo del edema

cerebral relacionado con hiperamonemia sostiene que éste se debe a la acumulación intracelu-

lar de glutamina, secundaria a un aumento en los niveles cerebrales de amonio. De acuerdo

con esta hipótesis, dicha acumulación determina un influjo osmótico de agua, que da lugar a

21

un aumento del volumen celular138†. Según observaciones en tejido cerebral post mortem116,139

y en cultivos de células in vitro140, dicha acumulación tendría lugar predominantemente en

astrocitos. Las bases de esta “hipótesis glutaminérgica” estan dadas por estudios que indican

que la aplicación de sulfoximetionina (MSO), una sustancia que inhibe de modo irreversible a

la GS, previene ó atenúa el aumento del volumen astroglial en diversos modelos experimenta-

les in vitro141,142 e in vivo143-145. No se ha demostrado, sin embargo, que exista una correlación

temporal entre la acumulación de glutamina y el desarrollo del edema cerebral. Asimismo,

otras observaciones ponen en duda la robustez de esta hipótesis:

i) en animales hiperamonémicos se observó que el edema cerebral que persiste tras el trata-

miento con MSO es mayor al que se esperaría de acuerdo con la disminución observada en los

niveles cerebrales de glutamina146.

ii) en dos estudios realizados en animales hiperamonémicos no se detectaron cambios

significativos en los niveles de glutamina cerebral147,148, en tanto que en ratas con anastomosis

portocava se observó de hecho una disminución en la actividad de la GS en diversas estructu-

ras del cerebro149-151.

iii) en astrocitos en cultivo, la exposición aguda al NH3/NH4+ no afecta la actividad de la

GS; más aún, tras la aplicación prolongada de NH3/NH4+, la actividad de esta enzima disminu-

ye significativamente153.

iv) aún cuando persiste un aumento en la concentración intracelular de glutamina, el

aumento del volumen observado en astrocitos en cultivo tratados con 5 mM de NH4Cl (por 12-

24 hs) se previene al inhibir la “transición de la permeabilidad mitocondrial” (TPM)154. Este

fenómeno, observado durante episodios de isquemia cerebral y otros trastornos, consiste en la

apertura de un poro de alta conductancia en la membrana interna de la mitocondria, que

permite el paso de sustancias de peso molecular inferior a 1.500 Dalton. La apertura de este

“poro de transición” causa disfunción mitocondrial, lo cual determina el cese de la producción

de ATP, al tiempo que se generan radicales libres con efectos deletéreos sobre las células. La

TPM se observa en cultivos primarios de astrocitos expuestos a NH4Cl155, se inhibe con MSO † Dado que se requiere de una molécula de Glu para formar una molécula de Gln, de no mediar cambios en la tasa de síntesis de Glu se esperaría que las concentraciones de ambos osmolitos cambien en proporción inversa, y no ocurran por lo tanto alteraciones en el equilibrio osmótico del cerebro. En animales hiperamonémicos se observó, sin embargo, que la disminución en los niveles de Glu cerebral es menor a la que cabría esperar de acuerdo con el aumento en la concentración de Gln. Esto podría deberse a una estimulación paralela de la síntesis de Glu (por ejemplo, a través de reacciones de transaminación) mediada por el NH3/NH4

+152.

22

y puede inducirse aumentando la concentración de glutamina en el medio de cultivo156. Estas

observaciones sugieren que el aumento del volumen astroglial no se debe a los efectos osmó-

ticos de la glutamina, sino antes bien a las consecuencias de la TPM sobre el balance energé-

tico celular157. Los autores de estos estudios plantean que esto último causa un desajuste en los

mecanismos que controlan el volumen celular.

No obstante, debido a la importancia que reviste la síntesis de glutamina en la detoxifica-

ción de NH3/NH4+ en el cerebro, y considerando su rápida tasa de síntesis (t1/2 ≤ 3 s27, es facti-

ble que la acumulación de glutamina en astrocitos contribuya, en efecto, al edema cerebral

precipitado por hiperamonemia. Aún en ausencia de un aumento en la síntesis de glutamina es

posible, como se propuso, que a concentraciones elevadas el par NH3/NH4+ inhiba el eflujo de

este aminoácido hacia el espacio extracelular, lo cual contribuiría a su acumulación y al

aumento de volumen de las células158.

No hay estudios que contemplen la posibilidad de que el edema cerebral se deba a los

efectos osmóticos directos del NH4+ acumulado en el interior de las células. Esta hipótesis no

es mutuamente excluyente con la hipótesis glutaminérgica: la acumulación de NH4+ podría

ocurrir, por ejemplo, si su tasa de entrada o su velocidad de generación, a partir de la protona-

ción del NH3, excedieran su tasa de remoción a través de la GS159.

23

Parte II

1.7 Control del volumen celular. Se cree que la capacidad de las células de regular su conte-

nido de agua y solutos frente a cambios osmóticos del medio externo representó un aconteci-

miento primordial en la evolución de la vida sobre la tierra. Incluso en ausencia de alteracio-

nes en la composición del medio externo, las células animales tienden a hincharse debido a

que sus membranas plasmáticas son permeables al agua y a pequeños solutos, pero no a las

macromoléculas que se encuentran confinadas en su interior, las cuales generan un gradiente

de presión coloidosmótica dirigido de afuera hacia adentro. A diferencia de lo que ocurre con

las células vegetales, la membrana plasmática de las células animales carece de una pared

celular rígida, por lo que cede fácilmente ante gradientes de presión osmótica. De no existir

una respuesta celular activa, el influjo constante de agua y solutos conduciría a un aumento del

volumen y a una eventual lisis celular160. A lo largo de la evolución, las células han desarro-

llado mecanismos de transporte de membrana que les permiten, a través del flujo regulado de

osmolitos y agua, mantener su volumen constante y compensar los cambios cuando éste se

desvía de su valor basal. Entre los mecanismos referidos juega un papel importante la bomba

de Na+/K+, cuya operación, a expensas de un gasto continuo de energía (ATP), contrarresta al

gradiente coloidosmótico dirigido hacia el interior de las células161,162. Además de la Na+/K+

ATPasa, una diversidad de mecanismos de transporte opera en las membranas celulares,

contribuyendo al balance general de iones y otros osmolitos entre las células y su medio

externo. Como resultado de la actividad de estos sistemas se establece un “equilibrio estacio-

nario”, conocido como "equilibrio Doble de Donnan"161,163, definido por la oposición entre el

influjo pasivo de solutos y la expulsión activa de los mismos, con los subsecuentes flujos

osmóticos de agua. Como consecuencia de este equilibrio, en un medio isosmótico (e isotóni-

co), como el que predomina en los organismos animales de manera normal, la suma de los

gradientes osmóticos dirigidos hacia adentro y hacia afuera de la célula es cero (véase recua-

dro I). El volumen celular se mantendrá constante, por lo tanto, siempre y cuando la cantidad

de soluto y agua que entra a la célula sea igual a la que sale, de tal manera que los flujos netos

sean nulos.

24

En condiciones fisiológicas, el control y el mantenimiento efectivo de la osmolaridad de

los fluidos corporales se ejerce a través de la función renal, modulada por la acción de hormo-

nas segregadas por estructuras neuroendócrinas en el sistema nervioso central164-166. Si bien en

los organismos animales algunas células estan expuestas normalmente a cambios pronuncia-

dos en la osmolaridad extracelular, -v.g.. epitelios transportadores, células renales y eritroci-

tos-, en condiciones fisiológicas, el balance entre agua y sales en el plasma, el citoplasma y el

líquido extracelular se mantiene constante167. La regulación y el mantenimiento del volumen

celular dependen de la actividad coordinada de múltiples mecanismos y funciones celulares,

que van desde los fenómenos de electrodifusión pasiva a través de canales iónicos y el

transporte acoplado de iones a través de la membrana, hasta la regulación a nivel genético de

la síntesis de enzimas y transportadores relacionados a su vez con la síntesis y/o acumulación

de osmolitos orgánicos168-170. En estos procesos intervienen diversas moléculas de señaliza-

ción intracelular, que transmiten los estímulos osmóticos y modulan las respuestas de osmore-

gulación de las células171,172. Una variedad de estados patológicos en el hombre guarda rela-

ción con el desajuste o la disrupción de los mecanismos que regulan la composición iónica,

IOsmolaridad y tonicidad

Al predecir el cambio que ejercerá una solución dada sobre el volumen celular, debe considerarse no sólo la osmolaridad relativa de ésta con respecto a la osmolaridad intracelular, sino también la permeabilidad relativa de la membrana plasmática a los solutos presentes en la solución considerada. Tal permeabilidad dependerá de los coeficientes de reflexión de los solutos en solu-ción. El concepto de tonicidad hace referencia a la capacidad que presentan las soluciones de producir cambios, o no, sobre el volumen de las células en contacto con ellas, independientemen-te de su osmolaridad. Así, hay soluciones que pueden ser isosmolares con una solución control pero anisosmóticas con respecto a su efecto sobre el volumen celular. El ejemplo clásico es una solución isosmolar de urea, que no obstante, es hipotónica. En términos prácticos, la respuesta celular observada define la tonicidad de una solución: esta última será isotónica, si el volumen celular no cambia, y anisotónica, si el volumen celular se altera. Si lo que se observa es un aumento de volumen celular, se dice que la solución es hipotónica; si el efecto es una disminu-ción en el volumen de la célula, la solución es hipertónica. Una solución isosmótica puede ser a la vez hipotónica (como en el ejemplo de la urea), si contiene solutos que atraviesan fácilmente la membrana de las células, aumentando la presión osmótica en el interior celular y provocando un aumento de volumen; este es el caso de las soluciones con NH4Cl utilizadas en la mayoría de los experimentos que se describen en el presente trabajo.

25

orgánica, y el contenido de agua del citosol173-178. El estudio de los fenómenos osmóticos

reviste por lo tanto un interés doble, relacionado con la fisiología básica de las células, por un

lado, y con las consecuencias patofisiológicas que supone la alteración de los mecanismos de

regulación del volumen celular, por el otro.

1.7.1. Estrategias para el estudio de los procesos de regulación del volumen celular. La

mayoría de las investigaciones en torno a los fenómenos de regulación del volumen celular se

llevan a cabo exponiendo las células a soluciones anisosmolares (y anisosmóticas), es decir a

medios que presentan concentraciones de solutos osmóticamente activos diferentes a las que

se encuentran en el plasma en condiciones normales179.

Si bien las estrategias que se valen del uso de medios “anisosmóticos” han sido útiles para

identificar mecanismos de regulación del volumen celular, las condiciones experimentales

empleadas en estos estudios difieren notablemente de las de los organismos vivos en condicio-

nes fisiológicas y aún patológicas pues, como se mencionó, la composición del medio extrace-

lular, tanto en circunstancias normales, así como en diversas patologías, se mantiene dentro de

un estrecho rango de tonicidad fuera del cual se compromete la vida misma del organismo.

No obstante su relevancia fisiopatológica, es poco lo que se conoce acerca de los

mecanismos de regulación del volumen celular en condiciones isosmóticas. La naturaleza de

los cambios de volumen producidos en uno y otro caso es diferente: el hinchamiento celular

que sigue a la exposición de las células a un medio hiposmótico – e hipotónico – resulta de

una entrada de agua que produce una dilución de los solutos intracelulares; un aumento del

volumen celular en un medio isosmótico resulta, por el contrario, de un incremento primario

en los solutos intracelulares, seguido necesariamente de una entrada osmótica de agua. La

corrección del volumen celular, por tanto, puede implicar, en uno y otro caso, mecanismos y

estrategias diferentes (véase sección 1.7.2). Al ser expuestas a medios ligeramente anisos-

móticos casi todas las células animales se hinchan o se encogen comportándose, inicialmente,

como osmómetros ideales, es decir, siguiendo la ley de van’t Hoff (ver recuadro II). Cuando el

grado de anisosmolaridad de las soluciones es relativamente alto, y el cambio de volumen

alcanza una cierta magnitud, las células activan mecanismos de regulación (no lineales). Estos

26

últimos comprenden, primariamente, canales iónicos y otros sistemas de transporte localizados

en la membrana plasmática celular, entre ellos sistemas de transporte primario (como la

bomba de Na+/K+) y secundario (cotransportadores e intercambiadores) cuya activación

permite o facilita la entrada ó la salida, a través de la membrana, de partículas osmóticamente

II Presión y flujo osmótico

El movimiento de agua a través de las membranas biológicas está determinado principalmente por el fenómeno de la ósmosis, que describe el flujo de agua que ocurre desde una solución más diluida hacia otra más concentrada, contenidas en compartimentos separados por una membrana semiper-meable, es decir impermeable a los solutos y permeable al agua. En estas condiciones, el flujo de agua puede contrarrestarse aplicando una presión hidrostática al compartimento que contiene la solución más concentrada; la presión necesaria para abolir el flujo de agua es la presión osmótica.

Suponiendo que las soluciones a cada lado de la membrana estén relativamente diluidas, y que ésta sea totalmente impermeable a los solutos, la presión osmótica se define operacionalmente por la ecuación de van`t Hoff:

π = (Pi − Pe) = RT∆Cs (2)

donde π denota la presión osmótica, equivalente a la diferencia de presión hidrostática entre los dos compartimentos (Pi − Pe), expresada en atmósferas, R es la constante de los gases, T es la tempera-tura absoluta y ∆Cs es la diferencia de concentración del soluto entre los dos compartimentos, expre-sada en moles/l.

La ecuación de van`t Hoff provee una buena aproximación a la presión osmótica de las solucio-nes biológicas –v.g. líquidos intra y extracelulares de vertebrados o invertebrados terrestres o de agua dulce- que en general se hallan relativamente diluidas. En la estimación de la presión osmótica de soluciones más concentradas, sin embargo, es necesario incluir un factor de corrección empírico, el coeficiente osmótico molar (φ’). Éste contempla, para diversas concentraciones de un soluto dado, las interacciones intermoleculares soluto-soluto, soluto-solvente y solvente-solvente, que des-vían a las soluciones del comportamiento osmótico ideal predicho por la ecuación de van`t Hoff. El coeficiente osmótico molar queda integrado en dicha ecuación de la siguiente manera:

π = φ’RT∆Cs (3)

que al considerar la molalidad (m) de las soluciones se expresa más comúnmente como: π = φRT∆m (4)

en donde φ es el coeficiente osmótico molal, y ∆m es la diferencia de molalidad de las soluciones. En las soluciones mixtas, que contienen dos ó más especies de solutos, como los fluidos

biológicos, pueden existir sin embargo interacciones moleculares adicionales que no están conside-radas en los coeficientes osmóticos. Las presiones osmóticas predichas para soluciones mixtas, basadas en los coeficientes osmóticos disponibles de los solutos que las componen, son por tanto aproximaciones, que pueden no reflejar de manera exacta las presiones osmóticas reales180.

27

activas (iones y ciertos osmolitos orgánicos). Como resultado de estos procesos, que se

acompañan de los flujos osmóticos de agua correspondientes, el volumen celular tiende a

“corregirse”, es decir tiende a regresar a su valor inicial160. El proceso de regulación que sigue

a aumentos de volumen en un medio hiposmótico – e hipotónico – se denomina "disminución

reguladora del volumen" y se abrevia: DRV. El proceso opuesto, tendiente a restablecer el

volumen celular tras una disminución producida en un medio hiperosmótico – e hipertónico –,

se conoce como "aumento regulador del volumen", ó ARV. De manera análoga, en este trabajo

los términos DRVi y ARVi se utilizan para designar, respectivamente, a los procesos de

regulación que ocurren frente a aumentos y disminuciones del volumen celular en medios

isosmóticos.

1.7.2 Cambios en el volumen celular acuoso en medios isosmóticos. En medios isosmóticos,

es decir aquellos que presentan una osmolaridad igual a la del líquido extracelular, cualquier

entrada o salida de soluto a las células que no sea compensada por una salida o una entrada

concomitante y equivalente de sustancias osmóticamente activas producirá, respectivamente,

un aumento o una disminución de volumen en el volumen celular (Fig. 5). Como ejemplo de

aumentos de volumen en un medio isos-

mótico podemos citar: la incorporación

celular de nutrientes181,182, la acción de

ciertas hormonas183,184 y la entrada neta

de iones a consecuencia de una despola-

rización sostenida de la membrana plas-

mática104-106,185, eventos todos que ejem-

plifican la ocurrencia de aumentos del

volumen celular en ausencia de cambios

en la osmolaridad extracelular.

Figura 5. Cambios en el volumen celular acuoso resultantes de alteraciones no compensadas en la tasa de transporte de solutos a través de la membrana plasmática. El VCA se mantendrá constante cuando la tasa de influjo y la tasa de eflujo de solutos sean iguales (C). Un aumento primario en la tasa de influjo (A), así como una disminución en la tasa de eflujo de solutos (B), que no sean compensadas conducirán a un aumento del VCA. De manera análoga, una reducción primaria en la tasa de influjo (D) así como un aumento primario en la tasa de eflujo de solutos (E) conducirán a una disminución del VCA.

28

Como ejemplo de disminución de volumen en un medio isosmótico puede mencionarse,

como caso notable, la acción de neurotransmisores como el GABA en algunas neuronas186 o

cualquier evento que culmine con un aumento en la concentración de Ca2+ libre intracelular

([Ca2+]i), que a su vez dispararía conductancias al K+ y al Cl- con la consecuente salida no

compensada de solutos y agua187,188. Los astrocitos y las neuronas son especialmente suscepti-

bles a sufrir cambios de volumen en diversas patologías, como los traumas cerebrales, la

isquemia, los trastornos epilépticos y hepáticos175,189,190. El aumento de volumen en astrocitos

expuestos experimentalmente al ácido láctico (un modelo de edema cerebral post-isquémico,

en relación con una acidosis orgánica) constituye otro ejemplo de alteración del volumen

celular en condiciones isosmóticas. Por ser un ácido débil, el ácido láctico penetra la membra-

na plasmática y se acumula en el interior celular. Esta acumulación causa acidosis intracelular

que dispara un aumento en la actividad del intercambiador Na+/H+, lo cual a su vez resulta en

un aumento del volumen, que se suma al producido por la acumulación del propio lactato191.

Se piensa que, en términos generales, la activación de fenómenos reguladores del volumen

celular en condiciones isosmóticas guarda una relación estrecha con los cambios en la fuerza

iónica intracelular y en la actividad termodinámica de especies iónicas específicas – especial-

mente la actividad del cloruro intracelular, αCl-i – que ocurren característicamente ante cam-

bios de volumen mediados por estímulos isosmóticos ó hiperosmóticos192. Mientras que la

salida de agua en medios hiperosmóticos favorece la concentración de sales, la disminución de

volumen en medio isosmótico se debe a la salida de sales y la consecuente salida osmótica de

agua. En estos cambios resalta la reducción en la αCl-i, dado que la actividad (o la concentra-

ción) relativa del Cl- puede regular la actividad del NKCC, el cotransportador de Na+,K+,2Cl-,

que ha sido postulado, aunque sin pruebas experimentales directas y definitivas, como uno de

los mediadores principales del ARV en muchos tipos celulares193. Algunos estudios muestran

asimismo que cambios en la fuerza iónica intracelular modulan la activación del VSOAC, un

canal aniónico sensible a aumentos del volumen que media, en un vasto número de tipos

celulares, la salida de Cl- y osmolitos orgánicos observada durante los procesos de DRV194,195 .

1.7.3 Elementos celulares que intervienen en las respuestas de osmoregulación. La regulación

del volumen celular, tanto en condiciones isosmóticas como anisosmóticas, requiere de tres

29

elementos celulares básicos: un sensor, que detecta los cambios de volumen; un efector, que

lleva a cabo la corrección de los mismos, y un sistema de señales o segundos mensajeros

intracelulares, que vinculan al sensor con el efector, activando una respuesta apropiada196,197.

Aunque esta categorización es válida para definir teóricamente las instancias y componentes

de la respuesta osmoreguladora, es importante destacar sin embargo que una distinción

puntual entre estos elementos no siempre es plausible; los canales activados por tensión de la

membrana, por ejemplo, poseen características comunes a los tres elementos162.

Las sustancias y mecanismos involucrados en las respuestas de osmoregulación han sido

estudiados en una amplia variedad de organismos, que van desde los protozoos198-201, las algas

y los hongos202-206, hasta las plantas y los animales170,207-212. Una visión de conjunto sobre

estos estudios revela dos conclusiones importantes: a) existe una multiplicidad de mecanismos

que pueden intervenir en los procesos de osmoregulación; b) en ciertos casos, la naturaleza

del cambio de volumen, antes que la magnitud del mismo, determina o no la activación de

unos u otros mecanismos reguladores.

1.7.3.1 Mecanismos de detección de los cambios de volumen. Mientras que en las bacterias,

las levaduras y otros microrganismos se han descubierto ciertas moléculas “osmosensoras”, así

como algunos componentes de las vías de transducción implicadas en la adaptación celular

frente a alteraciones osmóticas172,206,213,214, la naturaleza del sensor de volumen en los organis-

mos pluricelulares aun no ha sido esclarecida. Existen varias teorías al respecto, las cuales

invocan, de manera distintiva, efectos del volumen sobre la tensión de la membrana, la arqui-

tectura del citoesqueleto ó la concentración citoplasmática de iones y/o macromoléculas215-217.

La activación de mecanismos reguladores del volumen celular tras aumentos o disminu-

ciones del mismo está relacionada estrechamente con la noción de un “umbral” de detección

del cambio de volumen (“volume set point”). Dicho umbral representa un estado particular

(un nivel crítico de aumento o disminución) del volumen celular, que presupone la activación

de un mecanismo sensor que detecta los cambios de volumen y los transduce en una respuesta

efectora que corrige el volumen aberrante. Ciertos estudios muestran, sin embargo, que el

“umbral” de volumen no es necesariamente fijo, ó estático; en algunos tipos celulares, por

30

ejemplo, la presencia en el citoplasma de agentes como el Mg2+ o la urea desplaza el umbral

de detección de los cambios de volumen, de manera tal que las respuestas reguladoras celula-

res frente a los cambios osmóticos ocurren ante estímulos de una magnitud mayor – o menor –

que la requerida previamente para desencadenar tales respuestas218,219. Algunos estudios sugie-

ren, por otra parte, la existencia de múltiples umbrales de volumen, en relación con la ocurren-

cia de cambios graduales o súbitos en el volumen celular y con la activación diferencial de

vías efectoras de la respuesta220. Dichos estudios demuestran que ciertas células mantienen un

volumen constante al ser expuestas a soluciones en las cuales la osmolaridad aumenta, o se

reduce, lenta y gradualmente. Estas maniobras ponen además de manifiesto la activación se-

cuencial de diversos mecanismos de regulación (algunos de ellos activados ante cambios en la

osmolaridad menores del 3%), conforme el gradiente osmótico se acentúa. Este fenómeno,

denominado "regulación isovolumétrica"221, que ha sido descrito inicialmente en células rena-

les221-223 y posteriormente en cardiomiocitos224, células gliales225 y neuronas226, probablemente

refleja más fielmente la realidad de la homeostasis del volumen celular en los organismos, ya

que los cambios en la osmolaridad extracelular en estos últimos ocurren, por regla general,

lentamente.

Dado que los cambios en el volumen celular reflejan tanto movimientos de agua como

dilución o concentración de iones y macromoléculas (osmolitos en general) en el interior

celular, cabe preguntarse: ¿qué “trata” de preservar la célula, su volumen, o su composición

iónica y macromolecular?218 Existen dos hipótesis principales, aunque no mutuamente exclu-

yentes, acerca de los mecanismos de detección-transducción de los cambios en el volumen

celular: una sostiene que la señal proviene de eventos mecánicos tales como un estiramiento o

contracción de la membrana celular, o del rearreglo de estructuras internas (v.g. citoesquele-

to); esta es la hipótesis mecánica. La otra hipótesis propone que la señal se efectúa a través de

cambios en la concentración de uno o más factores citosólicos tales como ciertos iones, solu-

tos orgánicos o macromoléculas (v.g. proteinas). En esto se sustenta la hipótesis química.

Dando apoyo a la hipótesis mecánica, ciertos canales iónicos mecano-sensibles han sido

implicados tanto en la detección de los cambios de volumen como en la generación de las

respuestas efectoras, en varios tipos celulares incluyendo neuronas y células gliales215,227,228.

Numerosos estudios sugieren asimismo un papel importante del citoesqueleto en las respuestas

31

de regulación del volumen celular, si bien no se tiene una idea clara de los mecanismos y

procesos implicados229. La disrupción de los filamentos de actina con citocalasina, por ejem-

plo, no afecta en la mayoría de los casos el desarrollo de la DRV, mientras que en otros la

bloquea o incluso la potencia, dependiendo del tipo celular230,231.

La hipótesis química incorpora los conceptos de "apiñamiento" y confinamiento macromo-

lecular (“macromolecular crowding”), cuyo grado depende del volumen acuoso celular. De

acuerdo con esta hipótesis, la cinética y el equilibrio de las enzimas presentes en el espacio

intracelular puede alterarse de manera significativa por cambios pequeños en la concentración

(intracelular) de macromoléculas inertes en su entorno inmediato. Por ejemplo, se estimó que

un cambio del 10% en la concentración de proteínas intracelulares puede conducir a cambios

de hasta un orden de magnitud en la actividad termodinámica de moléculas con función regu-

ladora. Entre los sustratos de estas últimas se encuentran proteínas que forman canales iónicos

o transportadores232-236. El apoyo a esta hipótesis viene principalmente de estudios realizados

en "fantasmas" de eritrocitos y células musculares de percebes, en las cuales la adición o

perfusión de distintos solutos modifica el apiñamiento macromolecular y con él, la actividad

de los sistemas de transporte involucrados en la respuesta osmoreguladora219,237. Si bien las

consideraciones teóricas y las pruebas experimentales en torno a este modelo son válidas,

hasta el presente no se han identificado las moléculas de señalización que median los fenóme-

nos descritos, y el mismo no ha sido verificado en células intactas.

1.7.3.2. Transducción intracelular de los estímulos osmóticos. En los últimos años, numerosas

investigaciones se han encaminado a identificar y caracterizar funcionalmente a los mensaje-

ros intracelulares que median las señales osmóticas y modulan, en consecuencia, las respuestas

de ajuste del volumen celular. Iones como el Ca2+, el Mg2+, diversas cinasas y fosfatasas, pro-

teínas G, fosfoinosítidos, prostaglandinas, etc., y eventos tales como rearreglos del citoesque-

leto, entre otros factores, han sido señalados como componentes centrales de las vías de trans-

ducción que conectan los cambios del volumen con las respuestas de regulación en diversos

tipos celulares171,172,238-241. En muchas células se ha descrito un aumento en la [Ca2+]i tras

incrementos del volumen en medio hiposmótico, principalmente. La lista de células en las que

esto ocurre incluye neuronas, astrocitos, y células de neuroblastoma187,197,242. En la mayoría de

los casos, sin embargo, no se demostró fehacientemente un papel directo del Ca2+i en los

32

fenómenos de osmoregulación187. Más aún, en células de neuroblastoma NG108-15 y N1E-

115, por ejemplo, se demostró de manera directa que la [Ca2+]i se incrementa durante aumen-

tos del volumen en medio hiposmótico, pero que dicho incremento no es necesario para que

ocurra la DRV197.

1.7.3.3. Mecanismos efectores de la regulación del volumen celular. Ante cambios osmóticos

agudos, la difusión o el transporte mediado de iones (principalmente K+, Cl- y Na+) a través de

la membrana, que determina el flujo concomitante de agua, constituye la respuesta de regula-

ción primaria del volumen en numerosos tipos celulares168. La salida ó acumulación de ciertos

osmolitos orgánicos acompaña en ocasiones a la fase inicial de la respuesta reguladora.

Conforme las alteraciones osmóticas a las que se sujeta a las células adquieren un carácter

crónico, la concentración intracelular de osmolitos orgánicos (“compatibles”, desde el punto

de vista termodinámico, con la función enzimática celular) se ajusta en consecuencia; la regu-

lación génica de enzimas intermediarias en la síntesis de estas sustancias, que incluyen polial-

coholes, aminoácidos, azúcares, metilaminas y urea, ó de sus transportadores específicos,

participa esencialmente de este proceso169,243-246. El transporte iónico es un proceso rápido, que

media en general correcciones inmediatas del volumen celular; la internalización, secreción,

síntesis o degradación de osmolitos orgánicos representa, en muchos casos, una respuesta

adaptativa, a largo plazo, frente a desafíos osmóticos prolongados. Los mecanismos de induc-

ción génica activados en respuesta a condiciones de anisosmolaridad crónica en células de

vertebrados superiores no han sido elucidados.

1.7.4 DRV y ARV: paradigmas experimentales en el estudio de los fenómenos de osmore-

gulación. El conocimiento actual sobre los agentes y los mecanismos que median la regulación

del volumen celular proviene básicamente de estudios de la DRV y el ARV, que son, como

hemos visto, respuestas en medios anisosmóticos. A continuación se consideran someramente

las estrategias de osmoregulación más comúnmente observadas usando este paradigma experi-

mental.

1.7.4.1 Disminución reguladora del volumen, DRV. La activación de conductancias al K+ y al

Cl- por canales independientes (concomitantemente al eflujo osmótico de agua) constituye una

33

estrategia común de restauración del volumen celular en respuesta a hinchamientos en medios

hiposmóticos. Este fenómeno se ha descrito en numerosos tipos celulares, incluyendo astroci-

tos247, neuronas248,249 y células de neuroblastoma250,251,258,314 (ver recuadro III). Las oscilacio-

nes en el potencial de membrana que resultan de la activación primaria de canales de K+ ó Cl-

sensibles al volumen determinan el flujo simultáneo de estos iones, de manera que el proceso

general es electroneutro168,252,253. Durante la DRV, un eflujo adicional de KCl puede ocurrir

además a través del cotransporte acoplado de K+-Cl-; este es un fenómeno común en ciertas

células como los eritrocitos86,254. La salida de osmolitos orgánicos, que acompaña con frecuen-

cia a estos procesos durante la DRV in vitro, cobra especial importancia en células como las

renales y los astrocitos, durante cambios de volumen en el organismo sano ó enfermo. En la

Fig. 6 se ilustran los mecanismos básicos que median la DRV y el ARV en diferentes tipos de

células.

Figura 6. Mecanismos de transporte que intervienen en la disminución reguladora del volumen (DRV) y en el aumento regulador del volumen (ARV) tras las exposición a medios anisosmóticos. Tras aumentos del volumen celular en medio hiposmótico, la DRV en numerosos tipos celulares está determinada comúnmente por la salida conductiva de Cl- y K+, por el transporte acoplado de estos iones, en ciertos casos, y por el eflujo de osmolitos orgánicos, Osm(-) (v.g.: taurina). Entre los procesos que pueden contribuir al ARV que sigue a reducciones del volumen en medio hiperosmótico se encuentran el cotransporte de Na+,K+,2Cl-, el intercambio, funcionalmente acoplado, de Na+/H+ y de Cl-/HCO3

- y la internalización de osmolitos orgánicos. Si el estímulo hiperosmótico se prolonga en el tiempo, la síntesis de osmolitos orgánicos, o de sus proteínas transportadoras, contribuye al aumento de la osmolaridad interna de las células. La activación de las vías de transporte mencionadas determina flujos netos de agua (salientes, en la DRV, y entrantes, durante el ARV) que resultan en una corrección del volumen celular.

34

III Estudio de la DRV en células N1E-115

Dado que el presente trabajo se realizó en células de neuroblastoma N1E-115, es conveniente revisar someramente los estudios realizados en estas células utilizando el paradigma anisomótico. La magnitud y la cinética de la DRV se midieron con calceína en nuestro laboratorio, como parte de la validación del método de fluorescencia para cuantificar cambios en el volumen celular acuoso188. En un estudio posterior se demostró que el aumento de volumen en medio hiposmótico se acompaña de un aumento en la [Ca2+]i, que no es sin embargo necesario para desencadenar la DRV197. Tres estudios, además de los mencionados, evaluaron la DRV en estas células250,251,258. Las observaciones fueron realizadas en células aparentemente indiferenciadas (sin neuritas) y el volumen celular se estimó a través de técnicas morfométricas. Registros realizados con la técnica de “patch clamp” señalan que tras aumentos del volumen celular en medio hiposmótico se incrementa la actividad de canales catiónicos no selectivos activados por la tensión de la membrana(SACs, del inglés “stretch-activated cation channels”), lo cual determina una despolarización de la membrana plasmática. Este fenómeno es seguido por la activación de canales de K+ (KDR) y de un canal aniónico de alta conductancia, a través de los cuales se postula que ocurre la DRV250. En un estudio posterior se analizaron los efectos de diversos inhibidores del transporte iónico a través de la membrana sobre la DRV. Los resultados muestran que ésta se bloquea por inhibidores de canales de K+ (20 mM TEA) o de canales aniónicos (10 µM DIDS). La aplicación de gadolinio (10-20 µM), un inhibidor no específico de SACs, induce un bloqueo de magnitud variable de la DRV. Este proceso no se ve afectado, por el contrario, durante la aplicación de ouabaina (15-250 µM), ni por la inhibición del cotransportador NKCC (100 µM bumetanida) o del intercambiador Cl-/HCO3

- (500 µM SITS)251. Finalmente, en un estudio más reciente se observó que la DRV en células N1E-115 se bloquea

con TEA (10 mM); DIDS (250 µM); 4-aminopiridina (5 mM), un inhibidor de canales de K+ y con ácido niflúmico (50 µM), un inhibidor de canales aniónicos. En el estudio referido la bumetanida (10 µM) y la furosemida (un inhibidor inespecífico de los cotransportadores KCC y NKCC; 500 µM) bloquearon parcialmente la DRV258.

1.7.4.2 Aumento regulador del volumen, ARV. A diferencia de la DRV, que se observa en la

mayoría de los tipos celulares estudiados, la recuperación del volumen celular tras estímulos

hiperosmóticos es un fenómeno menos generalizado. Sin embargo, en algunas células que no

muestran ARV al ser expuestas a medios hiperosmóticos, es posible inducir este proceso some-

tiéndolas primero a un aumento de volumen hiposmótico, seguido de una recuperación en

medio isosmótico. Dado que las células pierden osmolitos durante la DRV en medio hiposmó-

tico, la solución isosmótica es ahora “hiperosmótica” con respecto al interior celular, por lo

cual las células disminuyen de volumen, mostrando a continuación un ARV180,196. Las causas

por las cuales muchas células no desarrollan ARV ante estímulos hiperosmóticos y sí lo hacen

tras sufrir un aumento de volumen hiposmótico no son claras. Es probable que los cambios en

35

la fuerza iónica ó en el contenido general de osmolitos intracelulares, que ocurren distintiva-

mente en uno y otro caso, influyan en la capacidad - ó determinen la “necesidad” - de respuesta

de las células. En términos generales, el ARV procede a través de una ganancia neta de KCl,

resultante de una entrada de NaCl, ó NaCl y KCl (el Na+ que ingresa es intercambiado por K+ a

través de la Na+/K+ATPasa, lo cual resulta en una ganancia neta de K+). A diferencia de la

DRV, diversos estudios coinciden en señalar que el ARV se desarrolla principalmente a través

de la activación de sistemas de transporte acoplado de iones. Entre estos últimos se ha postu-

lado principalmente al cotransportador de Na+-K+-2Cl-193,255 y al intercambiador de Na+/H+, a

menudo activado en forma paralela con el intercambiador Cl-/HCO3-256,257. En muchos casos,

sin embargo, las evidencias a favor de estos mecanismos son incompletas. En diversos tipos

celulares, como por ejemplo células de neuroblastoma Neuro-2a, se describió además la activa-

ción de un canal catiónico no selectivo (denominado NSC), tras la exposición a medios hiper-

tónicos259. Sin embargo, estos estudios no confirmaron la relevancia de este mecanismo en el

ARV.

Como ya se mencionó, en condiciones de hiperosmolaridad crónica, la inducción génica de

enzimas intermediarias en la síntesis de osmolitos orgánicos, o de sus transportadores de mem-

brana, cumple un papel fundamental en la restauración del volumen y en la adaptación al

medio externo en diversos tipos de células260 (Fig. 6).

36

2. OBJETIVOS

El objetivo general de este trabajo es contribuir al conocimiento de los mecanismos que

relacionan al pH intracelular con el volumen celular acuoso en neuronas. En particular, se

estudia la respuesta osmótica de células nerviosas mantenidas in vitro ante la exposición a

medios isosmóticos conteniendo amoníaco y amonio (NH3/NH4+). Además de las implicacio-

nes biofísicas, este estudio es relevante para entender aspectos celulares y moleculares de la

toxicidad del NH3/NH4+ producida ante aumentos patológicos de su concentración en el plas-

ma, como aquellos que ocurren en las hiperamonemias que siguen a la falla hepática aguda.

Los objetivos específicos son:

1. Caracterizar cuantitativamente los cambios en el volumen celular acuoso y en el pH intrace-

lular mediados por el par NH3/NH4+ en células individuales de neuroblastoma N1E-115, utili-

zando marcadores intracelulares y microscopía de fluorescencia.

2. Determinar la contribución relativa de las especies individuales NH3 y NH4+ a los cambios

de volumen y pH intracelular.

3. Poner a prueba la hipótesis de que la acumulación intracelular de NH4+ es responsable del

aumento del volumen celular inicial, tras la exposición de las células al par NH3/NH4+.

4. Identificar las vías de transporte de solutos que participan en la regulación del volumen

celular tras el aumento inicial mediado por el par NH3/NH4+.

5. Identificar las vías de transporte que median el influjo de NH4+ a las células.

37

3. MATERIALES Y METODOS

3.1 Células. Los experimentos se realizaron en células de neuroblastoma N1E-115, provenien-

tes de un clon de células C-1300261, derivadas de neuronas de ganglios simpáticos de ratón.

Las mismas fueron donadas a nuestro laboratorio por el Dr. Marshall Nirenberg (National

Institutes of Health, USA). Una vez diferenciadas, las células N1E-115 expresan característi-

cas neuronales262,263. Las propiedades eléctricas de estas células, así como sus transportadores

de membrana, canales iónicos, receptores, etc., se han estudiado extensivamente264-278. Asimis-

mo, estas células han sido objeto de estudio en fenómenos de osmoregulación por parte de

nuestro equipo de trabajo64,65,188,197 y de otros grupos de investigación250,251,258. Por estas

razones, y por la facilidad con la que pueden cultivarse bajo condiciones controladas, constitu-

yen un modelo ideal para estudios como el presente.

Una vez diferenciadas, las células N1E-115 en cultivo muestran un alto grado de

pleomorfismo. Para nuestros experimentos de fluorescencia se seleccionaron células aisladas;

con un soma pequeño o mediano (aproximadamente 25 a 40 µm de diámetro) y diferenciadas,

esto es, caracterizadas por la presencia de una o más proyecciones neuríticas de extensión

igual o superior al diámetro del soma (Fig. 8; Pág. 44). Se excluyeron, entre otras que no se

correspondían con este criterio, aquellas con una morfología esférica y sin neuritas (propia de

células no diferenciadas). También se excluyeron del registro las células que mostraron, tras

la carga con el indicador fluorescente, una fluorescencia ya fuera excesiva ó muy baja.

3.2. Cultivo celular. Las células se conservaron en viales (Nalgene, USA) herméticamente

cerrados con una cubierta de crioflex (Nunc, USA), congeladas en nitrógeno líquido, hasta el

momento de su siembra inicial. El mantenimiento y la resiembra celular se realizaron en

frascos de cultivo de 25 cm2 (Corning, USA). La composición del medio de mantenimiento fue

la siguiente: 90% DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium; Gibco, USA) suplementado

con 1% HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina; Gibco, USA), 1% glutamina (2 mM)

(Gibco, USA) y 10% suero fetal bovino (SFB, HyClone, USA). Para ser utilizadas en los

experimentos, las células se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio de 25 mm de diámetro

(Bellco Glass, Inc., USA) previamente tratados con poly-lisina D (Becton Dickinson, USA),

38

en cajas de Petri de plástico de 35 mm de diámetro (Becton Dickinson, USA). Alrededor de 4

a 24 horas después de esta siembra, realizada en medio de mantenimiento, éste se reemplazó

por medio de diferenciación, que se renovó cada 2 días. El medio de diferenciación tuvo la

siguiente composición: 98% DMEM suplementado con 1% HAT, 1% glutamina (2 mM), 1

mM teofilina (Sigma, USA) y 2% SFB, y como agente diferenciador adicional se agregó 5

µM/ml de prostaglandina E-1279 (PGE-1; Sigma, USA). Las células se incubaron a 37º C en

una atmósfera húmeda de 5% CO2 / 95% aire. No se añadieron antibióticos en la preparación

de los medios de cultivo o durante el proceso de mantenimiento y diferenciación celular. Los

experimentos se realizaron en células cultivadas que habían sido incubadas durante 3 a 7 días

en medio de diferenciación.

3.3 Soluciones experimentales. La solución de Krebs tuvo la siguiente composición (en mM):

NaCl, 130; KCl, 5,5; CaCl2, 2,5; MgCl2, 1,25; HEPES, 20; glucosa, 10. El pH se ajustó a 7,3

con NaOH 1M y fue igual en todas las soluciones experimentales, exceptuando aquellas que

se prepararon con [NH3] ó [NH4+] constantes (ver más abajo). En la solución de Krebs, así

como en todas las soluciones isosmóticas utilizadas en este trabajo, la osmolaridad se ajustó a

312 ± 2 mOsm/KgH2O a través de la adición de sucrosa. Esta osmolaridad es similar a la del

medio de cultivo de mantenimiento de las células. La solución isosmótica control (ISO) tuvo

una composición idéntica a la solución de Krebs, excepto que la concentración de NaCl se

redujo a 120 mM. Las soluciones anisosmóticas (± 10%) utilizadas para calibrar la respuesta

de volumen celular al inicio de cada experimento de fluorescencia tuvieron la misma composi-

ción iónica de la ISO, y su osmolaridad se ajustó con sucrosa. Las soluciones conteniendo

NH4Cl se prepararon a partir de la ISO control; el NH4Cl se agregó en reemplazo de cantida-

des equimolares de NaCl y la osmolaridad final fue similar a la de la solución ISO control

(312 ± 2 mOsm/KgH20). En las soluciones en que las concentraciones de NH3 ó NH4+ se

mantuvieron constantes, variando de manera independiente la concentración de la especie res-

tante, el pH se ajustó a los valores deseados (Tabla I) y la osmolaridad fue también de ~312

mOsm. La [NH4+] de las soluciones está dada por: BT x 10-pH/10-pK + 10-pH, en donde la base

total BT = [NH3]+[NH4+] y el pK = 9,25, a 25 ºC. Las soluciones con una [NH3] constante

39

(0,23 mM) y diferentes [NH4+] (4,77; 9,77; 19,77 y 29,77 mM) se prepararon a partir de solu-

ciones conteniendo 5, 10, 20 y 30 mM de NH4Cl, siendo la [NH3] idéntica a la presente en una

solución con 20 mM NH4Cl a pH 7,3. Las soluciones con una [NH4+] constante (10 mM) y

diversas [NH3] (0,05; 0,11; 0,22 y 0,33 mM) se prepararon a partir de soluciones conteniendo

10,05; 10,11; 10,22 y 10,33 mM de NH4Cl respectivamente, siendo las concentraciones de

NH3 en estos casos iguales a las presentes en soluciones con 5, 10, 20 y 30 mM de NH4Cl a

pH 7,3, respectivamente (Tabla I). Para obtener las concentraciones de NH3 y NH4+ deseadas,

en todas y cada una de estas soluciones el pH se ajustó de acuerdo con la ecuación de

Henderson-Hasselbalch: pH = pK + log {[NH3]/[NH4+]}.

Tabla I. Soluciones experimentales con concentraciones constantes de NH3 ó NH4

+.

3.3.1 Sustitución de iones. En la preparación de la solución isosmótica basal libre de Cl- (ISO

Cero Cl-) se emplearon sales de gluconato en reemplazo equimolar de las sales de Cl- presentes

en la solución ISO control. En las soluciones con NH3/NH4+ libres de Cl- se agregó gluconato

de amonio (20 mM, preparado a partir de NH4OH y ácido glucónico), en reemplazo equimolar

de gluconato de Na+ de la solución ISO Cero Cl-. El pH de estas soluciones se ajustó a 7.3 con

ácido glucónico. En las soluciones isosmóticas en que se eliminó el Na+, éste se sustituyó mol

por mol por N-Metil-D-Glucamonio (NMDG+), utilizando para ello la sustitución del NaCl

por cloruro de N-Metil-D-Glucamina. El pH de estas soluciones se ajustó a 7.3 con N-Metil-

D-Glucamina. En las soluciones conteniendo NH4Cl 20 mM en las que se omitió el Na+ la

concentración de cloruro de NMDG se redujo en 20 mM. En las soluciones isosmóticas libres

de Ca2+ el CaCl2 fue reemplazado por cantidades equimolares de MgCl2 y se agregó 1 mM de

[NH3]o = 0,23 mM [NH4+]o = 10 mM

pHo [NH4

+]o (mM)

TB (mM) pK = 9,25 (25 ºC) pHo

[NH3]o (mM)

TB (mM)

7,91 4.77 5 7 0,05 10,05 7,61 9.77 10 pH = pK + log {[NH3]/[NH4

+]} 7,3 0,11 10,11 7,31 19.77 20 7,6 0,22 10,22 7,13 29.77 30 Osm ≈ 312 mOsm 7,77 0,33 10,33

40

ácido etilenglicol-tetracético (EGTA), un agente quelante de Ca2+, para neutralizar la activi-

dad del Ca2+ residual.

Los reactivos utilizados en la preparación de todas las soluciones provinieron de Sigma,

USA.

3.3.2 Bloqueadores de canales y transportadores. Los agentes farmacológicos empleados en

el presente trabajo se agregaron, en cada caso, a soluciones ISO control de prueba y a solucio-

nes experimentales con NH4Cl. Estas sustancias fueron: bario (BaCl2; 1 mM), agregado a las

soluciones en reemplazo equimolar de NaCl; TEA (cloruro de tetraetilamonio; 10 mM), disuel-

to directamente en las soluciones en reemplazo equimolar de NaCl; gadolinio (GdCl3; 100

µM), disuelto directamente en las soluciones; NPPB (ácido-5-nitro-2-(3-fenilpropilamino)-

benzóico; 10 µM), tomado a partir de una solución madre (133 mM) en DMSO (concentración

final de DMSO en las soluciones experimentales < 0,01%); DIDS (2,2'-disulfonato-disodio-

4,4'-diisotiocianatostilbene; 100 µM), disuelto en KHCO3 0,1M, pH 8 y furosemida (1 mM),

disuelta en metanol (concentración final de metanol en las soluciones experimentales <

0,01%). Estas sustancias se compraron a Sigma, USA.

3.4 Fundamentos de la técnica de microscopía de fuorescencia para la medición del

volumen celular. Las técnicas de registro fluorométrico empleadas en el presente trabajo para

la estimación de los cambios dinámicos del volumen celular acuoso en celulas individuales,

fueron desarrolladas y validadas en nuestro laboratorio188,197,280-282. El principio básico en que

se fundan es que los cambios relativos en el volumen celular acuoso (VCA) pueden calcularse

introduciendo un marcador fluorescente impermeable (m) en las células y midiendo los

cambios en su concentración (Fig. 7). Si el contenido intracelular (cantidad de masa) del

marcador (Qm) permanece constante a lo largo de las perturbaciones osmóticas inducidas

experimentalmente, los cambios fraccionales en su concentración (Cm) reflejarán cambios en

el VCA, de acuerdo con la ecuación incluida en la Fig. 7. Así, toda vez que el volumen acuo-

so de la célula cambie, la concentración del marcador fluorescente cambiará en proporción

inversa, y en tanto la relación entre la intensidad de la fluorescencia (F), y la concentración

intracelular del marcador (c) permanezcan dentro del rango lineal, la fluorescencia provenien-

41

Figura 7. Fundamento teórico para estimar cambios en el volumen celular acuoso (VCA) a partir del registro de los cambios en la concentración intracelular de marcadores fluorescentes. Suponiendo que el contenido intracelular del marcador permanece constante, los cambios fraccionales en su concentración son proporcionales a los cambios en el VCA: un aumento de este último producirá una dilución del marcador y una disminución en los niveles de fluorescencia; una reducción del VCA resultará, por el contrario, en una concentración del marcador y en un aumento en la señal fluorescente.

te de la zona celular de registro (ver más adelante) será directamente proporcional a la

concentración del fluoróforo. La fluorescencia emitida puede describirse cuantitativamente a

través de una expresión simplificada de la Ley exponencial de Beer-Lambert:

F = 2.3 ф r εcd (5)

donde F es la intensidad de la fluorescencia (cuando la luz de excitación es constante), ф es la

eficiencia cuántica del fluoróforo, r es una constante que representa factores instrumentales

ópticos, ε es el coeficiente de extinción, c la concentración del fluoróforo y d es el espesor del

especimen.

El marcador “ideal” de volumen

celular debe estar confinado al espacio

acuoso citosólico y debe distribuirse de

manera homogénea dentro de este

compartimento; no debe ser transpor-

tado a través de la membrana plasmá-

tica, ni penetrar otros compartimentos

intracelulares a través de las membra-

nas internas; debe ser además química-

mente estable (no ser sintetizado ni

metabolizado por la célula), insensible

a los iones nativos, y debe permanecer

diluido en el espacio acuoso de la cé-

lula, sin unirse a estructuras intracelu-

lares. Por último, el marcador ideal no

42

debe ser tóxico y no debe interferir con los mecanismos que participan en el mantenimiento y

la regulación del volumen. No existe, hasta el momento, un marcador que reúna todas estas

condiciones. A través del estudio de las propiedades espectrales y del comportamiento

intracelular de ciertos colorantes, sin embargo, el trabajo desarrollado en nuestro laboratorio

permitió validar el uso de tres marcadores fluorescentes, con propiedades espectrales

distintivas y diferentes sensibilidades iónicas, para estimar cambios en el VCA en células

individuales. Estos marcadores son: 1) la calceína, que permite medir cambios en el VCA,

independientemente de cambios en la concentración de iones nativos intracelulares, como

Ca2+, Mg2+ y H+, dentro de rangos fisiológicos y experimentales; 2) el fura-2, utilizado para

medir, simultáneamente, cambios en la [Ca2+]i y el VCA en una misma célula, y 3) el BCECF

(2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-6-carboxifluoresceina), que permite medir, en la misma célula,

cambios paralelos en el pHi y en el VCA.

Los cambios en el VCA estimados con calceína188,280 se infieren a partir del registro

obtenido de la excitación de este marcador en el punto máximo (487 nm) de su espectro de

excitación o en un punto cercano al mismo (~490 nm). Los cambios en el VCA estimados con

fura-2 y BCECF se calculan a partir de la excitación de los mismos en sus puntos isosbésticos

(PIs) respectivos, es decir en la región de su espectro de excitación que es insensible a

cambios en la concentración intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) ó de H+ (pHi), respectivamente, pero

que es sensible a cambios en la concentración del colorante. En nuestro laboratorio hemos

determinado que los PIs del fura-2 y del BCECF, in vivo, están centrados en 358 y 438 nm

respectivamente64,282. El fura-2 es óptimamente sensible a cambios en la [Ca2+]i cuando se

excita a 380 nm, y el BCECF lo es al pHi cuando se excita a 495 nm; los valores de [Ca2+]i y

pHi se obtienen a partir del cociente entre los registros de fluorescencia derivados de las

longitudes de onda sensibles a la [Ca2+]i ó al pHi, en cada caso, y los valores obtenidos de la

excitación de estos colorantes en sus PIs (es decir 380/340 nm y 495/438 nm, respectiva-

mente). En años recientes se publicaron varias investigaciones en las que se empleó al BCECF

como marcador simultáneo del pHi y del volumen celular283-286. Sin embargo, en dichos

trabajos la técnica no se validó, y los cambios en el volumen celular no fueron cuantificados.

La validación general de este método, incluyendo un análisis extensivo de las posibles relacio-

nes de interferencia entre las señales fluorescentes, fue presentada recientemente en un trabajo

de Tesis282.

43

3.5 Carga de las células con indicadores fluorescentes. Los experimentos se realizaron a

temperatura ambiente (21-25ºC) en células tomadas entre los pasajes 16-27 de replicación y

cultivadas de 3 a 7 días en medio de diferenciación. Por cada experimento un cubreobjetos con

células se retiró de su caja de Petri de cultivo y se montó en una cámara de Leiden; tras lavar

las células con solución de Krebs, la cámara se colocó sobre un soporte circular adosado a la

platina de un microscopio invertido de epi-fluorescencia (Diaphot-TMD, Nikon, Japón). A

través de la observación con microscopía de fase se seleccionan una o varias células (depen-

diendo del sistema de registro utilizado; ver a continuación), en las cuales se mide la fluores-

cencia endógena (autofluorescencia), que será sustraída posteriormente de los registros de

fluorescencia experimentales; en estas células se controla luego la evolución de la carga del

indicador fluorescente. En el sistema de fluorometría que emplea un monocromador y una

cámara digital (ver más abajo) los valores de autofluorescencia celular no difieren de la señal

que se obtiene, en ausencia de colorantes, fuera de las células; en este caso la fluorescencia

extracelular “de fondo” se registra a lo largo de todo el experimento, y estos valores se sustra-

en finalmente de los registros de fluorescencia correspondientes a cada medida experimental.

En todos los casos las células se incuban en solución de Krebs con los derivados esterificados

(AM, éster acetoximetilico) del BCECF (5-7 µM) ó de la calceína (2-4 µM) (ambos prove-

nientes de Molecular Probes, Eugene, OR, USA), tomados de una solución stock (BCECF 10

mM, calceína ~6,2 mM) en DMSO. La concentración final de DMSO en la solución de carga

es < 0,01%. La molécula AM conjugada con los distintos fluorocromos es altamente hidrofó-

bica (liposoluble) y por tanto permea fácilmente a través de la membrana plasmática. Una vez

en el interior celular, las esterasas endógenas hidrolizan al enlace éster dejando a la molécula

en su forma ácida, cargada, y por ende impermeante. La hidrólisis del éster también restituye

las propiedades fluorescentes del indicador, que no muestra en su forma esterificada. La

evolución de la carga de los indicadores se controla registrando continuamente su fluorescen-

cia intracelular. Una vez alcanzados los niveles de fluorescencia deseados (entre 400-1200

unidades arbitrarias de fluorescencia, ~40 minutos de incubación), se realizan 3 lavados de la

preparación con solución de Krebs y las células se dejan equilibrar durante 1 hora en esta

solución. Al término de esta incubación la cámara se perfunde durante unos minutos con

solución de Krebs, y a través del registro fluorométrico se evalúa la estabilidad de los niveles

44

Figura 8. Localización del área celular de registro de las señales fluorescentes. Fotomicrografía de células N1E-115 diferenciadas y cargadas con BCECF, vistas con microscopía de contraste de fase e iluminación de epifluorescencia. Los círculos centrados sobre las células indican el área típica de registro de las señales fluorescentes.

de fluorescencia celular. En función de esto último se realiza, si es necesario, una nueva

selección de las células que serán registradas, tras lo cual se procede al inicio del registro

experimental. Las soluciones experimentales se perfunden a una tasa de ~6,6 ml/min.; el 90%

del fluido de la cámara en el punto de registro se recambia en ~13 seg (n = 3).

3.6 Registro de las señales fluorescentes.

Area de registro celular. Una vez concluido el proceso de carga del indicador fluorescente, los

cambios en su concentración intracelular se registran en una pequeña región del soma de cada

una de las células (Fig. 8). Esta región circular abarca un 3-10% -típicamente unos 120 µm2-

del área celular y está delimi-

tada por una apertura circular

(mecánica o digital) a partir de

la cual se registra la fluorescen-

cia en el plano focal de la ima-

gen microscópica, como se

muestra en la Fig. 9. El plano

focal y la dispersión de luz por

arriba y por abajo del plano

focal quedan circunscritos den-

tro de los límites celulares,

espacio donde se registran los

cambios en la concentración de

los indicadores. La fluorescen-

cia se extenderá hacia arriba y

hacia abajo del plano focal dependiendo de la profundidad de foco del objetivo, la cual está

determinada, entre otros factores, por la apertura numérica (A.N.) y la magnificación del

mismo. Para un objetivo de 40X y A.N. = 1.3, como el que se utilizó en estos experimentos, la

profundidad de campo será de < 2 µm en una sola dirección en el eje z. Quiere decir que hay

un elemento óptico tridimensional, específicamente un doble cono de volumen de fluorescen-

cia de aproximadamente 4 µm de longitud total (Fig. 9).

45

DF

(m

)

Z

Z o+ DF

= Plano focal

Zo - DF

nA = 0,16nA = 0,4nA = 0,5nA = 0,95nA = 1,3

1000

100

10

1

.11 10 100 1000

MAGNIFICACION TOTAL

10007nAM

+ DF = 2nA2

T

nA = Apertura numérica

T Magnificación totalM = Longitud de onda=

La morfología y la amplitud de los registros dependen críticamente del tamaño y de la posi-

ción de la apertura circular. La apertura ideal, así

como el sitio de registro, han sido ampliamente

explorados en nuestro laboratorio como parte de

la validación de la técnica282. En el presente traba-

jo las mismas se ajustaron para disminuir, en lo

posible, eventuales distorsiones en el registro y

obtener una relación señal/ruido óptima.

Equipamiento. En el presente trabajo se utilizaron dos sistemas de registro de fluorescencia.

En ambos se utilizó un microscopio invertido de epi-fluorescencia (Diaphot-TMD, Nikon,

Japón) y un objetivo 40x/A.N 1.3 de inmersión en aceite (C-Fluor, Nikon, Japón).

En la Fig. 10 se muestra un esquema del equipo utilizado en los primeros experimentos del

presente trabajo (ej: experimentos de reemplazo de Na+ y Cl- externos; concentraciones fijas de

NH3 ó NH4+). En la segunda etapa del proyecto se adquirió un equipo nuevo, con mejores

especificaciones técnicas, basado en una cámara digital enfriada y un programa de computación

para imágenes que permitió hacer registros de varias células de manera simultá-nea (Fig. 11).

El funcionamiento y los elementos constitutivos principales del equipo de la Fig. 10 se resumen

a continuación: la luz de excitación proveniente de un arco de xenón de 150 W pasa a través de

un filtro de agua (para reducir la radiación infrarroja) y es luego divi-dida por un partidor de

rayo. Cada haz de luz pasa por un obturador electrónico de alta velo-cidad (UniBlitz D122,

Vincent Associates, USA) controlado por computadora. Acoplado a cada obturador se

encuentra un disco que contiene filtros de excitación (Omega, USA), que pueden

intercambiarse para delimitar los distintos espectros de excitación para cada indicador

Figura 9. Factores determinantes de la profundidad de foco del objetivo del microscopio. Parte superior: la fluorescencia registrada en el eje z (profundidad) está determinada por la profundidad de foco del objetivo (DF), que es inversamente proporcional a la apertura numérica del objetivo y a la magnificación del objetivo. Hacia arriba y hacia abajo del plano focal (Zo) la luz se dispersa formando dos conos invertidos. Parte inferior: relación entre la profundidad de foco y la magnificación total, para objetivos con diferentes aperturas numéricas.

46

Figura 10. Diagrama esquemático de la vía óptica y del equipamiento utilizado en los experimentos de microespectrofluorometría. Ver detalles en el texto principal.

fluorescente. Para excitar al BCECF, el haz de luz 1 pasa por un filtro de 495 ± 10 nm,

mientras que el haz 2 lo hace por uno centrado en 440 ± 10 nm (para registrar en el punto

isosbéstico). La calceína (un indicador que tiene un solo máximo de excitación) se excita

empleando un filtro de 495 ± 10 nm. Tras atravesar estos filtros los haces de luz se recombi-

nan por medio de un haz bifurcado de fibras ópticas de silicato. El haz combinado es colima-

do y acoplado al epi-iluminador del microscopio. Para reducir la fotodecoloración de los indi-

cadores y el daño fotodinámico de las células, la intensidad de la luz de excitación es atenuada

utilizando filtros de densidad neutral (generalmente se obtiene un 10-15% de transmisión

final). La apertura del diafragma de campo se cierra para limitar la iluminación a una sola

célula y la excitación del colorante se realiza cada 5 segundos, a través de la apertura y cierre

automático de los obturadores electrónicos; el tiempo de adquisición de la señal fluorescente

es de 130 ms en cada exposición. Un espejo dicromático (515 nm) y un filtro de emisión (535

± 13 nm) (ambos de Omega, USA) se situan en el portafiltros del microscopio, ubicado por

47

Figura 11. Diagrama esquemático de la vía óptica y del equipamiento utilizado en los experimentos de videomicroscopia de fluorescencia. Ver detalles en el texto principal.

debajo de los objetivos. La luz emitida pasa a través de una lente de acoplamiento 1x unida a

un diafragma accesorio (Microflex PFX, Nikon, Japón) que contiene una serie de aperturas

circulares de distinto diámetro (0,1-10 mm) que se utilizan para definir el tamaño de la zona

de registro de la señal. Esta última pasa por la apertura seleccionada y es medida con un foto-

multiplicador (Oriel Corporation, USA), digitalizada con un conversor A/D y finalmente

expuesta y almacenada en una computadora, utilizando un programa informático (RFLUO)

desarrollado en nuestro laboratorio, para este propósito, por el Dr. William Crowe.

En el equipo esquematizado en la Fig. 11, la fuente de luz consistió en un arco de xenón

de 75 W, mientras que los filtros de excitación, al igual que los obturadores electrónicos, se

reemplazaron por un monocromador (Optoscan, Cairn, UK), que permite controlar el ancho

de la banda de excitación para cada longitud de onda con una apertura mínima de hasta ± 2

nm. Con este sistema, el BCECF se excitó a 495 ± 2 a 5 nm y a 438 ± 3 a 7 nm, y la calceína

48

a 487 ± 2 a 4 nm; se registró cada 5 s, y el tiempo de excitación en cada exposición fue de 60-

100 ms. El haz de fibra óptica bifurcada se reemplazó por una fibra líquida, y el fotomultipli-

cador por una cámara digital (ORCA-ER C4742-95, Hamamatsu, Japón) cuyo ruido de

captura (read-out noise) es muy bajo (7-8 e) a una frecuencia de muestreo por pixel de 1

MHz. Este equipo se opera por medio de un programa informático comercial de adquisición

de datos (Metafluor 4.6r3, Universal Imaging, USA), con el cual se definen además las zonas

de registro celular y los tiempos de exposición para cada longitud de onda. El análisis de los

registros de fluorescencia se realiza posteriormente a través del programa de computación

Sigma Plot V.2.0 ó 2001 (Jandel Co., USA). Para las pruebas estadísticas se utilizó Microsoft

Excel 97-SR2 (Microsoft Co., USA).

3.7 Calibración osmótica de las células y conversión de la señal fluorescente en unidades

de volumen celular acuoso relativo. Para calibrar la respuesta osmótica de las células y

estimar los cambios en el VCA relativo producidos durante los diferentes tratamientos

experimentales utilizados, la fluorescencia relativa obtenida de la excitación del BCECF

(~440 nm) o de la calceína (~490 nm) se expresa como el cociente Fo/Ft, donde Fo es la fluo-

rescencia inicial, medida en estado estacionario, de una región celular delimitada por una

apertura circular determinada, en presencia de una solución ISO, con una presión osmótica

extracelular πo, y Ft es el valor de la fluorescencia (máxima ó mínima) cuando ésta alcanza un

nuevo estado estacionario, registrada a partir de la misma región circular, durante la exposi-

ción de la célula a una solución con una presión osmótica πt. Los pulsos de calibración, efec-

tuados al inicio de cada experimento, consisten en la aplicación secuencial de soluciones

ligeramente anisosmóticas (~342 y ~280 mOsm/KgH2O, es decir nominalmente 10% hiper e

hiposmolares, respectivamente, con respecto a la solución ISO), durante ~7 min., separadas

por un intervalo similar en solución ISO (Fig. 12A). En este rango de osmolaridades, por lo

general, no se disparan respuestas reguladoras y por lo tanto los cambios de volumen caen

dentro de una relación lineal, la cual una vez sustraida la fluorescencia de fondo corresponde

a las predicciones de la ecuación de van’t Hoff , como puede observarse en la Fig. 12.

49

La representación en

un eje de coordenadas

de la recíproca de los

cambios en la fluores-

cencia (Fo/Ft) en res-

puesta a los pulsos de

calibración, en función

de la recíproca de la

presión osmótica relati-

va del medio (πο/πt),

resulta, efectivamente,

en una relación lineal

que indica la correspon-

dencia entre cambios en

la fluorescencia y cam-

bios en la concentra-

ción intracelular del in-

dicador, reflejando a la

vez cambios en el VCA

(Fig. 12C). La pendiente de una regresión trazada sobre estos puntos arroja un valor menor

que 1, que es el esperado para un sistema con un comportamiento osmótico ideal, según la

ecuación:

Fo/Ft = πο/πt (6)

Esta desviación del comportamiento ideal se debe a la presencia de colorante unido a

componentes citosólicos (ej: proteínas) o “atrapado” dentro de organelos intracelulares. Esta

fracción del colorante se comporta como si fuera insensible a cambios en la osmolaridad

externa. Para convertir los cambios de fluorescencia en valores que expresen los cambios

efectivos de volumen celular acuoso, la fluorescencia de esta fracción de colorante “de fondo”

Figura 12. Calibración de la respuesta osmótica de las células N1E-115.A) Registro de los cambios en la fluorescencia producidos por dos pulsos de ~7 min de duración con soluciones anisosmóticas de osmolaridad nominal = 10% hiper y 10% hiposmótica (omolaridad medida: 9.1% hiper y 12% hipos-mótica) en células cargadas con BCECF, el cual fue excitado a 438 ± nm. B)Cambios en el VCA (Vt/V0) derivados de la conversión del registro de fluores-cencia mostrado en A. C) Cociente de la fluorescencia basal ( ) sobre la fluo-rescencia máxima ( ) y mínima ( ) registrados en presencia de las soluciones de calibración anisosmóticas, graficados en función de la recíproca de la osmolaridad externa. D) Valores de VCA relativo, Vt/Vo, correspondientes a los cocientes de fluorescencia graficados en C, en función de la recíproca de la osmolaridad externa.

F t/F0

(%)

96

98

100

102

104

π0/πt

0.8 0.9 1.0 1.1 1.2

F 0/F t

0.94

0.98

1.02

1.06

π0/πt

0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

V t/Vo

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

V t/V0

0.850.900.951.001.051.101.15

5 min 5 min

A B

DC

Fig. 12

50

(“Fbkg,” ó fluorescencia “background”) debe ser estimada y sustraída de la flourescencia total.

En células N1E-115 cargadas con colorantes fluorescentes (BCECF, calceína) la Fbkg se deter-

minó a través de la permeabilización selectiva de la membrana plasmática utilizando la alfa-

toxina de Staphylococcus aureus188. Esta toxina tiene la peculiaridad de abrir poros en la

membrana plasmática, que permiten la salida del colorante disuelto en el agua citosólica pero

no de aquél unido a proteínas u otros componentes de alto peso molecular. Tras la liberación

del colorante disuelto en el citosol a través de este procedimiento, la fluorescencia remanente

representa la Fbkg. Se ha demostrado que esta última corresponde al valor en la intersección

con el eje y de una recta trazada sobre una grafica de Fo/Ft vs. πο/πt (Fig. 12C), por lo que

dicho valor se adopta como Fbkg 280. Los cambios normalizados del VCA (Vt/Vo) se calculan a

partir de la siguiente ecuación:

[(Fo/Ft) - Fbkg] / (1 - Fbkg) = Vt/Vo (7)

La Fig. 12B muestra los cambios relativos en el VCA correspondientes a los registros de fluo-

rescencia durante los pulsos de calibración (Fig. 12A), tras aplicar la ecuación (7). El análisis

de los datos de fluorescencia se realiza en cada célula de manera individual, y una gráfica de

Vt/Vo versus πο/πt, que incluye los valores provenientes de los pulsos de calibración mencio-

nados, se construye para cada célula registrada. Cada célula presenta, así, sus valores particu-

lares de calibración osmótica (Fig. 12D). Como predice la teoría, una vez hecha la corrección

de Fbkg, los datos se ajustan a una línea recta que pasa por el origen (Fig. 12D), lo que implica

que las células siguen un comportamiento osmótico ideal (van’t Hoff), según la Eq. (6). Esto

es posible porque las soluciones ligeramente anisosmóticas con las que se realiza la calibra-

ción no disparan respuestas reguladoras del volumen.

3.8 Protocolo experimental. El protocolo experimental básico para el estudio de las respues-

tas de volumen y pH celular en el presente trabajo, tanto en presencia de diversos fármacos,

como al emplear sustitución de iones, consistió en exponer las células a un primer pulso

(control) con una solución de NH4Cl durante ~7 min., y tras un intervalo de 30-60 min en

solución ISO, someterlas a un segundo pulso (experimental) con una solución de NH3/NH4+

51

V t/V0

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

F 1/F

2

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2.0

hiper 10 %

hipo 10 % 20 mM NH4ClISO

10 min

(NH4Cl, excepto cuando se sustituyó el Cl-) cuya concentración fue igual a la del primer pulso

y que contuvo el agente farmacológico de prueba, o bien presentó una composición iónica

específica (por ej., sustitución de Cl- por gluconato). Con anterioridad a este pulso, y tras su

remoción, se aplicó una solución ISO similar a la del pulso experimental, pero sin NH3/NH4+.

Los valores resultantes del análisis de la respuesta inicial (control) se utilizan como referentes

para cotejar los cambios producidos durante la aplicación del segundo pulso, conteniendo el

tratamiento experimental (X). A continuación se esquematiza la secuencia general de desarro-

llo de los experimentos:

ISO → NH4Cl → ISO → ISO-X → NH3/NH4+-X → ISO-X → ISO

(Control) ---------- (Experimental)-----------.

3.9 Evidencia de que los cambios de fluorescencia producidos por el par NH3/NH4

+ no

son espurios. Uno de los problemas potenciales que presentan los marcadores fluorescentes es

la posible interferencia por algún com-

ponente intracelular exógeno o endó-

geno que pudiera producir cambios en

la intensidad de la fluorescencia que

podrían interpretarse como cambios en

la dilución del colorante atribuibles a

cambios en el volumen celular acuoso.

Para confirmar que los cambios del

VCA observados durante la aplicación

de NH3/NH4+ no son producto de tales

artefactos de técnica evaluamos,

Figura 13. Respuesta osmométrica de las células durante la exposición al par NH3-NH4+. Trazo superior:

Registro del cociente entre los valores de fluorescencia sensibles (F1) e insensibles (F2) al pHi, que denota los cambios en el pHi. Trazo inferior: cambios en el VCA. El registro se realizó en una célula cargada con BCECF y expuesta a pulsos con soluciones hiper e hiposmóticas (10%), aplicadas secuencialmente, según se indica, antes y durante la perfusión con una solución de 20 mM de NH4Cl.

52

variando la osmolaridad de las soluciones de NH4Cl, la posible relación entre los cambios de

pHi y la respuesta osmótica de las células. En la Fig. 13 (Pág. anterior) se muestra uno de estos

experimentos, en el que pueden apreciarse varias cosas: i) Es posible contrarrestar el aumento

de volumen producido por el acúmulo de un osmolito interno (ej: NH4+) por la aplicación de

una solución hiperosmótica. ii) Es posible potenciar el aumento de volumen producido por el

NH3/NH4+ aplicando una solución hiposmótica. iii) La aplicación de soluciones ligeramente

anisosmóticas, antes y durante el pulso de NH3/NH4+, no afecta el curso característico del pHi.

Esto prueba que los cambios observados en el VCA ante la aplicación NH3/NH4+ son reales e

independientes de posibles fenómenos de interferencia (“cross talk”) entre el PI y la longitud

de onda sensible al pH, es decir, 495 nm. iv) La fluorescencia “de fondo” (Fbkg) no se modifica

durante la exposición de las células al par NH3/NH4+, por lo que es válido realizar el análisis

de estas respuestas utilizando un mismo valor de Fbkg.

3.10 Corrección de la deriva y análisis de las señales fluorescentes. Las señales fluores-

centes para cada longitud de onda decaen en intensidad con el tiempo. Esta deriva puede

resultar daño fotodinámico ó fuga del colorante del interior celular. Cuando la deriva no es

lineal el experimento se elimina. Cuando es lineal (mayoría de los casos), se corrige trazando

una regresión lineal hacia la señal basal y multiplicando el valor de la pendiente obtenida por

el tiempo correspondiente a cada medida experimental. Los valores de deriva calculados

punto a punto son entonces sustraídos de los valores de fluorescencia originales, obteniéndose

el trazo de fluorescencia corregido. Este procedimiento es válido en el curso temporal de

nuestros experimentos, pues la fluorescencia decae linealmente en función del tiempo.

3.10.1 Análisis de los cambios en el VCA. Los parámetros medidos en la respuesta de volu-

men celular acuoso típica inducida por NH3/NH4+ se ilustran en la Fig. 14. La magnitud de la

DRVi (Fig. 14, f) se calculó a los 4 minutos de iniciada la respuesta de regulación utilizando

la siguiente fórmula:

=

−

−

−

1

1%

VoVtpico

VoVtreg

VoVtpico

DRVi x 100 (8)

53

en donde los términos ‘pico

Vt/Vo’ y ‘reg Vt/Vo’ repre-

sentan el pico máximo del

VCA (Fig. 15, a) y la frac-

ción del volumen regulado

(Fig. 14, f), respectivamen-

te. La magnitud de la DRVi

se expresa como porcentaje

de volumen regulado, medi-

do a los 4 min de iniciado

este proceso, y denota la

recuperación del volumen

hacia su valor inicial, V0,

tras alcanzarse el aumento

máximo inicial del VCA (Vt

= 100%). De este modo, un

%DRVi = 0 señala la ausen-

cia del fenómeno regulador,

mientras que un % DRVi = 100 indica una recuperación completa del volumen celular.

Utilizando los términos de la Fig. 14, el %DRVi se define como [(a − g) / a ] x 100.

3.10.2 Análisis de los cambios en el pHi. En la Fig. 15 se representan los cambios típicos que

se observan en el pHi de las células N1E-115 cargadas con BCECF al ser expuestas a pulsos

con NH3/NH4+ y se definen los puntos de registro referenciales para cotejar la respuesta

celular ante los distintos tratamientos experimentales.

La comparación entre las medias de los parámetros de VCA y pHi correspondientes a los

pulsos control y experimental con NH3/NH4+ se realizó a través de la Prueba t de 2 colas para

medidas independientes, y el límite de significación establecido fue p<0,05 (excepto para

algunas variables, según se refiere en la sección 4.3 de Resultados). Todas las medidas, referi-

das tanto al VCA como al pHi, se expresan como Medias ± error estandar de la media (EEM).

Figura 14. Nomenclatura usada para denotar los componentes de la respuesta de VCA producida por un pulso de NH4Cl. El esquema representa una respuesta celular típica. Las variables cuantificadas en torno a los cambios del VCA fueron: (a) magnitud relativa del aumento máximo (pico) de volumen (%); (b) tasa inicial del aumento de volumen (%/min); (c) tiempo al pico de volumen (en segundos); (d) duración del pico máximo de volumen (en segundos); (e) tasa inicial de la disminu-ción reguladora del volumen en medio isosmótico (DRVi; %/min); (f) magnitud de la DRVi a los 4 min de su inicio (%); (g) VCA tras 4 min del comienzo de la DRVi (%); (h) tiempo al pico de disminución de volumen (en segundos); (i) magnitud de la disminución de volumen (%); (j) tasa inicial del aumento regulador del volumen en medio isosmótico (ARVi; %/min).

54

3.11 Calibración del pHi. La calibración de las señales fluorescentes para su posterior con-

versión a valores de pHi se realizó, al término de cada experimento, a través de la aplicación

secuencial de pulsos de breve duración (2-3 min c/u) con soluciones isosmóticas con diferen-

tes pHs (5,8, 6,2, 6,6, 7,0, 7,4, 7,8, 8,2 y 8,6; Fig. 16A), conteniendo una alta [K+] (125 mM)

y 5 µM de nigericina (Sigma, USA), de acuerdo con la técnica descripta por Boyarsky y cola-

boradores287-289. La nigericina es un iónoforo selectivo al K+ y al H+, que se incorpora a la

membrana plasmática haciéndola permeable a estas dos cationes, de tal manera que el pHi se

equilibra con el pH externo en cada pulso de calibración. Esta substancia (de Sigma, USA) se

utilizó a partir de una solución madre (10 mM) disuelta en etanol.

El pHi se calculó a partir del cociente de los valores de fluorescencia obtenidos tras la

excitación alternativa a 495 y 440 nm (ó 495 y 438 nm, según el sistema empleado) a lo largo

del experimento; los promedios de los valores obtenidos en la “cola” de cada pulso de calibra-

ción (una vez que la señal logra estabilizarse; Fig.16A) se utilizan para construir, a través de

un programa informático (NFIT 1.1, University of Texas, USA), una curva de pH y obtener

los parámetros que se utilizarán para convertir los cocientes referidos a valores de pHi (Fig.

16B).

Figura 15. Nomenclatura para el análisis de los cambios en el pHi en células N1E-115 expuestas al par NH3/NH4

+. Se midieron: el pHi basal (t = 0); el pHi alcanzado durante el pico alcalino (t=1); el pHi inmediatamente previo a la remoción del pulso de NH3/NH4

+ (t=2); el pHi al pico acídico (t=3), y el pHi tras su recuperación y estabilización (t=4). La tasa de acidifi-cación del plateau (t=1→ t=2) se cal-culó trazando una regresión lineal sobre los valores de pHi registrados durante los primeros 2-3 min de este proceso. A través de este método los valores se ajustaron con un alto grado de correlación.

Fig. 9

55

Figura 16. Calibración del pHi. A) Registro experimental, en una célula individual, del cociente de las señales de fluorescencia derivadas de la excitación del BCECF a 495 y 440 nm al aplicar soluciones isos-móticas con distintos pHs, conteniendo 125 mM de K+ y 5 µM de nigericina. B) Curva de calibración del pHiobtenida a partir de los datos mostrados en (A).

El pHi se calcula por medio de la siguiente ecuación:

t

tai CFCF

CFCFpKpH−

−+=

max

minlog (9)

donde pKa es el pK del BCECF (=7,0) y CF es el cociente de fluorescencias (i.e. 495/438 nm): CFt, a cualquier punto experimental

CFmin, al valor de calibración más ácido CFmax, al valor de calibración más alcalino

3.12 Criterio de selección de las células para el análisis de los cambios en el VCA y en el

pHi. Para el análisis cuantitativo de los cambios en el VCA y el pHi se seleccionaron, entre las

células registradas durante los experimentos que conforman este trabajo, aquellas que reunie-

ron las siguientes condiciones: 1) pHi basal entre 6,8 y 7,4 al comienzo del pulso control con

NH3/NH4+; 2) evidencia de DRVi durante el pulso control con NH4Cl; 3) ausencia de fluctua-

ciones ó “ruido” excesivo en el registro de fluorescencia. Se excluyeron asimismo del análisis

aquellas células en que no fue posible obtener la curva de calibración del pHi al finalizar el

experimento.

pHi

495

/ 440

Btiempo (min)

110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160

495

/ 440

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4soluciones de calibración alto K+ / nigericina 5µM

pH 5.8

pH 6.2

pH 6.6

pH 7.0

pH 7.4

pH 7.8

pH 8.2

pH 8.6

A

56

3.13 Ventajas y desventajas de las técnicas fluorescentes. Las técnicas fluorescentes pre-

sentan ciertas ventajas sobre otros métodos de determinación del volumen celular en células

individuales, por cuanto: a) no son invasivas; los indicadores fluorescentes o “fluoróforos”

pueden introducirse al interior celular sin disrupción de la membrana plasmática, conjugándo-

los con un grupo éster hidrolizable. Esto último los hace altamente hidrofóbicos y por ende

permeantes; b) los registros de fluorescencia pueden calibrarse con soluciones experimentales

para obtener medidas de volumen relativo, de tal manera que cada célula sirve como si fuese

su propio “osmómetro” ; c) son especialmente adecuadas para estudiar células individuales, a

diferencia de otros métodos, que proveen estimaciones de cambios de volumen en poblacio-

nes celulares, que pueden no ser homogéneas, o no responder sincrónicamente a las alteracio-

nes osmóticas; d) pueden medir cambios de volumen en células de morfología compleja, inde-

pendientemente de cambios en la forma de éstas; e) poseen una resolución temporal (≥ 0.1

Hz) y una sensibilidad (~1%) muy superiores a las de otras técnicas existentes.

Entre las desventajas comunes a todos los indicadores fluorescentes del volumen celular se

encuentran: a) la unión o confinamiento a estructuras u organelos celulares; b) el daño foto-

dinámico; c) la posible fuga del colorante; en el caso de la calceína, por ejemplo, por la acción

de la glicoproteína P; d) la alteración de la señal por movimientos o cambios de forma de las

células, en el caso de los indicadores que tienen solo ún máximo de excitación y uno de

emisión. Entre las desventajas asociadas al uso del BCECF (así como a otros fluoróforos) se

cuentan: a) cambios en la intensidad de la fluorescencia debidos a la microviscosidad del

medio; b) cambios intracelulares en la sensibilidad espectral del indicador (posibilidad descar-

tada en base a estudios hechos con BCECF en nuestro laboratorio, para el rango de pHi explo-

rado)64,282; c) sensibilidad a sustancias exógenas, como el NPPB, o endógenas, como ciertos

metales pesados que producen “apagamiento” (quenching) de la señal fluorescente, lo cual

afecta especialmente al PI y conduce a lecturas erróneas del VCA. A este respecto, experi-

mentos efectuados en nuestro laboratorio permitieron estimar la magnitud del cambio en la

fluorescencia del BCECF en presencia de diversas concentraciones de NPPB. Dichos estudios

determinaron que las concentraciones de NPPB usadas en nuestros experimentos (10 µM) no

producen alteraciones en la fluorescencia.

57

3.14 Detección de la enzima glutamina sintetasa por el método de Western Blot. La

detección con anticuerpos de la enzima glutamina sintetasa en células N1E-115 y NG-108

(neuroblastoma x glioma) se llevó a cabo según el procedimiento descrito en la Ref. 290. Se

utilizó el anticuerpo primario policlonal (cabra) anti glutamina sintetasa (Santa Cruz Biotech-

nologies, USA, Cat. Nº sc-6640) en una dilución 1:800. La detección de este anticuerpo se

realizó con un anticuerpo secundario (burro anti cabra) conjugado con peroxidasa de rábano

(Sta. Cruz, Cat. Nº sc-2020), en una dilución de trabajo de 1:30.000.

58

4. RESULTADOS 4.1 Cambios paralelos en el volumen celular acuoso y en el pH intracelular producidos

por el par amonio/amoníaco en células de neuroblastoma. La Fig. 17 muestra los registros

simultáneos de los cambios en el volumen celular acuoso relativo (Vt/V0; trazo negro superior)

y en el pH intracelular (pHi; trazo inferior) en una célula (N1E-115) expuesta a un pulso (20

min de duración) con una solución isosmótica conteniendo 20 mM de NH4Cl. Se observan los

cambios esperados en el pHi: alcalización inicial (1p); fase de acidificación del plateau (2p);

acidificación “de rebote” (3p) y recuperación de la acidificación (4p). Simultáneamente con

estos cambios en el pHi, se observaron cambios en el VCA que consistieron en: un aumento

inicial del volumen (1v), seguido de una disminución reguladora (2v o DRVi). Al eliminar el

pulso de NH4Cl y regresar a la solución isosmótica se observó una disminución transitoria del

VCA (3v), seguida de una fase de recuperación (4v ó ARVi). Para caracterizar las respuestas

descritas se realizaron experimentos similares al ilustrado en la Fig. 17, en los que el pulso de

NH4Cl (20 mM) se aplicó durante ~7 min. En 61 células N1E-115 que llenaron los criterios de

selección descritos en la sección 3.12 de Materiales y Métodos se encontró que: 1) el aumento

máximo promedio del VCA (1v) fue de 18,5 ± 1,1%. El volumen aumentó a una tasa inicial de

372 ± 19 % min y el pico máximo se alcanzó en 38 ± 2 s. Las células permanecieron hincha-

das en este valor máximo durante 75 ± 7 s y a continuación mostraron DRVi. Esta respuesta

reguladora ocurrió a una tasa inicial de –7,3 ± 0,9 %/min, que fue calculada aplicando una

regresión lineal sobre los datos de VCA registrados durante los primeros ~2 min a partir de su

inicio. El porcentaje de volumen regulado (%DRVi) calculado a los 4 min de iniciado el fenó-

meno regulador fue de 26,3 ± 2%, valor expresado en relación con el valor del aumento

máximo inicial del VCA normalizado, esto es, considerado como del 100% (ver Fig. 14,

sección 3.10.1, Materiales y Métodos). Tras la remoción del pulso de NH4Cl el VCA se redujo

(3v) por debajo del volumen basal inicial, alcanzando un mínimo promedio de -7,4 ± 0,6 % (n

= 56). Esta disminución del VCA se completó en un tiempo de 92 ± 9 s, medido entre el ins-

tante en el que se eliminó el pulso de NH4Cl y aquél en que se alcanzó el valor mínimo. Esta

fase fue seguida de una recuperación parcial, a veces total, del volumen inicial (ARVi ó fase

4v). Las fases 3v y 4v se caracterizaron por su variabilidad. Así, una vez terminado el pulso

59

de NH4Cl, en 5 de las 61 células estudiadas el volumen simplemente retornó a su valor inicial,

en el que permaneció estable por varios minutos, o bien se estabilizó ligeramente por encima

del volumen basal. La tasa inicial del ARVi fue de 13 ± 1,9 %/min, y pudo medirse en 54

células.

Figura 17. Cambios paralelos en el VCA y en el pHi inducidos por 20 mM de NH4Cl en una célula N1E-115 cargada con BCECF. En los cambios de volumen celular acuoso, (Vt/Vo, trazo negro superior) y de pHi

(trazo negro inferior) que ocurren ante la aplicación y remoción de NH4Cl se distinguen típicamente 4 fases, que siguen un curso paralelo: ante la exposición a NH4Cl las células responden con un aumento rápido de pHi

(1p), debido a la entrada de NH3 y su protonación en el citosol. El pico de pHi antecede, en unos pocos segun-dos, al pico de aumento del volumen acuoso [(1v); Inserto]. Después de alcanzarse los valores máximos respec-tivos, tiene lugar una fase de acidificación gradual del citosol (2p), determinada por el influjo de NH4

+ y su disociación intracelular, dando lugar a la formación de NH3 e H+. Concomitantemente con esta fase, se obser-va una disminución reguladora del volumen (DRVi; 2v). Al retirar el pulso de NH4Cl el pHi disminuye rápida-mente (3p), alcanza un mínimo (ácido con respecto al pHi previo al pulso) y a continuación se recupera gra-dualmente (4p). Paralelamente, la célula se encoge (3v), desarrollándose a continuación un aumento regulador del volumen (ARVi; 4v) que tiende a restablecer el volumen inicial. Dado que, aún tras la alcalinización inicial, el pHi « pK de la reacción NH3+H+ ⇌ NH4

+, se favorece la formación y continua acumulación de NH4+ en el

interior celular. La [NH4+]i en función del tiempo, calculada con la ecuación 10 (Pág. 61) para éstas células,

se muestra con un trazo verde, superpuesto al trazo de Vt/Vo. Con un trazo rojo se expresa el cambio teórico del volumen celular en función del tiempo, si la célula no mostrara DRVi. Estos valores se calcularon con la ecua-ción 11 (Pág. 62), tomando en cuenta el aumento en la osmolaridad intracelular debido a la acumulación de NH4

+ y un hipotético anión acompañante (principio de electroneutralidad macroscópica). Aquí puede verse que el aumen-to inicial del VCA es sensiblemente mayor que el aumento predicho a través de estos cálculos.

V t/V

0

1.0

1.1

1.2

1.3

Vt/V

0

0.880.920.961.001.041.081.121.161.201.241.28

1v

2v

3v

4v

4p3p

1p

2p

5 min

NH4Cl 20 mM solución isosmótica (ISO)

[NH

4+ ] i (m

M)

20

25

30

35

40

pHi

6.2

6.4

6.6

6.8

7.0

7.2

7.4

tiempo (s)0 10 20 30 40 50 60 70

pHi

6.8

7.0

7.2

7.4

60

Cambios semejantes en el VCA, pero de magnitud inferior, se observaron al exponer las

células a concentraciones de 0,5 y 1 mM de NH4Cl (Fig. 18), más próximas a las encontradas

en condiciones fisiopatológicas

(ver sección 1.6.1 de la Introduc-

ción). Cambios de VCA similares

a los observados en células car-

gadas con BCECF ocurrieron tam-

bién en células cargadas con cal-

ceína, un indicador insensible al

pHi y con propiedades espectrales

distintas a las del BCECF (Fig.

19).

En cuanto a los cambios en el pHi, en las 61

células se obtuvieron los siguientes resultados:

pHi basal (pHi t=0, véase Fig. 15, Materiales y

Métodos) de 7,08 ± 0,02. Ante la exposición del

pulso de NH4Cl el pHi promedio alcanzó un valor

máximo (pHi t=1, correspondiente a la fase 1p en

la Fig. 17) de 7,49 ± 0,02. Estos valores repre-

sentan un incremento del pHi (∆pHi) de 0,41 ±

0,01 unidades de pH (u.pH). En consonancia con

las predicciones teóricas (ver sección 1.3.1,

Introducción), mientras más ácido fue el pHi

basal inicial, mayor fue el ∆pHi (observación no ilustrada). Tras la alcalinización inicial, la

acidificación intracelular subsiguiente (fase 2p) ocurrió con una tasa inicial (dpHi/dt) de -0,024

± 0,001 u.pH/min, calculada a partir de una regresión lineal (r > 0,9) ajustada a los valores de

pHi registrados durante los 2 ó 3 minutos que siguieron al pico alcalino. La disminución del

pHi durante el plateau de acidificación tuvo un curso temporal exponencial decreciente, que

tendió a hacerse asintótico hacia el final del pulso de NH3/NH4+. Inmediatamente antes de

Figura 19. Cambios en el VCA registrados en una célula cargada con calceína y expuesta a un pulso de 20 mM de NH4Cl. Los cambios en el VCA, así como su cinética, fueron comparables a los registrados en células cargadas con BCECF.

V t/V

0

0.900.951.001.051.101.151.201.25

20 mM

5 min

ISONH4Cl

Figura 18. Cambios en el VCA registrados en células cargadas con BCECF y expuestas a pulsos de 0,5 y 1 mM de NH4Cl. Los registros provienen de células diferentes. Las características gene-rales de la respuesta fueron semejantes a las observadas ante concentraciones más altas de NH4Cl.

V t/V

0

0.96

0.98

1.00

1.02

1.04

1.06

1.08

ISO

10 min

0,5 mM 1 mMNH4Cl NH4Cl

61

finalizar dicho pulso el pHi (pHi t=2) fue de 7,35 ± 0,02, lo cual representa una disminución de

~0.14 u.pH (en 7 min) con respecto al valor del pico alcalino inicial (pHt=1). La remoción del

NH4Cl resultó en una acidificación rápida y pronunciada (fase 3p), que llevó al pHi a un valor

mínimo (pHi t=3) de 6,74 ± 0,02, es decir ~0,34 u.pH por debajo del pHi inicial, registrado en

condiciones basales. Luego tuvo lugar una fase de recuperación (fase 4p) que se desarrolló a

una tasa inicial de 0,02 ± 0,002 u.pH/min. Tras ~30 min de iniciado el lavado con la solución

control (ISO), el pHi (pHi t=4) alcanzó un valor de 6,96 ± 0,06. Esta recuperación incompleta

del pHi después de la aplicación de un pulso de NH4Cl (20 mM) se presentó prácticamente en

todos los casos y ha sido descrita en muchos otros tipos celulares. Es decir, las células se van

acidificando conforme transcurre el tiempo de experimentación y esta acidificación se poten-

cia con la exposición y remoción repetida del NH4Cl, de tal manera que después de cada pulso

el pHi se recupera, pero el nuevo estado estacionario se alcanza a valores más ácidos que los

iniciales.

4.1.1 ¿Es posible explicar el aumento inicial del VCA por la acumulación intracelular de

NH4+? Como vimos en la sección 1.3.1 de la Introducción, la exposición de las células a una

solución conteniendo NH3/NH4+ resulta en el influjo rápido del gas NH3 que en el interior

celular se protona, generando NH4+ en concentraciones del orden milimolar que, por ende,

pueden ejercer efectos osmóticos significativos, cuya magnitud no ha sido determinada hasta

el momento. La primera pregunta que surge de las observaciones descritas es si la fase inicial

de aumento de volumen (1v) puede explicarse simplemente por la acumulación de NH4+ y un

co-ión cargado negativamente, que sería necesario para preservar la condición de electroneu-

tralidad macroscópica del interior celular. A partir de los valores de pHi registrados durante el

plateau de acidificación (2p) al aplicar un pulso de NH4Cl, usando la ecuación de Henderson-

Hasselbalch (Ec. 1, Introducción), es posible calcular la [NH4+]i que corresponde a cada valor

de pHi medido:

[NH4+]i = [NH4

+]o x 10 pHo – pHi (10)

donde [NH4+]o es la concentración extracelular de NH4

+, que para una solución 20 mM de

62

NH4Cl a 25ºC es de 19,77 mM (pK =9.25; pHo = 7.3). La [NH4+]i en función del tiempo se

muestra, para la célula ilustrada en la Fig. 17, con un trazo verde sobre el registro del VCA. A

su vez, conociendo la [NH4+]i para cada instante “t” y el valor inicial de la osmolaridad

intracelular (ver abajo), es posible estimar el cambio de volumen relativo (Vt/Vo) que teórica-

mente produciría la acumulación de NH4+ y un anión acompañante, en ausencia de respuestas

reguladoras del volumen:

0t

t)(

=

==)0(mosm/kgH

0mosm/kgHVV

i2

ti2

0

t (11)

Los cambios en el VCA predichos de este modo para cada instante se ilustran en la Fig. 17

(trazo rojo). La predicción del VCA durante su fase de ascenso inicial no puede realizarse

dado que el sistema no ha alcanzado la condición de equilibrio, es decir aquella en la que

[NH3]i = [NH3]o. Esta es una condición requerida para estimar la [NH4+]i utilizando la teoría

de Henderson-Halselbalch. Por otra parte, dado que el aumento de volumen producido por el

par NH3/NH4+ determina la dilución de los solutos intracelulares, el cálculo de la [NH4

+]i debe

corregirse en función de los cambios efectivos observados en el VCA. Esta corrección se

realizó multiplicando la [NH4+]i calculada para cada instante por los valores correspondientes

(es decir, coincidentes en el tiempo) del VCA. Tras esta corrección, la [NH4+]i estimada en las

61 células durante el pico máximo de aumento del volumen fue de 16,8 ± 0,9 mM. En ese

momento, el aumento medio en la osmolaridad intracelular debido a la acumulación de NH4+ y

de un hipotético co-ión monovalente debió ser, por tanto, de 16,8 × 2 = ~33,6 mosm/Kg H2O.

Si aceptamos, en virtud de la estabilidad previa del registro del VCA en solución ISO, que las

células están en equilibrio osmótico, es decir, que la osmolaridad intracelular al comienzo del

pulso es igual a la extracelular (311,4 ± 0,2 mosm/KgH2O; n = 61), el aumento referido en la

osmolaridad intracelular induciría un aumento máximo en el VCA de ~11% (Eq. 11), mientras

que el observado experimentalmente es de ~18%. Para explicar el aumento máximo de volu-

men observado (~18%) se requeriría de un incremento en la osmolaridad intracelular de ~57,6

mosm/KgH2O, que es ~1,7 veces mayor que el incremento calculado a partir de la [NH4+]i.

Dicho de otra manera, el aumento en la concentración de NH4+ y un anión monovalente

63

Figura 20. Aumento máximo observado ( ) y predicho (○) del VCA, en función de la [NH4

+]i. Datos de 61 células expuestas a 20 mM de NH4Cl. Ordenada: valores del pico máximo del VCA. Abscisa: [NH4

+]i calculada durante el pico máximo de pHi. Los datos del pico máximo observado ( ) se ajustaron con un polinomio de segundo grado. Este ajuste tiene solamente un valor descriptivo.

[NH4+]

i (mM)

5 10 15 20 25 30 35

VCA

max

(%)

05

10152025303540

explicaría un ~58% del aumento del volumen inicial observado (1v), lo cual sugiere que el

NH4+ no es el único osmolito intracelular que se acumula rápidamente, dando lugar al aumento

referido del VCA. En la Fig. 20 se grafican los

valores observados del aumento máximo del

VCA (círculos negros) en función de la

[NH4+]i, calculada para el aumento máximo de

pHi (pHi t=1), en las 61 células. La correlación

entre estas variables es alta (coeficiente de

correlación de Pearson, R = 0,8) y es estadís-

ticamente significativa (p << 0,001), lo cual

sugiere que la acumulación intracelular de

NH4+, si bien es insuficiente para explicar la

totalidad del aumento de volumen inicial

observado, es un determinante importante del

mismo. En la misma figura se grafica el

aumento teórico del VCA (círculos blancos) en

función de la [NH4+]i, según se explicó más arriba. Puede apreciarse la diferencia entre los

valores teóricos y los observados, con las implicaciones que ya se mencionaron.

Otra de las hipótesis planteadas en este traba-

jo postula que si el aumento inicial del VCA en

células expuestas al par NH3/NH4+ se debe a la

acumulación intracelular de NH4+, la amplitud

del aumento inicial del VCA debe ser mayor

cuanto menor es el pHi inicial de las células. Esto

se debe a que, a pHis más ácidos, la [H+]i es más

elevada y la formación de NH4+ (derivada de la

protonación de NH3) se ve incrementada. En la

Fig. 21 se grafica la amplitud inicial del aumento de VCA producido por 20 mM de NH4Cl en

función del pHi basal, en las 61 células. Una regresión lineal ajustada a los datos muestra que

existe, en efecto, una correlación significativa entre estas variables (R = -0,85; p << 0,0001).

Figura 21. Aumento máximo del VCA en función del pHi basal. Las células fueron expuestas a un pulso de NH4Cl (20 mM).

pHi t=0

6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4

VC

A m

ax (%

)

05

10152025303540

64

Figura 22. Cambios en el VCA y en el pHi en función de la concentración externa de NH4Cl. Células cargadas con BCECF fueron expuestas a pulsos con soluciones conteniendo 0,5, 1, 5, 10, 20 y 30 mM de NH4Cl aplicados de manera aleatoria. A) Valores del pico máximo de VCA observado ( )y predicho (○), graficados en función de la [NH4Cl]o. B)Cambio inicial de pHi (∆pHi) ( ) y de la [NH4

+]i (○) en función de la concentración externa de NH4Cl.

[NH4Cl]o (mM)0 5 10 15 20 25 30

VC

A m

ax (V

t/V0)

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

[NH4Cl]o (mM)0 5 10 15 20 25 30

∆pHi

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0

5

10

15

20

25

(9)(11)

(15)

(11)

(10)

(13)

[NH

4+ ]i (m

M)

A

B

4.1.2 El volumen celular cambia en función de la concentración externa de NH4Cl. Si los

cambios de volumen y pHi que resultan de la exposición de las células al par NH3/NH4+ se

debiesen a la entrada de NH3 ó NH4+, ó de ambas especies, la amplitud de los mismos debería

variar con la concentración externa del par NH3/NH4+. Con el objeto de probar esta hipótesis,

así como de ampliar nuestras observaciones acerca de la relación entre el VCA observado y el

predicho, se realizaron experimentos

encaminados a obtener “curvas dosis-

respuesta” aplicando a las células pul-

sos isosmóticos de soluciones conte-

niendo diferentes concentraciones de

NH4Cl (en mM): 0,5; 1; 5; 10; 20 y 30.

En cada experimento, el orden de los

pulsos de distinta concentración fue

aleatorio, para descartar posibles efec-

tos acumulativos o de interacción entre

las distintas dosis. Los pulsos tuvieron

una duración de ~2 min y estuvieron

separados por lavados de entre 15 y 30

minutos con solución ISO basal. En la

Fig. 22 se muestra la relación entre el

pico máximo del VCA observado

(círculos negros) y el predicho (círcu-

los blancos) en función de las concen-

traciones externas de NH4Cl. La Fig.

22B muestra la amplitud del cambio

inicial del pHi (∆pHi) registrada para

cada [NH4Cl], así como la [NH4+]i correspondiente al pico alcalino en cada caso. El análisis de

la gráfica mostrada en la Fig. 22A indica que para [NH4Cl]o ≥ 5 mM el aumento predicho del

VCA explica entre 37 y 48% del aumento observado, mientras que para [NH4Cl]o de 0,5 y 1

mM los valores predichos explican, respectivamente, sólo 23 y 30% de los picos observados.

65

4.1.3 Efectos diferenciales del NH3 y el NH4+ sobre el VCA y el pHi. Dado que en las

soluciones de NH4Cl coexisten el NH3 y el NH4+, que son un gas y un ión, respectivamente,

con propiedades físicoquímicas y de permeación distintas, cabe preguntarse ¿qué determina

los cambios de volumen, el NH3, el NH4+ ó ambas especies? Con el objeto de contestar a esta

pregunta se diseñaron los experimentos que se describen a continuación y que se basan en los

siguientes razonamientos. En primer lugar, la rápida alcalinización intracelular que se observa

en células N1E-115 expuestas al NH4Cl indica que éstas, como la mayoría de las células

estudiadas hasta el momento, son más permeables al NH3 que al NH4+. Segundo, dado que el

pK de la reacción NH3 + H+ ⇆ NH4+ es de 9,25 a 25ºC, para valores de pHi iniciales como los

observados en nuestros experimentos (entre ~6,8 – 7,4), el equilibrio de esta reacción favore-

ce, en unos dos órdenes de magnitud, la formación del ion NH4+. Si la permeabilidad de la

membrana plasmática al NH3 fuese, además, significativamente mayor que al NH4+, y la

acumulación de este ion a consecuencia de la protonación del NH3 entrante guardase relación

directa con la magnitud del aumento inicial de volumen, este último debería de variar ostensi-

blemente con la concentración externa de NH3 y no con la del NH4+. Para evaluar esta hipóte-

sis se realizaron experimentos empleando soluciones con NH4Cl en las cuales se varió la

[NH3] manteniendo constante la [NH4+] y viceversa. Esto se logró a través del ajuste del pH de

las soluciones siguiendo el procedimiento descrito en la sección 3.3 (Tabla I) de Materiales y

Métodos. Los experimentos se realizaron en células cargadas con BCECF, a las que se aplica-

ron de dos a cuatro pulsos de soluciones conteniendo distintas concentraciones de las especies

en cuestión. Cada pulso duró ~6 minutos y las soluciones se presentaron de manera aleatoria.

La Fig. 23A (Pág. siguiente) muestra los cambios en el VCA registrados en una misma cé-

lula tras la aplicación de dos pulsos consecutivos (P1 y P2) de NH4Cl en los que la [NH4+]o se

mantuvo constante (10 mM), mientras que la [NH3]o se incrementó de 0,05 mM en P1 a 0,22

mM en P2. Puede observarse que el aumento de volumen es marcadamente mayor en P2 que en

P1. La Fig. 23B muestra, en otra célula, los efectos sobre el VCA producidos por dos pulsos de

NH4Cl en los que ahora la [NH3]o permaneció constante (0,23 mM), disminuyendo la [NH4+]o

de 19,77 mM en P1 a 4,77 mM en P2. Puede observarse que, no obstante la diferencia en las

concentraciones externas de NH4+ en P1 y P2, la amplitud del aumento de volumen fue similar

en ambos pulsos. En todos los experimentos la osmolaridad de las soluciones fue la misma.

66

[NH3]o = 0,05 mMA

P1 P2

[NH3]o = 0,22 mM

B

pH 7.6

[NH4+]o Constante = 10 mM

[NH3]o Constante = 0.23 mM

5 min

10.05 mM NH4ClIsopH 7.0 pH 7.3

10.22 mM NH4Cl

Vt/V

0

0.80.91.01.11.21.31.41.5

20 mM

IsopH 7.3

NH4Cl NH4Cl pH 7.91

5 mM

[NH4+]o = 4,77 mM

Vt/V

0 P2P1

[NH4+]o = 19,77 mM

0.80.91.01.11.21.31.41.5

[NH4+]o (mM)

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35

VCA

max

(Vt/V

0)

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6[NH

4+]o = 10 mMA

n = 16

0 5 10 15 20 25 30 35

VCA

max

(Vt/V

0)

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6B [NH

3]o = 0,23 mM

n = 17

[NH3]o (mM)

La Fig. 24 reúne los

datos de una serie de

experimentos como los

descritos y ejemplifica-

dos en la Fig. 23. En (A)

aparece graficada la amplitud del pico máximo de volumen en función de la [NH3]o, cuando la

[NH4+]o se mantuvo constante (10 mM). Nótese que

la amplitud del pico inicial del VCA aumenta con la

[NH3]o. La gráfica en (B) muestra la amplitud del

pico máximo de volumen en función de la [NH4+]o

cuando la [NH3]o se mantuvo constante (0,23 mM).

Nótese la insensibilidad relativa de la respuesta ante

diferentes [NH4+].

Figura 23. Efectos de la concentración externa de NH3 y NH4

+ sobre el VCA.Registro de los cambios en el VCA en dos células expues-tas a dos pulsos de NH4Cl (P1 y P2) en los que se man-tuvo constante el NH4

+ (A) oel NH3 (B). Las concentra-ciones relativas de cada es-pecie se ajustaron alterando el pH de las soluciones, se-gún se indica para cada pul-so, manteniendo la osmolari-dad constante.

Figura 24. Efectos diferenciales del NH3 y el NH4

+ sobre la amplitud del aumento inicial del VCA. Amplitud del pico máximo de VCA en función de A) la [NH3]o, manteniendo la [NH4

+]o constante (10 mM) y B) la [NH4

+]o, manteniendo la [NH3]o constante (0.23 mM).

67

10.05 mM NH4ClIsopH 7.0 pH 7.3

[NH3]o = 0,05 mMA

P1 P2

[NH3]o = 0,22 mM

6.46.66.87.07.27.47.6

B

[NH4+]o = 19,77 mM

P1 P2

[NH4+]o = 4,77 mM

6.4

6.6

6.8

7.0

7.2

7.4

Iso

[NH4+]o Constante = 10 mM

[NH3]o Constante = 0.23 mM

5 min

pHi

pHi

10.22 mM NH4Cl

20 mM

IsopH 7.3

NH4Cl5 mM

pH 7.91 NH4Cl

Figura 25. Efectos de la concentración externa de NH3 y NH4+

sobre el pHi. A) Registro del pHi en una célula expuesta a pulsos consecutivos con [NH4

+]o constantes (10 mM) y [NH3]o variables. B) Registro del pHi en una célula expuesta a pulsos consecutivos con [NH3]o constantes (0,23 mM) y [NH4

+]o variables.

Los cambios en el pHi registrados simultáneamente con los cambios en el VCA mostrados

en la Fig. 23 se muestran en la Fig. 25. Como era predecible, de acuerdo con la hipótesis

expuesta, lo que sucede con el pHi es similar a lo que ocurre con el VCA, esto es, que la

amplitud de la alcalinización ini-

cial depende principalmente de

la [NH3]o (Fig. 25A) y no de la

[NH4+]o (Fig. 25B). En la Fig.

25B se aprecia, además, que

aunque la amplitud de las res-

puestas de pHi fue similar en

ambos pulsos, la pendiente de la

acidificación del plateau fue

más pronunciada en P1, en don-

de la [NH4+]o fue mayor. Esta

observación es consistente con

la hipótesis de que la entrada de

NH4+, siguiendo su gradiente de

concentración, y su ulterior

disociación en H+ y NH3 en el

interior celular determina, en

parte, la pendiente de acidificación del plateau. Puede verse además que la caída del pHi tras

la remoción del NH4Cl es más marcada en P1 que en P2. Esto sugiere que la acumulación

intracelular de NH4+ fue mayor en P1 que en P2, de tal manera que ante la remoción de los

respectivos pulsos de NH4Cl, se generaron más protones intracelulares en P1 que en P2.

En la Fig. 26 (Pág. siguiente) se grafica la amplitud de los incrementos iniciales del pHi

(∆pHi) registrados en estos experimentos, en función de: A) la [NH4+]o manteniendo constante

la [NH3] y B) en función de la [NH3]o, manteniendo constante la [NH4+]. Puede notarse que

cuando la [NH4+]o es constante (Fig. 26B), el ∆pHi aumenta de manera lineal con la [NH3]o, lo

cual está de acuerdo con la hipótesis de que la difusión pasiva de la base neutra NH3 es el

determinante primario del cambio inicial del pHi ante la exposición al NH4Cl.

68

Por otro lado, el efecto del influjo de NH4+ sobre el pHi se manifiesta en la relación

ilustrada en la Fig. 27, en la que se grafica la tasa inicial de la acidificación intracelular

(plateau; fase 2p), en función de la [NH4+]o, cuando la [NH3]o fue constante.

4.2 Estimación del flujo y de la permeabilidad al NH3. El flujo de NH3 a través de la

membrana plasmatica de las células N1E-115 expuestas a pulsos de NH4Cl, se calculó a partir

de la tasa inicial de aumento del pHi (dpHi/dt), registrada en los experimentos de dosis-

respuesta (sección 4.1.2; Fig. 22). Dado un pK de ~9,25 para el par NH3/NH4+, a pHsi ~7,

como los registrados para las células de los experimentos mencionados, menos de un 1% de

los iones NH4+ que ingresen a las células liberarán sus protones. En estas condiciones, es de

[NH4+]o (mM)

0 5 10 15 20 25 30 350.3

0.4

0.5

0.6

[NH3]o (mM)0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

∆ pH

i

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

∆ p

Hi

(3)

(3)

(4)

(4)

A

B

(4)

(4)(3)

(6)

[NH4+]

o = 10 mM

[NH3]o = 0,23 mM

Figura 26. Incremento inicial del pHi, (∆pHi) en células expuestas a pulsos con concentraciones fijas ó variables de NH3 y NH4

+. A). ∆pHi en función de diversas [NH4+]o, manteniendo constante la [NH3]o. B)

∆pHi en función de [NH3]o variables, manteniendo constante la [NH4+]o. La relación entre el ∆pHi y la [NH3]o

(en presencia de 10 mM de NH4+

o) puede describirse empíricamente por medio de la relación: ∆pHi ≊ [NH3]ox 1,38 + 0,22.

Figura 27. Tasa de acidificación intracelular (fase 2p) en función de la [NH4

+]o. Ordenada: tasa inicial de acidificación intracelular (-dpHi/dt). Absisa: concentra-ción de NH4

+ externo. La [NH3]o se mantuvo constante (0,23 mM).

[NH4+]o (mM)

0 5 10 15 20 25 30

_ dpH

/dt (

u.pH

/min

)

0.004

0.008

0.012

0.016

0.020

0.024[NH3]o = 0.23 mM

(4) (3)

(4)

(6)

69

Figura 28. Capacidad de tamponamiento intrínseco (βΙ) del pHi. Los valores de βI, se calcularon a partir del cambio de pHi regis-trado ya sea ante la remoción de pulsos bre-ves de NH4Cl (○) o ante la eliminación de NH4Cl en ausencia de Na+ ( ).

pHi

6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2

β Ι (m

M /

u.pH

i)

20

25

30

35

40

45

50

55

esperar que la entrada directa de NH4+ tras la exposición súbita al NH3/NH4

+ no incida signifi-

cativamente sobre el cambio inicial del pHi, el cual estará determinado, principalmente, por la

difusión pasiva del NH3. El flujo del NH3 a través de la membrana plasmática está dado por la

siguiente ecuación:

JNH3 = V/S x βi x dpHi/dt (12)

donde V/S es el cociente entre el volumen y la superficie celular‡, βI es la capacidad o poder de

tamponamiento intrínseco intracelular (véase sección 1.4, Introducción), expresado en

mM/u.pHi, y dpHi/dt es la tasa inicial de aumento

del pHi, calculada a partir de la pendiente obteni-

da de una regresión lineal de los valores de pHi en

función del tiempo. βI se define como

∆[NH4+]i/∆pHi y fue calculado a partir de la

amplitud de la acidificación registrada tras la

remoción de pulsos breves de 0,5, 1 ó 5 mM de

NH4Cl (tomados de los experimentos de dosis-

respuesta) en los cuales el pHi recuperó su valor

inicial, ó bien del ∆pHi registrado tras la remo-

ción de pulsos con 20 mM NH4Cl en ausencia de

Na+ externo (el método quizá más apropiado, ya que aquí la magnitud de la acidificación

intracelular no se ve limitada ó reducida por la actividad del intercambiador Na+/H+291. En la

Fig. 28 se muestran los valores calculados para βI en función del pHi, este último expresado

como el valor de pHi intermedio entre el pHi previo a la remoción del pulso de NH4Cl (pHi t =2)

y el pHi mínimo, acídico, alcanzado tras su eliminación (pHi t=3). Con círculos blancos se

representan los datos provenientes de los experimentos con pulsos breves de NH4Cl, y con

círculos negros aquellos obtenidos de los experimentos en ausencia de Na+ externo.

‡ Los valores de volumen y superficie se calcularon a partir del radio celular medido sobre microfotografías (tomadas de diversos experimentos) de células N1E-115 diferenciadas, considerando a las células como hemies-feras. Esta aproximación arrojó un radio celular de ~16 µm, y una relación V/S ≈ 3,6 µm (n = 26).

70

Tal como se observa en otros tipos celulares, puede verse que βI varía inversamente con el

pHi291-293. La pendiente de los datos graficados en la Fig. 28 tuvo un valor de -39,8 mM/u.pHi.

En la Fig. 29 se grafica el flujo de

NH3 en función de la [NH3]o. En el grá-

fico inserto se presentan las medidas

correspondientes a las concentraciones

más bajas de NH3 (correspondientes a

las concentraciones más bajas de

NH4Cl: 0,5 – 5 mM). La pendiente de la

recta trazada sobre estos valores (Inserto

Fig. 29), corresponde a la permeabilidad

de la membrana al NH3 (PNH3), estimada

en 3,8 x 10-3 cm/s.

En la Tabla III se presentan los valores de dpHi/dt, JNH3 y PNH3, estos últimos en µm/s,

calculados para distintas concentraciones externas de NH3/NH4+.

Tabla III. dpHi/dt, JNH3 y PNH3 en células expuestas a diferentes concentraciones de NH4Cl.

Los valores se expresan como Medias ± E.E.M.

[NH4Cl]o (mM)

dpHi/dt (u.pHi/min)

JNH3 (mmol/cm2.s)

PNH3 (µm/s) N

0,5 0,13 ± 0,01 2,8 x 10-8 ± 1,9 x 10-9 50,6 ± 3,5 9

1 0,28 ± 0,02 6 x 10-8 ± 3,5 x 10-9 53,9 ± 3,2 9

5 1,08 ± 0,05 2,3 x 10-7 ± 1,1 x 10-8 40,6 ± 1,9 10

10 1,7 ± 0,12 3,6 x 10-7 ± 1,8 x 10-8 32,9 ± 1,6 7

20 2,84 ± 0,19 4,8 x 10-7 ± 1,7 x 10-8 21,8 ± 0,8 10

30 3,49 ± 0,12 7 x 10-7 ± 3,4 x 10-8 21 ± 1 11

Figura 29. Tasa inicial de influjo de NH3 (JNH3) en función de su concentración externa. En el gráfico inserto se muestran, ampliados, los valores correspondientes a pulsos con 0,5, 1 y 5 mM de NH4Cl.

[NH3]o (µmol/cm3)0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35

J NH

3 (µm

ol /

cm2 .

s)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.060

5

10

15

20

25m = PNH3 = 3,8 x 10-5 cm/seg

71

Puede verse que la permeabilidad aparente al NH3 disminuye a medida que aumenta la

[NH4Cl]o, lo cual permite inferir que, conforme se incrementa la concentración relativa de

NH3/NH4+ externos, el aumento inicial del pHi se ve contrarrestado por la entrada de NH4

+ a las

células. Por ello, a menos que se bloquee la entrada de NH4+ a las células, las medidas de PNH3

son confiables sólo para concentraciones de NH4Cl en el rango bajo, como las que se muestran

en el inserto de la Fig. 29.

4.3 Reproducibilidad de la res-

puesta celular a los pulsos de

NH3/NH4+. El estudio de la repro-

ducibilidad en el tiempo de la res-

puesta de VCA y pHi ante estímu-

los repetidos es necesario para vali-

dar los efectos de tratamientos ex-

perimentales, tales como la substitu-

ción de iones y la aplicación de

fármacos inhibidores. En términos

generales, tanto la forma como la

cinética de los cambios en el VCA y

en el pHi en respuesta a soluciones

con NH3/NH4+ fueron comparables, aunque se observó cierta variabilidad, tanto en una misma

célula como entre células. Para estudiar la reproducibilidad de las respuestas ante exposiciones

sucesivas al NH3/NH4+ y establecer la validez del análisis comparativo frente a los diversos

tratamientos experimentales (ver sección 3.8, Materiales y Métodos), se realizaron experi-

mentos exponiendo células cargadas con BCECF a dos pulsos idénticos (P1 y P2), cada uno de

7 minutos de duración, con una solución isosmótica conteniendo 20 mM de NH4Cl. El inter-

valo de tiempo entre los dos pulsos fue de ~30 min., durante los cuales las células se perfun-

dieron con la solución ISO control. La Fig. 30 muestra un ejemplo de estos registros en una

célula sometida a este protocolo experimental.

Vt/V

00.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

10 min

pHi

6.6

6.7

6.8

6.9

7.0

7.1

7.2

7.3 pHi

7.06

7.10

7.14

7.18

7.22

P1P2

ISO*NH4Cl 20 mM* *

Figura 30. Exposición a dos pulsos consecutivos de 20 mM de NH4Cl en una célula cargada con BCECF. Trazo superior: registro del VCA. Trazo inferior: registro del pHi. La duración de los pulsos fue de 7 min y el intervalo entre ambos fue de ~30 min durante los cuales la células se perfundieron con solución isos-mótica control (ISO). La tasa de acidificación tras el pico alcali-no fue típicamente más pronunciada en P1 que en P2 (Inserto).

72

Puede observarse que los cambios en el VCA y el pHi en uno y otro pulso fueron similares.

Sin embargo, el análisis estadístico de las respuestas, utilizando la prueba t de dos colas para

datos apareados reveló diferencias significativas (p<0,05) en 3 de los 10 parámetros cuanti-

ficados para el VCA (Tabla IV). Estos tres parámetros, cuya descripción gráfica se muestra en

la Fig. 14 (Materiales y Métodos) fueron: el pico máximo de aumento del VCA, ‘a’, que fue

mayor en P2 que en P1; la tasa de aumento inicial del VCA, ‘b’, que fue menor en P2 que en P1,

y el tiempo de permanencia en el pico máximo, ‘d’, que fue mayor en P1 que en P2. Es impor-

tante resaltar que tras quitar el pulso de NH4Cl, el curso temporal del ARVi (Fig. 14, ‘j’) fue

muy variable, tanto en P1 como en P2. En términos generales, el ARVi fue más lento en P2. En

algunos casos la recuperación del volumen no fue completa, ó no ocurrió. Sin embargo, en los

casos en los que pudo medirse, las diferencias no fueron significativas.

Atendiendo a las diferencias encontradas para las respuestas de VCA en P1 y P2, el análisis

de los experimentos subsiguientes que se

muestran en este trabajo se realizó utilizan-

do la prueba t de dos colas, reduciéndose el

límite de confianza, α, a 0,01 para los pará-

metros a, b, y d.

En cuanto a los cambios de pHi, éstos

fueron similares en P1 y P2, en lo que respec-

ta a sus características generales, morfológi-

cas y cinéticas (Fig. 30, trazo inferior). Sin

embargo, existieron también diferencias

estadísticamente significativas entre uno y

otro pulso. Estas fueron: la amplitud inicial

del cambio de pHi (∆pHi, fase 1p, Fig. 17)

que fue mayor en P2 que en P1, y la tasa de acidificación intracelular (fase 2p, Fig. 17) que fue

menor en P2 que en P1. Estas diferencias se ilustran en la Fig. 31.

Figura 31. Amplitud del aumento inicial y tasa de acidificación del pHi ante la aplicación de dos pulsos consecutivos (P1 y P2) de 20 mM de NH4Cl.A) Aumento inicial del pHi (∆pHi). B) tasa inicial de acidificación intracelular (dpHi/dt). Ambos paráme-tros se grafican en función del pHi basal registrado antes de cada pulso. *p < 0,5; **p < 0,01; n = 15 para cada medida. Barras:E.E.M..

pHi 6.8 6.9 7.0 7.1

d pH/

d t (u

pH/m

in)

-0.030

-0.025

-0.020

-0.015 (t=0)

P1

P2

P1

P2

∆ pH

i

0.3

0.4

0.5

0.6

*

**

A

B

73

Tabla IV. Cambios en el VCA y el pHi tras la aplicación de dos pulsos sucesivos de NH4Cl.

Los valores se expresan como Medias ± E.E.M., prueba t para muestras apareadas. n = 15, excepto *n = 14; **n = 13. N.S., no significativo. #Porcentaje del aumento inicial del VCA (a) que puede explicarse por la acumulación intracelular de NH4

+ y un anión.

Las diferencias observadas en el ∆pHi están determinadas por el valor del pHi antes de

cada pulso. Reflejando la recuperación incompleta del pHi que ocurre tras la aplicación de un

pulso de NH4Cl, el pHi previo a la aplicación de P2 fue ~0,15 u.pH menor que el registrado

20 mM NH4Cl

Variable 1er Pulso 2do Pulso

a, pico máximo de aumento del VCA (%) 24 ± 1,2 26 ± 1,5 p < 0,05

b, tasa de aumento inicial del VCA, (%/min) 522 ± 15 487 ± 18 p < 0,05

c, tiempo al valor máximo del VCA, (s) 30 ± 4 25 ± 2 N.S.

d, tiempo estable del VCA en el pico máximo (s) 133 ± 14 87 ± 12 p < 0,05

e, tasa inicial de la DRVi, (%/min) -5,4 ± 0,5 -4,8 ± 0,8 N.S.

f, VCA regulado a 4 min. de iniciada la DRVi (%) 21,5 ± 1,8* 22,9 ± 2,9 N.S.

g, VCA a los 4 min de iniciada la DRVi, (%) 78,5 ± 1,8* 77,1 ± 2,9 N.S.

h, tiempo al pico de disminución del VCA, (s) 60 ± 13 63 ± 6 N.S.

i, disminución máxima del VCA, (%) 9,8 ± 0,9 8,7 ± 1,2* N.S.

j, tasa inicial del ARVi, (%/min) 10,6 ± 2** 6,4 ± 3** N.S.

pHi t=0 7,0 ± 0,02 6,85 ± 0,03

pHi t=1 7,43 ± 0,04 7,31 ± 0,04

∆pH [pHi (t=1) – pHi (t=0)] 0,43 ± 0,03 0,46 ± 0,03 p < 0,05

pHi t=2 7,28 ± 0,03 7,19 ± 0,03

pHi t=3 6,71 ± 0,03 6,61 ± 0,03

pHi t=4 6,9 ± 0,03 6,75 ± 0,03

Tasa de acidificación (u.pHi/min) -0,025 ± 0,003 -0,02 ± 0,001 p < 0,01

[NH4+]i al pico de VCA (mM) 19 ± 1,5 25,5 ± 2,7

Aumento de volumen predicho (%) 12,2 ± 1 16,4 ± 2

Volumen explicado (%)# 52,9 ± 5,7 69,3 ± 13

74

antes de aplicar el P1 (7,0 ± 0,02). En estas condiciones la mayor disponibilidad de protones

intracelulares produce un ∆pHi mayor, como lo predice la teoría (sección 1.3.1, Introducción).

En cuanto a las diferencias encontradas en la tasa de acidificación del plateau, las mismas

pueden atribuirse a que el pico alcalino fue mayor en P1 que en P2: a medida que el pHi se

acerca al pK de la reacción NH3 + H+ → NH4+, mayor es el gradiente electroquímico del NH4

+

dirigido hacia el interior celular.

Dadas estas diferencias entre los cambios de pHi en P1 y en P2, el límite de confianza

establecido para evaluar los posibles efectos de los tratamientos experimentales sobre el ∆pHi,

se estableció en α = 0,01, mientras que para la pendiente de acidificación del plateau fue α =

0,005, empleándose la prueba t de dos colas para datos apareados.

En líneas generales, el análisis comparativo de las respuestas intraexperimentales sugiere

que la variación entre respuestas sucesivas al NH3/NH4+ en células individuales es más bien

constante, y que la comparación de las mismas es, en principio, plausible. Por consiguiente, el

protocolo experimental de “dobles pulsos”, descrito en la sección 3.8 de Materiales y Méto-

dos, se utilizó, para explorar el efecto de diversos tratamientos experimentales sobre las

respuestas producidas por NH3/NH4+.

4.4 Otros posibles factores determinantes del aumento inicial del volumen celular acuoso

en células N1E-115 expuestas al NH3/NH4+. De acuerdo con nuestros cálculos teóricos, la

acumulación intracelular de NH4+ y un anión acompañante puede explicar ~60% del aumento

del VCA que se observa en células expuestas a 20 mM de NH4Cl (sección 4.1.1). Esto indica

que existe un 40% de aumento (equivalente a un incremento en la osmolaridad intracelular de

~24 mmol/KgH2O) que debe resultar de la acumulación intracelular de uno ó más osmolitos,

además de los dos mencionados. Esta acumulación adicional de osmolitos podría ocurrir, en

principio, a través de los siguientes procesos:

a) la síntesis de glutamina

b) el influjo neto de iones extracelulares (v.g. Cl- y/o Na+)

En las siguientes secciones se exploran estas posibilidades.

75

4.4.1 Síntesis y acumulación de glutamina. Muchas investigaciones proponen que el aumento

en la concentración cerebral de glutamina, un fenómeno común en diversos trastornos hiper-

amonémicos129,294-296, es la causa principal del edema cerebral que se observa, con frecuencia,

en estas condiciones118,297. La glutamina se sintetiza en el citosol a partir de NH3 y glutamato,

en una reacción catalizada por la enzima glutamina sintetasa (GS; Rx.1, Introducción), que

está localizada principalmente en los astrocitos. Diversos estudios señalan que la inhibición de

la GS con sulfoximetionina (MSO) previene ó atenúa el edema cerebral asociado con hipera-

monemia143,144,146. En estas observaciones se basa la “hipótesis glutaminérgica” del edema

cerebral secundario a hiperamonemia, que se expuso en la Introducción (sección 1.6.1).

Pruebas preliminares realizadas en nues-

tro laboratorio usando la técnica de Western

Blot indican que esta enzima se expresa en

células N1E-115 indiferenciadas, es decir,

que no han desarrollado propiedades y estruc-

turas neuronales específicas; Fig. 32). En

células N1E-115 diferenciadas (ver Fig. 8,

Materiales y Métodos) son aparentes, sin em-

bargo, una disminución en los niveles de GS

y un ligero desplazamiento en el peso mole-

cular de la enzima (Fig. 32). La GS se expre-

sa además en células de neuroblastoma-glio-

ma NG-108, indiferenciadas y diferenciadas,

que expresan características tanto neuronales

como gliales. En ambos tipos celulares la

expresión de la GS se vio abolida cuando las

células se cultivaron en medio sin glutamina

(Fig. 32). Aún cuando hacen falta experimen-

tos adicionales para determinar los posibles

cambios cuantitativos en la expresión de la GS conforme avanza la diferenciación celular, así

como los cambios que en apariencia ocurren en su peso molecular, se evaluó si la síntesis y

acumulación de glutamina, inducida por el NH3/NH4+ en células N1E-115 diferenciadas,

Figura 32. Detección de la enzima glutamina sintetasa en células NG-108 y N1E-115 por “Western Blot.” La expresión de GS se detectó en células indiferenciadas de ambas líneas celulares cultivadas en presencia de L-glutamina (+). En células diferenciadas, y en presencia de este ami-noácido, la expresión de GS se detectó en células NG-108, mientras que en células N1E-115 se obser-vó una banda más tenue y con un peso molecular ligeramente mayor al de un monómero de la enzi-ma. En ausencia de L-glutamina (-) la expresión de GS se abolió, tanto en células diferenciadas (NG-108) como indiferenciadas (N1E-115 y NG-108). La expresión de GS en las N1E-115 diferenciadas aún no ha sido evaluada en esta última condición. El registro es representativo de tres experimentos.

76

VCA

max

(%

de

resp

uest

a co

ntro

l)

0

20

40

60

80

100

120

140

160Control = 100%

1mM 3mM 5mM

*

MSO

(5)

(4)

(6)

podría explicar la diferencia entre el aumento observado y el aumento teórico del volumen

celular. Si este fuera el caso, el bloqueo de la síntesis de glutamina, como consecuencia de la

inhibición de la GS, debería resultar en respuestas al NH4Cl de menor amplitud que las obser-

vadas en los experimentos control. Para evaluar esta hipótesis, se sometió a las células a un

pulso control con NH4Cl (20 mM), aplicándose luego (durante 20-60 min) una solución ISO

conteniendo 1, 3 ó 5 mM de MSO. A continuación se aplicó un segundo pulso de NH4Cl (20

mM) conteniendo MSO a concentraciones iguales a las de la solución isosmótica. En 7 de los

15 experimentos, realizados en células individuales, no fue posible calibrar el pHi debido a

que las células murieron pocos minutos después de finalizado el pulso de NH4Cl-MSO. Esto

se observó con mayor frecuencia en células tratadas con 5 mM de MSO, lo cual sugiere que

este inhibidor ejerce efectos citotóxicos a estas concentraciones. En las células en las que pudo

estimarse el pHi, el MSO no afectó de manera aparente a esta variable. En la Fig. 33 se

muestran los efectos que tuvieron dosis distintas de MSO sobre el aumento máximo del VCA

producido por 20 mM de NH4Cl. El aumento del VCA se expresa como porcentaje de los

valores control (considerados como del 100%). Los efectos del MSO, a distintas concentra-

ciones, fueron muy variables. El aumento inicial del VCA fue significativamente menor al

control sólo en células tratadas con 1 mM de MSO. Sin embargo, en estas últimas el porcen-

taje de aumento del VCA atribuible a la acumulación intracelular de NH4+ más un anión

(como se explicó en la sección 4.1.1) fue menor al 100% (77,7%, versus 54,9% para el pulso

control (n=3). Esto sugiere que, aún cuando la síntesis de glutamina estuviese inhibida, duran-

te la exposición a NH3/NH4+ otros osmolitos,

aparte del NH4+ y un anión acompañante, se

acumulan en las células y contribuyen al

aumento del VCA.

Figura 33. Efectos del MSO sobre el aumento inicial del VCA en células expuestas a 20 mM de NH4Cl. Se muestra el porcentaje de aumento del VCA con respecto al control (100%) en células tratadas con 20 mM de NH4Cl en presencia de 1, 3 y 5 mM de MSO. El tiempo de incubación en MSO, antes del pulso de NH4Cl, no se correlacionó con los efectos posteriores de esta sustancia sobre el VCA. Barras: EEM. Líneas de puntos: EEM del control. *p<0,05. Entre paréntesis se indica el número de observaciones.

77

Los cambios en la concentración intracelular de glutamina se estudiaron, además, por

cromatografía líquida (HPLC) en células N1E-115 diferenciadas y expuestas a un pulso de

NH4Cl. También en estos experimentos la variabilidad observada fue muy grande y no pudie-

ron extraerse resultados concluyentes. Así, son necesarios más experimentos para comprobar,

de modo fehaciente, que la síntesis de glutamina contribuye al aumento del VCA que ocurre al

exponer células N1E-115 al par NH3/NH4+.

4.4.2 Influjo neto de iones. La acumulación intracelular de NH4+ que ocurre durante la exposi-

ción de las células al par NH3/NH4+ induce cambios osmóticos y eléctricos que pueden alterar

el flujo de iones a través de la membrana plasmática. Este flujo puede verse alterado, además,

por los cambios que ocurren en forma paralela en el pHi. En estas circunstancias, el influjo de

iones tales como el Na+ o el Cl- podría contribuir al aumento inicial del VCA, lo cual explica-

ría al menos una parte de la diferencia hallada entre los valores observados y predichos de

dicho aumento. Para evaluar esta hipótesis, las células fueron expuestas a un pulso inicial con

una solución isosmótica conteniendo NH4Cl (20 mM) con un complemento iónico normal

(control), y a un pulso posterior (pulso de prueba) con una solución conteniendo idéntica con-

centración de NH3/NH4+ en la cual el Cl- ó el Na+ fueron reemplazados, respectivamente, por

cantidades equimolares de gluconato y de n-metil-d-glucamonio (NMDG+), iones supuesta-

mente impermeantes a través de la membrana plasmática.

Efectos de la remoción de Cl- y Na+ externos sobre el volumen basal. En la generalidad de los casos, la perfusión inicial con una solución ISO nominalmente libre de Cl- ó Na+ indujo un descenso moderado y transitorio de la señal fluorescente, que puede inter-pretarse como un aumento del VCA (Fig. 34). En ausencia de Cl-

este aumento fue rápido y estuvo seguido de una disminución del volumen, mientras que en ausencia de Na+ el aumento fue más lento, observándose a continuación una recuperación del volumen basal. ISO

-6

-3

0

3

6

Cero Na+

Cero Cl-

5 min

∆VC

A (%

)

-6

-3

0

3

6 Fig. 34

78

1 2

VC

A m

ax(%

de

resp

uest

a co

ntro

l)

0102030405060708090

100110120

5 mM 20 mM

gluconato de NH4+

(8)(8)

Control = 100%

4.4.2.1 Substitución del Cl- externo por gluconato. Los cálculos del aumento teórico del volu-

men ante la exposición de las células al NH3/NH4+ contemplan, concomitantemente al aumen-

to en la [NH4+]i, un aumento paralelo y equivalente en la concentración intracelular de un

anión, de acuerdo con el principio de electroneutralidad macroscópica. El anión en cuestión

puede provenir del medio externo (exógeno), o del interno (endógeno). El Cl- es el anión inor-

gánico extracelular más abundante, tanto en los líquidos biológicos como en nuestras solucio-

nes experimentales. Por lo tanto, un influjo de Cl- ante la exposición al NH3/NH4+ podría con-

tribuir al aumento en la osmolaridad intracelular y consecuentemente al aumento del volumen

celular. Para evaluar esta hipótesis las células se expusieron a soluciones nominalmente libres

de Cl- conteniendo 5 ó 20 mM de gluconato de NH4+. Se analizaron 8 células para sendas

concentraciones. Antes de aplicar estos pulsos, las células se perfundieron con solución ISO -

Cero Cl- durante 5 min (para el caso de los pulsos con 5

mM de gluconato de NH4+), o durante ~15 min (para los

pulsos con 20 mM de gluconato de NH4+). En la Fig. 35

se grafican los valores del aumento inicial del VCA

registrados ante estos tratamientos, como porcentajes de

la respuesta control (100 ± E.E.M. %). Para los pulsos de

5 mM de gluconato de NH4+ el aumento del VCA fue

similar al control. La respuesta para los pulsos de 20

mM de gluconato de NH4+ mostró una disminución me-

dia del ~17 %. Sin embargo, la variabilidad

de la respuesta control fue tal, que tampoco

en estos casos la diferencia entre las medias

fue estadísticamente significativa.

En la Fig. 36 se muestra el registro del VCA en una célula expuesta a 20 mM de gluconato

de NH4+. En este último grupo de experimentos, la proporción de aumento del volumen que

pudo explicarse en función de la acumulación intracelular de NH4+ más un anión acompañante

fue de ~80% para el pulso control y de ~93% para el pulso aplicado en ausencia de Cl- exter-

no. Quiere decir que aún en ausencia de influjo de Cl- debe existir una acumulación intracelu-

Figura 35. Aumento máximo del VCA en células expuestas a 5 o 20 mM de gluconato de NH4+. Para cada concentración, el aumento promedio del VCA se representa como porcentaje del aumento medido para cada control (100%). Barras: EEM. Con líneas de pun-tos se indica el EEM (%) para cada control. Entre paréntesis se indica el número de observaciones.

79

Figura 36. Cambios en el VCA en una célula expuesta a NH4Cl en ausencia nominal de Cl- externo. Registro de una célula expuesta a un pulso control con NH4Cl (20 mM) y a un pulso con gluconato de NH4

+ (20 mM), precedido por la aplica-ción de ISO-Cero Cl-. La célula se cargó con BCECF.

V t/V

0

0.9

1.0

1.1

1.2

*NH4Cl 20 mM

10 min

Cero Cl-ISO * ****gluconato NH4

+ 20 mM

Figura 37. Registro de la fluorescencia (en el punto isosbéstico) en una célula cargada con BCECF y expuesta a un pulso control con NH4Cl y a uno de prueba con gluconato de NH4

+. El Cl- externo se eliminó de la solución ISO control ~30 s antes de la aplicación del pulso de prueba (gluconato de NH4

+ sin Cl-). Ante este último pulso, la disminución en la fluorescencia (que denota un aumento en el VCA) fue similar a la disminución observada durante el pulso control, lo cual indica que el VCA varió de manera semejante en ambos pulsos. Los pulsos de calibración (±10% anisosmóticos) se muestran a modo de referencia.

tiempo (min)0 50 100 150

Fluo

resc

enci

a (u

.a.)

500

550

600

ISO-Cero Cl-gluconato NH4

+20 mM hiper (10%)hipo (10%)

ISO ISO

NH4Cl 20 mM

ISO

ISO

lar de uno ó más aniones que representa ~46% del aumento del VCA (es decir, la mitad de

93%). La otra mitad puede explicarse por la acumulación de NH4+. En otra serie de experi-

mentos se observó que el aumento

inicial del VCA no se reduce de

manera evidente al eliminar el Cl-

~30 s antes de la aplicación del pul-

so conteniendo 20 mM de glucona-

to de NH4+ (Fig. 37). Por lo tanto,

parece improbable que el influjo de

Cl- sea un determinante importante

del aumento del VCA producido

por el NH3/NH4+. En contraste,

estos resultados sugieren que la

actividad del Cl- intracelular, tras la remoción del Cl-, podría influir en la magnitud del

aumento de volumen mediado por NH3/NH4+. Aunque es necesario aumentar la “n” de los

experimentos de remoción del Cl- externo, un mayor conocimiento del papel que juega el Cl-

en la respuesta de las células al NH3/NH4+ requerirá de experimentos adicionales, en los que se

midan, por ejemplo, el potencial de membrana y los cambios en la [Cl-]i.

80

4.4.2.2 Sustitución de Na+ externo por n-metil-d-glucamonio. El influjo de Na+ a través de

canales voltaje-dependientes, o de canales catiónicos no selectivos activados por la tensión de

la membrana (“stretch-activated channels”; SACs), como consecuencia de una despolariza-

ción o del aumento del VCA, respectivamente, podría ser uno de los mecanismos que contri-

buirían al aumento inicial del VCA ante la exposición de las células al NH3/NH4+. Para eva-

luar esta hipótesis se realizaron experimentos sustituyendo al Na+ de las soluciones experi-

mentales por el catión impermeante NMDG+. En 5 células cargadas con BCECF el aumento

promedio de VCA ante la aplicación de 20 mM de NH4Cl en ausencia de Na+ externo fue 14%

menor que el control, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa. Sin embargo,

dado que al aplicar pulsos consecutivos de NH4Cl el aumento del VCA es generalmente mayor

durante el segundo pulso, la disminución del pico de volumen observada en ausencia de Na+

podría significar que el Na+ contribuye, si bien modestamente, al aumento del VCA. La

proporción del aumento explicado en función de la acumulación intracelular de NH4+ y un

anión acompañante fue de ~65% para el pulso control y de ~94% para el pulso experimental,

en ausencia de Na+ externo. Al igual que en los experimentos en los que se reemplazó el Cl-,

es necesario aumentar el número de la muestra y medir otras variables afectadas por la

remoción de Na+ externo (Em; [Na+]i) para establecer la contribución definitiva de este ión al

aumento del VCA producido por el NH3/NH4+.

Efectos de la sustitución de Cl- y Na+ externos sobre el pHi. La Fig. 38 muestra los cambios de

pHi registrados durante la exposición de las células a soluciones isosmóticas con 20 mM de

NH4Cl (control) y a un pulso de prueba conteniendo 20 mM de NH3/NH4+ en los que se reem-

plazó el Cl- (trazo superior), ó el Na+ (trazo inferior) por gluconato y NMDG+ respectivamen-

te.

a) Remoción del Cl- externo. La eliminación del Cl- en la solución ISO, antes de aplicar el

pulso de gluconato de NH4+ produjo una alcalinización gradual del citosol (Fig. 36A). La

amplitud de este incremento de pHi, medida tras ~15 min. de perfusión con ISO Cero Cl- e

inmediatamente antes de la aplicación del pulso con gluconato de NH4+, fue de 0,15 ± 0,04

u.pH (n = 8). Al aplicar esta última solución el ∆pHi (fase 1p) promedio fue menor que el

81

control, pero la diferencia no fue

significativa (p = 0,051). Tanto la

tasa de acidificación (fase 2p), en

presencia continua de gluconato de

NH4+, como la magnitud de la caída

del pHi tras su remoción (fase 3p),

fueron similares al control. La tasa

inicial de recuperación del pHi (fase

4p) tampoco se vió afectada en tér-

minos estadísticos.

b) Remoción del Na+ externo. La

aplicación de la solución ISO – Cero

Na+ indujo una acidificación gradual

del citosol (Fig. 38B), que puede

atribuirse claramente a la inhibición

del intercambiador Na+/H+, descrito

en estas células266. La cinética de

esta acidificación mostró, para diferentes células, una apreciable variabilidad. Esta observa-

ción, ilustrada en la Fig. 39, sugiere que la actividad de este sistema de transporte en células

diferentes es heterogénea. A los ~15 min de eliminarse el Na+ externo, la acidificación media

alcanzó una amplitud de 0,16 ±

0,07 u.pH (n = 5). En este nue-

vo estado basal, tal como lo

predice la teoría, el ∆pHi indu-

cido por la aplicación de 20

mM de NH4Cl fue mayor al

control, aunque esta diferencia

no fue estadísticamente signifi-

cativa.

pHi

6.00

6.25

6.50

6.75

7.00

7.25

7.50

10 min

0-Na+Na+

Figura 39. Efectos de la remoción del Na+ externo sobre el pHi. Se muestran, superpuestos, los registros del pHi en 3 células expuestas a dos pulsos de NH4Cl (20 mM) aplicados en presencia (líneas delgadas) y en ausencia (líneas gruesas) de Na+ externo.

Figura 38. Efectos de la sustitución de los iones extracelula-res Cl- y Na+ sobre los cambios de pHi producidos por NH3/NH4

+. Las células se cargaron con BCECF y se expusieron a un pulso inicial (control) con NH4Cl (20 mM) tras el cual se aplicó (A) un pulso con 20 mM de gluconato de NH4

+ (Cero Cl-) ó (B) un pulso con NH4Cl (20 mM) en el que el Na+ se sustituyó por NMDG+ (Cero Na+). Antes de cada pulso de prueba las célu-las se perfundieron con solución ISO deprivada de Cl- ó Na+.

pHi

6.06.26.46.66.87.07.27.4

pHi

6.4

6.6

6.8

7.0

7.2

7.4

A

B

Cero Cl-

Cero Na+

*NH4Cl 20 mMISO **

*NH4Cl 20 mM **gluconato NH4+ 20 mM

ISO * **

10 min

10 min

82

Figura 40. Cambios en el VCA y en el pHi en una célula expuesta a soluciones anisosmóticas (± ~11%) y a un pulso isosmótico con 20 mM de NH4Cl. Trazo superior: registro de los cambios en el VCA. Trazo inferior: registro de los cambios en el pHi. Los cambios inducidos por los distintos tratamientos se muestran superpuestos para facilitar su comparación. Nótese la ausencia de respuesta reguladora del volumen para las soluciones anisosmóticas.

ISO

Vt/V

0

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

pHi

6.0

6.6

7.2

7.8

NH4Cl 20mM

hiper 11.4%hipo 11.1%

5 min

La tasa de acidificación del plateau (fase 2p) durante este pulso fue, en promedio, mayor que

la del control, pero tampoco en este caso la diferencia resultó estadísticamente significativa.

Al eliminar la solución de NH4Cl libre de Na+, la amplitud de la acidificación intracelular fue

más pronunciada que la del pulso control. En esta instancia la recuperación del pHi (y del

VCA; fenómeno no ilustrado) se vio notablemente inhibida, tornándose evidente, como se

aprecia en las Figs. 38B y 39, tras la reincorporación del Na+ a la solución ISO control.

4.5 Factores determinantes de la disminución reguladora del volumen en células expues-

tas a soluciones isosmóticas conteniendo NH3/NH4+. Como se describió más arriba (sección

4.1; Fig.17, trazo de VCA), durante la exposición de las células a soluciones con NH3/NH4+, la

fase de expansión inicial del volumen (1v) es seguida de una fase de disminución reguladora

(2v), que por ocurrir en condiciones isosmóticas denominamos DRVi. A continuación se eva-

lúan algunos de los posibles factores determinantes de este proceso.

4.5.1 Cambios en la tensión mecánica de la

membrana celular. Si la capacidad de regu-

lar el volumen celular fuese consecuencia de

cambios en la tensión aplicada a la membra-

na por la expansión o la reducción del volu-

men, se esperaría que expansiones (o reduc-

ciones) del volumen, cuantitativamente simi-

lares, pero inducidas por medios diferentes,

fuesen seguidas de respuestas reguladoras

semejantes. En la Fig. 40 se muestran regis-

tros del VCA (trazos superiores) y del pHi

(trazos inferiores) en una célula expuesta

83

a soluciones anisosmóticas (trazos grises) y a una solución isosmótica conteniendo 20 mM de

NH4Cl (trazos negros). Puede observarse que la amplitud inicial de los cambios del VCA ante

la exposición a medios hipo- e hiperosmóticos fue similar a la producida por la aplicación y la

remoción de la solución con NH4Cl. Sin embargo, la regulación del volumen sólo ocurrió ante

el pulso de NH4Cl. En la misma figura puede observarse que el tratamiento con NH3/NH4+

indujo los cambios característicos en el pHi, mientras que las soluciones ligeramente anisos-

móticas no produjeron cambios en éste. Estos resultados demuestran que los cambios en la

tensión de la membrana plasmática per se no son suficientes para disparar la respuesta regula-

dora del volumen en células N1E-115. Sin embargo no invalidan la posibilidad de que los

cambios en la tensión de la membrana, en conjunción con otros producidos por el NH3/NH4+

(ej: cambios en el pHi), pudieran explicar la respuesta reguladora.

4.5.1.1 Efectos de la inhibición de canales no selectivos a cationes, activados por aumentos en

la tensión de membrana plasmática, sobre la DRVi. La activación de canales activados por

estiramiento mecánico de la membrana plasmática (SACs) se describió en células N1E-115

tras aumentos relativamente grandes del volumen, producidos por estímulos hiposmóticos de

~40%250 (ver recuadro III, sección 1.7.4.1, Introducción). De acuerdo con ese estudio, la

entrada de cationes vía

SACs causa una despola-

rización que conduce a la

activación de conductan-

cias al Cl- y al K+, a tra-

vés de las cuales ocurre la

DRV. Para evaluar el pa-

pel de los SACs en la

DRVi que ocurre al expo-

ner células N1E-115 al

NH3/NH4+ se aplicaron pulsos con NH4Cl (5 o 20 mM) conteniendo 100 µM de gadolinio

(GdCl3). El ión Gd3+ inhibe, si bien con baja selectividad, la apertura de SACs en diversos

tipos celulares298,299. La Fig. 41 muestra los cambios en el VCA en una célula expuesta a una

solución con 5 mM de NH4Cl y 100 µM de GdCl3.

Figura 41. Efectos de la inhibición farmacológica de SACs sobre los cambios de VCA producidos por NH3/NH4

+. Tras la aplicación de un pulso control con NH4Cl (5 mM), la célula (cargada con BCECF) se perfundió con solución ISO conteniendo GdCl3 (100 µM). Luego se aplicó un pulso de prueba con NH4Cl (5 mM) conteniendo idéntica concentración de GdCl3. Nótese el bloqueo de la DRVi durante el pulso de prueba.

Vt/V

0

0.940.981.021.061.101.14

ISO***NH4Cl 5 mM GdCl3 100 µM

5 min

*** ***

84

1 2

% d

e in

hibi

ción

de

la D

RV

i

0102030405060708090

100

5 mM 20 mM NH4Cl

**** (6)

(9)GdCl3 100 µM

La incorporación del GdCl3 en la solución ISO control, ~5 min antes del pulso de prueba,

produjo un ligero aumento en el volumen basal (4,3 ± 0,8%; n = 15). Al aplicar el pulso de

NH4Cl en presencia de GdCl3, se observó el bloqueo de la DRVi. En células expuestas tanto a

5 como a 20 mM de NH4Cl, el aumento inicial del VCA en presencia de Gd3+ fue similar al

control (datos no mostrados). En contraste, ante una y otra

concentración de NH4Cl, el Gd3+ inhibió de manera parcial ó

completa la DRVi. En la Fig. 42 se representa la magnitud

de esta inhibición, en relación con el porcentaje de DRVi

medido en condiciones control (100%), para las dos concen-

traciones de NH4Cl estudiadas.

4.5.2 Magnitud de la expansión inicial: relación entre la amplitud del aumento inicial del VCA

y la DRVi. Cuando las células N1E-115 son expuestas a soluciones hiposmóticas, la respuesta

reguladora (DRV) se observa, por lo general, tras aumentos del volumen superiores a ~25%.

Un trabajo previo hecho en nuestro laboratorio muestra que en soluciones hiposmóticas que

producen expansiones relativamente grandes, por arriba del 25%, la tasa inicial de la DRV está

relacionada con la magnitud del aumento inicial de volumen, de tal manera que a mayores

expansiones mayor es la tasa de regulación197. Cabe preguntarse, por lo tanto, si la regulación

del VCA tras aumentos isosmóticos como los producidos por el par NH3/NH4+, se relaciona de

igual manera con la magnitud de la expansión inicial del volumen. Si esto es así, es posible

que durante aumentos de volumen, tanto en medios hiposmóticos como isosmóticos, la detec-

ción y corrección subsecuente de tales cambios ocurra a través de mecanismos comunes. Esto

es importante ya que la naturaleza de los cambios de volumen es diferente en uno y otro caso:

en el medio hiposmótico el aumento de volumen está generado por un influjo inicial de agua,

mientras que en las soluciones isosmóticas primero hay un aumento de la osmolaridad intra-

celular, seguido del influjo de agua. En la Fig. 43 se grafican: A) el porcentaje de volumen

regulado (DRVi, parámetro f, Fig. 14) y B) la tasa inicial de la DRVi (dVCA/dt;

Figura 42. Inhibición de la DRVi en células expuestas a NH4Cl (5 ó 20 mM) en presencia de Gd3+. Se representa el porcentaje de inhibi-ción de la DRVi con respecto a los valores control (DRVi = 100%). Barras: EEM. **p<0,01. Entre paréntesis se indica el número de observaciones.

85

Figura 43. Relación entre la DRVi y la magnitud del aumento inicial del VCA. Datos provenientes de células cargadas con BCECF y expuestas a 20 mM de NH4Cl. El porcentaje de VCA regulado a los 4 min de iniciada la DRVi(A) y la tasa inicial de la DRVi (B) se grafican en función del aumento inicial del VCA.

VCA max (%)5 10 15 20 25 30 35 40

DR

Vi (%

)

0

10

20

30

40

50 A

B

5 10 15 20 25 30 35 40

dVC

A/dt

- D

RVi

(%/m

in)

-20

-15

-10

-5

0

n = 58R = 0.28

R = -0.46n = 58

parámetro e, Fig. 14), en función del aumento

máximo del VCA (parámetro a, Fig. 14) en 58

células§. Puede verse que tanto la magnitud

porcentual del VCA regulado (A) como la velo-

cidad inicial de la DRVi (B) se relacionaron

inversamente con el aumento máximo inicial del

VCA. Es decir, la DRVi ocurrió en general más

rápidamente, y alcanzó, tras 4 min de iniciada,

una magnitud mayor en células que sufrieron un

aumento inicial del volumen menor. En ambos

casos la correlación fue estadísticamente signifi-

cativa (p<0,001 en A; p<0,05 en B). Estos resul-

tados sugieren que las células responden al

aumento de volumen de manera diferente, según

éste resulte de la acumulación primaria de NH4+

(y otros osmolitos), o de un influjo de agua

secundario a una disminución en la osmolalidad

extracelular. A continuación se exploran otros

factores que podrían afectar la regulación del

volumen en estas células.

4.5.3 Alteraciones osmóticas resultantes del influjo de NH4+. Al considerar la observación

precedente resulta lógico presumir que la regulación del VCA observada en nuestros experi-

mentos con NH4Cl guarda relación con los efectos, directos o indirectos, del par NH3/NH4+

sobre los mecanismos o procesos que median la detección, la transducción y/o la corrección de

los cambios de volumen en las células. Específicamente, podemos postular que la magnitud y

la cinética de la respuesta osmoreguladora pueden estar relacionadas con la magnitud del

influjo de NH4+ y/o de su acumulación intracelular a causa de la protonación del NH3. Este

fenómeno favorece, como se mencionó, un aumento en la osmolaridad intracelular y afecta

§ En las gráficas que muestran la correlación entre los diversos parámetros del VCA y el pHi se eliminaron aque-llos datos que se apartaron en más de 2 desviaciones estandar de la media poblacional. Por eso, el número de observaciones en estas gráficas es < 61, el número total de células caracterizadas.

86

además diversos parámetros fisiológicos, entre ellos el pHi, la fuerza iónica, el potencial eléc-

trico y, de manera previsible, el metabolismo

celular. En la Fig. 44 se grafican la magnitud de la

DRVi (A) y la tasa inicial de la DRVi, dVCA/dt (B)

en función de la tasa de acumulación intracelular

concomitante de NH4+, dNH4

+i/dt, estimada a par-

tir de las pendientes del pHi (fase 2p) medidas en

cada célula. La correlación entre las variables de

DRVi examinadas y la tasa de acumulación intra-

celular de NH4+ no fue significativa.

Por otro lado, es posible que la regulación

del VCA esté determinada por la magnitud de la

acumulación inicial de NH4+ (u otros osmolitos)

durante el aumento inicial del VCA y no por la

tasa de acumulación subsecuente de los mismos.

En la Fig. 45 se grafica el porcentaje del VCA

regulado (DRVi), a los 4 min de exposición a 20

mM de NH4Cl, en función de la [NH4+]i calculada

al momento del pico máximo de aumento del pHi. Puede verse que existe una correlación

negativa, débil pero significativa (p<0,01), entre la magnitud de la DRVi y la [NH4+]i inicial.

Es decir, la amplitud de la DRVi tiende a ser

mayor cuanto menor es la [NH4+]i calculada al

pico de aumento del VCA. Esto podría significar,

en principio, que la acumulación intracelular de

NH4+ inhibe la regulación del volumen. Es posi-

ble, sin embargo, que estas variables no estén

relacionadas causalmente, sino que la correlación

descrita refleje efectos del pHi (a partir del cual

se estima la [NH4+]i) sobre los mecanismos de

regulación del volumen celular. A continuación

se evalúa esta posibilidad.

[NH4+]i (mM)

5 10 15 20 25 30 35

DR

Vi (%

)

0

10

20

30

40

50

60

n = 58R = -0.36

Figura 45. Magnitud de la DRVi en función de la concentración intracelular de NH4

+ medida al pico de la alcalinización (pHit=1). La magnitud de la DRVi tiende a ser menor cuando la acumula-ción inicial de NH4

+i es más alta.

d[NH4+]i/dt (mM/min)

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

d VCA

/d t -

DRVi

(%/m

in)

-20

-15

-10

-5

0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

DR

Vi (

%)

0

10

20

30

40

50

A

B

n = 58R = -0.13

n = 57R = -0.12

Figura 44. Relación entre la DRVi y la tasa inicial de acumulación intracelular de NH4

+. Células cargadas con BCECF se expusieron a un pulso de 20 mM de NH4Cl. El porcentaje del VCA regulado a los 4 min de iniciada la DRVi (A) y la tasa inicial de la DRVi (B) se grafican en función de la tasa inicial de acumulación intracelular de NH4

+ (d[NH4+]i/dt).

87

Figura 47. Tasa inicial de la DRVi (dVCA/dt) en función de la tasa de acidifi-cación del plateau (dpHi/dt). La correlación entre estas variables, calculada a través de una regresión lineal simple, fue débil pero signifi-cativa (p<0,005).

dpHi/dt (u.pHi/min)-0.05-0.04-0.03-0.02-0.01

dVC

A/dt

- D

RV

i (%

/min

)

-12

-8

-4

0

R = 0.38 n = 55

4.5.4 Cambios en el pH intracelular. Las variacio-

nes en el pH intra y/o extracelular modulan la

actividad de numerosos canales iónicos y sistemas

de transporte de solutos a través de la membrana

(Ver sección 1.4 de la Introducción). Por lo tanto,

es válido suponer que la DRVi observada durante

la exposición a NH4Cl pueda estar influenciada

por los cambios paralelos que ocurren en el pHi.

En la Fig. 46 se grafica la magnitud de la DRVi

en función del pHi basal, previo a la exposición a

20 mM de NH4Cl (A), y del pHi registrado tras su

aplicación, durante el pico alcalino (B). En ambos

casos puede verse que la magnitud de la DRVi es

mayor a pHs alcalinos, siendo la correlación sig-

nificativa en ambas instancias [p<0,0001 (A);

p<0,01 (B)].

En la Fig. 47 se grafica la tasa inicial de la

DRVi, dVCA/dt en función de la tasa de acidifica-

ción del plateau, -dpHi/dt (fase 2p), registrada concomitantemente. La correlación entre estas

variables también fue significativa (p < 0,005).

En términos generales, estos resultados

muestran que los parámetros que definen la

DRVi se correlacionaron de manera más marca-

da con los valores absolutos (pHi basal y pHi al

pico) y cinéticos (dpHi/dt) del pHi, que lo que lo

hicieron con la acumulación inicial y la tasa de

influjo de NH4+. En síntesis, estas observacio-

nes indican que cuanto más alcalino es el pHi

inicial, menor es el aumento del VCA pro-

ducido por el NH3/NH4+, menor la acumula-

ción inicial de NH4+

i y mayores la tasa y la

pHi t=1

7.2 7.4 7.6 7.8 8.0D

RVi

(%)

0

10

20

30

40

50

60pHi t=0

6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4

DR

Vi (%

)

0

10

20

30

40

50

60 A

B

n = 58

R = 0.54

n = 58R = 0.36

Figura 46. Magnitud de la DRVi en función del pHi. Se grafica el porcentaje de DRVi medi-do a los 4 min de iniciada la regulación, en fun-ción de: A) el pHi basal (previo al pulso de 20 mM de NH4Cl; pHi t=0) y B) el pHi registrado al pico alcalino (tras la aplicación de NH4Cl; pHi

t=1), en células cargadas con BCECF.

88

magnitud de la DRVi. Si bien estas observaciones permiten suponer un papel modulador del

pHi sobre la DRVi observada en células expuestas a NH3/NH4+ en medios isosmóticos, son

necesarias más observaciones experimentales para concluir que estos efectos están relacio-

nados causalmente.

4.5.5 Posible eflujo electrodifusional de Cl- y K+ durante la DRVi. En un vasto número de

tipos celulares, la inducción experimental de un aumento de volumen en medio hiposmótico

(≥40%) resulta en una DRV que se desarrolla principalmente a través del eflujo pasivo, neto,

de Cl- y K+. Para estudiar la posible participación de flujos iónicos a través de vías electro-

difusionales (canales de Cl- y de K+) en la DRVi que se observa en células N1E-115 expuestas

a NH3/NH4+, se realizaron experimentos incorporando inhibidores farmácológicos de estas

vías de transporte a soluciones conteniendo 5 ó 20 mM de NH4Cl**. La participación de cana-

les aniónicos en la DRVi se evaluó mediante la aplicación de NPPB (10 µM), un potente

inhibidor de conductancias al Cl-300. La participación de canales de K+ en la DRVi se estudió

utilizando el ión Ba2+ (como BaCl2, 1 mM), un inhibidor de amplio espectro de esta clase de

canales. En la Fig. 48 se muestran registros representativos de los cambios del VCA obser-

vados en células expuestas a 5 mM de NH4Cl ante cada uno de estos tratamientos. En células

expuestas ya sea a 5 ó a 20 mM de NH4Cl, la magnitud del aumento inicial del VCA en

presencia de NPPB fue similar al control. En contraste, como se muestra en la Fig. 49, ante

ambas concentraciones de NH4Cl la DRVi subsiguiente se vio fuertemente inhibida. Más aún,

en algunos casos, como el ilustrado en la Fig. 50, la DRVi se invirtió. La exposición a pulsos

con 5 mM de NH4Cl en presencia de Ba2+ indujo una reducción de ~26% en el aumento inicial

del volumen, con respecto al control (p<0,05). Ante este tratamiento, la DRVi mostró

asimismo una inhibición significativa de ~46% (p<0,05). Estos resultados se muestran en la

Fig. 51.

** Los resultados que se muestran provienen de una serie acotada de experimentos y representan observaciones iniciales que deben ser ampliadas y profundizadas aumentando el número de observaciones y evaluando otros inhibidores. El número de células analizadas, es decir aquellas en que la respuesta de volumen y pHi se cuanti-ficó, fue, en todos los tratamientos experimentales, bastante inferior al número de células registradas. Sin embargo, en aquellas células que no fueron analizadas, ya sea porque no pudo calibrarse el pHi al terminar el experimento, o porque la deriva de la señal de fluorescencia que denota los cambios en el VCA fue tal que impidió un análisis preciso de los datos, los efectos observados fueron, la mayoría de las veces, consistentes con los resultados presentados.

89

Vt/V

0

0.94

1.00

1.06

1.12

ISO

5 min

NPPB 10 µM*** ******NH4Cl 5 mM

Vt/V

0

0.92

0.96

1.00

1.04

1.08

1.12

5 min

ISO *** ******NH4Cl 5 mM Ba2+ 1 mM NH4Cl

2 1

% d

e in

hibi

ción

de

la D

RV

i

0102030405060708090

100110

5 mM 20 mM

*** ***(11)

(8)

NPPB 10 µM

Figura 48. Efectos de la inhibición independiente de conductancias al Cl- y al K+ sobre los cambios de VCA producidos por el NH4Cl. Tras la aplicación de un pulso control con NH4Cl (5 mM), se aplicó un pulso de prueba con idéntica concentración de NH4Cl conteniendo 10 µM de NPPB (trazo superior), un inhibidor de canales anióni-cos, ó 1 mM de BaCl2 (trazo inferior), un inhibidor gene-ral de canales de K+. Ambas sustancias tuvieron efectos inhibitorios sobre la DRVi.

Figura 49. Inhibición de la DRVi en células expuestas a NH4Cl (5 ó 20 mM) en presencia de NPPB. Se representa el porcentaje de inhibición de la DRVi con respecto a los valores control (DRVi = 100%). Barras:EEM. ***p<0,001. Entre paréntesis se indica el número de obser-vaciones.

Figura 51. Inhibición del aumento inicial del VCA y de la DRVi en células expuestas a 5 mM de NH4Cl en presencia de Ba2+.Los valores expresan el porcentaje de inhibi-ción con respecto al valor control (=100%) medido para cada parámetro. * p < 0,05. Entre paréntesis se indica el número de observaciones.

% d

e in

hibi

ción

0102030405060708090

100

*

*

(6)

(6)

aumento VCADRVi

Ba2+ 1 mM

V t/V

0

0.94

1.00

1.06

1.12

1.18

iso

NPPB 10 µMControl

3 min

NH4Cl 20 mM

Figura 50. Cambios en el VCA en una célula expuesta a NH4Cl (20 mM) en ausencia (Control) y en presencia de NPPB (10 µM). Puede obser-varse la inversión de la DRVi durante el pulso de NH4Cl conteniendo NPPB.

90

4.5.5.1 Efectos de los inhibidores de conductancias al Cl- y al K+ sobre el pHi. En la Fig. 52A

se ilustran los cambios de pHi registrados en una célula expuesta a 20 mM de NH4Cl en

ausencia (control) y en presencia de NPPB (10 µM). En la mayoría de las células registradas,

la incorporación del NPPB a la solución control (ISO) produjo una acidificación moderada del

citosol. En presencia del NPPB el ∆pHi inducido por el NH4Cl (5 ó 20 mM) no difirió del

control. Sin embargo, la tasa de

acidificación del plateau fue signi-

ficativamente mayor al control

(p<0,05) en células expuestas a 20

mM de NH4Cl pero no en células

expuestas a 5 mM de NH4Cl. Los

efectos del NPPB sobre el pHi son

consistentes con la entrada de este

ácido a las células y su posteror

disociación, resultante en un

aumento en la [H+]i. Reflejando

este aumento aparente en la per-

meabilidad de la membrana plas-

mática a H+, en células expuestas

a 20 mM de NH4Cl y NPPB la

tasa inicial de la fase de ascenso

del pHi (1,75 ± 0,09 u.pH/min) fue

significativamente menor al con-

trol (2,32 ± 0,13; p < 0,001; n=8).

En la Fig. 52B se ilustran los

cambios de pHi registrados en una

célula expuesta a NH4Cl (5 mM)

en ausencia (control) y en presencia de Ba2+ (1 mM). La incorporación de BaCl2 a la solución

ISO control no indujo cambios en el pHi basal, durante el intervalo de tiempo (~5 min) que

precedió al pulso de NH4Cl (5 mM). Al aplicar este último, el aumento inicial del pHi fue

significativamente mayor, y la tasa de acidificación del plateau significativamente menor, que

Figura 52. Efectos de los inhibidores de conductancias al Cl-

(NPPB) y al K+ (Ba2+) sobre los cambios de pHi producidos por NH4Cl. A) Registro del pHi en una célula expuesta a pulsos con NH4Cl (20 mM) en ausencia (control) y en presencia de NPPB (10 µM). B) Cambios en el pHi ante la aplicación de pulsos con NH4Cl (5 mM) en ausencia (control) y en presencia de BaCl2 (1 mM). Los pulsos de prueba (en presencia de NPPB ó Ba2+) estuvieron prece-didos por la aplicación (durante ~5 min) de soluciones ISO conte-niendo estos inhibidores. Inserto: Se muestran, superpuestos, los cambios de pHi (expresados como ∆pHi) para el pulso control y el experimental (1 mM Ba2+). Puede verse que el ∆pHi fue mayor y la tasa de acidificación del plateau fue menor al control durante el pulso con Ba2+.

pHi

6.8

7.0

7.2

7.4

7.6

ISO

A

NPPB 10 µM*

** NH4Cl 5 mM

pHi

6.8

6.9

7.0

7.1

7.2

7.3

7.4

Ba2+ 1 mM

*

10 min

*NH4Cl 20 mM

ISO ****

10 min

B5 min

∆pHi

-0.2-0.10.00.10.20.30.4

91

Ba2+Control

dpH

i/dt (

u.pH

i/min

)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

***(7)

(7)

los valores control. Estos efectos son consistentes con una probable inhibición del influjo de

NH4+ a través de canales de K+. Las diferencias señaladas se ilustran en la sección siguiente

(Fig. 53).

4.6 Posibles vías de transporte del NH4+.

a) Canales de K+. Numerosos estudios en células

de mamíferos indican que el NH4+ puede atrave-

sar la membrana plasmática a través de canales

de K+. Los resultados obtenidos al emplear Ba2+

son consistentes con esta hipótesis. Ante la

aplicación de NH4Cl (5 mM) en presencia de

Ba2+ (1 mM) se observó que:

i) El ∆pHi fue significativamente mayor al

control (p<0,0001; Fig. 53), lo cual se esperaría

si el influjo de NH4+ en esta instancia se viera

atenuado.

ii) La acidificación del plateau se redujo

significativamente (Fig. 53), aún en células que

al ser expuestas a NH4Cl alcanzaron un pico alcalino similar o superior al registrado durante el

pulso control (ver Fig. 52B, Inserto). Esto es consistente con la inhibición del influjo de NH4+.

iii) La tasa inicial de alcalinización intracelular fue significativamente mayor al control,

(Fig. 54) lo cual es consistente con una reducción en el

influjo concomitante de H+ (NH4+) en esta fase.

Figura 53. Efectos del Ba2+ sobre la amplitud del aumento inicial del pHi (∆pHi) y sobre la tasa de acidificación del plateau en células expuestas a NH4Cl (5 mM). Los valores control (○) y experimentales [en presencia de Ba2+, (●)]se expresan en función del pHi basal previo a cada pulso. Barras horizontales: EEM. del pHibasal. Barras verticales: EEM. de las variables dependientes correspondientes. ***p < 0,001; **** p < 0,0001.

pHi 6.806.856.906.957.007.05

d pH/

d t (u

.pH/m

in)-0.015

-0.010

-0.005

∆ pH

i

0.18

0.20

0.22

0.24

0.26

0.28

(t=0)

****

***

n = 7

ControlBaCl2 1 mM

Figura 54. Efectos del Ba2+ sobre la tasa de ascenso del pHi en células expuestas a NH4Cl (5 mM). La tasa inicial de aumento del pHi (dpHi/dt) se calculó a partir de una regresión lineal ajustada a los datos correspondientes a la fase de ascenso inicial del pHi (1p). *** p<0,001. Entre paréntesis se indica el número de observaciones.

92

P1 P2 Control

*(11)

(11)

Bum 10 µM

dpH

i/dt (

u.pH

i/min

)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0(15)(15)

pHi 6.70 6.75 6.80 6.85 6.90 6.95

dpH

/dt (

u.pH

/min

)

-0.026

-0.022

-0.018

-0.014

∆pHi

0.36

0.38

0.40

0.42

0.44

0.46

(t=0)

****

***

n = 11

ControlBumetanida 10 µM

b) Posible influjo de NH4+ a través del cotransportador de Na+,K+,2Cl-. El transporte de NH4

+

a través del triple cotransportador de Na+,K+, 2Cl- (NKCC) ocurre, de manera importante, en

ciertos segmentos de los túbulos renales. (Fig. 2C, Introducción). Para evaluar si el transporte

de NH4+ en células N1E-115 tiene lugar a través

del NKCC, se realizaron experimentos en los que

las células fueron expuestas a un pulso control

con NH4Cl (20 mM) y a un pulso de prueba con

idéntica concentración de NH4Cl al que se agre-

gó 10 µM de bumetanida, un inhibidor de este

cotransportador. En presencia de bumetanida,

tanto la tasa inicial de la alcalinización intracelu-

lar, como el ∆pHi, fueron significativamente

mayores que los valores control. La tasa de

acidificación del plateau, por el contrario, fue

significativamente menor que

el control. Estos efectos, que

se ilustran en las Figs. 55 y 56,

sugieren que parte del influjo

de NH4+ que tiene lugar en

presencia de NH3/NH4+ ocurre a través del NKCC. A partir de estas evidencias preliminares,

son necesarios experimentos adicionales para determinar en qué medida contribuyen al trans-

porte de NH4+ los canales de K+ y el cotransportador NKCC.

Figura 56. Efectos de la bumetanida sobre la tasa de alcalinización intracelular en células expuestas a NH4Cl (5 mM). La tasa de aumento del pHi (dpHi/dt) se calculó a partir de una regre-sión lineal ajustada sobre los datos correspon-dientes a la fase de ascenso inicial del pHi (1p), ante la exposición al NH4Cl. A modo de compara-ción, se ilustran los valores respectivos registrados durante la aplicación de pulsos dobles (P1 y P2) con 20 mM de NH4Cl. Barras: EEM. * p < 0,05. Entre paréntesis se indica el número de observa-ciones.

Figura 55. Efectos de la bumetanida sobre la amplitud del aumento inicial del pHi (∆pHi) y sobre la tasa inicial de acidificación del plateau en células expuestas a NH4Cl. Los valores control (○) y experimentales [en presencia de bumetanida, (●)] se expresan en fun-ción del pHi basal previo a cada pulso. Barras horizontales: EEM del pHi basal. Barras verticales: EEM de las variables dependientes.

93

5. DISCUSION

En el presente trabajo se demuestra que la exposición de células neurales en cultivo al par

amoníaco-amonio (NH3/NH4+) induce, además de las alteraciones previstas en el pHi, cambios

definidos en el VCA. Estos cambios se midieron empleando una técnica fluorométrica, refina-

da y validada en nuestro laboratorio, basada en las propiedades bioquímicas y espectrales

características del BCECF, que permiten la medición simultánea del VCA y del pHi a partir

del registro de cambios en la fluorescencia de este indicador, en puntos definidos de su espec-

tro de excitación64,280,282,283; sección 3.4, Materiales y Métodos). La validez de las observacio-

nes aquí descritas depende de la confiabilidad de la técnica usada. Por ello, antes de discutir la

cinética y los mecanismos de los cambios en el VCA y el pHi, así como su importancia biofísi-

ca y fisiopatológica, se considera brevemente la confiabilidad del método.

5.1 El método mide cambios fidedignos en el pHi y en el volumen celular acuoso de célu-

las individuales. Varias pruebas experimentales indican que los cambios en el VCA observa-

dos al exponer a las células al NH3-NH4+ son reales, es decir, no son artefactos del método.

Estas pruebas son: 1) los cambios en el pH, tanto in vivo (intracelular) como in vitro, no alteran

la fluorescencia del BCECF en el punto isosbéstico (438 nm), a partir del cual se infieren los

cambios en el VCA. Es decir, no hay interferencia entre las señales indicadores del VCA y del

pHi; 2) los cambios en el VCA pueden reproducirse con otros indicadores fluorescentes que

tienen propiedades distintas a las del BCECF (ej.: la calceína); 3) la dirección de los cambios

en el VCA puede reproducirse midiendo el diámetro de las células con microscopia de contras-

te interferencial; 4) el aumento del VCA producido por NH4Cl puede contrarrestarse, de mane-

ra predecible cuantitativamente, aumentando la osmolaridad del medio externo; 5) la aplica-

ción de pulsos de calibración anisosmóticos produce cambios en el VCA que siguen la Ley de

van't Hoff.

5.2 Cambios de pH y volumen en células expuestas al par conjugado amoníaco / amonio.

Los cambios en que se observan en el pHi y en el VCA en células de neuroblastoma N1E-115

94

expuestas a pulsos de 7 a 20 minutos de duración con una solución isosmótica conteniendo

NH4Cl presentan cuatro fases características, que proceden de forma casi paralela y que com-

prenden (Fig. 17): 1) un aumento rápido del VCA (1v) y del pHi (1p); 2) una disminución gra-

dual en ambas variables [DRVi (2v) y acidificación del plateau (2p)]; 3) una disminución del

VCA (3v) y del pHi (3p) al terminar el pulso de NH4Cl; 4) un aumento regulador del volumen

(ARVi; 4v) y una recuperación gradual del pHi (4p). Las fases 4v y 4p presentan un curso más

variable que las otras y culminan, con frecuencia, en una recuperación incompleta del VCA y

del pHi.

Los mecanismos subyacentes a los cambios de pHi mediados por la base débil NH3 y su

ácido débil conjugado, NH4+, se conocen desde mucho tiempo atrás50: tras la exposición al par

NH3/NH4+ el gas NH3 difunde rápidamente al interior celular, donde se une a protones libres

(H+), reduciendo la concentración intracelular efectiva de éstos y alcalinizando, en consecuen-

cia, al citosol. Esta alcalinización procederá hasta que el NH3 se equilibre a través de la

membrana, es decir hasta que su concentración externa sea igual a la intracelular. Tras esta

alcalinización y en presencia continua de NH3/NH4+ en la solución externa, el curso subsi-

guiente del pHi dependerá de la permeabilidad de la membrana plasmática al NH4+, tal y como

lo demostraron Boron y DeWeer (1976)51, en un estudio clásico realizado en el axón gigante

del calamar: en células impermeables al NH4+ y en ausencia de mecanismos reguladores del

pHi, este último se mantendrá constante (dpHi/dt = 0). Por el contrario, si las células además de

ser permeables al NH3 lo son al NH4+, tendrá lugar una acidificación relativa del citosol

(acidificación del plateau ó fase 2p) como consecuencia de la entrada de NH4+ y su ulterior

disociación en NH3 y H+.

A partir de observaciones experimentales y principios teóricos, ya a comienzos del siglo

XX se propuso que las sales de amonio deben producir cambios en el volumen celular (ver Ref.

50). Estos cambios deben resultar de la acumulación intracelular de NH4+, como consecuencia

de la protonación del NH3 que ingresa inicialmente a las células: la acumulación de NH4+

implica una ganancia neta de osmolitos que determina un aumento en la osmolaridad intracelu-

lar, la cual conduce, a su vez, al influjo osmótico de agua y al aumento del volumen celular. La

magnitud y el curso temporal de los cambios de VCA producidos por el NH3/NH4+ no habían

95

sido estudiados hasta el presente, no obstante su importancia biofísica y clínica. En lo que

respecta a los aspectos biofísicos, la exposición de células a un pulso de NH4Cl es una manio-

bra comúnmente usada para alterar de manera controlada y predecible el pHi y estudiar los

mecanismos subyacentes a su regulación66,88. Desde el punto de vista clínico, su importancia

está ligada a la fisiopatología del edema cerebral asociado con hiperamonemias agudas, como

las que caracterizan a los cuadros de encefalopatía hepática resultantes de fallas agudas del

hígado108.

5.2.1 La permeabilidad de la membrana plasmática al NH3 y al NH4+ determina la cinética de

los cambios de pHi y VCA. La alcalinización inicial observada en células N1E-115 expuestas al

par NH3-NH4+ indica que éstas son significativamente más permeables al NH3 que al NH4

+.

Los resultados de los experimentos en los que se modificaron las concentraciones relativas de

NH3 y NH4+ en las soluciones de NH4Cl (sección 4.1.1) son consistentes con esta hipótesis.

Estos experimentos muestran que la magnitud del cambio inicial del pHi, así como la del

aumento del VCA, dependen de la [NH3]o y no de la [NH4+]o. Dado que el NH3 es un gas, y

como tal no afecta la osmolaridad interna de las células, la correlación positiva entre la [NH3]o

y la magnitud del aumento del VCA es consistente con la hipótesis de que la acumulación de

NH4+, resultante del influjo de NH3, es un determinante importante del aumento de volumen.

El cálculo de la permeabilidad de la membrana plasmática al NH3 (PNH3) en nuestras células

arrojó un valor de ~38 µm/s. (sección 4.2, Resultados). Este valor es tan sólo una aproxima-

ción, dado que en su estimación no se considera la compleja geometría de estas células al

calcular la relación volumen/superficie celular. No obstante, el valor obtenido para PNH3 se

encuentra dentro del rango de los descritos para otras células de mamíferos56. A modo de

comparación, la PNH3 estimada para las células N1E-115 es ligeramente superior a la PNH3 cal-

culada para la barrera hematoencefálica del perro301 y del hombre302, esto es, ~22 µm/s.

Al igual que otras células, las N1E-115 son permeables al NH4+, tal como lo indica la acidi-

ficación del plateau que resulta, al menos en parte, del influjo gradual de NH4+48,51,88,303.

Consistente con esta hipótesis es el hecho de que la tasa de acidificación del plateau (-dpHi/dt)

se acentúe conforme aumenta la [NH4+]o cuando la [NH3] se mantiene constante, como se

muestra en la Fig. 27, sección 4.1.3.

96

La acumulación intracelular de NH4+ durante la fase de acidificación del plateau guarda

relación, además, con la magnitud de la acidificación “de rebote” que ocurre al retirar el pulso

de NH4Cl (Fig. 25): en células que acumularon más NH4+, la disociación de este ión en NH3 +

H+ resulta en una “carga ácida” intracelular más marcada, debido a que tras el eflujo del gas

NH3 la [H+]i remanente es más pronunciada. Además de estas evidencias, las medidas cinéticas

de los cambios de pHi indican que, ante la exposición al NH3/NH4+, el influjo de NH4

+ ocurre

también durante la fase de alcalinización inicial, como lo sugiere el carácter no lineal de la

relación entre el flujo de NH3 (JNH3) y la [NH3]o para las concentraciones más altas de NH4Cl

(Fig. 29, sección 4.2, Resultados). En esta relación, la Ley de Fick parece cumplirse sólo para

[NH3] ≲ 0,10 µmol/cm3. A concentraciones mayores de NH3, la desviación aparente de la Ley

de Fick puede deberse tanto a la entrada de NH4+, como a la activación de mecanismos de

regulación de pHi, (v.g. el intercambiador Cl-/HCO3-), fenómenos que tenderían a reducir la

amplitud del ∆pHi inicial a partir del cuál se cuantifica JNH3††. En otras palabras, si las células

fuesen impermeables al NH4+ se esperaría que JNH3 y [NH3]o guardasen una relación lineal para

todo el rango de concentraciones de NH3 exploradas, reflejando la difusión pasiva de NH3.

Además de la evidencia discutida, hay otra observación que permite suponer que ocurre un

influjo de NH4+ durante la fase inicial de aumento del pHi. A un pHi basal promedio de 7,08,

como el registrado en las 61 células estudiadas, le corresponde un poder de tamponamiento

intrínseco (βi) de ~25 mM/u.pH (Fig. 28, sección 4.2, Resultados). Esto implica que es

necesaria una acumulación intracelular neta de ~2,5 mM de un equivalente ácido (v.g. NH4+) o

básico, para producir un cambio de pHi de 0,1 u.pH. El ∆pHi promedio registrado ante la

aplicación de 20 mM de NH4Cl fue de 0,41 u.pH, valor que requeriría, de acuerdo con el

cálculo anterior, una acumulación de ~10,25 mM de NH4+. La acumulación promedio de NH4

+

estimada al pico alcalino fue, sin embargo, de 16,8 mM, valor que debió producir un ∆pHi de

~0,56 u.pH. La discrepancia entre el valor observado y el valor predicho del cambio de pHi

puede explicarse, al menos en parte, por el influjo directo del NH4+, que contrarresta la

alcalinización mediada por el NH3 y contribuye a la vez a aumentar el poder de tamponamiento

intracelular, al incorporar a las células equivalentes ácidos (el sistema NH3 + H+ ⇄ NH4+

†† En las observaciones descritas en el presente trabajo es posible que el intercambiador aniónico haya jugado, si acaso, un papel menor, dado que los experimentos se hicieron en ausencia virtual de HCO3

-.

97

constituye, en sí mismo, un factor adicional (extrínseco) de tamponamiento del pH). Final-

mente, en los experimentos en presencia de Ba2+, un inhibidor no selectivo de canales de K+, se

observó un ∆pHi de mayor amplitud, así como un bloqueo de la acidificación del plateau, que

son consistentes con la hipótesis de que el NH4+ permea a través de canales de K+ (Fig. 53).

Las posibles vías de influjo del NH4+ se discuten más adelante, en la sección 5.4.

5.2.1.1 Gradiente electroquímico y permeabilidad de la membrana celular al NH4+. En las 61

células en las que se caracterizaron los cambios en el pHi y en el VCA mediados por NH4Cl

(20 mM), la [NH4+]i calculada durante el pico máximo de aumento del VCA fue de 16,8 mM.

Siendo la concentración externa de NH4+ de ~19,78 mM, el potencial de equilibrio del NH4

+ en

el pico de la alcalinización es:

ENH4+ = RT/zF x ln [NH4

+]o/[NH4+]i ≅ 4,2 mV

donde RT/zF = 25,7 mV a 25ºC. Suponiendo un potencial de reposo para las células N1E-115

de ~ -46 mV (datos preliminares, no mostrados; véase también Ref. 277, la [NH4+]i requerida

para que este catión se equilibre a través de la membrana celular externa debería ser:

[NH4+]i = [NH4

+]o x e (-zEmF/RT) ≅ 119 mM

De estos cálculos se concluye que el gradiente electroquímico del NH4+ es ~ 50 mV y está

dirigido hacia adentro de las células, favoreciendo marcadamente el influjo de este ión.

La permeabilidad de las células N1E-115 al NH4+ se manifiesta, como se dijo, en la acidifi-

cación gradual del citosol que tiene lugar tras la alcalinización inicial inducida por el

NH3/NH4+. Para pulsos de 20 mM de NH3-NH4

+ esta acidificación proseguirá, en teoría, hasta

que la [NH4+]i alcance un valor de ~119 mM, ó en otras palabras, hasta que el potencial de

membrana, Em, sea igual al potencial de equilibrio del NH4+, ENH4

+304. En términos generales,

el cálculo teórico indica que para un Em ≈ -60 mV, el equilibrio electroquímico del NH4+ se

alcanzará cuando la [NH4+]i sea ~10 veces más alta que la [NH4

+]o.

98

La tasa de flujo inicial de NH4+ (calculada para los primeros ~2 min de la acidificación del

plateau) fue de ~5 x 10-9 mmol/cm2 × s. Esta tasa fue ligeramente superior a la tasa de

producción de protones, medida durante el mismo lapso, que fue de ~1,4 x 10-9 mmol/cm2 ×

s‡‡. Esta diferencia se explica porque dentro del rango de pHi registrado durante los

experimentos, no todo el NH4+ que ingresa a las células se disocia en NH3 + H+305, de tal

manera que el flujo de NH4+ (JNH4+) no es cuantitativamente igual a la tasa de producción de

protones (JH+). En relación con esto hay que tener en cuenta, además, que la tasa de

acidificación del plateau no expresa solamente velocidad con que se generan H+ a partir del

influjo de NH4+, sino que refleja también la actividad de mecanismos de regulación del pHi que

expulsan equivalentes básicos del interior celular51. A partir de la tasa de flujo de NH4+ calcu-

lada, la permeabilidad de la membrana plasmática al NH4+ se estimó en ~2,5 x 10-7 cm/s. Este

valor es ~4 órdenes de magnitud menor que la PNH3 calculada en estas mismas células, y entre

2 y 4 órdenes de magnitud menor que la permeabilidad al NH4+ medida en diversos segmentos

de los túbulos renales14,306.

5.3 Factores determinantes del aumento del VCA mediado por el par NH3/NH4+. En

ausencia de cambios en la osmolaridad extracelular, cualquier variación en el VCA debe

resultar de un cambio primario en la concentración de osmolitos intracelulares. En el presente

trabajo se demuestra que en las células expuestas a 20 mM de NH4Cl, alrededor de un tercio

del aumento inicial del VCA puede atribuirse a la acumulación de NH4+ (osmóticamente

activo), secundaria al influjo de NH3 (osmóticamente inactivo). Si, en virtud del principio de

electroneutralidad macroscópica, a esta acumulación le acompaña un incremento similar en la

concentración intracelular de un anión (de procedencia exógena o endógena), quedaría por

explicar sólo un tercio de dicho aumento. La naturaleza del anión que se acumula con el NH4+

así como la de los osmolitos responsables de la fracción del aumento de volumen restante se

discuten a continuación. ‡‡ El flujo de NH4

+ (JNH4+) se calculó como d[NH4+]i/dt x Vol/Area. Dado que el valor de d[NH4

+]i/dt representa la acumulación neta de NH4

+ en las células, los efectos del potencial de membrana y del poder de tamponamien-to intrínseco del pHi (βΙ) sobre la acumulación intracelular de NH4

+ están englobados en la determinación de este flujo. La tasa de producción de H+ (JH+) se calculó como dpHi/dt x βI x Vol/Area, donde βI = 10 mM/u.pHi (valor obtenido por interpolación de los datos mostrados en la Fig. 28 para un pHi = 7,49, tal el valor promedio del pico alcalino tras la aplicación de NH4Cl).

99

5.3.1 Acumulación intracelular de NH4+ y un anión acompañante. En las 61 células caracteri-

zadas, la concentración intracelular de NH4+ calculada al momento en que alcanzó el pico

máximo del VCA ante el pulso de 20 mM de NH4Cl, fue de 16,8 mM. Suponiendo que ocurre

un incremento concomitante y equivalente en la concentración de un anión monovalente, como

requiere el principio de electroneutralidad macroscópica del interior celular, la ganancia neta

de osmolitos en el citoplasma debió ser de ~ 33,4 mosm/KgH2O. De este modo, a partir de su

valor inicial de ~311 mosm/KgH2O, la osmolaridad intracelular aumentaría entonces a ~344

mosm/KgH2O, es decir un ~10,7%. Este sería por lo tanto el porcentaje de incremento predicho

para el volumen celular acuoso relativo, siempre y cuando las células exhibiesen un comporta-

miento osmométrico perfecto, y no se disparasen mecanismos de regulación. Sin embargo, el

aumento máximo observado del VCA en las 61 células fue 1,7 veces mayor (~18%) que el

predicho. En conclusión, el aumento observado del volumen no puede explicarse en su totali-

dad por la acumulación exclusiva de NH4+

i y un co-ión negativo, por lo que otros osmolitos

(sumando una concentración de ~24 mM) deben acumularse asimismo en el interior de las

células. Estos osmolitos podrían ser exógenos (ej: Na+ extracelular) ó endógenos, como la

glutamina. El aumento máximo del volumen ante la aplicación de NH3/NH4+ se alcanza en ~38

s. Tanto el transporte electrodifusional de iones como la síntesis de glutamina son procesos

suficientemente rápidos como para contribuir al aumento del VCA durante este lapso. Otro

factor que podría contribuir al aumento del VCA, y que no fue evaluado en este trabajo, es la

degradación de macromoléculas (v.g. glucogenólisis) en el interior celular. A continuación se

discute la posible influencia de la síntesis y acumulación de glutamina, y posteriormente los

efectos de la sustitución de los iones Cl- y Na+ extracelulares, sobre el aumento del volumen

celular mediado por el par NH3/NH4+.

5.3.2 Síntesis y acumulación de glutamina. Como se mencionó en la sección 1.6.1 de la Intro-

ducción, la acumulación intracelular de glutamina es considerada por muchos como el determi-

nante principal del aumento de volumen que se observa en células gliales en condiciones de

hiperamonemia. Sin embargo, la hipótesis de que esta acumulación conduce a un aumento en

el volumen celular, determinante de la aparición de un edema, aún no ha sido claramente

demostrada o refutada. Las pruebas de detección con anticuerpos (Western Blot) realizadas en

nuestro laboratorio indican que la enzima GS se expresa en células N1E-115 indiferenciadas

100

aunque parece estar disminuida o ausente en células diferenciadas (Fig. 30, sección 4.4.1). Sin

embargo, estos resultados son preliminares y deben repetirse con controles que aseguren que la

concentración de proteínas es la misma en cada muestra. Estas determinaciones se están reali-

zando actualmente en el laboratorio.

Por otro lado, si aceptamos que “el ciclo de la glutamina” (esquematizado en la Fig. 2,

Introducción) representa una compartamentalización funcional efectiva de la conversión de

glutamato en glutamina, y viceversa, en tipos celulares definidos (neuronas y astrocitos), la

presencia de GS en neuronas maduras podría considerarse como un fenómeno residual, sin

relevancia fisiológica. No sabemos si la GS se expresa en neuroblastos, pero la literatura coin-

cide en señalar que la expresión de GS en neuronas adultas es baja o ausente. En células N1E-

115 diferenciadas, la inhibición tentativa de la síntesis de glutamina con sulfoximetionina

(MSO; 1-3-5 mM), una sustancia que inhibe de modo irreversible la GS, ejerció un efecto

inhibitorio aparente sobre el aumento del VCA mediado por NH3/NH4+ a la concentración más

baja (1 mM). Sin embargo, a concentraciones mayores de MSO (3 y 5 mM), los efectos sobre

el VCA fueron indistinguibles del control (Fig. 31). La ausencia de un bloqueo dosis-

dependiente a las concentraciones más altas de MSO sugiere que la reducción observada en el

aumento del VCA ante 1 mM de MSO no tiene relevancia biológica, y se debe probablemente

a la variabilidad propia de un registro limitado de datos, como el que se analizó. Estos

resultados son consistentes con la aparentemente pobre expresión de GS en celulas N1E-115

diferenciadas. En otra serie de experimentos hemos medido, mediante cromatografía liquida

de alta presión (HPLC), la concentración intracelular de glutamina a diversos intervalos

durante la aplicación de pulsos de NH4Cl (20 mM). Estos resultados, que no se incluyeron en

este trabajo y que se realizaron en poblaciones de células en su mayoría diferenciadas, han

mostrado, en ocasiones, un aumento en los niveles de glutamina intracelular, a la vez que una

disminución en los niveles endógenos de glutamato, ~30 s después de la aplicación de

NH4Cl.§§ Sin embargo, esta observación no pudo ser reproducida consistentemente, y tras

varios experimentos, la variabilidad de los datos no permitió extraer resultados concluyentes.

§§ En este caso particular, la contribución de la glutamina al aumento del VCA debió ser, a lo sumo, marginal, ya que los niveles de glutamato disminuyeron de modo concomitante, limitandose de este modo el cambio neto en la osmolaridad intracelular.

101

En síntesis, los experimentos con MSO no permiten concluir de manera categórica que la

glutamina sea el osmolito responsable de la fracción de aumento del VCA que no puede expli-

carse por la acumulación de NH4+ y un anión acompañante en estas células. Estos experimen-

tos deben repetirse en células N1E-115 indiferenciadas, así como en células de neuroblasto-

ma/glioma NG-108, en las cuales la expresión de GS es evidente (Fig. 32).

5.3.3 Influjo de Cl- y Na+.

a) Sustitución del Cl- externo por gluconato. Ante la exposición a soluciones con NH4Cl el

influjo de Cl- podría contribuir, a un mismo tiempo, al restablecimiento de la electroneutralidad

del citosol y a un aumento en la osmolaridad intracelular. Si bien esta hipótesis es, en principio,

atractiva, carecemos de información precisa que nos permita estructurarla de modo más formal.

Por ejemplo, no sabemos cual es la actividad del Cl- intracelular, y cual es la magnitud y la

dirección de su gradiente electroquímico en las células usadas como modelo. Los experimentos

en los que se sustituyó el Cl- externo se condujeron por tanto para obtener información preli-

minar, empírica, sobre la posible participación de este anión en el aumento de volumen media-

do por el NH3/NH4+. Como se aprecia en los resultados (sección 4.4.2), los efectos de la

sustitución de Cl- externo por el anión gluconato en las soluciones de NH3/NH4+ fueron muy

variables, especialmente cuando el Cl- se eliminó por más de 10 min antes de aplicar dichas

soluciones. Sin embargo, la comparación estadística del aumento de VCA producido en estas y

en otras condiciones [v.g. ante períodos más cortos (30 s – 5 min) de remoción del Cl- en la

solución control] no mostró diferencias significativas con respecto al aumento observado en el

pulso control. Estos resultados sugieren que el influjo de Cl- no juega un papel importante en el

aumento del VCA producido por el NH3/NH4+. Por otra parte, si bien la variabilidad observada

en el aumento del VCA en estos experimentos podría señalar la existencia de diferencias bio-

químicas ó funcionales entre células distintas, es posible también que la magnitud de dicho

aumento se relacione con la actividad remanente del Cl-i y con el valor del potencial de mem-

brana al aplicar el pulso de NH3-NH4+.

Dado que el Cl- extracelular no parece contribuir de modo importante al aumento del VCA,

podemos especular que al menos una parte del NH4+ que se forma ó que ingresa a las células se

combina con cargas negativas intracelulares “fijas”, es decir cargas negativas en las macromo-

léculas. Si esto fuera cierto, la diferencia entre el volumen observado y el volumen predicho

102

sería aún mayor que la estimada, ya que la interacción con cargas fijas, si bien cumple con la

electroneutralidad, no contribuye a aumentar la presión osmótica intracelular. Esto se debe a

que una macromolécula que contenga múltiples cargas negativas contribuirá, de hecho, como

una sola partícula osmóticamente activa.

Es importante resaltar que la variabilidad de los resultados de los experimentos en los que

el Cl- externo se sustituyó por gluconato debe evaluarse teniendo en cuenta que este último

anión no solo sustituye al Cl-, sino que además “quela” al Ca2+ extracelular, por lo que se

necesita repetir estos experimentos bajo condiciones controladas. La participación del Cl- en

los cambios de VCA mediados por NH3/NH4+ podrá evaluarse mejor en experimentos con

marcadores fluorescentes como el MEQ, que permiten medir cambios en la [Cl-]i307.

b) Sustitución de Na+ por NMDG+. Es posible que un influjo neto de Na+ contribuya al aumen-

to del VCA que ocurre al exponer las células al par NH3/NH4+. Dicho influjo podría resultar

tanto de la activación de canales de Na+ voltaje-dependientes, como de la apertura de canales

catiónicos no selectivos, sensibles al estiramiento de la membrana, como consecuencia, respec-

tivamente, de la despolarización y del aumento de volumen producidos por NH3/NH4+. El

reemplazo del Na+ externo por el catión impermeante NMDG+ en las soluciones de NH4Cl

produjo una disminución moderada en la amplitud inicial del aumento del VCA. Sin embargo,

ésta fue significativa en células cargadas con calceína, pero no en aquellas conteniendo

BCECF. La discrepancia entre estos grupos se debe, probablemente, al tamaño reducido de las

muestras. Claramente se necesitan más experimentos para llegar a conclusiones definitivas con

respecto al papel del Na+ en el aumento del VCA. Además de los experimentos de sustitución

iónica, la utilización de marcadores intracelulares sensibles a cambios en la [Na+]i permitirá

estudiar la contribución de este catión al aumento referido del VCA.

5.3.3.1 Cambios en el pHi basal inducidos por la remoción del Cl- o del Na+ externos. Al susti-

uir el Cl- de la solución ISO control y reemplazarlo con gluconato se observó, en la mayoría de

las células, una alcalinización gradual del citosol. Este efecto podría atribuirse, en principio, a

la acumulación intracelular de HCO3-, resultante de la inhibición del intercambiador Cl-/HCO3

-.

Sin embargo, dado que los experimentos se realizaron en ausencia nominal de HCO3-, esta

103

hipótesis no parece factible. Más aún, la incorporación de DIDS (100 µM), un inhibidor del

intercambiador Cl-/HCO3-, a la solución control, no produjo alcalinización del citosol (observa-

ción no mostrada). Las causas de dicha alcalinización no son claras.

Por otra parte, la acidificación del pHi observada al reemplazar el Na+ con NMDG+ en la

solución ISO control, así como el bloqueo de la regulación del pHi tras la remoción del pulso

de NH4Cl-Cero Na+, puede adscribirse a la inhibición del intercambiador Na+/H+266.

5.4 Factores determinantes de la DRVi en células expuestas a soluciones conteniendo

NH3/NH4+. El aumento inicial del VCA producido por el NH3/NH4

+ es seguido de una fase de

disminución reguladora (DRVi) que tiende a restablecer el volumen inicial de las células (Fig.

17, sección 4.1). De acuerdo con la hipótesis del presente trabajo, esta respuesta reguladora del

volumen en un medio isosmótico, está determinada por la salida de osmolitos y agua, y ocurre

paralelamente a la acumulación gradual de NH4+ en el interior celular (Fig. 17). La ocurrencia

de la DRVi indica que, durante esta fase, las células pierden más osmolitos que los que ganan

por la acumulación de NH4+ (y otros osmolitos que supuestamente lo acompañan). Para las 61

células caracterizadas con pulsos de 20 mM de NH4Cl el aumento inicial promedio del VCA

fue de ~18%, equivalente a un aumento en la osmolaridad intracelular de ~57,6 mosm/KgH2O.

Dado que la tasa inicial de la DRVi fue de -7,3%/min, un cálculo aproximado indica que el

eflujo neto de osmolitos ocurrió con una tasa inicial de ~4,2 mM/min. Por otro lado, la tasa de

acumulación de NH4+, estimada a partir de los valores de pHi registrados durante la acidifica-

ción del plateau, fue de 0,84 ± 0,04 mM/min. Esto indica que la tasa de inicial de salida de

osmolitos fue ~5 veces mayor que la tasa de acumulación. A continuación se evalúan algunos

mecanismos que podrían mediar la DRVi.

5.4.1 Cambios en la tensión de la membrana plasmática. En la sección 4.5.1 se demuestra que

las células regulan activamente su volumen tras aumentos o disminuciones provocados por

estímulos isosmóticos, como la exposición y remoción de NH3/NH4+, pero no lo hacen tras

cambios de volumen de amplitud similar provocados por una reducción o un aumento en la

osmolaridad del medio externo (Fig. 40). Más aún, la DRVi y el ARVi se presentan ante

104

cambios pequeños (<5%) del volumen, como los producidos por concentraciones bajas (0,5 ó 1

mM) de NH4Cl, lo cual constituye una evidencia clara de que la regulación del volumen, den-

tro del rango de expansiones y disminuciones explorado (<20%), no es consecuencia de la

mera expansión ó contracción de las células. La DRVi y el ARVi deben, por lo tanto, resultar

de otras acciones del NH3/NH4+.

5.4.1.1 Activación de canales catiónicos activados por aumentos en la tensión de la

membrana. La apertura de canales catiónicos no selectivos, activados por aumentos en la ten-

sión de la membrana (SACs) contribuye al desarrollo de la DRV que ocurre en células N1E-

115 tras aumentos del volumen (40% o más) en medio hiposmótico250. Nuestros resultados

muestran que la DRVi durante la aplicación de NH3/NH4+ se inhibe marcadamente en presen-

cia de Gd3+, un inhibidor de SACs (sección 4.5.1.1, Figs. 41 y 42). Ante la apertura de estas

vías, la dirección del flujo de las corrientes generadas y la identidad de los iones transportados

dependerán de los gradientes electroquímicos de los cationes implicados (Na+, K+ y Ca2+) y de

la selectividad relativa de los canales a éstos. Tras aumentos del VCA como los producidos

por el NH3/NH4+, el bloqueo de la DRVi podría resultar de una restricción o reducción en el

eflujo de iones a través de SACs, ó alternativamente, de la inhibición de un influjo inicial de

cationes (v.g. Na+ ó Ca2+), que podría activar otras conductancias (v.g. de K+ o Cl-)313.

Tras su incorporación a la solución ISO control, el Gd3+ indujo además un aumento en el

volumen basal de las células (Fig. 41). Esta observación sugiere que el Gd3+ afecta la actividad

de una ó más vías de transporte con actividad basal en estas células, distintas probablemente

de los SACs, si atendemos al mecanismo que media la activación de estos últimos, es decir un

aumento en la tensión de la membrana plasmática. Alternativamente, es posible que los cam-

bios en la fluorescencia basal producidos por el Gd3+ sean un artefacto producido por “apaga-

miento” (quenching) de la fluorescencia del BCECF, suponiendo que el Gd3+ permea las

células. Sin embargo, aún en este caso, la inhibición observada de la DRVi debió ser real, ya

que el supuesto apagamiento de la fluorescencia no debería modificar la cinética de los cam-

bios de volumen. Cabe señalar, por otro lado, que los efectos del Gd3+ son inespecíficos. Así,

por ejemplo, a la concentración empleada (100 µM) es probable que el Gd3+ haya inhibido

corrientes de Ca2+308,309. A este respecto, es interesante señalar que otro catión de la serie de

los lantánidos, el La3+ (10 µM), inhibe fuertemente dichas corrientes en células N1E-115267.

105

El papel de los SACs en el aumento y la disminución reguladora del volumen observados

tras la aplicación de NH3/NH4+ podrá investigarse con inhibidores más específicos de estos

canales, tales como la toxina GsMTx-4310.

5.4.1.2 Expansión inicial del volumen. Como vimos más arriba, la mera expansión del volumen

celular no basta, bajo ciertas condiciones, para desencadenar una respuesta de regulación. No

obstante, ante aumentos de volumen de magnitud suficiente, esta respuesta ocurre independien-

temente de la causa primaria que ocasionó la expansión. En estos casos es válido preguntarse

¿en qué medida la magnitud de la expansión inicial del volumen afecta la velocidad y la mag-

nitud del proceso regulador? La respuesta a esta pregunta debería permitir distinguir si la DRV

(o la DRVi) es consecuencia de alteraciones en las propiedades viscoelásticas de las células

(que determinarían un ajuste de tipo “mecánico”, es decir proporcional al grado de perturba-

ción original en la estructura celular), o si por el contrario, las respuestas reguladoras guardan

relación con factores no estructurales, de carácter más dinámico, como los cambios en la

concentración intracelular de uno ó más osmolitos. Las correlaciones mostradas en la Fig. 43

muestran que, a diferencia de lo que se observa ante aumentos de volumen en medio hiposmó-

tico, la tasa inicial y la magnitud de la DRVi son mayores cuanto menor es el aumento del

VCA. Esto podría significar que tras aumentos primarios en la concentración intracelular de

osmolitos (v.g. NH4+), las células responden de manera más efectiva cuando el aumento de

volumen es pequeño (y por ende, puede decirse más fisiológico), siendo probablemente, en

estos casos, “más sencillo” de contrarrestar. A este respecto, una observación general que no se

explicitó en los resultados, pero que puede apreciarse en los registros de VCA, es que la DRVi

fue proporcionalmente mayor ante la exposición a 5 que a 20 mM de NH4Cl. Esto ocurrió aún

en células en las que la aplicación de una u otra concentración de NH4Cl indujo aumentos de

volumen similares, lo cual sugiere que la DRVi es más “eficiente” cuando el estímulo primario

es poco severo. En contraste, el hecho de que la DRV en medio hiposmótico sea mayor ante

aumentos mayores del VCA sugiere que los mecanismos implicados en esta respuesta son

distintos de aquellos que median la DRVi tras aumentos producidos por el NH3/NH4+.

5.4.2 Efectos osmóticos del NH4+. La Fig. 44 indica que la DRVi es relativamente indepen-

diente de la tasa de acumulación concomitante de NH4+. En otras palabras, la acumulación

106

gradual de osmolitos no incide, dentro de los límites que definen nuestras condiciones experi-

mentales, sobre la cinética de la DRVi que procede de manera simultánea. Esto sugiere que,

tras su puesta en marcha, la DRVi es un proceso relativamente autónomo, que no se ve

afectado por variaciones concurrentes (en este caso modestas) de la osmolaridad intracelular.

En la Fig. 45 se observa, por contraste, que la magnitud de la acumulación inicial de NH4+ se

correlaciona inversamente con la DRVi. Esta correlación es consistente con aquella otra obser-

vada entre el aumento máximo del VCA y la DRVi. Es decir, en células en las que inicial-

mente se acumuló más NH4+, el aumento de VCA fue mayor (Fig. 20) y la DRVi fue menor.

En ausencia de más pruebas experimentales, es difícil discernir si la reducción de la DRVi se

debe a efectos derivados de la acumulación de NH4+ o a la magnitud del aumento inicial del

VCA per se. La dificultad es aún mayor dado que ambas variables están correlacionadas entre

sí y las dos varían, a su vez, con el pHi.

5.4.3 Posible influencia del pHi sobre la DRVi. El análisis de las 61 células expuestas a pulsos

de 20 mM de NH4Cl mostró que la DRVi fue más pronunciada cuanto más alcalino era el pHi

basal (antes de la exposición al pulso de NH4Cl), como se observa en la Fig. 46A. La

correlación que se observa entre el pHi basal y la DRVi es consistente con las correlaciones

descritas anteriormente. Esto se resume, de manera simplificada, en la siguiente tabla:

pHi basal [NH4+]i ∆VCA DRVi

En esta tabla se muestra que, en términos generales, a un pHi inicial ácido, la exposición a

NH3/NH4+ induce una acumulación mayor de NH4

+ y un aumento mayor del VCA, mientras

que la DRVi es menor. A pHs intracelulares alcalinos, por el contrario, puede verse que las

magnitudes respectivas se invierten.

En la Fig. 47 se observa que la tasa de acidificación del plateau, proceso paralelo a la

DRVi, se correlacionó asimismo significativamente con la tasa de la DRVi. Dado que, como

vimos más arriba, la tasa de acumulación de NH4+ no mostró una correlación significativa con

107

la DRVi, podemos suponer que la DRVi guarda relación con los cambios en el pHi, antes que

con los efectos de la acumulación progresiva del NH4+. Las variaciones en el pHi podrían, por

ejemplo, afectar la conductancia a traves de ciertos canales de K+ como los TWIK, TASK ó

TREK311. En células de Erlich hinchadas en medio hiposmótico se observó, por ejemplo, que la

inducción de un aumento de pHi determina un aumento en una corriente de K+ que resulta a su

vez en una potenciación de la DRV312. Los autores definen a esta corriente, mediada probable-

mente por TASK-2, como “sensible al volumen”, puesto que aumenta ante incrementos del

volumen celular. Aunque nuestros resultados sugieren que el pHi afecta la regulación del volu-

men en células N1E-115, se requieren estudios exhaustivos para esclarecer la posible relación

entre el pHi y la DRVi en nuestro modelo experimental.

5.4.4 Activación de vías electrodifusionales (canales iónicos) durante la DRVi.

a) Canales no selectivos a cationes activados por estiramiento de la membrana plasmática.

Ya vimos que en células expuestas a NH4Cl, el Gd3+ bloqueó marcadamente la DRVi. La única

manera por la cual la DRVi podría efectuarse a través de SACs, es mediante la salida de K+,

que es el único catión presente en concentraciones suficientemente altas en las células. Sin

embargo, dado que la DRVi se inhibe críticamente ante el bloqueo de canales aniónicos, es

probable que los SACs no constituyan una vía efectora directa de la DRVi, sino antes bien, que

su apertura tras aumentos del VCA sea un disparador del fenómeno regulador. Esto podría

ocurrir si la apertura de SACs favoreciese, tal como se observó ante aumentos hiposmóticos del

volumen en estas células, una despolarización que activase conductancias al Cl- y al K+ 250.

Una manera sencilla de probar esta hipótesis es aplicando Gd3+ una vez que la DRVi ha

comenzado. La apertura de SACs podría determinar asimismo un influjo de Ca2+, que mediaría

la activación de cierto tipo de canales de K+ y quizás de Cl-, efectores de la DRVi313,314,242.

b) Canales aniónicos. La incorporación de NPPB (10 µM) a las soluciones de NH4Cl (5 y

20 mM) resultó en una marcada inhibición de la DRVi. Este hallazgo sugiere que el eflujo de

aniones (Cl- y ciertos aniones orgánicos) por vías electrodifusionales, contribuye de manera

importante a la generación de la DRVi. Más aún, en ocasiones, el NPPB indujo una inversión

de la iDRV, es decir una fase adicional de aumento del volumen, tras la expansión inicial. Esta

108

inversión de la DRVi sugiere la acumulación de aniones en el interior celular que se añadiría a

la ganancia de osmolitos (NH4+ y otros) que ocurre continuamente durante la exposición al

NH4Cl.

El NPPB podría estar inhibiendo la actividad del canal VSOAC (del inglés "volume-

sensitive organic osmolyte-anion channel"), estudiado en estas células315 y que se ha propuesto

como mediador importante de la DRV hiposmótica en muchos tipos celulares (253Okada). Sin

embargo, un estudio previo realizado en células N1E-115 sugiere que los canales aniónicos que

se abren tras aumentos hiposmóticos del volumen son activados por el voltaje de transmem-

brana250, propiedad que no exhiben los canales VSOAC. Además de su acción bloqueante

sobre las conductancias aniónicas, el NPPB tuvo efectos en el pHi (sección 4.5.5.1). Por ejem-

plo, produjo una acidificación basal, que ha sido descrita en otras células316 y, ante la aplica-

ción de NH4Cl, una disminución en la tasa de alcalinización inicial y un aumento en la pen-

diente de acidificación del plateau (Fig. 52A), que indican que la membrana plasmática de las

células es permeable al NPPB, que es un ácido***. Más aún, se ha demostrado que el NPPB

puede incorporarse a las membranas celulares y actuar como un protonóforo317. En virtud de

esto, es de suponer que el NPPB tiene consecuencias osmóticas, dado que al acentuarse la tasa

de acidificación del plateau, la tasa de acumulación intracelular de NH4+ debe acentuarse

concomitantemente. Si esta acumulación fuese suficientemente aguda, la DRVi podría verse

atenuada, inhibida, o incluso, como se vió en ocasiones, invertida. Si bien la tasa de acumula-

ción de NH4+ en células tratadas con NH4Cl (20 mM) y NPPB fue, en efecto, significativamen-

te mayor al control (1,35 ± 0,2 vs. 0,5 ± 0,03 mM/min, respectivamente; p<0,001), la acumula-

ción de NH4+ durante el pulso de prueba (con NPPB) debió inducir un aumento de volumen a

una tasa de ~0,4 %/min. Dado que la tasa inicial de la DRVi (en el pulso control) fue ~10 veces

más rápida (-3,6 %/min) la acumulación de NH4+ calculada resulta insuficiente, por sí misma,

para afectar de manera notable la DRVi. En otras palabras, de no mediar una inhibición efecti-

va y simultánea del eflujo de osmolitos, es poco probable que la acumulación de NH4+ (e

incluso un co-ión) haya bastado, por sí sola, para abolir o invertir el proceso regulador. En el

estudio arriba mencionado se demuestra, además, que el NPPB induce una caída en los niveles *** En experimentos preliminares observamos que la incorporación a la solución ISO control de ácido nifúmi-cο (100 µM) y tamoxifén (10 µM), sustancias que se emplean comúnmente para inhibir canales de Cl-, resulta en una disminución y un aumento, respectivamente, en el pHi.

109

de ATP de las células, como resultado de la disrupción del metabolismo mitocondrial. En

células N1E-115 se demostró, recientemente, que la activación del VSOAC, disminuye cuando

se reduce el contenido intracelular de ATP315. Si en nuestros experimentos el NPPB hubiese

causado una reducción en el ATP celular, podemos suponer además que la actividad de la

bomba de Na+/K+ pudo haberse comprometido, lo cual podría conducir a un aumento adicional

del volumen celular. En conclusión, la inhibición de la DRVi en presencia de NPPB no puede

adscribirse exclusivamente al bloqueo específico de conductancias aniónicas. Es de esperar que

un conocimiento mayor de los mecanismos que median el eflujo de aniones durante la DRVi

resulte de la caracterización farmacológica y el análisis molecular de sus vías transportadoras.

c) Canales de K+. La salida conductiva de K+ a través de canales dependientes de voltaje (v.g.

KDR) contribuye a la DRV que sigue a aumentos del volumen en medio hiposmótico, tanto en

células N1E-115251,258, como en otros tipos celulares168. Al ser expuestas a 5 mM de NH4Cl en

presencia de 1 mM de Ba2+, las células N1E-115 mostraron una inhibición de ~46% en la mag-

nitud del volumen regulado (Figs. 48 y 51). Esta inhibición sugiere que el eflujo de K+ contri-

buye, en nuestras condiciones experimentales, a la respuesta osmoreguladora de las células.

Este eflujo podría ocurrir por canales de K+ dependientes de voltaje, activados por la despolari-

zación de la membrana250 producida por el NH4Cl y magnificada, a su vez, por el Ba2+.

A la concentración usada, el Ba2+ inhibe en estas células canales de K+ activados por Ca2+

(denominados indistintamente BK ó Maxi-K+)274 y probablemente inhiba la corriente “M” de

K+, mediada al parecer por canales KCNQ318,319. Ambos canales han sido propuestos como

mediadores de la DRV en medio hiposmótico242,320, 321.

Dado que la salida electrodifusiva de K+ parece contribuir a la DRVi, ante el bloqueo de

este eflujo se esperaría que el aumento inicial del VCA mediado por NH3/NH4+ fuera sensible-

mente mayor al que ocurre en condiciones control. Sin embargo, en presencia de Ba2+ el

aumento referido fue menor que el control. Con base en los efectos que el Ba2+ tuvo sobre el

pHi, es posible que la reducción en el pico del VCA se deba a la inhibición del influjo de NH4+

(ver sección 5.5).

110

5.5. Probables vías de influjo del NH4+. Con la posible excepción del intercambiador

K+/NH4+, propuesto en los túbulos colectores de la médula renal72, y de las proteinas Rh69, no

se han descubierto sistemas de transporte específicos del NH4+ en células de vertebrados supe-

riores. En contraste, numerosos estudios en donde se evalúa la permeabilidad de canales ióni-

cos y transportadores acoplados muestran que este ión puede atravesar la membrana plasmática

a través de vías comunes al K+319,322,323. La incorporación de Ba2+ (1 mM), un inhibidor general

de canales de K+, a las soluciones de NH4Cl (5 mM) indujo cambios en el pHi consistentes con

una inhibición del influjo de NH4+ (sección 4.5.5.1 y 4.6). Específicamente, ante la aplicación

NH3/NH4+, la magnitud ∆pHi y la tasa de alcalinización fueron significativamente mayores que

el control, mientras que la tasa de acidificación del plateau fue menor (Figs. 53 y 54). El Ba2+

inhibe el transporte de NH4+ en preparaciones del segmento grueso ascendente (SGA) del asa

de Henle77 y en cultivos de astrocitos de ratón58. Mientras que en el SGA la vía que media el

transporte de NH4+ sensible al Ba2+ aún no ha sido determinada, en los astrocitos se sugirió que

ésta podría estar representada por canales de K+ rectificadores de entrada (Kir).

Efectos similares, pero de magnitud inferior a los observados en presencia de Ba2+, se

observaron en presencia de bumetanida (10 µM), un inhibidor del cotransporte de Na+,K+,2Cl+

(NKCC) y de K+,Cl+ (KCC), lo cual sugiere que en células N1E-115 el NH4+ puede cruzar la

membrana a través de estas vías de transporte mediado. La entrada de iones a través de NKCC

debió haberse inhibido, asimismo, al eliminar el Cl- ó el Na+ de las soluciones externas durante

los experimentos de sustitución iónica. En estos casos, sin embargo, los cambios en el pHi

asociados con estos procedimientos no permiten identificar ó aislar los efectos específicos de

dicha inhibición.

La participación del NKCC en el transporte transtubular de NH4+ en los riñones está bien

documentada76,324 (Fig. 2, Introducción), pero un papel similar del NKCC no se había descrito

en neuronas, ni en otras células del sistema nervioso.

5.6 Posibles implicaciones fisiopatológicas. La vasta mayoría de los estudios realizados en

torno a la patogénesis de la encefalopatía hepática coinciden en señalar a la acumulación de

111

NH3/NH4+ en el cerebro como causa de los múltiples transtornos (metabólicos, energéticos y

funcionales) asociados con esta condición. Muchos de estos efectos son, en buena parte,

directos y afectan primariamente la función neuronal (v.g. despolarización; inhibición del po-

tencial inhibitorio postsináptico; activación de receptores NMDA). Otros efectos, como la de-

pleción energética y el edema celular (derivados, respectivamente, de la disfunción mitocon-

drial y del aumento en la síntesis de glutamina), parecen ser por el contrario consecuencia

indirecta de dicha acumulación, y se supone afectan principalmente a los astrocitos. En este

trabajo se demuestra que el NH3/NH4+ ejerce efectos osmóticos directos sobre células de origen

neuronal. Estos cambios, definidos por un aumento inicial del volumen acuoso celular, seguido

de una recuperación parcial, ocurren ante concentraciones externas de NH3/NH4+ similares a

las medidas en el cerebro de animales con hiperamonemia crónica ó aguda (1-5 mM). Aún

cuando no podemos concluir que estos cambios, observados en neuronas aisladas, in vitro,

reproducen las alteraciones del volumen celular que ocurren en condiciones de hiperamonemia

en el cerebro de los organismos, los mismos demuestran que el volumen neuronal puede alte-

rarse de manera significativa como consecuencia de la acumulación intracelular de NH4+. A

partir de esta observación básica, es factible que el aumento del volumen neuronal, con las

implicaciones funcionales que esto representa, constituya un evento aún no reconocido en la

serie de alteraciones patológicas producidas por aumentos agudos en la concentración cerebral

de NH3/NH4+.

112

6. CONCLUSIONES

1) Se estudiaron los cambios de volumen celular acuoso (VCA) y de pH intracelular (pHi) que

ocurren en células neurales, cargadas con el indicador fluorescente BCECF, al exponerlas

transitoriamente a soluciones isosmóticas conteniendo NH3 y NH4+. Para medir

simultáneamente el VCA y el pHi, en células individuales, se utilizó una técnica

microespectrofluorométrica de imágenes. Los cambios en el VCA se midieron en el punto

isosbético intracelular del indicador (438nm), que es insensible al pHi y sensible a cambios en

la dilución intracelular del indicador. Los cambios simultáneos en el pHi se midieron a partir

del cociente de fluorescencia 495/438. Los experimentos se realizaron en células diferenciadas

de neuroblastoma (N1E-115).

2) La exposición a NH3/NH4+, produce una alcalinización intracelular rápida seguida de un

aumento del VCA. La magnitud de esta alcalinización y del aumento del VCA depende de la

concentración externa de NH3, y no de NH4+. La alcalinización inicial resulta del influjo de

NH3, que en el interior celular se protona formando NH4+, un catión osmóticamente activo. La

permeabilidad aparente de la membrana plasmática al NH3 excede en aproximadamente cuatro

órdenes de magnitud a la permeabilidad estimada para el NH4+.

3) Aproximadamente el 60% del aumento inicial del volumen puede explicarse por la

acumulación intracelular de NH4+ y de un co-ión negativo, necesario para preservar la

electroneutralidad macroscópica. La magnitud del aumento de volumen celular se relaciona

inversamente con el valor del pH intracelular previo a la aplicación de NH3/NH4+. La

113

proporción restante de dicho aumento (40%) se debe a la acumulación intracelular de otros

osmolitos hasta ahora no identificados. Se descartó la posibilidad de que estos últimos fueran

glutamina, Na+ o Cl-.

4) La fase de acidificación del plateau que sigue al aumento inicial del pHi se debe

principalmente a la entrada pasiva de NH4+. El influjo de NH4

+ tiene lugar, al menos en parte,

a través de canales de K+ y del triple cotransportador de Na+,K+,2Cl-, como lo sugiere el

bloqueo parcial de la acidificación del plateau con Ba2+ y bumetanida, respectivamente.

5) La disminución reguladora del volumen que ocurre tras el aumento inicial del volumen

celular se bloquea con Gd3+, un inhibidor inespecífico de canales catiónicos activados por

aumentos en la tensión de la membrana plasmática, y con NPPB, un inhibidor de canales

aniónicos. El bloqueo parcial de este proceso regulador por el Ba2+ sugiere que en el mismo

participan también canales de K+. La cinética de la regulación del volumen parece estar

modulada por los cambios en el pH intracelular.

6) Los resultados se discuten tanto en su significado biofísico como fisiopatológico. El sistema

in vitro desarrollado en este trabajo se propone como un modelo adecuado para estudiar, a

escala celular, la fisiopatología de los cambios de volumen y de pHi en el tejido nervioso ante

crisis hiperamonémicas como las que ocurren en la falla hepática aguda.

114

7. PERSPECTIVAS

En la presente investigación se presenta, a través del registro simultáneo de los cambios en

el volumen celular acuoso y el pHi, una caracterización inicial del edema citotóxico mediado

por amoníaco y amonio en células de origen neural. Dado que las variaciones en el VCA y en

el pHi pueden considerarse, en buena medida, como la expresión “visible” de un conjunto de

mecanismos y procesos celulares funcionalmente integrados, la metodología presentada consti-

tuye, a nuestro parecer, un valioso acercamiento integral a fenómenos complejos de la fisiolo-

gía celular. Nuestro paradigma experimental, es decir el edema celular citotóxico, así como las

técnicas de fluorescencia empleadas para su estudio, permiten abordar aspectos básicos de la

fisiopatología de la encefalopatía hepática y otras enfermedades neurodegenerativas, ofrecien-

do amplias perspectivas de desarrollo y profundización:

1) En primer lugar, creemos que es necesario estudiar la respuesta celular ante estímulos

más parecidos a los que enfrentan las células en el organismo. Sería adecuado, en relación con

nuestro modelo de edema celular, investigar con mayor detalle los efectos de concentraciones

bajas de NH3/NH4+, en el rango de 0,2 - 5 mM. De interés, también, será evaluar la respuesta

de las células al variar la velocidad de perfusión con sales de amonio, ya que es posible que los

mecanismos reguladores del VCA muestren una activación diferencial, dependiendo de la

velocidad del cambio de volumen. Esta variable parece controlar, por caso, la activación del

canal VSOAC, tal como sugiere un trabajo realizado en células N1E-115315. En este sentido, la

puesta a punto de un protocolo que permita incrementar gradualmente la concentración de

NH3/NH4+ en la solución de perfusión hará posible investigar el fenómeno de “regulación iso-

volumétrica” descrito en la sección 1.7.3.1 de la Introducción221, que reviste, en teoría, una

considerable importancia fisiológica.

2) Un aspecto importante que aún resta investigar es la posible influencia del Ca2+ en las

respuestas de VCA y pHi en células expuestas a NH3/NH4+. La remoción del Ca2+ externo

durante pulsos con NH4Cl permitirá confirmar resultados preliminares, no incluidos en este

trabajo, que sugieren que el influjo de Ca2+ es necesario para que tenga lugar la DRVi. Las

variaciones dinámicas en la [Ca2+]i serán investigadas, en paralelo con los cambios de volu-

men celular, empleando el indicador fluorescente Fura-2.

115

3) La identificación de las vías electrodifusionales que median la DRVi y el influjo de

NH4+ requerirá la utilización de inhibidores farmacológicos más específicos así como técnicas

de biología molecular. Por ejemplo, la participación de canales de K+ activados por voltaje

podrá evaluarse mediante diversas toxinas tales como la rAgitoxina-2, la margatoxina y ciertas

dendrotoxinas, que tienen una selectividad diferencial. La activación de SACs, aparentemente

necesaria para que tenga lugar la DRVi tras la exposición a NH3/NH4+, podrá confirmarse

utilizando la toxina GsMTx-4310, un inhibidor específico de estos canales. La participación de

canales aniónicos en los cambios del VCA caracterizados en este estudio será reexaminada

farmacológicamente con otros inhibidores (v.g. dideoxiforscolina, acido niflumico, etc.). Sin

embargo, dado que no se conocen inhibidores selectivos de estos canales, es probable que la

identificación definitiva de estas vías demande la utilización de técnicas de biología molecular.

Para evaluar si el aumento del VCA está influenciado por la síntesis y acumulación de

intermediarios resultantes de la conversión metabólica del NH3/NH4+ (v.g. aspartato), se inves-

tigarán los efectos de la inhibición de aminotransferasas, aplicando aminooxiacetato.

4) La medición de los cambios en el potencial de membrana ante la exposición de las célu-

las al NH3/NH4+ permitirá comprender mejor los cambios en el flujo iónico resultantes de este

tratamiento y elaborar hipótesis con mayor poder predictivo. Para esto, intentaremos medir el

potencial de membrana con marcadores fluorescentes como el di-8-ANEPPS277, 325.

5) Los efectos aparentes del pHi sobre la disminución reguladora del volumen podrán

estudiarse más a fondo induciendo cambios controlados en el pHi y observando a continuación

el curso de la DRV(i) ante aumentos del VCA en medio hiposmótico ó isosmótico.

6) Finalmente, será de gran interés estudiar los efectos del NH3/NH4+ sobre el VCA y el

pHi en cultivos primarios de astrocitos, los cuales revisten, de acuerdo con el conocimiento

actual, una relevancia fisiológica mayor (o al menos más directa) con relación al edema

cerebral asociado con hiperamonemia. En este modelo, que puede expandirse y abarcar co-

cultivos de neuronas y astrocitos, será posible estudiar la correlación temporal entre la

acumulación intracelular de glutamina y el aumento del volumen astroglial.

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