Lic. Biologa.

Microbiologa.

Proyecto: 1. Estudio fitopatolgico: caracterizacin morfolgica del hongo Colletotrichum gloeosporioides patgeno de la guayaba (Psidium guajava L.1753). 2. Caracterizacin de una variante del virus mosaico del pepino (CMV) 3. Aislamiento de bacterias del gnero Lactobacillus con capacidad probitica.

Presenta: Ramrez Mares Juan Daniel Maya Ramrez Ana Esmeralda Negrete Fras Arnulfo.

Profesor: Rafael Pea Ramrez

1. Estudio fitopatolgico: caracterizacin morfolgica del hongo Colletotrichum gloeosporioides patgeno de la guayaba (Psidium guajava L.1753). Introduccin. La guayaba (Psidium guajava) es una fruta climatrica en Mxico se distribuye en 27 estados. El principal productor es Aguascalientes, seguido por Zacatecas, Oaxaca y Guerrero, que aportan el 56.7%, 11.7%, 8.6% y 5.6% de la produccin, respectivamente (1). El fruto es una baya esfrica, globulosa, elipsoidal o piriforme; sus dimensiones varan enormemente de una variedad a otra; es averrugado o liso, densamente punteado, brillante, con 5 a 12 cm de largo y 5 a 7 cm de ancho; su peso va de 30 a 225 g. La baya en el exterior presenta un color amarillo verdoso y amarillo claro en su plena madurez; en algunos tipos se distingue un tinte ligeramente rosado en el lado expuesto. El color de su carne es muy variable: puede ser blanco, blanco amarillento, rosado, amarillo, naranja y salmn (Ochse, 1976). El fruto vara de casco delgado con muchas semillas a casco grueso con pocas semillas. En la epidermis y el mesocarpio se hallan clulas duras, esclereidas, solas o en grupos, que le dan la consistencia arenosa caracterstica; en el centro se encuentra una masa de material pulposo, donde se encuentran depositadas las semillas (1). La mayora de los problemas con enfermedades postcosecha empiezan en la huerta como infecciones latentes en las frutas en desarrollo. Las enfermedades incluyen: antracnosis causada por el hongo Colletrotrichum gloeosporioides y especies asociadas, pudricin causada por Aspergillus niger, Mucor hiemalis, Phomopsis destructum y Rhizopus stolonifer. Las estrategias para el control de enfermedades incluyen: buena sanidad de las huertas, manejo eficiente para reducir infecciones precosecha, manejo cuidadoso para reducir los daos fsicos, inmediato enfriamiento a 10C y subsecuente mantenimiento de esta temperatura a travs de todo el sistema de manejo (Freeman et al., 1997). La antracnosis causada por el hongo Colletotrichium gloeosporioides es la enfermedad ms importante de las que afectan la fruticultura en el mbito mundial y nacional, debido a la severidad de los daos que ocasiona, a la magnitud de las prdidas que genera tanto en produccin como en calidad de la cosecha y a la dificultad que se presenta para su control (Freeman et al., 1997). La antracnosis ataca hojas y frutos, formando en el follaje lesiones que se localizan especialmente en las hojas ms viejas y se presentan como manchas necrticas concntricas de color negro a lo largo de las nervaduras, siendo ms conspicuas en el envs. Las lesiones en los frutos aparecen ligeramente hundidas, de color negro y bien definidas (Freeman S. 2000.). Colletotrichum gloeosporioides es un microorganismo que en la naturaleza vive de la materia orgnica y en ocasiones especiales tiene la capacidad de volverse patgeno, prefiriendo atacar tejidos muy jvenes o tejidos muy viejos y

fsicamente dbiles. Los ataques ms severos a los frutos ocurren cuando coinciden el estado ms susceptible del cultivo (floracin, fructificacin) con un tiempo lluvioso y das de permanente humedad relativa, mayor del 90%. Las fuentes de inculo se encuentran en las hojas, ramas, inflorescencias, brcteas de las flores y en los frutos, en trminos generales en todo el rbol (Aranzazu, 1999). Planteamiento del problema. Los estudios han demostrado que este patgeno tiene gran facilidad para asociarse con otros microorganismos, especialmente con bacterias del tipo Pseudomonas, que actan en asocio (sinergismo) y le permiten una mejor germinacin y formacin de rganos que le facilitan la infeccin (apresorio), mientras la bacteria se beneficia, obteniendo del lugar donde producen las esporas elementos nutritivos como el hierro para formar metabolitos (siderforos) (Aranzazu 1999; Rondn, 1999). Prdidas causadas por efecto de la enfermedad se dan en diferentes estados de crecimiento vegetativo, sobre todo en cada prematura de inflorescencias y frutos, ocasionando disfunciones fotosintticas y fisiolgicas, y prdidas postcosecha por fenmenos de infecciones, ocasionando perdidas a los agricultores. (Franco et al. 2002.). Objetivo general. Aislar y realizar la caracterizacin morfolgica del hongo Colletotrichum gloeosporioides patgeno de la guayaba. Objetivos especficos. 1.- Aislar por siembra directa el hongo Colletotrichum gloeosporioides en medio de cultivo Agar Papa Dextrosa 2.- Determinar los tipos de colonias y las caractersticas morfolgicas que presenten. 3.- Realizar pruebas de patogenicidad en hojas, tallos y frutos para determinar el grado de lesin presentada Metodologa. La metodologa se lleva a cabo en dos etapas: 1) Etapa de campo

Se obtuvieron muestras de hojas y ramas con los sntomas tpicos de la enfermedad (Figura 1). El muestreo se realiz en un huerto del municipio de Irapuato, las muestras fueron marcadas y preservadas en refrigeracin hasta su uso en el laboratorio.

Fig. 1: Sntomas de antracnosis en hojas de guayabas 2) Etapa de laboratorio:

A) Antes de iniciar en el laboratorio, se mantuvo el mayor cuidado en la limpieza del material y del laboratorio mismo para poder obtener un trabajo confiable. Los materiales de vidrio y cualquier otro material se limpiaron profundamente antes de comenzar el trabajo. B) Aislamiento del hongo: En el Laboratorio de Microbiologa del Instituto Tecnolgico Superior de Irapuato, se hicieron cortes de las manchas oscuras que indican la presencia del hongo de las hojas (figura 2).

Fig. 2: Manchas oscuras, zona de corte. Se prepar el medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) con las siguientes concentraciones: 9.75 g del medio para 250 ml. Se realiz la esterilizacin del medio de cultivo utilizando la olla exprs (121 lb/ 15 min), una vez terminada la esterilizacin se inici el vaciado del medio en las cajas Petri en las campana de extraccin, el vaciado se realiz teniendo cuidado de no pasar objetos o las manos sobre las cajas que ya contenan el medio de cultivo, el vaciado fue en torre (figura 3). Para disminuir la

contaminacin tambin se utilizaron dos mecheros de alcohol al 90% que rodeaban el rea de trabajo separados unos treinta centmetros entre cada uno (figura 4). Una vez terminado el vaciado se esper hasta que se enfri el medio que ya estaba en las cajas Petri, cuando se solidific el medio, las cajas se sellaron con cinta egapack (figura 4) y se guardaron en la caja de materiales hasta realizar la siembra del hongo en el laboratorio.

Fig. 3: Vaciado en torre

Fig. 4: Sellado con cinta egapack

Los aislamientos se obtuvieron por siembra directa en medio Papa Dextrosa Agar (PDA), con un asa de siembra, colocando un pequeo corte de tejido que presentaba el sntoma. La siembra se realiz por puncin en ngulo recto en el centro de la caja Petri que contena el medio de cultivo PDA (figura 5). Una vez terminada la siembra del tejido daado, se mantuvo a temperatura ambiente hasta que en las cajas de Petri se present crecimiento del hongo.

Fig. 5: Siembra de tejido con posible hongo

C) Se realiz la caracterizacin morfolgica. Se observ el inicio de crecimiento del hongo y as cada 2 das para identificar estructuras, los tipos de crecimiento (el cual se mide de lado a lado pasando por el centro en dos puntos de la colonia), aspecto, textura y coloracin de ambas caras y la produccin de pigmentos. D) Pruebas de patogenicidad: Se preparar una suspensin de esporas agregando agua destilada estril a las cajas petri para resuspender las esporas, posteriormente se filtrara en gasa para evitar el paso de micelio y de medio. Para la inoculacin se utilizaran estacas (tallos, ramas) de 15 cm., hojas y frutos de plantas de guayaba sanas, se realizaran tres repeticiones por tratamiento, los tratamientos sern: d.1. Puncin de estacas: Mediante aguja hipodrmica, se realizaran ocho punciones, seguidamente la suspensin del hongo ser asperjada. d.2. Mtodo de herida: Se realizara un corte con bistur, enseguida sern colocados fragmentos de medio PDA con hongo. d.3. Puncin en hojas: Se realizaran ocho punciones a los tres foliolos igual que a las estacas ya descritas anteriormente. d.4. Aspersin en fruto. En todos los tratamientos se haran controles con material vegetal con y sin herida, asperjados solo con agua estril. Los cuatro tratamientos sern puestos en cmara hmeda a 23 C, bajo condiciones de oscuridad durante 15 das. Para la evaluacin de las pruebas de patogenicidad, se realizara una escala con el grado de lesin presentada (manchas de coloracin caf) as: 0 1 2 3 Sin sntomas. Sntomas leves. Varios lesiones (Coalescencia). Deterioro total (Muerte de tejidos).

Las evaluaciones para todas las pruebas se realizaran cada dos das durante 15 das. Resultados. Se realiz la preparacin del medio. Este procedimiento tuvo que repetirse dos veces ya que la primera vez que se vaci el medio de cultivo en cajas petri fue de manera tradicional, ordenadas en filas estando destapadas hasta que se solidific el medio para despus taparlas y sellarlas, lo cual provoc que las cajas con medio de cultivo presentarn crecimiento de hongos en ocho cajas de diez que contenan medio de cultivo (figura 7), esto provoc que la siembra del tejido con la probable presencia del hongo se retrasara. Se prepar medio de cultivo por segunda vez y el vaciado se realiz ahora en torre (figura 8), de igual forma teniendo las mismas precauciones para disminuir

la contaminacin y se guardaron, cuando se revisaron las cajas antes de sembrar el hongo, las cajas petri con medio de cultivo no presentaban contaminacin interna, solo se present contaminacin a los costados de las cajas en la parte externa donde se encontraba la cinta egapack esto fue provocado porque las cajas petri guardaron agua de condensacin, pero sta no afect el interior de las cajas con medio de cultivo, as que antes de iniciar la siembra del tejido daado se utilizo alcohol al 70% para esterilizar y desinfectar la parte externa de la caja.

Fig. 7. Arreglo en lnea de las cajas Petri

Fig. 8. Arreglo en torre de las cajas Petri.

La siembra del tejido con la probable presencia del hongo se realiz en la campana de extraccin y se guard a temperatura ambiente. Previo a la siembra de tejido infectado, se realiz el lavado con Hipoclorito de Sodio 0.01% por tres veces y se enjuag con agua destilada estril. Se realizaron cortes pequeos que fueron sembrados directamente en la caja Petri y se dejaron incubando a temperatura ambiente. Una vez crecido el hongo, en un portaobjetos coloc una gota de agua destilada y se adicion una pequea muestra del hongo con ayuda de un asa bacteriolgica. Se agreg una gota de azul de bromofenol, se coloc el cubreobjetos y se observ en el microscopio. Caracterizacin morfolgica del hongo Colletotrichum gloeosporioides.

2

Fotografa tomada en laboratorio. 1. Hifas. 2. Conidio.

1

3 Fotografa de Freeman et al., 1997. 3. Hifas. 4. Conidios.

4

Cepa del hongo Colletotrichum gloeosporioides

Discusin. Se obtuvieron los rganos vegetales afectados con necrosis y se colocaron en medio PDA donde se aisl el patgeno para su crecimiento. Los resultados obtenidos en el inicio del proyecto indican que se requiere un mayor cuidado al momento de vaciar el medio de cultivo a las cajas Petri, ya que hubo contaminacin en el primer ensayo. Para la caracterizacin del micelio se realizaron observaciones directas en las placas y se determino la morfologa, coloracin y la presencia de clamidosporas, que coincide con lo de la literatura al presentar morfologa similar con formacin de abundante micelio areo, las hifas presentaban coloracin marrn y clamidosporas irregulares en tamao y forma. Existen muy pocos estudios sobre antracnosis de la guayaba, y una de las preocupaciones sobre esta enfermedad es la correcta identificacin, de manera cvomun esta enfermedad es provocada por el hongo Colletotrichum gloeosporioides, pero en estudios recientes han comprobado que la enfermedad es causada por dos hongos C. gloeosporioides y C. acutatum La bsqueda de alternativas duraderas para el control de enfermedades vegetales y que adems sean amables con el ambiente, como es el caso del uso de elicitores fngicos (molculas derivadas del hongo que son capaces de estimular mecanismos metablicos de defensa vegetal) requiere, entre otros, del conocimiento de la biologa y de las caractersticas ptimas de cultivo del patgeno.

Conclusin.

Se realiz el aislamiento del hongo Colletotrichum gloeosporioides de hojas de rbol de guayaba que presentaba sntomas de infeccin por el agente de inters y se logr la observacin de estructuras morfolgicas tales como las hifas y conidios, con las que se pudo realizar la caracterizacin morfolgica del hongo para poder compararla con las caractersticas de la literatura, con los que se lleg a la conclusin de que el hongo aislado corresponde a Colletotrichum gloeosporioides. Bibliografa. Aranzazu, F. (1999). Determinacin de la presencia de enfermedades quiescentes causadas por (Colletotrichum gloeosporioides Penz). En: Frutos de tomate de rbol (Cyphomandra betacea). Convenio CORPOICAPRONATTA. p. 20 (1) http://www.conabio.gob.mx/conocimiento/info_especies/arboles/doctos/52myrta3m.pdf Franco G. y Giraldo M. 2002. El cultivo de la mora. Corpoica Regional 9. 78 pp. Freeman S. y Katan. 1997. Identification of Colletotrichum species responsible for anthracnose and root necrosis of strawberry in Israel.. Phytopathology 87:516-521. Freeman S. 2000. Genetic diversity and host specificity of Colletotrichum species on various fruits. In: Colletotrichum Host Specificity, Pathology, and Host-Pathogen Interaction. APS Press. USA. pp: 131-144. Rondn, G. et al. (1999). Estudios biolgicos y epidemiolgicos de la antracnosis del tomate de rbol y generacin de alternativas para su manejo integrado en Colombia. p.147 Anexo 1: medio de cultivo utilizado Papa dextrosa agar (PDA) solido Es un medio muy usado que sirve para aislar todo tipo de hongos. Beauveria, Paecilomyces, Lecanicillium (Verticillium) y Metarhizium, los ms importantes hongos parsitos de insectos, al igual que los parsitos de plantas y los hongos saprofitos crecen muy bien y esporulan en este medio. Con los mismos ingredientes, excluyendo el agar, se obtiene el medio lquido de Papa Dextrosa (PD), muy utilizado para la preparacin del inculo en forma masiva. Papa sin pelar 200 g Dextrosa 10 g Agar 18 g Agua destilada 1 litro

2. Caracterizacin de una variante del virus mosaico del pepino (CMV)

En diferentes pases donde se cultiva la azucena, se ha reportado slo cuatro virus que afectan a esta planta: virus mosaico del Hippeastrum (MhiV.Potyvirus), virus latente del Nerine (NeLV.Carlavirus), virus de la marchites manchada del tomate (TSWV.Tospovirus), y virus mosaico del pepino (CMV.Cucumovirus). En Mxico no se encontr informacin acerca de las enfermedades y patgenos que afectan a la azucena. Ciclo del N , la presencia del virus en los tejidos induce a la muerte del tejido y finalmente la muerte del organismo este proceso da pie a la siguiente fase con las bacterias descomponedoras que llevaran a cabo el proceso de desnitrificacion, en este proceso los nitratos son reducidos a nitrgeno, el cual se incorpora nuevamente a la atmsfera, este proceso se produce por la accin catablica de los organismos, estos viven en ambientes con escasez de oxgeno como sedimentos, suelos profundos, etc. Las bacterias utilizan los nitratos para sustituir al oxgeno como aceptor final de los electrones que se desprenden durante la respiracin. De esta manera el ciclo se cierra. Objetivo. Identificar y caracterizar al agente causal del moteado amarillo en la planta denominada azucena. Metodologa. Material. - Plantas de azucena que presenten signos de infeccin por CMV.

Moteado amarillo en hojas

-

Solucin amortiguadora (Fosfato de sodio 0.02 M a pH=7. Carborundum.

Mtodo. Aislamiento del virus e induccin de la infeccin en plantas sanas.

Fueron recolectadas porciones de hojas de azucenas con sntomas y se maceraron en una solucin amortiguadora (fosfato de sodio 0.02 M, pH 7). El macerado se froto usando un hisopo de algodn en hojas de 5 diferentes plntulas sanas, previamente espolvoreadas con carborundum. Las hojas inoculadas fueron lavadas con agua para eliminar los residuos del macerado y del carborundum.

Las plantas inoculadas se incubaron en invernadero a 25-35C, con un fotoperiodo de 12 h y humedad relativa de 70-80%, hasta la aparicin de sntomas. Se prepar la solucin amortiguadora de fosfatos (fosfato de sodio 0.02 M, pH 7), los clculos fueron los siguientes: M = no moles / Vol No de moles = (M)(Vol) = (0.02 M)(0.1 L) = 0.002 No de moles = gr de soluto / PM Gr de soluto = (no moles)(PM) = (0.002)(138) = 0.276 gr

Una vez preparada la solucin, se midi el pH que fue de 4.5 y se ajust a 7 con NaOH al 1%.

Se maceraron porciones de las hojas de plantas que presentaban sntomas de infeccin por CMV y se les adicion la solucin amortiguadora previamente preparada. Esta mezcla se aplic a plantas sanas con ayuda de un hisopo estril. Las plantas infectadas se dejaron en incubacin en un invernadero a 25-35C, con un fotoperiodo de 12 h y humedad relativa de 70-80% aproximadamente, hasta la aparicin de sntomas.

Resultados. Se realiz la infeccin de plantas sanas mediante inoculacin de tejido enfermo macerado en una solucin amortiguadora. Este tratamiento result positivo al comenzar a mostrar sintomatologa propia del virus del mosaico amarillo. Resultados. Inoculo Fig. 1. Virus en una planta enferma colectada

Fig. 2. Macerado en solucin amortiguadora de fosfatos al 0.02 M pH=7

Fig. 3. Experimento fijado, 2 repeticiones en hojas verdaderas adultas y jvenes

Fig. 4. Inoculacin de las plantas

Fig. 5. Aparicin de los sntomas

Sntomas segn bibliografa.

Fig. 6. Sntoma extendindose en el tejido

Fig. 7. Clorosis y necrosis en el rea afectada

Fig. 8. Clorosis

Sntomas propios del virus: 2. Clorosis en las hojas 3. Deformidad de las hojas 4. Necrosis en estadios avanzados 5. Enroscamiento de las hojas 6. Enanismo

Discusin. La aparicin de sntomas en plantas indicadores inoculadas mecnicamente con los macerados de hojas de azucena con el moteado amarillo ocurri entre los 8 y 15 das despus de permanecer en el invernadero y se asociaron a los causados tpicamente por alguna clase de virus. El aislamiento de virus resulta un proceso algo complicado debido principalmente a la infraestructura del laboratorio del ITESI ya que para realizar la identificacin a fondo del organismo de inters son necesarias tcnicas de inmunoadsorcin enzimtica en fase doble sndwich (DAS-ELISA), as como el uso de microscopa electrnica. Sumado a las tcnicas antes mencionadas, se puede obtener RNA de doble cadena con el objeto de determinar el nmero de componentes virales y detectar posibles infecciones latentes por virus desconocidos. Conclusin. Se logr la infeccin de plantas sanas de azucena con el virus del mosaico del pepino mediante inoculacin mecnica del macerado de hojas de azucena con el moteado amarillo. Se observ que el periodo de infeccin es relativamente corto y slo requiere estrs mecnico para entrar en los tejidos.

Literatura consultada. Gutirrez, V.C; Ruz, M.R; Piedra, I.E & De la Torre, A.R. 2004. Caracterizacin de una variante del virus mosaico del pepino (CMV) asociada con los sntomas de moteado amarillo de la azucena (Hippeastrum hybridum Leopoldii) en Mxico. Rev. Agrociencia. Vol. 38. No. 003

3. Aislamiento de bacterias del gnero Lactobacillus con capacidad probitica. Introduccin. Existe una estrecha relacin entre la dieta y el estado de salud. En los ltimos aos se ha observado un creciente inters tanto por la comunidad cientfica como por parte de la poblaci por el papel de los probiticos en la salud humana (Desmazeaud, 1996). La asociacin sin duda ms conocida de probiticos con derivados lcteos fermentados, es la que corresponde a Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricus y Streptococcus thermophilus, tradicionalmente utilizada en la produccin del yogur. En la actualidad, el abanico de cepas se ha incrementado con otros microorganismos que pueden estar presentes en la microbiota intestinal, como por ejemplo, otras especies de Lactobacillus, especies de Bifidobacterium, Saccharomyces, cepas de Escherichia coli e incluso de especies del gnero Enterococcus (Dominguez-Bello, 2008). Las bacterias probiticas son microorganismos vivos que pertenecen a la microbiota natural humana y se caracterizan por tener una mnima o nula capacidad patgena, as como por desempear funciones favorables sobre la salud y el bienestar de los huspedes (Rodrguez, 2009). Las bacterias probiticas, tanto autctonas como las aportadas al organismo mediante la alimentacin pueden controlar la instauracin y/o el desarrollo de diversos microorganismos patgenos, entre los que destacan Salmonella typhimurium, Shigella spp., Clostridium difficile, Campylobacter jejuni y Escherichia coli, y tambin proporcionan una proteccin importante frente a patgenos urogenitales como Gardnerella vaginalis, Bacteroides bivius, Candida albicans y Chlamydia trachomatis (Hilton et al., 1995). Ciclo del N, los lactobacilos necesitan una fuente de carbono y nitrgeno para desarrollarse ,estas necesidades son proporcionadas por el medio en donde se desenvuelven, La peptona y glucosa constituyen la fuente de nitrgeno ,entonces actan como consumidores del nitrgeno Algunos bacilos forman parte de la flora intestinal normal y pueden predominar en lactantes e individuos con ingestin elevadas de azcares, especialmente lactosa. De manera que se integran en el metabolismo de algunos mamferos y estn involucrados en la degradacin de compuestos que sern arrojados en forma de desechos por los vertebrados y sern desnitrificados en suelo por otros agentes bacterianos para ser reincorporados a la atmosfera. Medio para aislamiento. El medio a utilizar es agar MRS (desarrollado por Man, Rogosa y Sharpe) para lactobacilos. En laboratorio no se cuenta con el medio ya preparado por lo que se requiere prepararlo con los reactivos que se muestran en la Tabla 1. Tabla 1. Ingredientes del agar MRS. Frmula (en gramos por litro) Peptona de carne 10.0 Extracto de carne 8.0 Extracto de levadura 4.0 Dextrosa 20.0 Sorbitol 1 ml Instrucciones Suspender 64 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullicin durante 1 2 minutos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 C.

Fosfato dipotsico Acetato de sodio Sulfato de amonio Sulfato de magnesio Sulfato de manganeso Agar

2.0 5.0 2.0 0.2 0.05 13.0 pH final: 6.4 0.2

Objetivo. Realizar el aislamiento de bacterias del gnero Lactobacillus provenientes de alimentos lcticos. Metodologa. Material. - Agar MRS. Diferentes productos lcteos que contienen lactobacilos (yogurth, leche en polvo)

Mtodo. 1. De cada muestra de producto lcteo que contiene lactobacilos, se obtuvo una alcuota de 0,1 ml que se cultiv en cajas petri de agar MRS, medio selectivo para BAL (Rogosa et al., 1951). (Bacterias acidolacticas). 2. Las cajas petri se incubaron durante 72 h a 30C. 3. A partir de caja se separaron los diferentes morfotipos coloniales.

4. Se procedi a identificar las colonias por medio de los bacilos Gram positivos. 5. Conservacin de los aislamientos bacterianos: Cada una de las cepas seleccionadas fue inoculada en tubos de ensayo con agua destilada. Para su conservacin a largo plazo, las cepas sern congeladas a -70C en glicerol al 20%. Resultados. El medio de cultivo MRS no se encontraba disponible en el laboratorio del ITESI, por lo que se prepar segn las indicaciones antes mencionadas.

Una vez preparado el medio en las caja Petri, se realiz la inoculacin:

Colonias de lactobacilos en agar MRS

Ya crecidas las colonias, se procedi a realizar la tincin de Gram, que result positiva.

Lactobacilos vistos al microscopio.

En agar MRS la mayora de las colonias de lactobacilos que aparecen son blancas, grandes y con bordes bien definidos

Discusin. Descripcin de la especie Lactobacilos casei En el sistema de clasificacin tradicional Lb. casei es una bacteria Gram (+) que pertenece al subgnero Streptobacterium, que incluye organismos homofermentativos que pueden crecer a 15 C con un mximo de 41C. Su contenido de G+C es de 45-47% y produce cido L-lctico como principal producto metablico a partir de glucosa, sacarosa, lactosa fructosa y maltosa. Produce adems vitaminas B1, B2, B6, B12. El patrn de utilizacin de carbohidratos por esta cepa es similar al observado en otras cepas de Lb. casei. Su capacidad de utilizar la lactosa esta controlada por un plsmido. La viabilidad de Lb. casei cepa Shirota en el intestino despus de su administracin oral tiene importantes implicaciones en la evaluacin de sus efectos biolgicos. Los jugos gstricos constituyen la primera barrera antibacteriana cuando Lb. casei Shirota es administrado oralmente. En los humanos son secretados diariamente de 1-2 l. de jugos gstricos que contienen pepsina y cido clorhdrico que poseen un potente efecto antibacteriano. La viabilidad de esta cepa en jugos gstricos fue analizada cultivando este microorganismo en una preparacin de jugo gstrico artificial empleando un medio de cultivo estndar suplementado con cido clorhdrico y pepsina. Se observa que Lb. casei Shirota sobreve en esta preparacin artificial con un pH de 2.7, mientras el nmero de clulas viables disminuye rpidamente a pH 2.5. Lb. casei cepa Shirota muestra ser ms resistente a los jugos gstricos que cualquier otra bacteria lctica empleada en la elaboracin de productos lcteos, sin embargo, muestra una disminucin en su nmero en un pH de 3.0.

En el duodeno, donde el pH se incrementa hasta 7.0, la tripsina y la bilis actan tambin como agentes antibacterianos. Esta cepa tambin fue sometida a una preparacin artificial del contenido duodenal. Presentando un desarrollo lento y con una disminucin en su tasa de crecimiento conforme se incremento la concentracin de bilis en esta preparacin. Los cidos deoxiclico y cido quenodeoxiclico, que son el resultado de la desconjugacin bacteriana intestinal de los cidos biliares tienen tambin una potente actividad bactericida. Hasta el momento, Lb. casei Shirota parece ser el segundo microorganismo ms resistente al cido deoxiclico (50ml/m1) despus de Enterococcus faecalis ATTC 10541. A pesar de la dificultad de determinar el comportamiento de Lb. casei Shirota en el intestino humano, a partir de estas evidencias in vitro es posible inferir, que este microorganismo es capaz de sobrevivir en el tracto gastrointestinal del humano. De hecho, el nmero de este microorganismo recuperado en muestras fecales despus de su administracin oral esta reportado que corresponde a un 200 al 600% del nmero inicial administrado. Conclusin. Se logr el aislamiento de Lactobacilus casei provenientes del producto lcteo denominado Yakult. La siembra de otros productos lcteos como Sofl y yogurth Biobalance no dio resultados positivos al no observarse crecimiento de colonias en el medio de cultivo. Literatura citada. Desmazeaud, M. (1996) Las bacterias lcticas de la alimentacin humana: utilizacin e inoculacin. Cuadernos de Agricultura. No. 5 pp 331-343 Dominguez-Bello, M.G. y Blaser, M.J. (2008) Tienes probiticos en tu futuro? Rev. Microbios e Infeccin. No. 10. Vol. 9 pp 1072-1076 Hilton, E., Rindos, P. e Isenberg H.D. (1995) Lactobacillus GG. Journal of Clinical Microbiology. No. 33. Rodrguez G.M. (2009) Aislamiento y seleccin de cepas del gnero Lactobacillus con capacidad probitica e inmunomoduladora. Departamento de Gentica y Microbiologa. Universidad Autnoma de Barcelona.