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CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE UNA CEPA DE VIRUS ZIKA AISLADA EN
SINCELEJO, COLOMBIA
CARLOS ALBERTO SERMEÑO CORREA
FACULTAD DE EDUCACIÓN Y CIENCIAS
PROGRAMA DE BIOLOGÍA
UNIVERSIDAD DE SUCRE
SINCELEJO - SUCRE
2018
CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE UNA CEPA DE VIRUS ZIKA AISLADA EN
SINCELEJO, COLOMBIA
Carlos Alberto Sermeño Correa
Trabajo de grado modalidad investigativa como requisito parcial para optar al título de
BIÓLOGO
Director:
Erwin Camacho Burgos
BSc. MSc. PhD (c)
Co-Director:
Margaret Paternina Gómez
BSc. MSc. PhD (c)
FACULTAD DE EDUCACIÓN Y CIENCIAS
PROGRAMA DE BIOLOGÍA
UNIVERSIDAD DE SUCRE
SINCELEJO - SUCRE
2018
NOTA DE ACEPTACIÓN
_____________________
_____________________
_____________________
_____________________
______________________________
PhD. Eduar Elías Bejarano Martínez
______________________________
PhD. Luis Enrique Paternina Tuirán
Sincelejo, 21 de mayo de 2018.
DEDICATORIA
A mi madre, mi gran apoyo, a quien debo todo lo que soy.
A todas las personas que han sufrido las consecuencias ocasionadas por el virus Zika; a padres y
a niños a quienes sus sueños y anhelos pudieron ser truncados.
“El corazón del hombre genera muchos proyectos, pero al final prevalecen los planes
designados por Dios” Proverbios 19:21
AGRADECIMIENTOS
A Dios, mi guía, mi sustento.
Al Doctor Pedro Blanco, por permitirme ser parte del grupo Investigaciones Biomédicas;
agradecerle por el apoyo y por demostrar con su ejemplo que con constancia y disciplina, se pueden
alcanzar grandes logros.
A mis tutores, por su valioso tiempo y dedicación, por enseñarme tanto en este camino, por su
confianza y ser un pilar en mi formación como investigador. Sin ellos no hubiera sido posible el
desarrollo de esta investigación.
A Juan Mercado, al profesor Alveiro Pérez y a Merab Manjarrez, por la colecta de los mosquitos.
A los evaluadores, por aceptar calificar este trabajo.
A los profesores adscritos al programa, quienes fueron parte importante en mi desarrollo como
Biólogo.
A mis compañeros de estudio, amigos e integrantes del grupo Investigaciones Biomédicas, por su
apoyo y sus enseñanzas.
Únicamente los autores son responsables de las ideas expuestas en este trabajo.
(Artículo 12 Resolución 02 de 2003)
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
LISTA DE TABLAS ................................................................................................................... VIII
LISTA DE GRÁFICAS ................................................................................................................ IX
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................................... X
LISTA DE ANEXOS .................................................................................................................... XI
ABREVIACIONES ...................................................................................................................... XII
RESUMEN .................................................................................................................................. XIII
ABSTRACT ................................................................................................................................XIV
INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 15
1. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 17
1.1 Objetivo general .............................................................................................................. 17
1.2 Objetivos específicos ....................................................................................................... 17
2. MARCO REFERENCIAL ...................................................................................................... 18
2.1 Antecedentes .................................................................................................................... 18
2.2 Marco teórico conceptual ................................................................................................ 19
2.2.1 Arbovirus .................................................................................................................. 19
2.2.2 Epidemiología .......................................................................................................... 20
2.2.3 Características del virus Zika ................................................................................... 21
2.2.4 Interacción virus-hospedero ..................................................................................... 24
2.2.5 Patogénesis ............................................................................................................... 27
2.2.6 Síntomas y signos clínicos ....................................................................................... 28
2.2.7 Diagnóstico ............................................................................................................... 28
3. METODOLOGÍA ................................................................................................................... 30
3.1 Cepa viral ......................................................................................................................... 30
3.2 Extracción de ARN .......................................................................................................... 30
3.3 Diseño de cebadores ........................................................................................................ 30
3.4 Transcripción Inversa (RT) y Reacción en Cadena de la Polimerasa Touchdown (PCR-
TD)............................................................................................................................................. 31
3.5 Purificación de bandas y secuenciación .......................................................................... 33
3.6 Ensamblaje del genoma ................................................................................................... 34
3.7 Identificación de cambios nucleotídicos y aminoacídicos .............................................. 34
3.8 Determinación de la estructura secundaria de 3’ UTR .................................................... 34
3.9 Análisis filogenético y reloj molecular ............................................................................ 34
3.10 Cultivo celular e infección in vitro .................................................................................. 37
3.11 Ensayo de placa y cinética de crecimiento viral .............................................................. 37
4. RESULTADOS ....................................................................................................................... 39
4.1 Caracterización genética de COL345Si ........................................................................... 39
4.2 Cambios nucleotídicos y aminoacídicos .......................................................................... 40
4.3 Determinación de la estructura secundaria de 3’ UTR .................................................... 45
4.4 Análisis filogenético y estimaciones por reloj molecular ................................................ 47
4.5 Cinética de crecimiento viral ........................................................................................... 53
5. DISCUSIÓN ........................................................................................................................... 57
6. CONCLUSIÓN ....................................................................................................................... 66
7. RECOMENDACIONES ......................................................................................................... 67
LISTA DE REFERENCIAS .......................................................................................................... 68
ANEXOS ........................................................................................................................................ 77
LISTA DE TABLAS VIII
Pág.
Tabla 1. Función de las proteínas del virus Zika. .......................................................................... 23
Tabla 2. Mezcla de la primera fase de reacción para la síntesis de ADNc con M-MLV RT
(Invitrogen) ..................................................................................................................................... 31
Tabla 3. Mezcla de la segunda fase de reacción para la síntesis de ADNc con M-MLV RT
(Invitrogen) ..................................................................................................................................... 32
Tabla 4. Mezcla de reacción para amplificación del genoma viral con la enzima Q5® High-Fidelity
DNA Polymerase (New England Biolabs) ..................................................................................... 32
Tabla 5. Frecuencia de nucleótidos en el genoma viral de la cepa COL345Si ............................. 39
LISTA DE GRÁFICAS IX
Pág.
Gráfica 1. Cinética de crecimiento in vitro de cepas de ZIKV en diferentes líneas celulares ...... 54
LISTA DE FIGURAS X
Pág.
Figura 1. Esquema de la organización del genoma y proteínas virales de Zika .......................... 22
Figura 2. Representación de la superficie viral (a-c) y corte transversal (b-d) del virus Zika ..... 27
Figura 3. Distribución del contenido de G-C en el genoma viral de la cepa COL345Si ............. 40
Figura 4. Cambios nucleotídicos de secuencias de ZIKV aisladas en América, en comparación
con la secuencia disponible más antigua del continente (Brasil2015; GenBank: KY558989.1). .. 41
Figura 5. Cambios nucleotídicos en los genomas de ZIKV aislados en Colombia, con respecto a
la secuencia más antigua del país (Bolívar2015; GenBank: KX548902.1) ................................... 42
Figura 6. Frecuencia de la sustitución nucleotídica estimada para las tres posiciones del codón en
genomas de ZIKV aislados en América ......................................................................................... 43
Figura 7. Cambios aminoacídicos en las proteínas de cepas de ZIKV pertenecientes al linaje
asiático ............................................................................................................................................ 44
Figura 8. Estructura secundaria de la región 3’ UTR de cepas aisladas de humanos y mosquitos.
........................................................................................................................................................ 46
Figura 9. Árbol filogenético construido con secuencias de genomas completos de ZIKV aislados
de mosquitos y primates no humanos ............................................................................................ 48
Figura 10. Árbol de Máxima Verosimilitud generado con genomas de ZIKV pertenecientes al
linaje asiático .................................................................................................................................. 50
Figura 11. Reconstrucción filogenética de ZIKV en las Américas con reloj molecular .............. 51
Figura 12. Detalle del clado formado por cepas de ZIKV aisladas en Colombia, isla de Martinica,
Panamá, República Dominicana y Venezuela, en el árbol de Máxima Credibilidad generado con
BEAST ........................................................................................................................................... 52
Figura 13. Red filogenética de aislados de ZIKV pertenecientes al linaje asiático ..................... 53
LISTA DE ANEXOS XI
Pág.
Anexo 1. Cebadores utilizados para la secuenciación de COL345Si ............................................ 77
Anexo 2. Información y números de acceso en GenBank de las secuencias utilizadas para la
reconstrucción filogenética a partir de aislados de mosquitos y primates no humanos. ................ 79
Anexo 3. Información y números de acceso en GenBank de las secuencias utilizadas para la
reconstrucción filogenética a partir de aislados de humanos y mosquitos ..................................... 81
Anexo 4. Selección de modelos para análisis en BEAST. ............................................................. 88
Anexo 5. Visualización de la convergencia en Tracer v.1.6 del análisis ejecutado en BEAST, con
400 millones de pasos en MCMC .................................................................................................. 89
Anexo 6. Estimación de los parámetros ejecutados en BEAST con 400 millones de pasos en
MCMC ........................................................................................................................................... 90
ABREVIACIONES XII
ADN Ácido desoxirribonucleico
ARN Ácido ribonucleico
ZIKV Virus Zika
Aminoácidos:
A Alanina
D Ácido aspártico
E Ácido glutámico
F Fenilalanina
G Glicina
H Histidina
I Isoleucina
K Lisina
L Leucina
M Metionina
N Asparagina
P Prolina
R Arginina
S Serina
T Treonina
V Valina
W Triptófano
Y Tirosina
RESUMEN XIII
El virus Zika (ZIKV) fue el arbovirus causante de una gran emergencia de salud pública
internacional en 2016. A pesar de las múltiples investigaciones, hasta la fecha no existe consenso
de las razones que expliquen la asociación de la infección viral, con el desarrollo de síndromes
neurológicos en recién nacidos y en adultos, en la epidemia ocurrida en las Américas; así mimo, la
falta de secuencias genómicas ha dificultado entender la epidemiología y encontrar factores
asociados a la neurovirulencia. En el presente trabajo se caracterizó genéticamente una cepa de
ZIKV aislada a partir de mosquitos, durante el brote epidémico ocurrido en el 2015 en Sincelejo,
Colombia. Se analizaron genomas completos de virus aislados en otras regiones del país y del
mundo, con el propósito de determinar cambios nucleotídicos y aminoacídicos adquiridos por
ZIKV en Colombia, así como para establecer relaciones filogenéticas y estimar el tiempo de llegada
del virus al país. Se encontró que ZIKV en Colombia adquirió dos sustituciones únicas en las
proteínas no estructurales NS1 (R1118W) y NS5 (T3353A). Las inferencias filogenéticas sugieren
que el virus pudo haber ingresado a Colombia en marzo de 2015 desde el estado de Pernambuco,
Brasil, siete meses antes de la confirmación del primer caso, con una posible circulación simultánea
con los virus Dengue y Chikungunya; además, se determinó que ZIKV fue exportado desde
Colombia a la isla de Martinica, Panamá, República Dominicana y Venezuela.
Palabras clave: Flavivirus, filogenómica, mosquitos, secuenciación.
ABSTRACT XIV
Zika virus (ZIKV) was the arbovirus that caused a major international public health emergency in
2016. Despite the many investigations carried out, there is still no consensus about the means
explaining the association of the infection, with the development of neurological syndromes in
newborns and adults, in the epidemic in the Americas; likewise, the lack of genomic sequences has
made it difficult to understand the epidemiology and find factors associated with neurovirulence.
In the present work, a strain of ZIKV isolated from mosquitoes is genetically characterized during
the epidemic outbreak in 2015 in Sincelejo, Colombia. Complete genomes of viruses isolated in
others regions of the country and the world, were analyzed to determine nucleotide and amino acid
changes acquired by ZIKV in Colombia, as well as to establish phylogenetic relationships and
estimate the time of arrival of the virus into the country. We found that ZIKV in Colombia acquired
two unique substitutions in the non-structural proteins NS1 (R1118W) and NS5 (T3353A).
Phylogenetic inferences suggested that the virus could be introduced in Colombia in March 2015
from Pernambuco, Brazil, seven months before the confirmation of the first case, with possible
simultaneous circulation with Dengue and Chikungunya viruses; in addition, it was determined that
ZIKV was exported from Colombia to the island of Martinique, Panama, the Dominican Republic
and Venezuela.
Keywords: Flavivirus, phylogenomics, mosquitoes, sequencing.
15
INTRODUCCIÓN
Los últimos brotes epidémicos ocurridos en países de América, han sido causados por la
introducción al continente de dos virus originarios del este de África, el virus Chikungunya
(CHIKV) y el virus Zika (ZIKV) (Musso, Cao-Lormeau, & Gubler, 2015). La transmisión en la
mayoría de los países se ha dado debido a que albergan mosquitos de la especie Aedes aegypti,
considerado como vector principal, lo que ha permitido la alta prevalencia e incidencia de la
infección. Así como el virus Dengue (DENV), los virus CHIKV y ZIKV se transmiten entre
humanos y mosquitos, lo que explica la magnitud de los recientes brotes.
ZIKV llegó al continente americano en el 2014 (Tognarelli et al., 2016), su expansión fue
explosiva y la infección asociada al aumento de casos de malformaciones congénitas y síndromes
neurológicos (WHO, 2016). Factores como la globalización, las altas densidades del vector, el
cambio climático y la susceptibilidad inmunológica de la población, explican en parte la
propagación del virus. Por otro lado, aunque no existe un consenso definido, estudios demuestran
que mutaciones no sinónimas en el genoma adquiridas por ZIKV en su paso por Oceanía, lo
volvieron más neurovirulento; lo que sustentaría la asociación de la infección con el aumento de la
notificación de casos de microcefalia en recién nacidos y de síndrome de Guillain-Barré en adultos
(Yuan et al., 2017), a diferencia de la ausencia de estos reportes en epidemias ocurridas en África
y Asia.
Por la importancia de ZIKV en salud pública, estudios de genomas completos de cepas
circulantes en las Américas son necesarios, debido a que permitirían mejorar el entendimiento de
la biología viral, epidemiología molecular y puntualizar posibles genes responsables de la
virulencia; esto mediante el estudio y la identificación de mutaciones adquiridas en su introducción
16
al continente. La caracterización genética también proporcionaría información útil para el
desarrollo de vacunas y antivirales, a través de la identificación de genes involucrados en la evasión
de la respuesta inmune o de aquellos con capacidad para bloquear la acción de fármacos. Por lo
anterior, en el presente estudio se caracterizó genéticamente la cepa COL345Si, aislada de
mosquitos durante la epidemia de ZIKV en Sincelejo, Colombia (diciembre de 2015) y se comparó
la información genética del virus respecto a cepas circulantes en otras epidemias, para identificar
los cambios nucleotídicos y aminoacídicos que tuvo el virus en Colombia. Se realizaron análisis
filogenéticos y se propone una posible fecha de introducción al país, además, se caracteriza la
cinética de crecimiento de la cepa aislada en diferentes líneas celulares.
17
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
Caracterizar genéticamente la cepa de virus Zika COL345Si aislada en Sincelejo,
Colombia.
1.2 Objetivos específicos
Identificar mutaciones nucleotídicas y aminoacídicas adquiridas por COL345Si en
Colombia.
Establecer relaciones filogenéticas de COL345Si con secuencias de cepas aisladas en
distintos brotes epidémicos.
Caracterizar la cinética de crecimiento de COL345Si en diferentes líneas celulares.
18
2. MARCO REFERENCIAL
2.1 Antecedentes
Los primeros análisis filogenéticos del virus Zika (ZIKV) fueron desarrollados después del
brote ocurrido en la isla de Yap, Estados Federales de Micronesia (Lanciotti et al., 2008), desde
entonces, se han desarrollado investigaciones que han permitido identificar las mutaciones
adquiridas por el virus y entender como ocurrió su expansión en las actuales y pasadas epidemias.
Estudios del genoma evidenciaron que ZIKV en su divergencia al linaje asiático, obtuvo varios
cambios aminoacídicos en proteínas no estructurales (Pettersson et al., 2016). Por su paso en países
de Asía, adquirió mutaciones no sinónimas principalmente en la proteína de envoltura (proteína E),
que produjo tres sustituciones aminoacídicas (D683E, T777M y V763M) (Pettersson et al., 2016);
debido a que en la mayoría de los virus la proteína E cumple un papel primordial en la infección
celular y propagación, los cambios anteriores se consideran importantes mutaciones adaptativas.
En análisis retrospectivos de genomas de ZIKV durante la epidemia en la Polinesia
Francesa y en las islas de Samoa Americana, se evidenció una mutación puntal en el gen que
codifica para la proteína estructural prM, que causó un cambio aminoacídico de Serina por
Aspargina en el residuo 139 (S139N); además, se identificó una sustitución de Metionina/Treonina
por Valina en el residuo 2634 de la proteína NS5 (M/T2634V). La aparición de estos cambios
adquiridos por el virus, los cuales se han conservado de manera estable, coincidieron con el
aumento de casos de microcefalia y Síndrome de Guillain-Barré (Pettersson et al., 2016). Un año
más tarde, se comprobó experimentalmente que el fenotipo de ZIKV que posee la sustitución
S139N, a diferencia de otros fenotipos probados, potencia la neurovirulencia del virus (Yuan et al.,
2017); en cultivo de células progenitoras neuronales, la infección viral interrumpe la proliferación
y diferenciación de las células, y en modelos animales, los virus reducen el desarrollo del cerebro,
19
lo que provoca una microcefalia severa (Yuan et al., 2017). Seguidamente en cepas aisladas durante
el brote en América, se identificó una nueva mutación en el gen que codifica para la proteína NS1
(A982V), el cual incrementa la secreción de esta proteína en sangre de mamíferos infectados, lo
que aumenta la infectividad viral en A. aegypti, al alimentarse este de hospederos virémicos, debido
a que la presencia de NS1 potencia la replicación en el vector (Y. Liu et al., 2017); esto pudo
contribuir a la extensión del brote por el aumento de vectores infectados.
En Colombia se han realizado estudios filogenéticos y secuenciado genomas completos de
cepas de ZIKV aisladas en los departamentos de Atlántico, Cundinamarca y Santander (Cherabuddi
et al., 2016; Lahon et al., 2016; Metsky et al., 2017); sin embargo, hasta la fecha no existe un
análisis detallado de los cambios nucleotídicos y aminoacídicos adquiridos por ZIKV en Colombia,
análisis filogenéticos de cepas recientemente secuenciadas ni tampoco registro de genomas
completos provenientes de mosquitos; información que es importante para comprender la epidemia
en el país.
2.2 Marco teórico conceptual
2.2.1 Arbovirus.
Arbovirus por sus siglas en inglés (Arthropod Borne Virus), son virus transmitidos por
artrópodos hematófagos. Este grupo está conformado por virus de las familias Bunyaviridae,
Flaviviridae, y Togaviridae; también incluye al género Thogotovirus perteneciente a la familia
Orthomyxoviridae, y un único virus de ADN de la familia Asfarviridae, el Virus de la Peste Porcina
Africana (Weaver, 2006). Esta clasificación agrupa a unos 500 virus, de los cuales más de 150
infectan a humanos y animales (Pfeffer & Dobler, 2010). Por ser en su mayoría virus de ARN,
tienen una alta probabilidad de adquirir mutaciones, debido a la tasa de error de la ARN polimerasa
20
dependiente de ARN, que se estima en un rango de 10-3 a 10-5 errores por ronda de replicación
(Drake, 1999).
La circulación de estos virus ocurre en áreas selváticas, con una gran variedad de
hospederos que incluyen a primates, aves, roedores, murciélagos, reptiles, entre otros; y a vectores
como garrapatas, ácaros, moscas y principalmente mosquitos (Weaver & Barrett, 2004). Los
humanos son hospederos accidentales al momento de ser infectados en áreas selváticas, excepto en
el ciclo de transmisión del virus Dengue (DENV) en el cual es el reservorio principal.
2.2.2 Epidemiología.
El virus Zika fue aislado por primera vez en 1947, de una muestra de sangre proveniente de
un mono Rhesus (Macaca mulatta) en el bosque de Zika, localizado en el sur de Uganda, África
(Dick, Kitchen, & Haddow, 1952). Desde su descubrimiento el virus se propagó por el occidente
de África y Asia, con pocos casos documentados de infecciones a humanos (Fagbami, 1979; Filipe,
Martins, & Rocha, 1973; Simpson, 1964). En el 2007, se presentó el primer brote significativo por
fuera de los continentes asiático y africano, ocurrió en la isla de Yap, Estados Federales de
Micronesia, con 49 casos confirmados y un poco más del 70% de la población con anticuerpos IgM
específicos para el virus (Duffy et al., 2009). Posteriormente, el virus reemerge en el 2013 en la
Polinesia Francesa, con un reporte de 396 casos confirmados y más de 29.000 casos sospechosos
(Ioos et al., 2014).
ZIKV se introdujo en el continente americano por la isla de Pascua, Chile, a principios del
2014 (Tognarelli et al., 2016). Luego en Brasil, a inicios de 2015 se notificó el primer caso
autóctono (Zanluca et al., 2015); país que hasta la fecha ha reportado más de 369000 casos
(PAHO/WHO, 2018). El origen de introducción del virus en Brasil ha sido un tema controversial,
inicialmente se asumió que la Copa Mundial de Fútbol de la FIFA en junio – julio de 2014, fue el
21
escenario en el que se dio la introducción, pero al comprobar que no hubo participación en este
evento deportivo de países con circulación reportada de ZIKV, se propuso que la introducción pudo
darse durante el Campeonato Mundial Va´a de Sprint de canoas en Rio de Janeiro en agosto de
2014, en el que participaron deportistas de cuatro países del Pacifico (Nueva Caledonia, islas Cook,
isla de Pascua y la Polinesia Francesa) donde ZIKV había circulado (Faria et al., 2016). No
obstante, estudios recientes en el que se hicieron estimaciones de la ventana de introducción de
ZIKV en Brasil, a partir de modelos matemáticos, sugirieron que el virus se introdujo y se
estableció en Brasil por viajeros infectados que llegaron desde la Polinesia Francesa durante el
periodo comprendido entre octubre de 2013 y marzo de 2014 (Massad et al., 2017).
Posterior a su introducción, el virus se extendió hacia el norte del continente hasta llegar a
los Estados Unidos (PAHO/WHO, 2018), así mismo, se reportaron casos importados a países como
China y Francia (L. Liu et al., 2017; Sokal et al., 2016). En Colombia, se notificó su presencia en
octubre de 2015 (Ministerio de Salud y Protección Social, 2015), y se ha convertido en uno de los
países que más ha reportado casos por la infección, con más de 108700 notificaciones, estimándose
un número mayor por el subregistro de la enfermedad. La mayoría de los casos en Colombia se
registraron en los departamentos del Valle del Cauca, Santander y Norte de Santander. En Sucre,
se notificaron 1667 casos, la mayoría de su capital, Sincelejo (Camacho, Paternina-Gomez, Blanco,
Osorio, & Aliota, 2016; Instituto Nacional de Salud, 2016, 2017, 2018).
2.2.3 Características del virus Zika.
2.2.3.1 Clasificación filogenética.
ZIKV es miembro de la familia Flaviviridae, perteneciente al género Flavivirus. Análisis
filogenéticos, indican que está estrechamente relacionado con el virus Spondweni y cercano a otros
clados que incluyen a DENV y al virus Tembusu (Hayes, 2009). Se han descrito tres linajes de
22
ZIKV, dos linajes africanos (africano occidental y africano oriental) y un linaje asiático (Gong,
Gao, & Han, 2016); este último se originó a partir del brote en Malasia en 1966 (Ye et al., 2016).
Las cepas del linaje asiático que circularon durante el brote en la Polinesia Francesa en el 2013,
fueron las responsables de la epidemia en el continente americano (Wang, Thurmond, Islas, Hui,
& Hai, 2017).
2.2.3.2 Estructura, genoma y proteínas.
ZIKV es un virus envuelto con simetría icosaédrica, que posee un tamaño de 500 Å (Sirohi
et al., 2016). Su genoma es de ARN de cadena sencilla de sentido positivo con aproximadamente
10800 nucleótidos de longitud, el cual está conformado por un marco abierto de lectura (ORF)
flanqueado por dos regiones no codificantes 5’ UTR y 3’ UTR (Figura 1) (Kuno & Chang, 2007).
Figura 1. Esquema de la organización del genoma y proteínas virales de Zika. Modificado de:
https://talk.ictvonline.org
El extremo 5’ UTR posee una caperuza (CAP) seguida de dinucleótidos conservados (AG),
que constituyen una región importante para la traducción del genoma viral, así como para la evasión
23
de la respuesta inmune. El extremo 3’ UTR es altamente estructurado con regiones conservadas
entre flavivirus (Goertz, Abbo, Fros, & Pijlman, 2017). El ORF codifica para tres proteínas
estructurales (Cápside, Pre-Membrana/Membrana y Envoltura) que participan en la entrada y
salida del virus de la célula, además, de ser los principales blancos de la respuesta inmune
adaptativa (Lindenbach & Rice, 2003). El ORF también codifica siete proteínas no estructurales
(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5), que están involucradas en la replicación y
ensamble viral, así como en el antagonismo de la respuesta inmune innata del hospedero a la
infección (Tabla 1) (Lindenbach & Rice, 2003).
Tabla 1. Función de las proteínas del virus Zika.
Proteína Función Referencia
Cápside (C)
Forma la estructura icosaédrica del
virus en la que se encuentra
empaquetado el genoma viral. Regula
la expresión génica y síntesis de
ARN.
(Ni & Kao, 2013)
Precursora de
Membrana (prM)
Ayuda en el plegamiento de la
proteína E. Previene la fusión
prematura de los viriones.
(Mukhopadhyay, Kuhn,
& Rossmann, 2005;
Roby, Setoh, Hall, &
Khromykh, 2015)
Membrana (M) Estabilización de la proteína E. (Shi & Gao, 2017)
Envoltura (E)
Necesaria para la entrada a la célula
del hospedero, así como para la
fusión de la membrana endosomal.
Blanco de respuesta inmune.
(Shi & Gao, 2017)
NS1
Principal marcador antigénico.
Evasión de la respuesta inmune.
Formación del complejo de
replicación.
(Shi & Gao, 2017; Youn
et al., 2012)
NS2A Regula la replicación de ARN y el
ensamblaje viral. (Shi & Gao, 2017)
24
NS2B Actúa como un cofactor de NS3 para
el procesamiento de poliproteínas.
(Aguilera-Pesantes &
Mendez, 2017)
NS3
Fundamental para replicación viral y
procesamiento de la poliproteína
debido a su dominio N terminal junto
con el dominio C-terminal con
actividad helicasa.
(Shi & Gao, 2017)
NS4A
Bloquea la señalización de interferón
tipo I, induce la autofagia y protege
las células del hospedero de la muerte
durante la infección.
(Roosendaal, Westaway,
Khromykh, &
Mackenzie, 2006)
2K Antagonista de la actividad interferón
de NS4B.
(Munoz-Jordan et al.,
2005)
NS4B
Bloquea la señalización de interferón
tipo I y la interferencia de ARN.
Modulador de gránulos de estrés en
células hospederas.
(Roosendaal et al., 2006)
NS5
Actividad ARN polimerasa
dependiente de ARN. Adición de
caperuza al ARN genómico.
Actúa como un antagonista de la
respuesta del interferón.
(Grant et al., 2016; Shi &
Gao, 2017)
*NS: Proteínas no estructurales, No Structural, por sus siglas en inglés.
2.2.4 Interacción virus-hospedero.
2.2.4.1 Vectores y transmisión.
ZIKV es transmitido principalmente por mosquitos hembra del género Aedes (Stegomyia)
(Diptera: Culicidae), considerándose como vector principal en zonas urbanas a la especie A. aegypti
(Duffy et al., 2009). Los insectos vectores presentan un hábito hematófago, necesario para la
producción de huevos, por lo que la frecuencia de la ingestión en la picadura del mosquito favorece
el contacto entre el virus y los hospederos vertebrados (Beerntsen, James, & Christensen, 2000).
La interacción virus-vector inicia cuando los mosquitos adquieren el virus al ingerir sangre de un
25
hospedero virémico; en el intestino medio del insecto el virus infecta a las células epiteliales
replicándose rápidamente, atraviesa la lámina basal para alcanzar la hemolinfa y luego invadir a
otros órganos blanco como las glándulas salivales, donde mantiene una infección activa (Beerntsen
et al., 2000; Romoser et al., 2004). Los virus son liberados junto con la saliva en una ingesta de
sangre posterior (Pascoa et al., 2002).
ZIKV tiene dos ciclos de transmisión, un ciclo selvático, que involucra principalmente a
primates no humanos (McCrae & Kirya, 1982), así como a roedores y murciélagos (Olson et al.,
1983), y un ciclo urbano en el que son infectados humanos, convirtiéndose en amplificadores y
principales hospederos del virus (Aliota, Peinado, Velez, & Osorio, 2016). Además de la trasmisión
vectorial, se ha evidenciado la transmisión de humano a humano, por transmisión transplacentaria
(Calvet et al., 2016; Oliveira Melo et al., 2016), y en menor medida por transmisión sexual (Foy et
al., 2011) y transfusiones sanguíneas (Musso et al., 2014).
2.2.4.2 Ciclo de replicación.
En la transmisión vectorial, en el hospedero luego de la picadura del mosquito infectado,
los viriones infectan a células de la dermis y epidermis como fibroblastos, queratinocitos y células
dendríticas (Hamel et al., 2015), posteriormente migran hacia los ganglios linfáticos y se diseminan
por el torrente sanguíneo (Kumar, Krause, Azouz, Nakano, & Nerurkar, 2017).
Después de la unión de la proteína E del virus a receptores de superficie celular como DC-
SING (Moléculas de adhesión intercelular no asociada a integrina, específica de células
dendríticas) o miembros de la familia fosfatidilserina (AXL, Tyro 3 o TIM-1) (Hamel et al., 2015;
Tabata et al., 2016), se da la internalización del virus mediada por endocitosis. El virus es
transportado hacia el interior de la célula por un fagosoma en un entorno ácido (pH bajo), lo que
desencadena un cambio conformacional de la proteína E, que induce la fusión de la membrana
26
endocítica con la membrana viral y permite la liberación de la cápside y el ARN genómico en el
citoplasma de la célula infectada (Acosta, Kumar, & Bartenschlager, 2014). Luego de la
circularización del ARN, comienza la traducción del genoma con la síntesis de la poliproteína, la
cual posteriormente es clivada por proteasas virales y celulares; lo anterior ocurre dentro de fábricas
de replicación inducidas por el virus, que son paquetes de vesículas producto de invaginaciones del
retículo endoplasmático que se encuentran envueltas por microtúbulos y filamentos intermedios de
la célula (Cortese et al., 2017). Las fábricas permiten agrupar todos los metabolitos necesarios para
la replicación, además de brindar protección contra las nucleasas celulares y evitar la activación de
la inmunidad innata mediada por sensores de ARN citosólico (Cortese et al., 2017). Posterior al
montaje en el retículo endoplasmático, los viriones se dirigen a la red trans-Golgi donde se
empaquetan en exosomas; aquí a un pH bajo, las proteínas prM-E sufren un cambio conformacional
y forman homodímeros de E, lo que conduce a la exposición del punto de escisión de prM, que
luego es clivado por la proteasa furina (Elshuber, Allison, Heinz, & Mandl, 2003).
La población viral liberada de la célula es una mezcla de viriones maduros, parcialmente
maduros e inmaduros (Fig. 2). Se presume que las formas inmaduras de ZIKV tienen un papel
importante en la infección (V. M. Prasad et al., 2017), así como ocurre con otros flavivirus como
DENV y el Virus del Oeste del Nilo (WNV), los cuales pueden entrar e infectar a la célula
facilitados por anticuerpos (Colpitts et al., 2011; Rodenhuis-Zybert et al., 2010).
27
Figura 2. Representación de la superficie viral (a-c) y corte transversal (b-d) del virus Zika. Virión
maduro (arriba) e inmaduro (abajo). Las flechas negras gruesas indican las densidades entre el
núcleo interno de ARN y la membrana viral (la flecha de doble punta indica las capas interna y
externa de la membrana) en ZIKV inmaduro. Las flechas negras delgadas numeradas en b y d,
representan los ejes de simetría icosaédrica. La unidad asimétrica se muestra como un triángulo
negro en a y c. Barra de escala, 100 Å. Tomado de: Vidya Mangala Prasad et al. (2017).
2.2.5 Patogénesis.
Los estudios de patogénesis realizados en modelos animales, demuestran características
similares a lo que ocurre en los humanos, como la infección de la placenta (Li et al., 2016; Miner
& Diamond, 2017), córnea, nervio óptico, retina neurosensorial (Miner et al., 2016), bazo, tejido
nervioso periférico, tejido linfoides y tejidos de los órganos reproductores masculinos y femeninos
(Coffey et al., 2017; Hirsch et al., 2017).
28
En la transmisión transplacentaria, ZIKV infecta al feto y causa apoptosis de las células
progenitoras neuronales (CPN), lo que afecta el desarrollo del cerebro (Cugola et al., 2016).
Evidencia científica indica que en el primer trimestre de embarazo, existe el mayor riesgo para
desarrollar algún daño neurológico por la infección del virus (Honein et al., 2017). También se ha
demostrado que ZIKV restringe el crecimiento intrauterino y en algunos casos provoca aborto
espontáneo (Miner et al., 2016; van der Eijk et al., 2016).
Con la infección viral igualmente se evidencia la infiltración de células T en el sistema
nervioso central (SNC) (Miner & Diamond, 2017), lo que demuestra el neurotropismo del virus
(Kumar et al., 2017). Por consiguiente, el desarrollo del Síndrome de Guillain-Barré podría
desencadenarse por la alta respuesta inflamatoria producida por las células T y otros leucocitos,
que generan grandes cantidades de quimiocinas y citosinas, que provocan daño tisular y
enfermedad neurodegenerativa (Wang et al., 2017).
2.2.6 Síntomas y signos clínicos.
Solo en el 20% de los casos, los infectados con ZIKV presenta un cuadro clínico clásico
con: fiebres bajas (37.8°C – 38.5°C), conjuntivitis bilateral no purulenta, dolor de cabeza, mialgia,
artralgia con edema periarticular y erupción maculopapular eritematosa generalizada, que se
extiende desde la cara hasta los miembros inferiores (Duffy et al., 2009). Sin embargo, en la
reciente epidemia la infección del virus, aunque no en todos los casos, está asociada a
malformaciones del SNC en neonatos y al Síndrome de Guillain-Barré en adultos (Brasil et al.,
2016; Calvet et al., 2016; Oehler et al., 2014; WHO, 2017).
2.2.7 Diagnóstico.
El diagnóstico molecular y serológico es necesario para la confirmación de la infección por
ZIKV, debido a que para el diagnóstico clínico no existe una diferenciación entre los síntomas
29
causados por ZIKV y otros flavivirus. Las muestras recurrentes para la detección de ZIKV son:
sangre, suero sanguíneo, fluido cerebroespinal, orina, saliva, fluido amniótico, semen o tejido
cerebral fetal (Plourde & Bloch, 2016).
Las pruebas estándar para el diagnóstico por infección de ZIKV son: el aislamiento viral y
la detección del material genético por el método de reacción en cadena de la polimerasa con
transcripción inversa convencional (RT-PCR) o en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) (Lanciotti
et al., 2008). El aislamiento viral es la prueba de referencia que se realiza por cultivo celular, sin
embargo, requiere de medios de mantenimientos costosos y en algunos casos es poco exitoso por
bajos niveles de viremia; por el contrario, el método de RT-PCR es altamente sensible y específico
para la detección del genoma del virus a través de cebadores que se dirigen a genes específicos,
como los que codifican para la proteína E y NS5 (Faye et al., 2013; Lanciotti et al., 2008). Otro
tipo de diagnóstico se basa en pruebas serológicas, por la detección de anticuerpos
inmunoglobulina M (IgM) e inmunoglobulina G (IgG) contra antígenos virales, mediante la prueba
ELISA o prueba de neutralización por reducción de placa; no obstante, el diagnóstico es presuntivo,
debido a la reacción cruzada de anticuerpos con otros flavivirus (Mansfield et al., 2011).
La severidad de las consecuencias producidas por ZIKV, ha provocado el rápido desarrollo
de candidatos a vacunas en diferentes enfoques: vacunas de subunidades virales, virus inactivado,
virus vivo atenuado, vacunas quiméricas de flavivirus y vacunas de ADN y ARN (Morabito &
Graham, 2017); actualmente dos candidatos a vacunas se encuentran en la fase II de prueba clínica
(WHO, 2018). Anticuerpos monoclonales y antivirales también han demostrado tener una
capacidad de protección contra la infección de ZIKV (Makhluf & Shresta, 2018; Wahid, Ali,
Rafique, & Idrees, 2017). Debido a que aún no existen vacunas licenciadas contra el virus, la
prevención de la infección se basa en evitar la picadura del mosquito y la erradicación del mismo.
30
3. METODOLOGÍA
3.1 Cepa viral
La cepa COL345Si fue aislada a partir de un grupo de mosquitos de la especie A. aegypti,
capturados en la vivienda de un paciente febril en diciembre de 2015, durante el brote de ZIKV en
la ciudad de Sincelejo. Los mosquitos fueron positivos para ZIKV por la técnica qRT-PCR,
desarrollada por Lanciotti et al. (2008). El virus se aisló después de dos pases en cultivo de células
Vero (Riñón de Mono Verde africano), y se encuentra almacenado a -80°C en el Laboratorio de
Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Sucre.
3.2 Extracción de ARN
Alícuotas de la cepa COL345Si se emplearon para realizar la extracción de ARN con el
estuche comercial ZR Viral RNA (Zymo Research). Se mezclaron 200 µl de la muestra con 600 µl
de Buffer ZR Viral RNA y se transfirieron a una columna de separación, que se centrifugó a 14000
rpm por 2 min. Luego, se agregaron 500 µl de buffer de lavado y se llevó nuevamente a
centrifugación a 14000 rpm por 2 min. Posteriormente, se transfirió la columna a un tubo de
microcentrífuga de 1.5 ml y se agregó 20 µl de agua libre de DNasa/RNasa; se centrifugó a 14000
rpm por 30 segundos y el volumen eluido se almacenó a -80°C hasta su uso.
3.3 Diseño de cebadores
Para la amplificación del genoma de COL345Si, inicialmente se utilizaron cebadores
diseñados a partir de la secuencia de la cepa de referencia PRVABC59 (GenBank: KX087101.3),
aislada en Puerto Rico. Luego, con el propósito de asegurar la amplificación del genoma viral
durante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se construyeron nuevas parejas de
iniciadores, basados en los segmentos del genoma de COL345Si obtenidos con los cebadores
previamente diseñados. El diseño de todos los cebadores empleados se realizó con la versión de
31
prueba del programa SnapGene™ v.4.1.8, considerando características como: un tamaño entre 18
y 25 nucleótidos, temperatura melting (Tm) de 56°C, porcentaje de guanina y citosina en un 50%
y terminación en 3’ del cebador con nucleótidos Guanina o Citosina (Anexo 1). Los cebadores se
enviaron a sintetizar a la empresa Macrogen Inc (Corea del Sur).
3.4 Transcripción Inversa (RT) y Reacción en Cadena de la Polimerasa Touchdown
(PCR-TD)
La síntesis de ADN complementario (ADNc) se realizó en dos fases con la enzima M-MLV
Reverse Transcriptase (Invitrogen). En la primera fase se realizó la unión del cebador antisentido
al ARN molde, con una mezcla de reacción de 13 μl (Tabla 2).
Tabla 2. Mezcla de la primera fase de reacción para la síntesis de ADNc con M-MLV RT
(Invitrogen)
Componente Cantidad
Cebador antisentido (10mM)* 1 μl
dNTPs Mix (10mM) 1 μl
Agua ultrapura 6 μl
ARN 5 μl
* Z16R (5’-AGACCCATGGATTTCCCCA-3’).
La reacción se incubó a 65°C por 5 minutos en el termociclador Veriti 96-Well (Applied
Biosystems). Luego, en una segunda fase se agregó a la mezcla los componentes descritos en la
Tabla 3.
32
Tabla 3. Mezcla de la segunda fase de reacción para la síntesis de ADNc con M-MLV RT
(Invitrogen)
Componente Cantidad
Buffer First-Strand 5X 4 μl
DTT 0,1 M 2 μl
Transcriptasa Inversa M-MLV 1 μl
El perfil térmico de la segunda reacción se desarrolló con un ciclo de 27°C por 10 min,
37°C por 50 min y 70°C por 15 min. Con el ADNc obtenido se procedió a la amplificación de las
secuencias de interés con la técnica PCR touchdown utilizando la enzima Q5® High-Fidelity DNA
Polymerase (New England BioLabs), con las condiciones descritas en la Tabla 4.
Tabla 4. Mezcla de reacción para amplificación del genoma viral con la enzima Q5® High-
Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)
Componente Cantidad
Buffer de reacción Q5 (5X) 10 μl
dNTPs Mix (10mM) 1 μl
Cebador antisentido (10mM) 2.5 μl
Cebador sentido (10mM) 2.5 μl
ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 0.5 μl
High GC Enhancer Q5 10 μl
DMSO (100%) 2.5 μl
Agua libre de RNasa 19 μl
ADNc 2 μl
33
La amplificación se realizó en tres etapas, la primera con un ciclo de desnaturalización a
98°C por 1:30 min; la segunda etapa con 16 ciclos de desnaturalización a 98°C por 10 segundos,
hibridación con un rango de temperatura de 64°C a 56°C por 30 segundos (disminuyendo 0.5°C
por ciclo), y una extensión final a 68°C por 5:30 min; por último, una tercera etapa de 35 ciclos
con una desnaturalización a 98°C por 10 segundos, una hibridación a 56°C por 30 segundos y una
extensión final a 68°C por 5:30 min. El tiempo de extensión dependió de la longitud del fragmento
a amplificar; se emplearon 30 segundos por cada kilobase.
3.5 Purificación de bandas y secuenciación
Se realizó un corrido electroforético de los productos de PCR, en un gel de agarosa ultrapura
de bajo punto de fusión (Invitrogen) al 0.8% y se visualizó en un transiluminador QUANTUM
ST4. Las bandas de ADN de interés fueron extraídas del gel, depositadas en un tubo de
microcentrífuga de 1.5 ml y purificadas con el estuche Zymoclean™ Gel DNA Recovery (Zymo
Research), según las instrucciones del fabricante. Dependiendo de su peso, los geles se mezclaron
con 3 volúmenes de Buffer ADB, se incubaron a 55°C por 5 min y la solución de agarosa se
transfirió a una columna Zymo-Spin™ dentro de un tubo colector, para su centrifugación a 14000
rpm por 1 min. Posteriormente se realizaron dos lavados, se adicionó 200 µl de Buffer de lavado
de ADN a cada columna y se centrifugó a 14000 rpm por 30 segundos. Por último, se transfirió la
columna a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml, se agregó 30 µl de Buffer de elución de ADN y
se centrifugó a 14000 rpm por 1 min. Las muestras se cuantificaron con el espectrofotómetro
NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) y fueron deshidratadas en un concentrador de ADN
miVac (Genevac), para luego ser enviadas a secuenciar por el método Sanger con la empresa
Macrogen Inc (Corea del Sur).
34
3.6 Ensamblaje del genoma
Para obtener la secuencia consenso del genoma de COL345Si, los fragmentos generados
por secuenciación, se ensamblaron y editaron con la versión de prueba del programa Vector NTI
Advanced® v.11.5.1 (Invitrogen), utilizando como plantilla a la cepa FRL (GenBank:
KU820897.5) aislada en Barranquilla, Colombia.
3.7 Identificación de cambios nucleotídicos y aminoacídicos
Con el programa MEGA v.6.0 se realizó la comparación de cambios nucleotídicos con las
secuencias de las cepas disponibles más antiguas de América (Brasil2015; GenBank: KY558989.1)
y Colombia (Bolívar2015; GenBank: KX548902.1); así mismo, se realizó la comparación de
cambios aminoacídicos con cepas aisladas en las pasadas y en las recientes epidemias con respecto
a la cepa P6-740 aislada en Malasia (GenBank: KX377336.1) (Anexo 3). Además, se determinaron
las tasas de transición y transversión de las regiones codificantes y selección de codón en la
primera, segunda y tercera posición, utilizando secuencias exclusivas de América, con el método
de Máxima Verosimilitud (Maximum Likelihood – ML).
3.8 Determinación de la estructura secundaria de 3’ UTR
La predicción de la estructura secundaria de la región 3’ UTR, se calculó con el método de
Mínima Energía Libre (Minimum Free-Energy, MFE), en el servidor web RNAfold (Hofacker,
2003). Se compararon los diferentes dominios de la región no codificante de una cepa de ZIKV
aislada de mosquito en Malasia: P6-740 (GenBank: KX377336.1) y una aislada de humanos en
Puerto Rico: PRVABC59 (GenBank: KX087101.3).
3.9 Análisis filogenético y reloj molecular
Una vez ensamblado el genoma de COL345Si, se realizaron dos alineamientos múltiples
de la región codificante de este y secuencias de ZIKV aislados en las actuales y pasadas epidemias,
35
en el programa MEGA v.6.0. Estos alineamientos fueron empleados para generar dos árboles por
el método ML en el servidor web IQ-TREE (Trifinopoulos, Nguyen, von Haeseler, & Minh, 2016),
con el fin de observar la agrupación de las cepas analizadas; el modelo de sustitución utilizado fue
General de Tiempo Reversible (General Time-Reversible - GTR) y cuatro categorías de tasa de
sustitución Gamma (+G), seleccionado como el modelo de mejor ajuste identificado previamente
por el programa jModelTest (Darriba, Taboada, Doallo, & Posada, 2012). El primer árbol se
construyó con el alineamiento que incluía una secuencia de ZIKV aislada de Macaca mulatta, junto
con 43 secuencias de genomas de aislados exclusivamente de mosquitos (Anexo 2). El segundo
árbol se generó con 191 secuencias nucleotídicas de virus aislados tanto de humanos como de
mosquitos (Anexo 3). Todas las secuencias fueron miembros representativos de los tres linajes del
virus y se encuentran disponibles en GenBank. Los soportes de las ramas fueron evaluados a partir
de 1000 pseudoréplicas por bootstraping, los árboles se visualizaron con el programa FigTree
v.1.4.3 y editados con Inkscape v.0.92.2. El segundo árbol resultante del análisis por ML, fue
utilizado para realizar un análisis de regresión de distancia genética de raíz a punta (Root-to-Tip)
versus fechas de aislamiento, en el software TempEst v.1.5.1 (Rambaut, Lam, Max Carvalho, &
Pybus, 2016), con el fin de explorar la aplicación de modelos de reloj molecular para inferencias
filogenéticas.
Los análisis con reloj molecular se realizaron con el programa BEAST v.1.8.4 (Drummond,
Suchard, Xie, & Rambaut, 2012) con un alineamiento que contenía únicamente secuencias de
aislados americanos (n= 187). Para los análisis por inferencia bayesiana, se utilizó el modelo
SRD06 basado en el modelo de sustitución nucleotídica HKY (Hasegawa, Kishino, Yano), con
tasa de distribución gamma y dos particiones en posiciones de codón [posiciones (1+2) y 3]
(Shapiro, Rambaut, & Drummond, 2006). Se evaluaron combinaciones de dos modelos de reloj
36
molecular (reloj estricto y reloj relajado no correlacionado Log-normal) y tres modelos
coalescentes de crecimiento poblacional (de tamaño constante, con crecimiento exponencial y
bayesiano skyline), para seleccionar el que mejor se ajustara a los datos de acuerdo a la estimación
de verosimilitud marginal por path sampling (PS) y stepping-stone samplig (SS) (Metsky et al.,
2017). Cada análisis de selección de modelo se ejecutó con 100 millones de pasos en Montecarlo
vía cadenas de Markov (MCMC). De acuerdo a los resultados de selección de modelo, se utilizó el
árbol inferido por coalescencia bayesiano skyline con reloj molecular relajado para los análisis
posteriores (Anexo 4).
Para la estimación de los parámetros del árbol y el tiempo de divergencia del ancestro
común más cercano de los clados, se ejecutó BEAST con 400 millones de pasos con el modelo de
sustitución SRD06, bayesiano skyline y modelo de reloj molecular relajado. Los datos fueron
analizados con el programa Tracer v.1.6, luego se obtuvo un árbol de máxima credibilidad
(Maximum clade credibility – MCC tree) a partir de los árboles generados en MCMC, con
TreeAnnotator y el árbol resultante fue visualizado con FigTree v.1.4.3. En todos los análisis por
inferencia bayesiana, el 10% de las observaciones iniciales en MCMC fue descartado como burn-
in. Por el requerimiento computacional, los cálculos del programa BEAST se realizaron en el portal
web CIPRES (Miller, Pfeiffer, & Schwartz, 2010).
Se tomaron algunas secuencias representativas de los clados formados en el árbol bayesiano
y se analizaron con el programa SplitsTree 4 v.4.14.6 (Huson & Bryant, 2006) que utiliza la
estimación de las distancias por el método de ML para la reconstrucción y visualización de la
historia evolutiva.
37
3.10. Cultivo celular e infección in vitro
Para estudiar la cinética de crecimiento de COL345Si, se comparó la replicación in vitro en
líneas celulares de riñón de Mono Verde africano (Vero), riñón de Hámster bebé (BHK-21) y una
línea celular de Aedes albopictus (C6/36), con respecto a cepas de referencia del linaje africano:
MR766 (Uganda, 1947) y del linaje asiático: H/PF/2013 (Polinesia Francesa, 2013) y PRVABC59
(Puerto Rico, 2015). Las células de mamífero se cultivaron en medio Eagle Modificado de
Dulbecco, DMEM (Gibco) a 37°C y a una atmosfera de CO2 al 5%. La línea celular C6/36 se
cultivó en medio Leibovitz, L-15 (Gibco) a 28°C. Todos los medios de cultivo se suplementaron
con 10% de Suero Fetal Bovino (Fetal Bovine Serum – FBS), 1X de Gentamicina y 0.5X de
aminoácidos no esenciales.
Células Vero, BHK-21 y C6/36 se sembraron en platos de 6 pozos. Las monocapas de
células con una confluencia entre el 80-90%, se inocularon por duplicado con las diferentes cepas
virales a una Multiplicidad de Infección (Multiplicity of Infection - MOI) de 0.1. A cada pozo se
le adicionó 5 ml de medio DMEM suplementado con 2% de FBS, 1X de Gentamicina y 0.5X de
aminoácidos no esenciales y se incubaron por siete días a 37°C y 5% de CO2. Cada 24 horas se
tomaron 200 µl del sobrenadante de cultivo y se adicionó la misma cantidad de medio fresco para
mantener un volumen de cultivo constante, así mismo, se monitorearon las células para evidenciar
algún efecto citopático ocasionado; los sobrenadantes extraídos fueron rotulados y almacenados a
-80°C.
3.11. Ensayo de placa y cinética de crecimiento viral
Las muestras de virus tomadas se titularon en platos de 24 pozos con células Vero. Platos
con células previamente establecidas y confluentes, se inocularon con 0.1 ml de diluciones seriadas
1:10 (1x10-1 a 1x10-5) del sobrenadante y fueron incubados por una hora a 37°C y 5% de CO2.
38
Posteriormente, el inoculo fue removido y se adicionó a cada pozo 1 ml de Carboximetilcelulosa
(CMC) suplementada con FBS al 2%; los platos se mantuvieron en incubación por 4 días a 37°C
con 5% de CO2. Transcurrido este tiempo, se descartó la CMC y se agregó a cada pozo 1 ml de
paraformaldehído (PFA) al 3.7% por 15 min. El PFA adicionado se descartó y se realizó un lavado
con 1 ml de buffer fosfato salino (Phosphate Buffered Saline - PBS), luego se adicionó 1 ml de
cristal violeta y se incubó por 30 min a temperatura ambiente. Finalmente se lavaron las placas con
agua destilada y se dejaron secar toda la noche.
Para el cálculo del título viral, se contaron las calvas o placas presentes en la monocapa de
células de la última dilución en la que fue posible identificar placas individuales. El título viral se
calculó con la siguiente fórmula:
𝑇í𝑡𝑢𝑙𝑜 𝑉𝑖𝑟𝑎𝑙 =[(𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎𝑠) ∗ (𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛)]
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑖𝑛ó𝑐𝑢𝑙𝑜(𝑚𝑙)
Se construyeron curvas de crecimiento (título viral versus tiempo) con el software
GraphPad Prism7 (versión de prueba). Para la comparación de las cinéticas de crecimiento de cada
virus se aplicó un análisis de varianza para múltiples comparaciones.
39
4. RESULTADOS
4.1 Caracterización genética de COL345Si
La longitud total obtenida del genoma de COL345Si fue de 10706 nucleótidos, que incluye
toda la región codificante y parte de las regiones no codificantes (Tabla 5). La frecuencia de los
nucleótidos (nt) en el genoma varió entre 2284 nt (Uracilo 21.3%) y 3122 nt (Guanina 29.2%); con
un porcentaje de Guanina-Citosina (G-C) del 51% (Figura 3) y una mayor proporción de purinas
(A+G: 56.6%) que de pirimidinas (U+C: 43.4%). La secuencia se encuentra depositada en
GenBank con el siguiente número de acceso: MH179341.
Tabla 5. Frecuencia de nucleótidos en el genoma viral de la cepa COL345Si.
Región
Genómica nt A U C G Pu/Py
Completa 10706 2934 (27.4 %) 2284 (21.3 %) 2366 (22.1 %) 3122 (29.2 %) 1.302
ORF 10272 2817 (27.4 %) 2208 (21.5 %) 2250 (21.9 %) 2997 (29.2 %) 1.304
5´ UTR 40 9 16 4 11 -
3´ UTR 394 108 60 112 114 -
5´+3´ UTR 434 117 (27 %) 76 (17.5 %) 116 (26.7 %) 125 (28.8 %) 1.26
A: Adenina; U: Uracilo; C: Citosina; G: Guanina; Pu/Py: Relación purina-pirimidina.
40
Figura 3. Distribución del contenido de G-C en el genoma viral de la cepa COL345Si. Líneas en
azul indican el contenido de G-C.
4.2 Cambios nucleotídicos y aminoacídicos
Al comparar la secuencia genómica del aislado más antiguo del continente americano
(Brasil2015; GenBank: KY558989.1), con secuencias reportadas desde la introducción de ZIKV a
Brasil hasta la fecha (174 secuencias incluidas en este estudio), se evidenció un alto número de
variaciones nucleotídicas en todo el genoma (982 cambios), con mayor frecuencia en genes que
codifican para las proteínas no estructurales NS1, NS3 y NS5. Al comparar Brasil2015 con la
secuencia de la cepa del estudio COL345Si, se encontraron 17 sustituciones nucleotídicas, de las
cuales cuatro condujeron a mutaciones en las proteínas de la cápside (D428E), NS1 (R3459W;
V3534M) y 2K (M6866I) (Figura 4). Las mutaciones D428E y R3459W, se encontraron en menor
frecuencia que el resto: 0.2 (35/174 aislados) y 0.18 (31/174 aislados) respectivamente; la primera
sustitución (D428E) se encontró en algunos aislados de Brasil, República Dominicana y
Venezuela, así como en todas las cepas aisladas de Colombia, Martinica y Panamá; la segunda
41
sustitución (R3459W) se presentó en los aislados mencionados anteriormente para la primera
sustitución, a excepción de las cepas de Brasil.
Figura 4. Cambios nucleotídicos de secuencias de ZIKV aisladas en América en comparación con
la secuencia disponible más antigua del continente (Brasil2015; GenBank: KY558989). La
frecuencia corresponde a la proporción de los 174 genomas incluidos en el estudio, que comparten
una variación en el genoma con respecto a Brasil2015 (barras de color gris). Las barras en rojo y
escarlata representan sustituciones sinónimas y no sinónimas que están presentes en la secuencia
de COL345Si.
En el alineamiento de secuencias de aislados procedentes de Colombia, en comparación
con el aislado más antiguo disponible del país (Bolívar2015; GenBank: KX548902.1), se evidenció
42
un menor número de variaciones nucleotídicas, y con respecto a COL345Si se presentaron 13
substituciones de las cuales 11 ocurrieron con alta frecuencia y seis condujeron a mutaciones no
sinónimas en las proteínas NS1 (Y3345H; L3390T), NS2A (K3802R), NS3 (H5445N; D5448Y) y
NS5 (E10192G). Se identificaron dos sustituciones sinónimas con una frecuencia inferior al 20%
en los genes prM y NS2B, que se encontraron presentes sólo en la secuencia con acceso a GenBank:
KY317937.1 y la secuencia del estudio COL345Si (Figura 5).
Figura 5. Cambios nucleotídicos en los genomas de ZIKV aislados en Colombia, con respecto a
la secuencia más antigua del país (Bolívar2015; GenBank: KX548902.1). La frecuencia
corresponde a la proporción de los 13 genomas incluidos en el estudio, que comparten una
variación con respecto a Bolívar2015. Las barras en rojo y escarlata representan sustituciones
sinónimas y no sinónimas de nucleótidos que están presentes en la secuencia de COL345Si.
43
Se estimó una tasa de transición y transversión de 8.85 y se observó una alta frecuencia de
sustituciones de Citosina a Timina (C-T) y Timina a Citosina (T-C) en las tres posiciones del codón
que varío entre un 23% y un 38% (Figura 6).
Figura 6. Frecuencia de la sustitución nucleotídica estimada para las tres posiciones del codón en
genomas de ZIKV aislados en América.
La comparación de los aislados virales de humanos y mosquitos en las Américas, con la
cepa P6-740 aislada en Malasia (GenBank: KX377366.1), permitió detectar 40 substituciones
aminoacídicas en toda la poliproteína viral y evidenciar tres nuevas variaciones exclusivas en cepas
aisladas en Colombia y algunas del Caribe, Brasil, Panamá y Venezuela. Los tres nuevos cambios
ocurrieron en el residuo 170 de la proteína de la cápside, 1118 de NS1 y 3353 de NS5, en las que
se presentó un cambio de Ácido aspártico por Ácido glutámico (D107E), Arginina por Triptófano
(R1118W) y Treonina por Alanina (T3353A), respectivamente (Figura 7). Una de las secuencias
aisladas de humanos (GenBank: KX247646.1), no presentó la variación T3353A en NS5. Las
regiones menos variables en cepas del linaje asiático desde su divergencia en Malasia, fueron las
proteínas M, NS2B y NS4A, que desde su paso por Oceanía hasta el brote en las Américas, no
presentaron cambios de aminoácidos.
0
10
20
30
40
50
A >
C
C >
A
A >
T
T >
A
C >
G
G >
C
G >
T
T >
G
A >
G
G >
A
C >
T
T >
C
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C
C >
A
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T
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A
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G
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C
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A
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A
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G >
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T
T >
G
A >
G
G >
A
C >
T
T >
C
Pro
bab
ilid
ad d
e su
stit
uci
ón
1era posición codón 2da posicioón codón 3ra posición codón
44
Figura 7. Cambios aminoacídicos en las proteínas de cepas de ZIKV pertenecientes al linaje asiático. Se realizó una comparación de
los cambios aminoacídicos de las cepas aisladas en América (azul claro), Colombia (azul) y Oceanía (rojo), con respecto a la cepa P6-
740 aislada en Malasia en 1966 (naranja). Mutaciones únicas en cepas aisladas en Colombia se representan con el color azul oscuro.
/M C
107
123
139
143
153
446
683
763
777
982
1058
1080
1095
1118
1232
1263
1289
1780
1781
1902
1974
2086
2283
2286
2295
2318
2367
2449
2453
2455
2634
2659
2715
2749
2787
2795
2802
2896
2909
3046
3050
3107
3162
3167
3223
3239
3353
3362
3387
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HU
MA
NO
NS3
AISLADOS LINAJE ASIÁTICO
NS4B NS5M
OS
QU
ITO
HU
MA
NO
pr E NS1C
107
123
139
143
153
446
683
763
777
982
1058
1080
1095
1118
1232
1263
1289
1780
1781
1902
1974
2086
2283
2286
2295
2318
2367
2449
2453
2455
2634
2659
2715
2749
2787
2795
2802
2896
2909
3046
3050
3107
3162
3167
3223
3239
3353
3362
3387
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COL/2016/KY785466.1 E A N E M T E M M V M . . W . A V . - H L H S . I F I V I S V P . T V M I S . - R K S N D H A . N
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COL/2016/KY785469.1 E A N E M T E M M V M . . W . A V . . H L H S . I F I V I S V P M T V M I S . I R K S N D H A . N
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VEN/2016/KY693680.1 . A N E M T E M M V M . . . . A V . . H L H S . I F . V I S V P . T V M I S . I R K S N D H . . N
NS3
AISLADOS LINAJE ASIÁTICO
NS4B NS5M
OS
QU
ITO
HU
MA
NO
pr E NS1 NS2A
45
4.3 Determinación de la estructura secundaria de 3’ UTR
Para analizar los posibles cambios estructurales en regiones no codificantes, se realizó la
predicción de la estructura secundaria de 3’ UTR de las cepas virales: COL345Si (Colombia),
PRVABC59 (Puerto Rico) y P6-740 (Malasia). La cepa P6-740 formó patrones de plegado distintos
a PRVABC59 y COL345Si, mientras que estos últimos fueron similares entre sí. En 3’ UTR de los
virus de América se encontró una mayor longitud en la región que sigue al codón de parada, con
15 nucleótidos para las cepas contemporáneas en comparación de 12 nucleótidos en la cepa
ancestral (P6-740), por lo que la horquilla I (SLI) del dominio I en PRVABC59 y COL345Si es
más corta. Además, se observó un cambio en SLIII en el dominio II, que a diferencia de la cepa de
Malasia, en las cepas contemporáneas se reduce el tamaño del bucle en el tallo y este se forma más
distal del asa. El dominio III fue el más conservado entre los aislados (Figura 8).
46
Figura 8. Estructura secundaria de la región 3’ UTR de cepas aisladas de humanos y mosquitos.
Cambios en las horquillas SLI y SLIII señalado de color verde y rojo, respectivamente. Los 34
47
nucleótidos que no fueron posible secuenciar en la región 3’ UTR de COL345Si, se
complementaron a partir de la secuencia reportada de un aislado de Barranquilla, Colombia
(GenBank: KU820897.5) y se encuentran representados en color azul.
4.4 Análisis filogenético y estimaciones por reloj molecular
Con el fin de evaluar la relación entre el aislado COL345Si y los aislados de ZIKV que se
han obtenido a partir de mosquitos, se realizó una reconstrucción filogenética por el método ML.
El árbol resultante mostró que dentro del linaje asiático ocurren dos agrupaciones distintas: las
cepas aisladas en los brotes de países de América y aquellas aisladas en Singapur, a pesar de que
ocurrieron en el mismo año. COL345Si se encontró dentro del grupo de los aislados de países de
América perteneciente al linaje asiático, cercano a cepas de Haití y México, también aisladas de A.
aegypti en 2016. Las cepas africanas se agruparon en dos clados correspondientes al linaje africano
occidental con cepas de Senegal, y al linaje oriental con cepas de República Centroafricana y
Uganda (Figura 9).
48
Figura 9. Árbol filogenético construido con secuencias de genomas completos de ZIKV aislados
de mosquitos y primates no humanos. COL345Si se encuentra señalado por la flecha de color rojo.
49
La segunda reconstrucción filogenética por ML incluyó secuencias de ZIKV del linaje
asiático aislados de América, y cuatro secuencias de países de Asia y Oceanía, estas últimas
sirvieron como grupo externo (Figura 10a). Esta reconstrucción se realizó para (1) evaluar la
aplicabilidad del modelo de reloj molecular en las secuencias seleccionadas con el fin de realizar
inferencias filogenéticas y (2) definir clados de agrupación con los que se podrían determinar
tiempos de divergencia y hacer comparaciones con estimaciones previamente reportadas. El
análisis de regresión “root-to-tip” en TempEst mostró una asociación positiva moderada (R2: 0.55),
entre la distancia genética y las fechas de aislamiento de las cepas de ZIKV incluidas en el estudio,
lo que junto con la inspección visual del diagrama de dispersión obtenido (Figura 10b), demuestran
la existencia de señal temporal en las secuencias y la posibilidad de aplicar el modelo de reloj
molecular para hacer inferencias filogenéticas.
De acuerdo al árbol filogenético resultante del análisis ejecutado en BEAST, se encontró
que las cepas aisladas en Brasil se agruparon en diferentes clados del árbol. Se evidenciaron
grandes clados conformados por cepas de Brasil, Honduras y una rama mixta con secuencias de
República Dominicana, Jamaica y Estados Unidos (Figura 11); así mismo, se observó un clado
formado por secuencias de Colombia y cepas correspondientes a la isla de Martinica, Panamá,
República Dominicana y Venezuela. COL345Si se agrupó con la cepa más antigua de Colombia,
obtenida de una muestra humana tomada en el departamento de Bolívar (GenBank: KX548902) y
con cepas aisladas en la isla de Martinica (Figura 12).
50
Figura 10. Árbol de Máxima Verosimilitud generado con genomas de ZIKV. A. En el árbol las
secuencias están coloreadas con base al país de origen. B. Regresión lineal de raíz a punta (Root-
to-Tip). La tasa de sustitución de todo el árbol está indicada por la pendiente de la regresión lineal.
51
Figura 11. Reconstrucción filogenética de ZIKV en las Américas con reloj molecular. Árbol de
MCC generado con BEAST. Los recuadros muestran los cambios aminoacídicos en cada uno de
los clados. Las cepas se encuentran coloreadas con base al país de origen.
52
Figura 12. Detalle del clado formado por cepas de ZIKV aisladas en Colombia, isla de Martinica,
Panamá, República Dominicana y Venezuela, en el árbol de MCC generado con BEAST.
Con el análisis filogenético por inferencia bayesiana con reloj molecular relajado y
coalescencia bayesiana skyline, se estimó que la introducción de ZIKV en las Américas se dio en
febrero de 2014 (95% Hightest Posterior Density - HPD: agosto de 2013 y julio de 2014). En
Colombia el tiempo probable de llegada del virus fue marzo de 2015 (95% HPD: enero de 2015 y
junio de 2015), extendiéndose el brote en esa misma fecha hacia islas del Caribe y Honduras
(Figura 11). La tasa de sustitución en el brote de América se estimó de 1.18x10-3
sustituciones/sitio/año (95% HPD: 1x10-3 – 1.37x10-3).
La red filogenética, al igual que el árbol filogenético antes mostrado, evidencia la
separación en dos grupos de las secuencias de Brasil, además de la agrupación en nodos distintos
de secuencias aisladas del Caribe y Estados unidos y las secuencias de Colombia (Figura 13).
53
Figura 13. Red filogenética de aislados de ZIKV pertenecientes al linaje asiático.
4.5 Cinética de crecimiento viral
Los resultados de la cinética de crecimiento mostraron una replicación activa de COL345Si
en todas las líneas celulares utilizadas. Al comparar las curvas, se evidenció que hubo diferencias
en la replicación viral con relación a la línea celular y la cepa, independientemente del linaje.
En células Vero, las curvas generadas por todas las cepas de ZIKV estudiadas, incluida
COL345Si, evidenciaron un patrón similar: las cepas se comportaron igual después del tercer día
de infección y no mostraron diferencias estadística con relación a la replicación (p-valor = 0.1199),
con una alta producción viral a los cuatro días post infección que varío entre 6.3 Log10 PFU/ml y
6.5 Log10 PFU/ml. Para las células BHK-21 hubo diferencia en la producción viral (p-valor =
0.0007): las cepas COL345Si y PRVABC59 presentaron un crecimiento exponencial hasta el final
54
del experimento y produjeron un número menor de partículas infecciosas (5.6 y 5.1 Log10 PFU/ml,
respectivamente), en comparación con MR766 (6.4 Log10 PFU/ml) y H/PF/2013 (6.5 Log10
PFU/ml); estas últimas al cuarto día de la infección presentaron disminución de sus títulos virales.
En la infección de células C6/36 los virus mostraron un patrón similar, pero con respecto a la
producción de partículas infecciosas si hubo diferencia (p-valor = 0.0023); durante el experimento
COL345Si mantuvo títulos virales bajos a diferencia de las otras cepas estudiadas (Gráfica 1).
Gráfica 1. Cinética de crecimiento in vitro de cepas de ZIKV en diferentes líneas celulares. Las
gráficas representan curvas de crecimiento de múltiples pasos de cuatro virus: COL345Si,
55
H/PF/2013, MR766 y PRVABC59 en tres líneas celulares distintas (Vero, BHK-21 y C6/36).
La progresión de efecto citopático en cada infección se correlacionó con la cinética de
crecimiento de cada virus (evidenciado en las curvas de crecimiento), es decir, a mayor muerte
celular observada, mayor título viral fue cuantificado en el ensayo de placa. El efecto citopático en
las células C6/36 y BHK-21 se evidenció a partir del día tres, mientras que en las células Vero a
partir del día dos después de la infección. Se observó que en la línea celular C6/36 el efecto
citopático causado por la cepa COL345Si fue menor (Figura 14), mientras que en las células Vero
y BHK-21 hubo mayor muerte celular, específicamente por la infección de MR766 y H/PF/2013
(Figura 15).
Figura 14. Efecto citopático causado por la replicación viral en células C6/36 en el día 7 post-
infección. A. Control. B. COL345Si. C. PRVABC59. D. H/PF/2013. E. MR766.
56
Figura 15. Efecto citopático causado por la replicación viral en células Vero y BHK21 en el día 4 post-infección. Células Vero: A.
Control. B. COL345. C. H/PF/2013. D. MR766. E. PRVABC59. Células BHK-21: F. Control. G. COL345Si. H. H/PF/2013. I. MR766.
J. PRVABC59.
57
5. DISCUSIÓN
El estudio del genoma de COL345Si, muestra una mayor proporción de purinas que
pirimidinas y se ha demostrado que esto causa un uso preferente de codones ricos en Adenina o
Guanina en ZIKV (van Hemert & Berkhout, 2016); lo anterior, es consistente con estudios que
demuestran una alta variación en el uso de codones dependiendo de la composición de nucleótidos
en el genoma viral (Jenkins & Holmes, 2003). El porcentaje G-C tuvo una tendencia estable en
todo el genoma y puede influenciar en que se codifiquen con mayor frecuencia aminoácidos como
Glicina y Alanina en las proteínas virales, debido a que estos poseen un alto porcentaje intrínseco
de G-C (van Hemert & Berkhout, 2016).
La comparación de la cepa P6-740, con los aislados de ZIKV en América, permitió detectar
40 cambios aminoacídicos, de los cuales 35 fueron identificados previamente por Wang et al.
(2016) y Petterson et al. (2016). En este trabajo se identificaron cinco nuevos cambios
aminoacídicos en la proteína de la cápside (D107E), Envoltura (I446T), NS1 (R1118W), NS2A
(V1263A) y NS5 (T3353A). Dos cambios fueron adquiridos por ZIKV en su paso por Asia, una
sustitución en el residuo 446 de la proteína E (Isoleucina por Treonina) y en el residuo 1263 de
NS2A (Valina por Alanina), que no se reportaron anteriormente por falta de datos nucleotídicos en
la secuencia de Malasia utilizada. En conjunto con los datos filogenéticos, se demostró que la
mutación en la proteína de la cápside (D107E), reportadas para cepas de Colombia, se adquirió
desde la cepa ancestral proveniente de Brasil, y posteriormente en la introducción al país, el virus
adquirió las sustituciones aminoacídicas en las proteínas no estructurales NS1 (R1118W) y NS5
(T3353A).
58
En el citoplasma, luego de la liberación del material genético, los aminoácidos hidrofílicos
de la cápside se unen al ARN y los residuos hidrofóbicos interactúan con la membrana viral
(Lobigs, 1993); en la mutación D107E, se conservó el tipo de aminoácido hidrofóbico, lo que
posiblemente no pudo afectar la interacción Cápside-Membrana viral. En las variaciones de las
proteínas NS1 (R1118W) y NS5 (T3353A), se presentaron cambios de aminoácidos de tipo
hidrofílico a hidrofóbico. El cambio de aminoácido en NS1 ocurrió en la región carboxilo terminal,
la cual posee un dominio continuo de láminas beta (Xu et al., 2016). La proteína NS1 glicosilada
dentro de la célula se une con lípidos, forma homodímeros y desarrolla tres funciones distintas: la
formación del complejo de replicación viral, la unión a la membrana de las células infectadas y
evasión de la respuesta inmune (Gutsche et al., 2011; Muller et al., 2012). NS1 es la única proteína
no estructural secretada al espacio extracelular como lipoproteína hexamérica (trímeros de
dímeros), por lo que el permanente contacto con el sistema inmune del hospedero, provoca una
presión selectiva de poblaciones de virus con mutaciones que puedan evadir esta respuesta inmune.
Por otra parte, la mutación en NS5 ocurrió en el dominio ARN polimerasa dependiente de ARN,
con alto número de estructuras de láminas alfa (Duan et al., 2017). Estas mutaciones puntuales en
las proteínas podrían modificar la estructura secundaria y por ello las propiedades fisicoquímicas
del entorno proteico. Al observar la fijación de estas sustituciones en la progenie viral, se podría
presumir que funcionalmente estas variaciones pudieron mejorar la replicación viral y evasión de
la respuesta inmune.
La cepa aislada en Bolívar mostró sustituciones aminoacídicas que no se presentaron en las
demás cepas aisladas en Colombia, estas mutaciones posiblemente fueron adquiridas por la cepa
en su circulación por el departamento; lo que sugiere que, aunque sea el aislado más antiguo del
país, no es el fenotipo representativo de los primeros establecimientos del virus, probablemente la
59
cepa original no tuvo tales sustituciones. Se observó una mutación adicional en la cepa ZC204Se
(GenBank: KY317939), que presentó una variación en la proteína pr (N139K); este cambio puede
ser relevante debido a que hubo una mutación anterior en la misma posición (S139N), que demostró
un aumento en la virulencia por la mejora en la replicación viral (Yuan et al., 2017). Se cree que
esta región del genoma puede controlar el tropismo del virus como ocurre con el Virus del Nilo
Occidental (Davis et al., 2006). Por la formación de heterodímeros de prM con la proteína E, los
cuales están anclados en la membrana lipídica y participan en la entrada del virus a la célula, es
viable que esta alteración pueda crear algún cambio conformacional en la proteína de envoltura y
generar viriones capaces de interactuar con nuevos receptores celulares.
La identificación de las variaciones en el genoma del virus en muestras aisladas de humanos
y mosquitos, brindarían información para comprender la replicación viral y la dinámica de la
transmisión. Los alineamientos de secuencias de la región codificante del genoma, para la
comparación de las cepas aisladas de humanos con las aisladas de mosquitos, evidenciaron
mutaciones nucleotídicas, pero estas no condujeron a cambios en las secuencias aminoacídicas
(Figura 7). La región 3’ UTR del genoma desempeña un papel importante en la síntesis viral,
debido a que es el sitio para la iniciación de la síntesis de ARN mediante la unión del extremo 5’,
para formar el complejo replicativo (Villordo & Gamarnik, 2009); adicionalmente se ha
demostrado cambios en la estructura 3’ UTR de DENV, considerados como una adaptación rápida
al hospedero (humano o mosquito) (Filomatori et al., 2017). El análisis de la estructura secundaria
del 3’ UTR mostró cambios en la cepa P6-740 de Malasia, en comparación con COL345Si, aun
cuando las dos fueron aisladas de mosquitos; sin embargo, la cepa contemporánea COL345Si es
prácticamente idéntica a PRVABC59, a pesar de que fueron aisladas de diferentes hospederos
(Figura 8). Por lo anterior, se podría presumir que si existieron mutaciones que ayudaron a la
60
mejora en la transmisión y replicación viral dadas en la región 3’ UTR, fueron adquiridas antes de
la introducción en las Américas, probablemente en la Polinesia Francesa, al considerar que se
comparte la misma especie vector (A. aegypti) (Richard, Paoaafaite, & Cao-Lormeau, 2016).
También, teniendo como base estudios más profundos de regiones no codificantes (Zhu et al.,
2016) y los resultados obtenidos, podríamos presumir que las variaciones en la región 3’ UTR
pudieron influenciar en el aumento de la replicación viral y neurovirulencia, pero no fueron tan
determinantes como las mutaciones presentadas en la región codificante.
La agrupación de las cepas con el árbol construido por ML, mostró que COL345Si comparte
una mayor homología con las cepas aisladas en América, lo que indica que pertenece al linaje
asiático (Figura 10). A pesar de la replicación viral de COL345Si en células Vero para su
aislamiento, esta cepa viral no presentó cambios aminoacídicos con respecto a cepas de ZIKV
aisladas y secuenciadas directamente de muestras humanas en Colombia (Figura 7).
La reconstrucción filogenética sustenta que los brotes generados en los países del continente
americano se originaron desde Brasil, debido a que cepas de este país se encuentran en los nodos
más ancestrales de los diferentes clados del árbol. Al parecer la expansión desde Brasil comenzó
en primer lugar hacia el Caribe (República Dominicana y Haití), en mayo y julio de 2014, y luego
se propagó hacia los demás países (Figura 11). Todos los aislados de Colombia tienen un origen
de cepas de Brasil aisladas en el Estado de Pernambuco, por lo que se presume que la introducción
fue desde esta región costera; Brasil y Colombia tienen un alto flujo migratorio de
aproximadamente 16000 ingresos por año (Ministerio de Relaciones Exteriores, 2018), sin
embargo, no se descarta la posibilidad de introducción del virus desde otros países. Los resultados
además respaldan lo expuesto por el Ministerio Nacional de Salud, quienes a partir de datos
epidemiológicos indican que la entrada del virus a Colombia se dio por la Región Caribe, con
61
extensión hacia el sur del país (Ministerio de Salud y Protección Social, 2015), así mismo, el árbol
filogenético muestra en el clado de Colombia, a la cepa aislada en el departamento de Bolívar como
ancestro común y a COL345Si como la segunda cepa más ancestral, con posterior divergencia a
los virus aislados en el departamento de Cundinamarca y Santander.
La evidencia filogenética generada en este estudio, también indica que desde Colombia se
dio la introducción del virus a la isla de Martinica, debido a que la secuencia se agrupó con la cepa
del departamento de Bolívar, lo que difiere de lo expuesto por Lahon et al. (2016); además, se
puede evidenciar que el virus también fue exportado hacia Panamá, República Dominicana y
Venezuela. En el árbol, todas las secuencias aisladas de isla de Martinica y Panamá se agruparon
en el clado de Colombia, lo que infiere que los brotes generados en estos dos países fueron
originados desde Colombia, muy probablemente desde la Costa Atlántica. Con respecto a cepas
aisladas en República Dominicana y Venezuela, además de agruparse en el clado de Colombia,
también se encontraron secuencias en otros clados, lo que evidencia múltiples introducciones del
virus en estos países, originalmente desde Brasil y luego desde Colombia. Otros casos importados
desde Colombia se han reportado hacia países como Perú, con tres casos notificados de los cuales
uno fue procedente del departamento de Antioquia (Aspilcueta-Gho et al., 2017; Ministerio de
Salud del Perú, 2016). Debido a que las infecciones por arbovirus se están convirtiendo en un
problema de salud pública mundial, la importancia de identificar el origen de la transmisión, servirá
como datos útiles para evitar la propagación de nuevos brotes, en este caso de ZIKV o para la
prevención de la entrada de nuevos virus al país.
La estimación del tiempo de llegada de ZIKV a Brasil (febrero 2014), fue igual a la
reportada por Faria et al. (2017) y Metsky et al. (2017), sin embargo, la fecha de introducción para
Colombia fue más temprana en el estudio (marzo de 2015), incluso siete meses antes de la
62
notificación de los primeros casos por el Ministerio de Salud. En esta fecha, el país se encontraba
en la fase epidémica de CHIKV (Instituto Nacional de Salud, 2015), lo que indica que posiblemente
hubo una circulación simultánea de este virus con ZIKV y DENV, este último por su circulación
endémica (Mendez et al., 2012). Es probable que los primeros casos de ZIKV hayan sido
confundidos con infección por CHIKV o DENV, debido a su presentación clínica similar, como
fiebre, mialgia, dolor de cabeza, artralgia y sarpullido (Staples, Breiman, & Powers, 2009); por lo
que el diagnóstico certero en su momento pudo ser importante para el caso de ZIKV, por la
asociación de la infección en mujeres embarazadas con el desarrollo de microcefalia. La estimación
de los tiempos llegada del virus a Brasil y a Colombia son confiables, debido a que en el estudio
también se estimó el tiempo de divergencia de diferentes clados del árbol y estos fueron similares
a los reportados por Metsky et al. (2017), a diferencia del clado Colombia el cual se calculó dos
meses antes, posiblemente por el uso en este estudio de cepas como las aisladas en Bolívar y
Sincelejo, no incluidas por los autores.
La tasa evolutiva de ZIKV obtenida no difiere de las estimaciones recientemente
publicadas, que varían entre 9.78x10-4 y 1.43x10-3 sustituciones/sitio/año (Faria et al., 2016;
Metsky et al., 2017). ZIKV presenta las tasas de sustitución más altas en comparación a las
reportadas para otros flavivirus (Sall et al., 2010); se cree que estas estimaciones son tan altas
debido a que se han medido en un lapso de tiempo relativamente corto y por lo tanto se incluye una
alta proporción de mutaciones medianamente deletéreas, que no han sido removidas a través de
procesos de selección purificadora (Metsky et al., 2017); esta alta variabilidad le ha permitido a
ZIKV adaptarse a diferentes condiciones, siendo la causa de que haya conquistado diferentes
ambientes y sea considerado un virus emergente. ZIKV también mostró una alta tasa de transición
a transversión, con un mayor número de transiciones, específicamente de pirimidina a pirimidina
63
(C a T o T a C), por lo que posiblemente este sesgo de las transiciones sobre las transversiones será
muy sensible a la saturación mutacional.
SplitsTree es un programa alternativo e informativo para el análisis y visualización de datos
evolutivos. En la gráfica generada con este programa, se evidenció una separación de las secuencias
en cuatro clados; esto se debe a mutaciones únicas adquiridas por las cepas agrupadas. En el clado
de secuencias de Estados Unidos y el Caribe, las secuencias presentaron mutaciones en la proteína
NS1 (M1143V) y NS5 (I2842V; T3326I; D3398E); por el contrario, las secuencias de Brasil que
se separan del clado principal mostraron un mayor número de mutaciones en la proteína de la
cápside (D107D/E), NS1 (V988V/A), NS2A (V1273V/A), NS2B (A1394A/T) y NS5 (Y2722Y/H;
H2962H/Y; K3100K/R). Por su parte, la separación de secuencias de Colombia se dio por las tres
mutaciones mencionadas anteriormente: D107E en la proteína C, R1118W en NS1 y T3353A en
NS5.
Para comprender los posibles efectos generados por las substituciones aminoacídicas
presentadas en cepas de Colombia, se procedió a la infección in vitro de COL345Si. Al igual que
otras cepas de ZIKV, COL345Si infecta varias líneas celulares y causa efectos citopáticos típicos
(desprendimiento de células y formación de placas). La cinética de crecimiento en células Vero fue
similar con todas las cepas virales (COL345Si, PRVABC59, H/PF/2013 y MR766), lo anterior
puede ser explicado por la deficiencia en la producción de Interferones alfa y beta (IFN-α y IFN-
β) de esta línea celular, que representa uno de los principales mecanismos de defensa del sistema
inmune innato en mamíferos contra infecciones virales (Desmyter, Melnick, & Rawls, 1968), lo
que en consecuencia facilitaría la replicación viral sin presentarse diferencia alguna entre cepas.
La producción de partículas infecciosas en células C6/36 no fue tan eficiente como en
células Vero, a pesar de que estas presentan una respuesta deficiente de ARN interferente (ARNi)
64
(Brackney et al., 2010), principal mecanismo de respuesta a la infección viral por parte de los
invertebrados. El sitio de N-glicosilación en la proteína viral E, tiene como función el ensamblaje
y liberación de los virus (Beasley et al., 2005), se ha demostrado que la presencia del sitio de
glicosilación reduce la infectividad en las células C6/36, mientras que la aumenta en las células
BHK-21 y QT6 (Hanna et al., 2005; Lee, Leang, Davidson, & Lobigs, 2010). Todas las cepas
utilizadas presentan sitio de glicosilación N en la posición 154 de la proteína E (Fontes-Garfias et
al., 2017), lo que puede explicar el comportamiento de la curva en C6/36, línea celular en la que se
produjo además de un bajo título viral, menor efecto citopático. Según la curva en las células C6/36,
la infección se puede extender por muchos más días a diferencia de células Vero, línea celular en
que decaen los títulos virales en el quinto día. Aunque se evidencia muerte celular, un porcentaje
de células sobrevive y permite que se continúe la propagación viral; posiblemente en la naturaleza
los mosquitos pueden mantener una infección persistente, prolongando el contacto del virus con el
hospedero.
Algunas investigaciones exponen que la replicación de ZIKV difiere con respecto al linaje,
con una mayor producción de partículas virales y muerte celular por parte de cepas del linaje
africano (Anfasa et al., 2017), sin embargo, en la curva de crecimiento en células BHK21, se
demuestra un comportamiento similar de la cepa africana (MR766) y la cepa asiática (H/PF/2013).
La alta carga viral, eficiencia en la replicación y muerte celular causada por la cepa asiática
H/PF/2013 (comparables a lo observado con la cepa MR766), puede entonces corresponder a la
adquisición de mutaciones adaptativas a diferentes líneas celulares, por efecto del alto número de
pases en laboratorio a los que se ha sometido esta cepa viral desde su aislamiento; contrario a lo
observado con las cepas COL345Si y PRVABC59, quienes fueron aisladas más recientemente y
cuyo historial de pases es reducido.
65
Con excepción de la curva de crecimiento en células Vero, COL345Si produjo un menor
número de partículas infecciosas comparado con las otras cepas estudiadas, por lo que no fue
posible evidenciar mediante las pruebas in vitro realizadas, que efectos pudieron producir los
cambios aminoacídicos adquiridos en Colombia, con respecto a la capacidad replicativa o por el
contrario posiblemente las mutaciones fueron de tipo neutral.
66
6. CONCLUSIÓN
Se identificaron dos nuevas mutaciones en el genoma adquirida por ZIKV en Colombia,
adicional a las anteriormente reportadas, que condujeron a un cambio de Arginina por
Triptófano en el residuo 1118 de la proteína NS1 (R1118W) y de Treonina a Alanina en el
residuo 3353 (T3353A) en la proteína NS5.
Se estimó que el tiempo de llegada de Zika a Colombia fue en marzo de 2015, con un
posible origen de introducción desde el estado de Pernambuco, Brasil.
La cinética de crecimiento de COL345Si en dos líneas celulares de mamíferos y una de
mosquito, mostró que este aislado presentó una menor replicación viral en células BHK-21
que en células Vero y C6/36.
67
7. RECOMENDACIONES
Modelar in silico las proteínas en las que se detectaron las mutaciones adquiridas por ZIKV
en Colombia (NS1 y NS5), para identificar los posibles cambios en la estructura
tridimensional y en el entorno proteico.
Caracterizar in vitro la cinética de crecimiento de COL345Si en líneas celulares
progenitoras neuronales humanas, para evaluar la neurovirulencia y el potencial de la cepa
para causar microcefalia.
Realizar experimentos de infección in vivo con COL345Si, para evaluar el efecto de las
mutaciones adquiridas en Colombia con respecto al neurotropismo, capacidad replicativa,
transmisibilidad e infectividad.
68
LISTA DE REFERENCIAS
Acosta, E. G., Kumar, A., & Bartenschlager, R. (2014). Revisiting dengue virus-host cell
interaction: new insights into molecular and cellular virology. Adv Virus Res, 88, 1-109.
doi: 10.1016/B978-0-12-800098-4.00001-5
Aguilera-Pesantes, D., & Mendez, M. A. (2017). Structure and sequence based functional
annotation of Zika virus NS2b protein: Computational insights. Biochem Biophys Res
Commun, 492(4), 659-667. doi: 10.1016/j.bbrc.2017.02.035
Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., & Osorio, J. E. (2016). The wMel strain of Wolbachia
Reduces Transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Sci Rep, 6, 28792. doi:
10.1038/srep28792
Anfasa, F., Siegers, J. Y., van der Kroeg, M., Mumtaz, N., Raj, V. S., de Vrij, F. M., . . . Simonin,
Y. (2017). Phenotypic differences between Asian and African lineage Zika viruses in
human neural progenitor cells. mSphere, 2(4), e00292-00217.
Aspilcueta-Gho, D., Benites Villafane, C., Sánchez, C., Menel, M., Yberico, C., & Gilmer, J.
(2017). Infección por zika en el Perú: de amenaza a problema de salud. Revista Peruana de
Ginecología y Obstetricia, 63(1), 57-64.
Beerntsen, B. T., James, A. A., & Christensen, B. M. (2000). Genetics of mosquito vector
competence. Microbiol Mol Biol Rev, 64(1), 115-137.
Brackney, D. E., Scott, J. C., Sagawa, F., Woodward, J. E., Miller, N. A., Schilkey, F. D., . . . Blair,
C. D. (2010). C6/36 Aedes albopictus cells have a dysfunctional antiviral RNA interference
response. PLoS Negl Trop Dis, 4(10), e856.
Brasil, P., Pereira, J. P., Jr., Moreira, M. E., Ribeiro Nogueira, R. M., Damasceno, L., Wakimoto,
M., . . . Nielsen-Saines, K. (2016). Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de
Janeiro. N Engl J Med, 375(24), 2321-2334. doi: 10.1056/NEJMoa1602412
Calvet, G., Aguiar, R. S., Melo, A. S. O., Sampaio, S. A., de Filippis, I., Fabri, A., . . . de Filippis,
A. M. B. (2016). Detection and sequencing of Zika virus from amniotic fluid of fetuses
with microcephaly in Brazil: a case study. Lancet Infect Dis, 16(6), 653-660. doi:
10.1016/S1473-3099(16)00095-5
Camacho, E., Paternina-Gomez, M., Blanco, P. J., Osorio, J. E., & Aliota, M. T. (2016). Detection
of Autochthonous Zika Virus Transmission in Sincelejo, Colombia. Emerg Infect Dis,
22(5), 927-929. doi: 10.3201/eid2205.160023
Coffey, L. L., Pesavento, P. A., Keesler, R. I., Singapuri, A., Watanabe, J., Watanabe, R., . . . Van
Rompay, K. K. (2017). Zika Virus Tissue and Blood Compartmentalization in Acute
Infection of Rhesus Macaques. PLoS One, 12(1), e0171148. doi:
10.1371/journal.pone.0171148
Colpitts, T. M., Rodenhuis-Zybert, I., Moesker, B., Wang, P., Fikrig, E., & Smit, J. M. (2011).
prM-antibody renders immature West Nile virus infectious in vivo. J Gen Virol, 92(Pt 10),
2281-2285. doi: 10.1099/vir.0.031427-0
69
Cortese, M., Goellner, S., Acosta, E. G., Neufeldt, C. J., Oleksiuk, O., Lampe, M., . . .
Bartenschlager, R. (2017). Ultrastructural Characterization of Zika Virus Replication
Factories. Cell Rep, 18(9), 2113-2123. doi: 10.1016/j.celrep.2017.02.014
Cugola, F. R., Fernandes, I. R., Russo, F. B., Freitas, B. C., Dias, J. L., Guimaraes, K. P., . . .
Beltrao-Braga, P. C. (2016). The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in
experimental models. Nature, 534(7606), 267-271. doi: 10.1038/nature18296
Cherabuddi, K., Iovine, N. M., Shah, K., White, S. K., Paisie, T., Salemi, M., . . . Lednicky, J. A.
(2016). Zika and Chikungunya virus co-infection in a traveller returning from Colombia,
2016: virus isolation and genetic analysis. JMM Case Rep, 3(6), e005072. doi:
10.1099/jmmcr.0.005072
Darriba, D., Taboada, G. L., Doallo, R., & Posada, D. (2012). jModelTest 2: more models, new
heuristics and parallel computing. Nat Methods, 9(8), 772.
Desmyter, J., Melnick, J. L., & Rawls, W. E. (1968). Defectiveness of interferon production and
of rubella virus interference in a line of African green monkey kidney cells (Vero). J Virol,
2(10), 955-961.
Dick, G. W., Kitchen, S. F., & Haddow, A. J. (1952). Zika virus. I. Isolations and serological
specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg, 46(5), 509-520.
Drake, J. W., Holland, J.J. . (1999). Mutation rates among RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S. A., 96, 13910–13913.
Drummond, A. J., Suchard, M. A., Xie, D., & Rambaut, A. (2012). Bayesian phylogenetics with
BEAUti and the BEAST 1.7. Mol Biol Evol, 29(8), 1969-1973. doi:
10.1093/molbev/mss075
Duan, W., Song, H., Wang, H., Chai, Y., Su, C., Qi, J., . . . Gao, G. F. (2017). The crystal structure
of Zika virus NS5 reveals conserved drug targets. EMBO J, 36(7), 919-933. doi:
10.15252/embj.201696241
Duffy, M. R., Chen, T. H., Hancock, W. T., Powers, A. M., Kool, J. L., Lanciotti, R. S., . . . Hayes,
E. B. (2009). Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. N Engl J
Med, 360(24), 2536-2543. doi: 10.1056/NEJMoa0805715
Elshuber, S., Allison, S. L., Heinz, F. X., & Mandl, C. W. (2003). Cleavage of protein prM is
necessary for infection of BHK-21 cells by tick-borne encephalitis virusFN1. Journal of
General Virology, 84(1), 183-191.
Fagbami, A. H. (1979). Zika virus infections in Nigeria: virological and seroepidemiological
investigations in Oyo State. J Hyg (Lond), 83(2), 213-219.
Faria, N. R., da Silva Azevedo, R. d. S., Kraemer, M. U., Souza, R., Cunha, M. S., Hill, S. C., . . .
Rissanen, I. (2016). Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings.
Science, 352(6283), 345-349.
Faye, O., Faye, O., Diallo, D., Diallo, M., Weidmann, M., & Sall, A. A. (2013). Quantitative real-
time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J, 10,
311. doi: 10.1186/1743-422X-10-311
70
Filipe, A. R., Martins, C. M., & Rocha, H. (1973). Laboratory infection with Zika virus after
vaccination against yellow fever. Arch Gesamte Virusforsch, 43(4), 315-319.
Filomatori, C. V., Carballeda, J. M., Villordo, S. M., Aguirre, S., Pallares, H. M., Maestre, A. M.,
. . . Gamarnik, A. V. (2017). Dengue virus genomic variation associated with mosquito
adaptation defines the pattern of viral non-coding RNAs and fitness in human cells. PLoS
Pathog, 13(3), e1006265. doi: 10.1371/journal.ppat.1006265
Fontes-Garfias, C. R., Shan, C., Luo, H., Muruato, A. E., Medeiros, D. B. A., Mays, E., . . . Shi, P.
Y. (2017). Functional Analysis of Glycosylation of Zika Virus Envelope Protein. Cell Rep,
21(5), 1180-1190. doi: 10.1016/j.celrep.2017.10.016
Foy, B. D., Kobylinski, K. C., Chilson Foy, J. L., Blitvich, B. J., Travassos da Rosa, A., Haddow,
A. D., . . . Tesh, R. B. (2011). Probable non-vector-borne transmission of Zika virus,
Colorado, USA. Emerg Infect Dis, 17(5), 880-882. doi: 10.3201/eid1705.101939
Goertz, G. P., Abbo, S. R., Fros, J. J., & Pijlman, G. P. (2017). Functional RNA during Zika virus
infection. Virus Res. doi: 10.1016/j.virusres.2017.08.015
Gong, Z., Gao, Y., & Han, G. Z. (2016). Zika Virus: Two or Three Lineages? Trends Microbiol,
24(7), 521-522. doi: 10.1016/j.tim.2016.05.002
Grant, A., Ponia, S. S., Tripathi, S., Balasubramaniam, V., Miorin, L., Sourisseau, M., . . . Garcia-
Sastre, A. (2016). Zika Virus Targets Human STAT2 to Inhibit Type I Interferon Signaling.
Cell Host Microbe, 19(6), 882-890. doi: 10.1016/j.chom.2016.05.009
Gutsche, I., Coulibaly, F., Voss, J. E., Salmon, J., d'Alayer, J., Ermonval, M., . . . Mégret, F. (2011).
Secreted dengue virus nonstructural protein NS1 is an atypical barrel-shaped high-density
lipoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108(19), 8003-8008.
Hamel, R., Dejarnac, O., Wichit, S., Ekchariyawat, P., Neyret, A., Luplertlop, N., . . . Misse, D.
(2015). Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol, 89(17), 8880-8896.
doi: 10.1128/JVI.00354-15
Hayes, E. B. (2009). Zika virus outside Africa. Emerg Infect Dis, 15(9), 1347-1350. doi:
10.3201/eid1509.090442
Hirsch, A. J., Smith, J. L., Haese, N. N., Broeckel, R. M., Parkins, C. J., Kreklywich, C., . . .
Streblow, D. N. (2017). Zika Virus infection of rhesus macaques leads to viral persistence
in multiple tissues. PLoS Pathog, 13(3), e1006219. doi: 10.1371/journal.ppat.1006219
Hofacker, I. L. (2003). Vienna RNA secondary structure server. Nucleic Acids Res, 31(13), 3429-
3431.
Honein, M. A., Dawson, A. L., Petersen, E. E., Jones, A. M., Lee, E. H., Yazdy, M. M., . . .
Bingham, A. (2017). Birth defects among fetuses and infants of US women with evidence
of possible Zika virus infection during pregnancy. JAMA, 317(1), 59-68.
Huson, D. H., & Bryant, D. (2006). Application of phylogenetic networks in evolutionary studies.
Mol Biol Evol, 23(2), 254-267. doi: 10.1093/molbev/msj030
Instituto Nacional de Salud. (2015). Boletín epidemiológico semana 12, 2015. Recuperado de
http://www.ins.gov.co/buscador-
eventos/BoletinEpidemiologico/2015%20Boletin%20epidemiologico%20semana%2012.
71
Instituto Nacional de Salud. (2016). Boletín epidemiológico semana 52, 2016. Recuperado de
http://www.ins.gov.co/buscador-
eventos/BoletinEpidemiologico/2016%20Bolet%C3%ADn%20epidemiol%C3%B3gico%
20semana%2052%20-.pdf
Instituto Nacional de Salud. (2017). Boletín epidemiológico semana 52, 2017. Recuperado de
http://www.ins.gov.co/buscador-
eventos/BoletinEpidemiologico/2017%20Bolet%C3%ADn%20epidemiol%C3%B3gico%
20semana%2052.pdf
Instituto Nacional de Salud. (2018). Boletín epidemiológico semana 06, 2018. Recuperado de
http://www.ins.gov.co/buscador-
eventos/BoletinEpidemiologico/2018%20Bolet%C3%ADn%20epidemiol%C3%B3gico%
20semana%2006.pdf
Ioos, S., Mallet, H. P., Leparc Goffart, I., Gauthier, V., Cardoso, T., & Herida, M. (2014). Current
Zika virus epidemiology and recent epidemics. Med Mal Infect, 44(7), 302-307. doi:
10.1016/j.medmal.2014.04.008
Kumar, M., Krause, K. K., Azouz, F., Nakano, E., & Nerurkar, V. R. (2017). A guinea pig model
of Zika virus infection. Virol J, 14(1), 75. doi: 10.1186/s12985-017-0750-4
Kuno, G., & Chang, G. J. (2007). Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza,
Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol, 152(4), 687-696. doi: 10.1007/s00705-006-0903-
z
Lahon, A., Arya, R. P., Kneubehl, A. R., Vogt, M. B., Dailey Garnes, N. J., & Rico-Hesse, R.
(2016). Characterization of a Zika Virus Isolate from Colombia. PLoS Negl Trop Dis, 10(9),
e0005019. doi: 10.1371/journal.pntd.0005019
Lanciotti, R. S., Kosoy, O. L., Laven, J. J., Velez, J. O., Lambert, A. J., Johnson, A. J., . . . Duffy,
M. R. (2008). Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic,
Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis, 14(8), 1232-1239. doi:
10.3201/eid1408.080287
Li, H., Saucedo-Cuevas, L., Regla-Nava, J. A., Chai, G., Sheets, N., Tang, W., . . . Gleeson, J. G.
(2016). Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters
Proliferation. Cell Stem Cell, 19(5), 593-598. doi: 10.1016/j.stem.2016.08.005
Lindenbach, B. D., & Rice, C. M. (2003). Molecular biology of flaviviruses. Adv Virus Res, 59,
23-61.
Liu, L., Zhang, S., Wu, Song, J., Li, A., Zhang, H., . . . Li, D. (2017). Identification and genetic
characterization of Zika virus isolated from an imported case in China. Infect Genet Evol,
48, 40-46. doi: 10.1016/j.meegid.2016.10.023
Liu, Y., Liu, J., Du, S., Shan, C., Nie, K., Zhang, R., . . . Cheng, G. (2017). Evolutionary
enhancement of Zika virus infectivity in Aedes aegypti mosquitoes. Nature, 545(7655),
482-486. doi: 10.1038/nature22365
Lobigs, M. (1993). Flavivirus premembrane protein cleavage and spike heterodimer secretion
require the function of the viral proteinase NS3. Proceedings of the National Academy of
Sciences, 90(13), 6218-6222.
72
Makhluf, H., & Shresta, S. (2018). Development of Zika Virus Vaccines. Vaccines (Basel), 6(1).
doi: 10.3390/vaccines6010007
Mansfield, K. L., Horton, D. L., Johnson, N., Li, L., Barrett, A. D., Smith, D. J., . . . Fooks, A. R.
(2011). Flavivirus-induced antibody cross-reactivity. J Gen Virol, 92(Pt 12), 2821-2829.
doi: 10.1099/vir.0.031641-0
Massad, E., Burattini, M. N., Khan, K., Struchiner, C. J., Coutinho, F. A. B., & Wilder-Smith, A.
(2017). On the origin and timing of Zika virus introduction in Brazil. Epidemiol Infect,
145(11), 2303-2312. doi: 10.1017/S0950268817001200
McCrae, A. W., & Kirya, B. G. (1982). Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in
Uganda. Trans R Soc Trop Med Hyg, 76(4), 552-562.
Mendez, J. A., Usme-Ciro, J. A., Domingo, C., Rey, G. J., Sanchez, J. A., Tenorio, A., & Gallego-
Gomez, J. C. (2012). Phylogenetic reconstruction of dengue virus type 2 in Colombia. Virol
J, 9, 64. doi: 10.1186/1743-422X-9-64
Metsky, H. C., Matranga, C. B., Wohl, S., Schaffner, S. F., Freije, C. A., Winnicki, S. M., . . .
Sabeti, P. C. (2017). Zika virus evolution and spread in the Americas. Nature, 546(7658),
411-415. doi: 10.1038/nature22402
Miller, M. A., Pfeiffer, W., & Schwartz, T. (2010). Creating the CIPRES Science Gateway for
inference of large phylogenetic trees. Paper presented at the Gateway Computing
Environments Workshop (GCE), 2010.
Miner, J. J., & Diamond, M. S. (2017). Zika Virus Pathogenesis and Tissue Tropism. Cell Host
Microbe, 21(2), 134-142. doi: 10.1016/j.chom.2017.01.004
Miner, J. J., Sene, A., Richner, J. M., Smith, A. M., Santeford, A., Ban, N., . . . Apte, R. S. (2016).
Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears. Cell Rep,
16(12), 3208-3218. doi: 10.1016/j.celrep.2016.08.079
Ministerio de Relaciones Exteriores. (2018). Boletines Migratorios de Colombia. Recuperado de
http://www.migracioncolombia.gov.co/index.php/es/buscar?q=boletines
Ministerio de Salud del Perú. (2016). Boletín Epidemiológico del Perú, Semana 52 2016.
Recuperado de http://www.dge.gob.pe/portal/docs/vigilancia/boletines/2016/52.pdf
Ministerio de Salud y Protección Social. (2015). MinSalud confirma primeros nueve casos de Zika
en Colombia. Recuperado de https://www.minsalud.gov.co/Paginas/Confirmados-
primeros-casos-de-virus-del-zika-en-Colombia.aspx
Morabito, K. M., & Graham, B. S. (2017). Zika Virus Vaccine Development. J Infect Dis,
216(suppl_10), S957-S963. doi: 10.1093/infdis/jix464
Mukhopadhyay, S., Kuhn, R. J., & Rossmann, M. G. (2005). A structural perspective of the
flavivirus life cycle. Nat Rev Microbiol, 3(1), 13-22. doi: 10.1038/nrmicro1067
Muller, D. A., Landsberg, M. J., Bletchly, C., Rothnagel, R., Waddington, L., Hankamer, B., &
Young, P. R. (2012). Structure of the dengue virus glycoprotein non-structural protein 1 by
electron microscopy and single-particle analysis. J Gen Virol, 93(Pt 4), 771-779. doi:
10.1099/vir.0.039321-0
Munoz-Jordan, J. L., Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L., Ashok, M., Lipkin, W.
I., & Garcia-Sastre, A. (2005). Inhibition of alpha/beta interferon signaling by the NS4B
73
protein of flaviviruses. J Virol, 79(13), 8004-8013. doi: 10.1128/JVI.79.13.8004-
8013.2005
Musso, D., Cao-Lormeau, V. M., & Gubler, D. J. (2015). Zika virus: following the path of dengue
and chikungunya? Lancet, 386(9990), 243-244. doi: 10.1016/S0140-6736(15)61273-9
Musso, D., Nhan, T., Robin, E., Roche, C., Bierlaire, D., Zisou, K., . . . Broult, J. (2014). Potential
for Zika virus transmission through blood transfusion demonstrated during an outbreak in
French Polynesia, November 2013 to February 2014. Eurosurveillance, 19(14), 20761.
Ni, P., & Kao, C. C. (2013). Non-encapsidation activities of the capsid proteins of positive-strand
RNA viruses. Virology, 446(1-2), 123-132.
Oehler, E., Watrin, L., Larre, P., Leparc-Goffart, I., Lastere, S., Valour, F., . . . Ghawche, F. (2014).
Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French
Polynesia, December 2013. Euro Surveill, 19(9).
Oliveira Melo, A. S., Malinger, G., Ximenes, R., Szejnfeld, P. O., Alves Sampaio, S., & Bispo de
Filippis, A. M. (2016). Zika virus intrauterine infection causes fetal brain abnormality and
microcephaly: tip of the iceberg? Ultrasound Obstet Gynecol, 47(1), 6-7. doi:
10.1002/uog.15831
Olson, J. G., Ksiazek, T. G., Gubler, D. J., Lubis, S. I., Simanjuntak, G., Lee, V. H., . . . See, R.
(1983). A survey for arboviral antibodies in sera of humans and animals in Lombok,
Republic of Indonesia. Ann Trop Med Parasitol, 77(2), 131-137.
PAHO/WHO. (2018, 12 March 2018 ). Zika suspected and confirmed cases reported by countries
and territories in the Americas Cumulative cases, 2015-2017. Recuperado de
http://www.paho.org/hq/index.php?option=com_content&view=article&id=12390&Itemi
d=42090&lang=en
Pascoa, V., Oliveira, P. L., Dansa-Petretski, M. l., Silva, J. R., Alvarenga, P. H., Jacobs-Lorena,
M., & Lemos, F. J. (2002). Aedes aegypti peritrophic matrix and its interaction with heme
during blood digestion. Insect Biochem Mol Biol, 32(5), 517-523.
Pettersson, J. H.-O., Eldholm, V., Seligman, S. J., Lundkvist, Å., Falconar, A. K., Gaunt, M. W., .
. . Gould, E. A. (2016). How did Zika virus emerge in the Pacific Islands and Latin
America? MBio, 7(5), e01239-01216.
Pfeffer, M., & Dobler, G. (2010). Emergence of zoonotic arboviruses by animal trade and
migration. Parasit Vectors, 3(1), 35. doi: 10.1186/1756-3305-3-35
Plourde, A. R., & Bloch, E. M. (2016). A Literature Review of Zika Virus. Emerg Infect Dis, 22(7),
1185-1192. doi: 10.3201/eid2207.151990
Prasad, V. M., Miller, A. S., Klose, T., Sirohi, D., Buda, G., Jiang, W., . . . Rossmann, M. G. (2017).
Structure of the immature Zika virus at 9 A resolution. Nat Struct Mol Biol, 24(2), 184-186.
doi: 10.1038/nsmb.3352
Prasad, V. M., Miller, A. S., Klose, T., Sirohi, D., Buda, G., Jiang, W., . . . Rossmann, M. G. (2017).
Structure of the immature Zika virus at 9 Å resolution. Nature Structural and Molecular
Biology, 24(2), 184.
74
Rambaut, A., Lam, T. T., Max Carvalho, L., & Pybus, O. G. (2016). Exploring the temporal
structure of heterochronous sequences using TempEst (formerly Path-O-Gen). Virus Evol,
2(1), vew007. doi: 10.1093/ve/vew007
Richard, V., Paoaafaite, T., & Cao-Lormeau, V. M. (2016). Vector Competence of French
Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus. PLoS Negl Trop Dis,
10(9), e0005024. doi: 10.1371/journal.pntd.0005024
Roby, J. A., Setoh, Y. X., Hall, R. A., & Khromykh, A. A. (2015). Post-translational regulation
and modifications of flavivirus structural proteins. J Gen Virol, 96(Pt 7), 1551-1569. doi:
10.1099/vir.0.000097
Rodenhuis-Zybert, I. A., van der Schaar, H. M., da Silva Voorham, J. M., van der Ende-Metselaar,
H., Lei, H. Y., Wilschut, J., & Smit, J. M. (2010). Immature dengue virus: a veiled
pathogen? PLoS Pathog, 6(1), e1000718. doi: 10.1371/journal.ppat.1000718
Romoser, W. S., Wasieloski, L. P., Jr., Pushko, P., Kondig, J. P., Lerdthusnee, K., Neira, M., &
Ludwig, G. V. (2004). Evidence for arbovirus dissemination conduits from the mosquito
(Diptera: Culicidae) midgut. J Med Entomol, 41(3), 467-475.
Roosendaal, J., Westaway, E. G., Khromykh, A., & Mackenzie, J. M. (2006). Regulated cleavages
at the West Nile virus NS4A-2K-NS4B junctions play a major role in rearranging
cytoplasmic membranes and Golgi trafficking of the NS4A protein. J Virol, 80(9), 4623-
4632.
Sall, A. A., Faye, O., Diallo, M., Firth, C., Kitchen, A., & Holmes, E. C. (2010). Yellow fever virus
exhibits slower evolutionary dynamics than dengue virus. J Virol, 84(2), 765-772. doi:
10.1128/JVI.01738-09
Shapiro, B., Rambaut, A., & Drummond, A. J. (2006). Choosing appropriate substitution models
for the phylogenetic analysis of protein-coding sequences. Mol Biol Evol, 23(1), 7-9. doi:
10.1093/molbev/msj021
Shi, Y., & Gao, G. F. (2017). Structural Biology of the Zika Virus. Trends Biochem Sci, 42(6),
443-456. doi: 10.1016/j.tibs.2017.02.009
Simpson, D. I. (1964). Zika Virus Infection in Man. Trans R Soc Trop Med Hyg, 58, 335-338.
Sirohi, D., Chen, Z., Sun, L., Klose, T., Pierson, T. C., Rossmann, M. G., & Kuhn, R. J. (2016).
The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science, 352(6284), 467-470. doi:
10.1126/science.aaf5316
Sokal, A., D'Ortenzio, E., Houhou-Fidouh, N., Brichler, S., Dorchies, J., Cabras, O., . . . Matheron,
S. (2016). Zika virus infection: report of the first imported cases in a Paris travel centre. J
Travel Med, 24(1). doi: 10.1093/jtm/taw066
Staples, J. E., Breiman, R. F., & Powers, A. M. (2009). Chikungunya fever: an epidemiological
review of a re-emerging infectious disease. Clin Infect Dis, 49(6), 942-948. doi:
10.1086/605496
Tabata, T., Petitt, M., Puerta-Guardo, H., Michlmayr, D., Wang, C., Fang-Hoover, J., . . . Pereira,
L. (2016). Zika Virus Targets Different Primary Human Placental Cells, Suggesting Two
Routes for Vertical Transmission. Cell Host Microbe, 20(2), 155-166. doi:
10.1016/j.chom.2016.07.002
75
Tognarelli, J., Ulloa, S., Villagra, E., Lagos, J., Aguayo, C., Fasce, R., . . . Fernandez, J. (2016). A
report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Arch Virol,
161(3), 665-668. doi: 10.1007/s00705-015-2695-5
Trifinopoulos, J., Nguyen, L. T., von Haeseler, A., & Minh, B. Q. (2016). W-IQ-TREE: a fast
online phylogenetic tool for maximum likelihood analysis. Nucleic Acids Res, 44(W1),
W232-235. doi: 10.1093/nar/gkw256
van der Eijk, A. A., van Genderen, P. J., Verdijk, R. M., Reusken, C. B., Mogling, R., van Kampen,
J. J., . . . Koopmans, M. P. (2016). Miscarriage Associated with Zika Virus Infection. N
Engl J Med, 375(10), 1002-1004. doi: 10.1056/NEJMc1605898
van Hemert, F., & Berkhout, B. (2016). Nucleotide composition of the Zika virus RNA genome
and its codon usage. Virol J, 13, 95. doi: 10.1186/s12985-016-0551-1
Villordo, S. M., & Gamarnik, A. V. (2009). Genome cyclization as strategy for flavivirus RNA
replication. Virus Res, 139(2), 230-239.
Wahid, B., Ali, A., Rafique, S., & Idrees, M. (2017). Current status of therapeutic and vaccine
approaches against Zika virus. Eur J Intern Med, 44, 12-18. doi:
10.1016/j.ejim.2017.08.001
Wang, A., Thurmond, S., Islas, L., Hui, K., & Hai, R. (2017). Zika virus genome biology and
molecular pathogenesis. Emerg Microbes Infect, 6(3), e13. doi: 10.1038/emi.2016.141
Weaver, S. C. (2006). Evolutionary influences in arboviral disease. Curr Top Microbiol Immunol,
299, 285-314.
Weaver, S. C., & Barrett, A. D. (2004). Transmission cycles, host range, evolution and emergence
of arboviral disease. Nat Rev Microbiol, 2(10), 789-801. doi: 10.1038/nrmicro1006
WHO. (2016). Zika Strategic Response Framework & Joint Operations Plan. Recuperado de
http://www.who.int/emergencies/zika-virus/strategic-response-framework.pdf
WHO. (2017). Situation report: Zika virus microcephaly and Guillain-Barré syndrome.
Recuperado de http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/254714/1/zikasitrep10Mar17-
eng.pdf?ua=1
WHO. (2018). WHO vaccine pipeline tracker. Recuperado de
http://www.who.int/immunization/research/vaccine_pipeline_tracker_spreadsheet/en/
Xu, X., Song, H., Qi, J., Liu, Y., Wang, H., Su, C., . . . Gao, G. F. (2016). Contribution of
intertwined loop to membrane association revealed by Zika virus full-length NS1 structure.
EMBO J, 35(20), 2170-2178. doi: 10.15252/embj.201695290
Ye, Q., Liu, Z. Y., Han, J. F., Jiang, T., Li, X. F., & Qin, C. F. (2016). Genomic characterization
and phylogenetic analysis of Zika virus circulating in the Americas. Infect Genet Evol, 43,
43-49. doi: 10.1016/j.meegid.2016.05.004
Youn, S., Li, T., McCune, B. T., Edeling, M. A., Fremont, D. H., Cristea, I. M., & Diamond, M.
S. (2012). Evidence for a genetic and physical interaction between nonstructural proteins
NS1 and NS4B that modulates replication of West Nile virus. J Virol, 86(13), 7360-7371.
Yuan, L., Huang, X. Y., Liu, Z. Y., Zhang, F., Zhu, X. L., Yu, J. Y., . . . Qin, C. F. (2017). A single
mutation in the prM protein of Zika virus contributes to fetal microcephaly. Science. doi:
10.1126/science.aam7120
76
Zanluca, C., Melo, V. C., Mosimann, A. L., Santos, G. I., Santos, C. N., & Luz, K. (2015). First
report of autochthonous transmission of Zika virus in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz,
110(4), 569-572. doi: 10.1590/0074-02760150192
Zhu, Z., Chan, J. F., Tee, K. M., Choi, G. K., Lau, S. K., Woo, P. C., . . . Yuen, K. Y. (2016).
Comparative genomic analysis of pre-epidemic and epidemic Zika virus strains for
virological factors potentially associated with the rapidly expanding epidemic. Emerg
Microbes Infect, 5, e22. doi: 10.1038/emi.2016.48
77
ANEXOS
Anexo 1. Cebadores utilizados para la secuenciación de COL345Si.
Nombre del
Primer Secuencia 5'-3'
Temperatura
Melting (Tm) Tamaño
Porcentaje
GC
17US
AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGA
CTG 58°C 27 nt 41%
9US GGGTCAGAGTTTGCATGTCC 57°C 20 nt 55%
8US CGATTGTTGGTGCAACACG 56°C 19 nt 53%
11US TGCCACATAGTGTGAAAGACC 56°C 21 nt 48%
10US GGTGATCGAGGAATGGTGC 56°C 18 nt 58%
12US GACAAAGTAGCAGCCATTGAGG 57°C 22 nt 50%
13US TCAAGTACATGTAGTGCGCC 56°C 20 nt 50%
14US GGAATAGCCATGACCGACACC 58°C 21 nt 57%
15US TCCCAGTTGGAACCCAGTC 57°C 19 nt 58%
16US GCCTGCTATTCGGCGATCTGTG 53°C 22 nt 59%
ZOF GGGTTGTGTACGGAACCTG 56 °C 19 nt 58%
Z1R CATTTCCCCAGCCTCTGTC 56°C 19 nt 50%
Z2F CGTAGATTGGCAGCAGCA 56°C 18 nt 56%
Z3R GGGAGAAGTGATCCATGTGATC 56°C 22 nt 50%
Z4F TGAGATCAACCACTGCAAGC 56°C 20 nt 50%
Z5R CACTGCCTTTTCCCTTCAGAG 56°C 21 nt 52%
Z6F GACTTGCATCCTGGAGCTG 56°C 19 nt 58%
Z7R GAGTCCGGAAATGCGTCA 56°C 18 nt 56%
Z8F CGCAGAGACTGACGAAGAC 56°C 19 nt 58%
Z9R GGCTTTGTAAGGCCTGCTT 56°C 19 nt 53%
Z10F CCATACACCAGCACTATGATGG 56°C 22 nt 50%
Z11R CATTGCTACGCACCTTGTTG 56°C 20 nt 50%
Z12F GGAGGTCCATTGTGGTTCC 56°C 19 nt 58%
78
Z13R TGCTTACAGCACTCCAGGT 56°C 19 nt 53%
Z14F TCGGCCCTGGAGTTCTAC 56°C 18 nt 61%
Z15R AGTGGCACTCTGACCAGT 56°C 18 nt 56%
Z16R AGACCCATGGATTTCCCCA 56°C 19 nt 53%
Z17F GGCTGGAGCTTCTCTAATCTAC 55°C 22 nt 50%
Z18R GGAGTTCTACTCCTACAAAAAGTC
AG 56°C 26 nt 42%
Z19R GCTTCTTCCACTTCAGGACTAG 55°C 22 nt 50%
17* CTCTTCCAGGATTGCGTTGAGCT 60°C 23 nt 52%
18* AGCTCAACGCAATCCTGGAAGAG 60°C 23 nt 52%
19* GTAGTAGACGTGAAGTGAAGGTG
GCAT 61°C 27 nt 48%
20* ATGCCACCTTCACTTCACGTCTAC
TAC 61°C 27 nt 48%
21* CACTTCTTGAACTTTGCGGATGGT 59°C 24 nt 46%
22* ACCATCCGCAAAGTTCAAGAAGT
G 59°C 24 nt 46%
30*
TAAGCCATAATACGACTCACTATA
GAGTTGTTGATCTGTGTGAATCAG
ACTGC
67°C 53 nt 40%
33* GAGAGATATCGCCTGCTATTCGGC
GATCTGTG 66°C 32 nt 53%
* Cebadores diseñados por Erwin Camacho B, Universidad de Sucre,
Colombia/Universidad de Wisconsin, Estados Unidos.
79
Anexo 2. Información y números de acceso a GenBank de las secuencias utilizadas para la
reconstrucción filogenética a partir de aislados de mosquitos y primates no humanos.
Código
GenBank País
Fecha
aislamiento Hospedero
MF099651.1 China/Guizhou ago-16 Culex quinquefasciatus
MF384325.1 Haití 16-may-16 Aedes aegypti
KX377336.1 Malasia jul-66 Aedes aegypti
KY648934.1 México/Chiapas 2016 Aedes aegypti
KX247632.1 México nov-15 Aedes aegypti
KF268950.1 R. Centroafricana/Bozo 1976 Aedes africanus
KF268949.1 R. Centroafricana/Bozo 1980 Aedes opok
KF268948.1 R. Centroafricana /Bozo 1979 Aedes africanus
KF383116.1 R. Centroafricana 1968 Aedes africanus
KU955595.1 Senegal 14-dic-84 Aedes taylori
KU955591.1 Senegal 20-nov-84 Aedes africanus
KF383116.1 Senegal 1968 Aedes luteocephalus
HQ234501.1 Senegal 1984 Aedes africanus
KF383117.1 Senegal 1997 Aedes luteocephalus
KF383119.1 Senegal 2001 Aedes dalzieli
KF383118.1 Senegal 2001 Aedes dalzieli
KY241775.1 Singapur 05-sep-16 Aedes aegypti
KY241786.1 Singapur 06-sep-16 Aedes albopictus
KY241785.1 Singapur 05-sep-16 Aedes albopictus
KY241784.1 Singapur 08-sep-16 Aedes aegypti
KY241783.1 Singapur 07-sep-16 Aedes aegypti
KY241782.1 Singapur 07-sep-16 Aedes aegypti
KY241781.1 Singapur 06-sep-16 Aedes aegypti
KY241780.1 Singapur 06-sep-16 Aedes aegypti
80
KY241779.1 Singapur 06-sep-16 Aedes aegypti
KY241778.1 Singapur 06-sep-16 Aedes aegypti
KY241777.1 Singapur 06-sep-16 Aedes aegypti
KY241776.1 Singapur 05-sep-16 Aedes aegypti
KY241774.1 Singapur 05-sep-16 Aedes aegypti
LC002520.1 Uganda 1947 Macaca mulatta
KY785468.1 USA/Miami 05-oct-16 Aedes aegypti
KY014324.2 USA/Miami 22-ago-16 Aedes aegypti
KY014323.2 USA/Miami 23-ago-16 Aedes aegypti
KY014322.2 USA/Miami 23-ago-16 Aedes aegypti
KY014299.2 USA/Miami 04-sep-16 Aedes aegypti
KY785422.1 USA/Miami 09-sep-16 Aedes aegypti
KY075939.2 USA/Miami 16-nov-16 Aedes aegypti
KX838906.2 USA/Miami 23-ago-16 Aedes aegypti
KX838905.2 USA/Miami 23-ago-16 Aedes aegypti
KX838904.2 USA/Miami 22-ago-16 Aedes aegypti
KY075938.1 USA/Miami 20-sep-16 Aedes aegypti
KY075937.1 USA/Miami 09-sep-16 Aedes aegypti
KX922708.1 USA/Miami 04-sep-16 Aedes aegypti
MF988743.1 USA/Miami 01-sep-16 Aedes aegypti
81
Anexo 3. Información y números de acceso a GenBank de las secuencias utilizadas para la
reconstrucción filogenética a partir de aislados de humanos y mosquitos. Todas las cepas aisladas
de mosquitos fueron de la especie A. aegypti. N/R: No Registra.
Código
GenBank País Localidad Hospedero
KY785446.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY014313.2 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY785439.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY785433.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY014297.2 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY014301.2 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY785429.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY785456.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY785436.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY014296.2 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY014317.2 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY014320.2 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY014309.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY014307.2 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY785437.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY785455.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY785426.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KU321639.1 Brasil N/R Humano
KU365777.1 Brasil N/R Humano
KU365778.1 Brasil N/R Humano
KU365779.1 Brasil N/R Humano
82
KU497555.1 Brasil N/R Humano
KU527068.1 Brasil Natal Humano
KU707826.1 Brasil Salvador Humano
KU729217.2 Brasil N/R Humano
KU729218.1 Brasil N/R Humano
KU926310.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KU940224.1 Brasil Bahía Humano
KU940227.1 Brasil Bahía Humano
KU940228.1 Brasil Bahía Humano
KX101060.1 Brasil Bahía Humano
KX101061.1 Brasil Bahía Humano
KX101066.1 Brasil Bahía Humano
KX197192.1 Brasil Recife Humano
KX280026.1 Brasil Paraibá Humano
KY014308.2 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY558989.1 Brasil Rio Grande do
Norte Humano
KY558994.1 Brasil Pernambuco Humano
KY558996.1 Brasil Pernambuco Humano
KY558998.1 Brasil Pernambuco Humano
KY558999.1 Brasil Pernambuco Humano
KY559007.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559010.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559013.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559015.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY785410.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY785427.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY785450.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
83
KY785479.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY785480.1 Brasil Rio de Janeiro Humano
KY559001.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559003.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559005.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559017.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559018.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559019.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559011.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559012.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559021.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559023.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559024.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559014.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559006.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY559009.1 Brasil Sao Paulo Humano
KY785417.1 Colombia Santander Humano
KY785466.1 Colombia Santander Humano
KY785477.1 Colombia Santander Humano
KY785469.1 Colombia Santander Humano
KU820897.5 Colombia Barranquilla Humano
KX247646.1 Colombia Cundinamarca Humano
KX548902.1 Colombia Bolívar Humano
KY317936.1 Colombia N/R Humano
KY317937.1 Colombia N/R Humano
KY317938.1 Colombia N/R Humano
KY317939.1 Colombia N/R Humano
KY317940.1 Colombia N/R Humano
84
KU501216.1 Guatemala N/R Humano
KU501217.1 Guatemala N/R Humano
KY785482.1 Haití N/R Humano
KU509998.3 Haití N/R Humano
KX051563.1 Haití N/R Humano
KX269878.1 Haití N/R Humano
KY415988.1 Haití N/R Humano
KY415990.1 Haití N/R Humano
KY415991.1 Haití N/R Humano
MF384325.1 Haití N/R Mosquito
KY785414.1 Honduras Tegucigalpa Humano
KY785461.1 Honduras Tegucigalpa Humano
KY785444.1 Honduras Tegucigalpa Humano
KY785448.1 Honduras Tegucigalpa Humano
KY785458.1 Honduras Tegucigalpa Humano
KY014306.2 Honduras Tegucigalpa Humano
KY785431.1 Honduras Tegucigalpa Humano
KY785416.1 Honduras Tegucigalpa Humano
KY014319.2 Honduras Tegucigalpa Humano
KY014310.2 Honduras Tegucigalpa Humano
KY014312.2 Honduras Tegucigalpa Humano
KY785418.1 Honduras Tegucigalpa Humano
KY785471.1 Honduras Tegucigalpa Humano
KY014315.2 Honduras Tegucigalpa Humano
KY014327.2 Honduras Tegucigalpa Humano
KY785442.1 Honduras Tegucigalpa Humano
KY785452.1 Honduras Tegucigalpa Humano
KY785424.1 Jamaica N/R Humano
85
KY785438.1 Jamaica N/R Humano
KY785430.1 Jamaica N/R Humano
KY785432.1 Jamaica N/R Humano
KY785419.1 Jamaica N/R Humano
KU647676.1 Martinica N/R Humano
KY785451.1 Martinica N/R Humano
KX156774.2 Panamá Panamá D.C Humano
KX156775.2 Panamá Panamá D.C Humano
KX156776.2 Panamá Panamá D.C Humano
KX198135.2 Panamá Panamá D.C Humano
KU501215.1 Puerto Rico N/R Humano
KY785462.1 Puerto Rico N/R Humano
KY785464.1 Puerto Rico N/R Humano
KY785481.1 Puerto Rico N/R Humano
KY785425.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785463.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785449.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785475.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY014321.2 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785415.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY014303.2 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY014304.2 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785476.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785420.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY014300.2 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY014302.3 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY014318.3 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785428.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
86
KY785441.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY014314.2 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785453.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785478.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785484.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785473.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785470.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785460.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785435.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785434.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785447.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785413.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KU853012.1 República Dominicana N/R Humano
KU853013.1 República Dominicana N/R Humano
KY014305.2 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785423.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785465.1 República Dominicana Santo Domingo Humano
KY785454.1 Salvador/Guatemala N/R Humano
KY348640.1 Surinam N/R Humano
KU312312.1 Surinam N/R Humano
KY014295.2 USA Miami Humano
KY014324.2 USA Miami Mosquito
KY785445.1 USA Miami Humano
KY785412.1 USA Miami Humano
KY785443.1 USA Miami Humano
KY785457.1 USA Miami Humano
KY014323.2 USA Miami Mosquito
KY014325.2 USA Miami Humano
87
KY014298.1 USA Miami Humano
KY785474.1 USA Miami Humano
KY014326.1 USA Miami Humano
KY014316.2 USA Miami Humano
KY014322.2 USA Miami Mosquito
KY014299.2 USA Miami Mosquito
KY785422.1 USA Miami Mosquito
KY785472.1 USA Miami Mosquito
KY785468.1 USA Miami Mosquito
KY785459.1 USA Miami Humano
KX702400.1 Venezuela Barquisimeto Humano
KX893855.1 Venezuela Barquisimeto Humano
KY693680.1 Venezuela Maracay Humano
JN860885.1* Camboya N/R Humano
KU681082.3* Filipinas N/R Humano
EU545988.1* Micronesia N/R Humano
KJ776791.2* Polinesia Francesa N/R Humano
*Secuencias utilizadas como grupo externo para el árbol de Máxima Verosimilitud.
88
Anexo 4. Selección de modelos para análisis en BEAST. En la tabla se muestran las verosimilitudes
marginales calculadas por Path Sampling y Stepping Stone Sampling para la combinación de tres
priors de árbol coalescente (población de tamaño constante, población con crecimiento exponencial
y Skyline) y dos modelos de reloj molecular (reloj estricto y reloj relajado no correlacionado con
distribución Log-normal). En rojo se muestra la combinación con mayor verosimilud marginal y
por tanto la seleccionada para realizar las estimaciones filogenéticas posteriores.
Path sampling
(log verosimiltud marginal)
Stepping stone sampling
(log verosimiltud marginal)
Rejalado Constante -2560,02489384975 -2560,51611002707
Estricto Exponencial -2558,81027288259 -2559,09773323015
Estricto Constante -2561,78586492538 -2562,15042521896
Relajado Exponencial -2557,32352102885 -2557,73764224387
Estricto Skyline -2555,24428547608 -2555,86451294598
Relajado Skyline -2554,12530779930 -2554,68545180477
89
Anexo 5. Visualización de la convergencia en Tracer v.1.6 del análisis ejecutado en BEAST, con
400 millones de pasos en MCMC con reloj molecular relajado no correlacionado y crecimiento
poblacional bayesiado Skyline. El 10% de las observaciones iniciales en MCMC fue descartado
como burn-in (color gris).
90
Anexo 6. Estimación de los parámetros ejecutados en BEAST con 400 millones de pasos en
MCMC en el programa Tracer v.1.6, para las secuencias utilizadas en el estudio con reloj molecular
relajado no correlacionado y crecimiento poblacional bayesiado Skyline. ESS: Effective Sample
Size (Tamaño efectivo de la muestra); R: Real.
Statistic Mean ESS Type
posterior -29836.147 1084 R
prior -5184.313 760 R
likelihood -24651.834 7741 R
treeModel.rootHeight 2.659 1743 R
tmrca(Brasil) 2.659 1743 R
tmrca(Colombia) 1.581 1830 R
skyline.popSize1 5.174 15504 R
skyline.popSize2 16.227 239 R
skyline.popSize3 42.46 572 R
skyline.popSize4 44.492 370 R
skyline.popSize5 28.546 417 R
skyline.popSize6 20.84 877 R
skyline.popSize7 19.588 925 R
skyline.popSize8 10.659 398 R
skyline.popSize9 2.16 290 R
skyline.popSize10 0.353 742 R
Skyline.groupSize1 12.1 438 R
Skyline.groupSize2 7.385 181 R
Skyline.groupSize3 18.138 209 R
Skyline.groupSize4 22.298 287 R
Skyline.groupSize5 26.079 335 R
Skyline.groupSize6 29.544 232 R
Skyline.groupSize7 25.216 206 R
Skyline.groupSize8 19.122 301 R
91
Skyline.groupSize9 17.01 363 R
Skyline.groupSize10 9.106 323 R
CP1+2.kappa 12.023 35844 R
CP3.kappa 19.452 35637 R
frequencies1 0.262 36001 R
frequencies2 0.232 34631 R
frequencies3 0.28 36001 R
frequencies4 0.227 36001 R
CP1+2.alpha 4.881E-2 35231 R
CP3.alpha 0.572 34947 R
CP1+2.mu 0.353 35502 R
CP3.mu 2.294 35502 R
ucld.mean 1.217E-3 591 R
ucld.stdev 0.34 3548 R
meanRate 1.187E-3 527 R
coefficientOfVariation 0.346 3470 R
covariance -2.073E-3 33420 R
CP1+2.treeLikelihood -12285.203 10726 R
CP3.treeLikelihood -12366.631 7674 R
branchRates -2201.829 - R
skyline -635.439 748 R