caracterizaciÓn del tejido vegetal manicaria …

CARACTERIZACIÓN DEL TEJIDO VEGETAL MANICARIA SACCIFERA PARA DETERMINAR LA

VIABILIDAD DE USARSE COMO REFORZAMIENTO DE MATERIALES COMPUESTOS EN

APLICACIONES CLÍNICAS.

JESÚS DAVID CHAUX SÁNCHEZ

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA MECÁNICA

BOGOTÁ D.C., COLOMBIA

2018

CARACTERIZACIÓN DEL TEJIDO VEGETAL MANICARIA SACCIFERA PARA DETERMINAR LA

VIABILIDAD DE USARSE COMO REFORZAMIENTO DE MATERIALES COMPUESTOS EN

APLICACIONES CLÍNICAS.


Proyecto de grado presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniero Mecánico

ASESOR: EDGAR ALEJANDRO MARAÑÓN LEÓN, PhD.

COASESOR: NIYIRETH ALICIA PORRAS HOLGUÍN, PhD.

COASESOR: CAROLINA MUÑOZ CAMARGO, PhD.

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA MECÁNICA

BOGOTÁ D.C., COLOMBIA

2018

i

Bogotá D.C., noviembre 28 de 2018

Doctores

EDGAR ALEJANDRO MARAÑÓN LEÓN, PhD.

NIYIRETH ALICIA PORRAS HOLGUÍN, PhD.

CAROLINA MUÑOZ CAMARGO, PhD.

Universidad de los Andes

Respetados doctores:

Por medio de la presente me permito someter a su consideración el proyecto de grado titulado

CARACTERIZACIÓN DEL TEJIDO VEGETAL MANICARIA SACCIFERA PARA DETERMINAR LA VIABILIDAD

DE USARSE COMO REFORZAMIENTO DE MATERIALES COMPUESTOS EN APLICACIONES CLÍNICAS,

como requisito académico para optar al título de Ingeniero Mecánico de la Universidad de los Andes.

Cordial saludo,


ii

AGRADECIMIENTOS

Es muy grato para mi saber que en este proyecto participaron personas de diferentes áreas del

conocimiento con habilidades destacables. Sin embargo, aunque el conocimiento y las habilidades

son importantes, considero que el verdadero valor de las personas, si se quisiera representar

mediante una ecuación, se puede resumir a la siguiente expresión,

𝑉 = 𝐴 ∗ (𝐶 + 𝐻) [1]

Dónde,

𝑉 = 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑠 𝑝𝑒𝑟𝑠𝑜𝑛𝑎𝑠 𝐶 = 𝐶𝑜𝑛𝑜𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝐻 = 𝐻𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝐴 = 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑡𝑢𝑑

Según la ecuación, el valor de las personas se puede calcular si se tienen en cuenta tres variables:

Conocimiento, Habilidades y Actitud. Cabe destacar que la variable con mayor peso en la ecuación

es la actitud, ya que multiplica a la suma de los conocimientos y las habilidades. Es decir, la diferencia

entre las personas geniales y cualquier otra persona está en la actitud, ya que las personas con

buena actitud pueden transmitir con mayor facilidad sus conocimientos, habilidades y, sobre todo,

logran contagiar para que podamos dar lo mejor de sí. Así pues, quiero resaltar mi gratitud a cada

una de las personas que participaron en este proyecto, no sólo por sus conocimientos y habilidades

brindadas, sino por su buena actitud con la que logré contagiarme para sacar este trabajo adelante.

Quiero agradecer a toda mi familia, en especial a mis padres ALDEMAR CHAUX COLLAZOS y

YOLANDA SÁNCHEZ QUINTERO, por enseñarme las virtudes necesarias para obrar correctamente,

por el cariño y el apoyo que me han brindado y a mi hermano OSCAR ORLANDO CHAUX SÁNCHEZ,

por ser el ejemplo a seguir que he tenido durante toda la vida.

A EDGAR ALEJANDRO MARAÑÓN, PhD., NIYIRETH ALICIA PORRAS HOLGUÍN, PhD., CAROLINA

MUÑOZ CAMARGO, PhD., CARLOS ARTURO ÁVILA BERNAL PhD., y a GERARDO ALFONSO ROQUE

ROMERO, M.Sc., por su confianza, excelente actitud transmitida y cada uno de los valiosos aportes

a mi conocimiento durante el desarrollo de este proyecto de grado, que hoy en día se ven reflejados

en el deber cumplido.

Finalmente, a la Universidad de los Andes y todos los colaboradores que hicieron posible el

desarrollo de este proyecto y mi formación como ingeniero mecánico

iii

Resumen

El presente trabajo es un estudio del tejido vegetal Manicaria Saccifera, como el primer paso para

determinar la viabilidad de usarse como reforzamiento de materiales compuestos en aplicaciones

clínicas. Para ello se llevaron a cabo pruebas de tensión en diferentes direcciones, correspondientes

a la dirección en la que se orientan las fibras, transversal a estas y orientadas a 45°. Además, se llevó

a cabo la reconstrucción tomográfica del tejido vegetal, para calcular las áreas que realmente

estaban soportando los esfuerzos a tensión. Por último, se desarrollaron pruebas de

biocompatibilidad in vitro (citotoxicidad) para tener una idea general del comportamiento del

material en escenarios biológicos. Después de llevar a cabo dichas pruebas se concluye que el tejido

vegetal Manicaria Saccifera presenta comportamientos in vitro favorables, por lo se puede proceder

con las pruebas de biocompatibilidad in vivo.

Abstract

The present work is a study of the vegetable tissue Manicaria Saccifera, as the first step to determine

the feasibility of being used as reinforcement of composite materials in clinical applications. For this,

stress tests were carried out in different directions, corresponding to the direction in which the

fibers are oriented, transverse to these and oriented at 45°. In addition, the tomographic

reconstruction of the vegetable tissue was carried out, to calculate the areas that were really

supporting the tension efforts. Finally, in vitro biocompatibility tests (cytotoxicity) were developed

to get a general idea of the behavior of the material in biological scenarios. After carrying out these

tests, it is concluded that the plant tissue Manicaria Saccifera has favorable in vitro behaviors, so it

is possible to proceed with the biocompatibility tests in vivo.

iv

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Aplicaciones de la celulosa. a) Prótesis vascular de poliuretano/nanocelulosa. b)

Nanocompuesto antibacterial celulosa/Ag [6, 7]................................................................................ 2

Figura 2. Secciones de la hoja analizadas [4]. ..................................................................................... 3

Figura 3. Curva típica de esfuerzo contra deformación para un acero ASTM A36 [9]. ...................... 6

Figura 4. Descripción de diferentes curvas de esfuerzo contra deformación [9]. .............................. 6

Figura 5. Distancias representativas para el cálculo del tamaño del foco de la fuente [16]. ............. 8

Figura 6. Sistema de rotación [16]. ..................................................................................................... 8

Figura 7. Representación gráfica de las secciones de estudio del tejido vegetal Manicaria Saccifera.

............................................................................................................................................................. 9

Figura 8. Probeta de tensión en la dirección de las fibras. Todas las dimensiones están en

milímetros. ........................................................................................................................................ 10

Figura 9. Montaje de prueba de tensión en la dirección de las fibras. ............................................. 11

Figura 10. Probeta diseñada para la prueba de tensión en la dirección transversal a las fibras y

orientadas a 45°. La zona blanca corresponde a los tabs de madera y la zona café al tejido vegetal.

Todas las dimensiones están en milímetros. .................................................................................... 12

Figura 11. Montaje de prueba diseñado para medir la deformación del material de estudio

transversal a las fibras y orientadas a 45°.1. Sistema de adquisición de imágenes 2. Cámara de alta

velocidad. 3. Máquina de tensión (instron 3367) 4. Sistema de iluminación. 5. Sistema de

adquisición de datos de la máquina de tensión. 6. Probeta de prueba. .......................................... 13

Figura 12. Medición de la deformación con ayuda del Software Tracker Video Analysis®. ............. 13

Figura 13. a) Equipo de autoclave b) Envolturas por wrapped (izquierda) y tubo (derecha). .......... 14

Figura 14. Cabina de extracción. ....................................................................................................... 14

Figura 15. a) Agar en agitación b) caja de petri con agar y muestras de Manicaria Saccifera. ........ 15

Figura 16. Discos de material obtenidos con ayuda de un punch. ................................................... 16

Figura 17. Medio DMEM con 1% de penicilina extractomisina. ....................................................... 16

Figura 18. Distribución en la microplaca de 96 pozos para el ensayo de MTT. ................................ 17

Figura 19. Sensor Medipix 3. ............................................................................................................. 19

Figura 20. Montaje tomografía. ........................................................................................................ 20

Figura 21. Probetas tomografía. ....................................................................................................... 20

Figura 22. Binarización de una reconstrucción tomográfica. ........................................................... 21

Figura 23. Diagrama de esfuerzo contra deformación en la dirección de las fibras......................... 22

Figura 24. Probetas de tensión en la dirección transversal a las fibras. ........................................... 23

Figura 25. Probetas falladas a tensión en la dirección transversal a las fibras. ................................ 23

Figura 26. Curva de carga contra deformación del ensayo de tensión en la dirección transversal a

las fibras. ........................................................................................................................................... 24

Figura 27. Bifurcación e interbloqueo de fibras [4]. ......................................................................... 24

Figura 28. Curva de carga contra deformación del ensayo de tensión con las fibras orientadas a

45°. .................................................................................................................................................... 25

Figura 29. Probeta fallada en la prueba de tensión con las fibras orientadas a 45°. ....................... 26

Figura 30. a) 121[°C] método wrapped b) 121[°C] método wrapped réplica c) 134[°C] método

wrapped d) 134[°C] método wrapped réplica e) 121[°C] método tubo f) 121[°C] método tubo

réplica g) 134[°C] método tubo h) 134[°C] método tubo réplica. ..................................................... 28

Figura 31. Material esterilizado por el método de UV. ..................................................................... 29

v

Figura 32. Células Vero expuestas. ................................................................................................... 30

Figura 33. Sección transversal reconstruida tomográficamente. ..................................................... 30

Figura 34. Sección transversal de una fibra obtenida con un microscopio electrónico de barrido a

una escala de X1000 y posteriormente binarizada [5]. ..................................................................... 31

Figura 35. Reconstrucción 3D del tejido vegetal Manicaria Saccifera. ............................................. 31

Figura 36. Histograma de áreas de la sección 1. ............................................................................... 32

Figura 37. Histograma de áreas de la sección 2. ............................................................................... 33

Figura 38. Histograma correspondiente a las áreas de la sección 3 del tejido. ................................ 34

Figura 39. Histograma correspondiente a las áreas de la sección 4 del tejido. ................................ 35

vi

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Composición química del tejido vegetal Manicaria Saccifera para cada una de las

secciones presentadas en la Figura 2 [4]. ........................................................................................... 3

Tabla 2. Contenido de celulosa en diferentes fibras naturales [4]. .................................................... 3

Tabla 3. Parámetros de prueba norma ASTM D5035 ....................................................................... 10

Tabla 4. Parámetros de prueba de tensión en la dirección transversal a las fibras y orientadas a

45°. .................................................................................................................................................... 11

Tabla 5. Componentes necesarios para la prueba de MTT. ............................................................. 15

Tabla 6. Instrumentos necesarios para la prueba de MTT. .............................................................. 15

Tabla 7. Distancias representativas del montaje de prueba de la reconstrucción tomográfica. ..... 18

Tabla 8. Condiciones de la fuente de rayos X empleada para la reconstrucción tomográfica. ........ 18

Tabla 9. Configuración del sensor MediPix 3. ................................................................................... 18

Tabla 10. Umbrales de energía empleados en el software pixelman®. ............................................ 19

Tabla 11. Propiedades mecánicas del tejido en la dirección de las fibras. ....................................... 22

Tabla 12. Resultados de la prueba de citotoxicidad. ........................................................................ 29

Tabla 13.Estadísticas descriptivas sección 1. .................................................................................... 32

Tabla 14. Prueba de bondad del ajuste sección 1. ........................................................................... 32

Tabla 15. Estadísticas descriptivas sección 2. ................................................................................... 33

Tabla 16. Prueba de bondad del ajuste sección 2. ............................................................................ 33

Tabla 17. Estadísticas descriptivas para S3. ...................................................................................... 34

Tabla 18.Prueba de bondad del ajuste para S3 ................................................................................ 35

Tabla 19. Estadísticas descriptivas sección 4. ................................................................................... 36

Tabla 20. Prueba de bondad del ajuste sección 4. ........................................................................... 36

vii

NOMENCLATURA

Abreviaciones

AD: Anderson-Darling

ADN: Ácido desoxirribonucleico

ASTM: American Society for Testing and Materials

CT: Reconstrucción tomográfica

DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (medio de cultivo celular)

DMSO: Dimetil sulfóxido

FDA: Administración de Alimentos y Medicamentos

FFC: Flat Field Correction

ISO: International Organization for Standardization

MTT: Bromuro de 3-(4,5-dimetiliazol- ilo)-2,5-difeniltetrazol

PBS: Buffer fosfato salino.

PLA: Ácido poliláctico

P/S: Penicilina extractomisina

SEM: Scanning Electron Microscope

SBF: Suero Fetal Bovino

TM: Tejido de Manicaria Saccifera

UV: Ultravioleta

Lista de variables

𝑎: 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎

𝐴𝑜: Á𝑟𝑒𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 [𝑚𝑚2]

B: Número de bits in la representación binaria de los niveles de luminosidad [bit]

𝐸: 𝑀ó𝑑𝑢𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑌𝑜𝑢𝑛𝑔 [𝐺𝑃𝑎]

G: Escala de grises

L: Longitud de la probeta de estudio [mm]

𝐿𝑜: Longitud inicial de la probeta de estudio [mm]

𝑃: 𝐶𝑎𝑟𝑔𝑎 [𝑁]

𝑤𝐹: 𝑇𝑎𝑚𝑎ñ𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑓𝑜𝑐𝑜 [𝑚]

viii

𝑤𝐷: 𝑇𝑎𝑚𝑎ñ𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑒𝑛𝑠𝑜𝑟 [𝑚]

𝛼 =Significancia (%)

𝜎: 𝐸𝑠𝑓𝑢𝑒𝑟𝑧𝑜 𝑛𝑜𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙 [𝑀𝑝𝑎] ó [𝑘𝑃𝑎]

𝜀: 𝐷𝑒𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑢𝑛𝑖𝑡𝑎𝑟𝑖𝑎 [𝑚𝑚/𝑚𝑚]

𝑂𝐹̅̅ ̅̅ : 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝐹𝑢𝑒𝑛𝑡𝑒 − 𝑜𝑏𝑗𝑒𝑡𝑜 [𝑚]

𝐷𝑂̅̅ ̅̅ : 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑂𝑏𝑗𝑒𝑡𝑜 − 𝑆𝑒𝑛𝑠𝑜𝑟 [𝑚]

ix

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1

1.1 ANTECEDENTES ................................................................................................................... 2

1.2 ALCANCE .............................................................................................................................. 4

1.3 IMPORTANCIA ..................................................................................................................... 4

1.4 LIMITACIONES ..................................................................................................................... 4

2. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 4

2.1. GENERAL .............................................................................................................................. 4

2.2. ESPECÍFICOS ........................................................................................................................ 5

3. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................... 5

3.1 PRUEBAS MECÁNICAS ......................................................................................................... 5

3.2 PRUEBAS DE BIOCOMPATIBILIDAD ..................................................................................... 6

3.2.1 ESTERILIZACIÓN ........................................................................................................... 7

3.2.2 ENSAYO DE MTT .......................................................................................................... 7

3.3 RECONSTRUCCIÓN TOMOGRÁFICA ..................................................................................... 7

3.4 BINARIZACIÓN Y CÁLCULO DE ÁREAS ................................................................................. 9

4. METODOLOGÍA ................................................................................................................. 9

4.1. MATERIAL ............................................................................................................................ 9

4.2. PROPIEDADES MECÁNICAS ................................................................................................. 9

4.2.1 PRUEBA DE TENSIÓN EN LA DIRECCIÓN DE LAS FIBRAS ............................................. 9

4.2.2 PRUEBA DE TENSIÓN EN LA DIRECCIÓN TRANSVERSAL A LAS FIBRAS Y ORIENTADAS

A 45° 11

4.3 PRUEBAS DE BIOCOMPATIBILIDAD ............................................................................ 14

4.3.1 ESTERILIZACIÓN ......................................................................................................... 14

4.3.2 CITOTOXICIDAD ......................................................................................................... 15

4.4 RECONSTRUCCIÓN TOMOGRÁFICA ................................................................................... 17

4.5 BINARIZACIÓN Y CÁLCULO DE ÁREA ................................................................................. 20

4.5.1 IMPLEMENTACIÓN DEL CÓDIGO ............................................................................... 20

4.5.2 ANÁLISIS DE DATOS ................................................................................................... 21

5. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ................................................................. 21

5.1 PROPIEDADES MECÁNICAS ............................................................................................... 21

5.1.1 PRUEBRA DE TENSIÓN EN LA DIRECCIÓN DE LAS FIBRAS ......................................... 21

5.1.2 PRUEBRA DE TENSIÓN EN LA DIRECCIÓN TRANSVERSAL A LAS FIBRAS ................... 22

5.1.3 PRUEBRA DE TENSIÓN CON LAS FIBRAS ORIENTADAS A 45°+ .................................. 24

x

5.2 PRUEBAS DE BIOCOMPATIBILIDAD ................................................................................... 26

5.2.1 ESTERILIZACIÓN ......................................................................................................... 26

5.2.2 CITOTOXICIDAD ......................................................................................................... 29

5.3 RECONSTRUCCIÓN TOMOGRÁFICA ................................................................................... 30

5.4 BINARIZACIÓN Y CÁLCULO DE ÁREA ................................................................................. 31

6. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 36

7. RECOMENDACIONES Y TRABAJOS FUTUROS..................................................................... 37

REFERENCIAS .......................................................................................................................... 37

ANEXOS.................................................................................................................................. 39

1

1. INTRODUCCIÓN

Dentro de los países neotropicales, Colombia es el país con mayor diversidad de palmas: 220

especies incluidas en 43 géneros [2]. En ese territorio, las especies de palmas se distribuyen

desde las zonas más áridas del país como la Guajira al norte, hasta las selvas más cálidas y

lluviosas como las del Chocó al occidente del territorio nacional [2]. Debido a esto, en Colombia

existe una alta variedad de especies que se pueden analizar para la elaboración de

biocompuestos, siempre y cuando no generen un impacto ambiental. Por ejemplo, la especie

Manicaria Saccifera Gaertn se encuentra dentro del estatus de conservación LC (Least Concern),

es decir, el de menor preocupación de acuerdo a la UICN [3]. Por tal motivo, la manicaria es un

tentador recurso renovable que puede utilizarse para la elaboración de biocompuestos a escala

industrial.

Las hojas del tejido vegetal Manicaria Saccifera están conformadas por fibras onduladas que se

interbloquean y bifurcan para formar un tejido de forma natural (ver Figura 27). Dichas fibras

están constituidas principalmente por lignina y celulosa [4], con lo que se obtiene un tejido con

propiedades mecánicas apropiadas para servir como reforzamiento de materiales

biocompuestos [4, 5]. No obstante, uno de los retos actuales consiste en buscar aplicaciones en

las cuales el material biocompuesto pueda llegar a ser industrialmente competitivo, por lo que

sigue siendo tema de interés para algunos investigadores encontrar propiedades asociadas a

este material.

Debido a que la celulosa es conocida por sus propiedades de biocompatibilidad (Ver Figura 1),

surge la idea de utilizar el tejido de Manicaria Saccifera como reforzamiento de materiales

biocompuestos en aplicaciones clínicas. Como se mencionó anteriormente, una de las

características más representativas de las hojas de Manicaria Saccifera es su alto contenido de

celulosa, correspondiente a alrededor del 66% (ver Tabla 1), por lo que este material puede ser

un prometedor candidato para dichos fines.

Ahora bien, para evaluar si un material o dispositivo es biocompatible, la norma ISO 10993

sugiere llevar a cabo pruebas biológicas y mecánicas. Cuando es la primera vez que se realizan

pruebas biológicas, como es el caso de la Manicaria Saccifera, el primer paso consiste en

establecer un método de esterilización adecuado, para posteriormente llevar a cabo pruebas in

vitro. Unas de las pruebas biológicas in vitro sugeridas por la norma es la de citotoxicidad, en la

que se recomienda variar las condiciones de prueba para entender la naturaleza del material de

estudio en diferentes escenarios biológicos. Ahora bien, el tejido vegetal Manicaria Saccifera es

un material de naturaleza anisotrópica, por lo que propiedades como las mecánicas varían con

la dirección en la que se estudian. Así pues, es necesario llevar a cabo pruebas mecánicas de

tensión no sólo en la dirección sobre la cual están orientadas las fibras, sino también transversal

a estas y guiadas a 45°.

Por otro lado, para entender el comportamiento mecánico del material de estudio, es necesario

construir curvas de esfuerzo contra deformación. Para ello es necesario calcular el área que

realmente está soportando los esfuerzos a tensión, es decir, el área correspondiente a material

netamente. Además, cuando el tejido se carga a tensión con las fibras orientadas

2

transversalmente o dirigidas a 45°, la probeta sufre deformaciones significativas que no se

pueden medir con instrumentos piezoeléctricos convencionales, como los extensómetros.

Figura 1. Aplicaciones de la celulosa. a) Prótesis vascular de poliuretano/nanocelulosa. b) Nanocompuesto antibacterial celulosa/Ag [6, 7].

De este modo, un reto muy interesante consiste en implementar un método para caracterizar

el tejido vegetal en direcciones diferentes a la orientación de las fibras, ya que por su naturaleza

anisotrópica se deben tener en cuenta factores como el tamaño de forma de la probeta de

estudio, las grandes deformaciones del material y el área que realmente soporta los esfuerzos.

Todo esto para construir la curva de esfuerzo contra deformación, con la que se puede obtener

mayor información sobre el comportamiento mecánico del material de estudio.

En conclusión, el presente proyecto de investigación es el primer paso para analizar la viabilidad

de utilizar el tejido vegetal Manicaria Saccifera Gaertn como reforzamiento de materiales

biocompuestos en aplicaciones clínicas. Para ello, se llevaron a cabo pruebas mecánicas en

diferentes direcciones y biológicas in vitro (citotoxicidad).

1.1 ANTECEDENTES

Hasta el momento no se han llevado a cabo ensayos biológicos sobre el tejido vegetal Manicaria

Saccifera Gaertn, por lo que se desconoce por completo la biocompatibilidad del mismo. Sin

embargo, se conocen estudios de investigación en el que se ha caracterizado al tejido bajo

diferentes normas y estándares. Uno de los trabajos más destacados es el de Marañón y Porras

[4], en el que se valoró la composición química y morfológica del tejido, además de propiedades

térmicas, físicas y mecánicas. La valiosa conclusión a la que se llegó fue que la Manicaria

Saccifera se puede utilizar como reforzamiento para materiales biocompuestos, principalmente

a)

b)

3

porque presenta propiedades mecánicas específicas competitivas con respecto a otras fibras

naturales e incluso con materiales sintéticos como la fibra de vidrio [4].

Tabla 1. Composición química del tejido vegetal Manicaria Saccifera para cada una de las secciones presentadas en la Figura 2 [4].

Componente (%) S1 S2 S3 S4 S5

Ceniza 2.19 2.12 2.75 2.83 2.60

Extractos 0.54 0.50 0.49 0.54 0.60

Lignina 30.42 32.99 29.66 31.23 31.34

Celulosa 66.86 64.39 67.10 65.40 65.46

Debido a la variación de densidad de fibra a lo largo de la hoja [4], en el trabajo de Porras y

Marañón, se analizaron 5 secciones diferentes (Ver Figura 2 ). Para cada una de las secciones se

valoró la composición química del tejido vegetal (ver Tabla 1) y se encontró que el contenido

de celulosa era relativamente alto, si se comparaban con otros tejidos naturales (ver Tabla 2).

Figura 2. Secciones de la hoja analizadas [4].

Ahora bien, Debido a que la celulosa es conocida por su biocompatibilidad (ver Figura 1), surgió

la idea de utilizar el tejido vegetal Manicaria Saccifera para evaluar la posibilidad de que fuera

biocompatible. Para ello, se empezó con pruebas de citotoxicidad, en las que se analizó el tejido

con su composición natural (ver Tabla 1) y bajo un tratamiento alcalino que remueve

componentes como la lignina, los extractos, la cera y los ácidos grasos [5] .

Tabla 2. Contenido de celulosa en diferentes fibras naturales [4].

Fibra Celulosa (%)

Yute 61-71

Sisal 65-78

Lino 71-81

Cáñamo 68

Coco 32-43

Aceite de palma 65

Piasava 31.6

Férula 53.3

Alcachofa 75.3

Althaea 44.6

Arundo 43.2

4

1.2 ALCANCE

Este proyecto de grado se centra en la caracterización del tejido vegetal Manicaria Saccifera Gaertn,

con el fin de estudiar la viabilidad de usarse en materiales compuestos con fines clínicos. Es decir,

es el primer paso en la búsqueda de posibles aplicaciones clínicas en las que se puedan aprovechar

las propiedades del tejido de estudio en un material denominado como biocompuesto. Por tal

motivo, más allá de ser un proyecto de grado presentado como requisito parcial para optar al título

de Ingeniero Mecánico, es un trabajo que se planteó con el fin de continuarse en estudios de

postgrado.

1.3 IMPORTANCIA

La importancia de este proyecto de grado radica en la contribución a la comunidad científica e

ingenieril en la búsqueda de fibras-tejidos naturales que sirvan como reforzamiento de

biocompuestos y sean capaces de satisfacer las mismas necesidades que actualmente cumplen

materiales provenientes de fuentes fósiles, pero de manera sostenible. Además, en este proyecto

se invitó a investigadores de diferentes áreas del conocimiento, correspondientes a doctores de las

facultades de Ingeniería Mecánica, Ingeniería Biomédica, Ingeniería Química y Física de la

Universidad de los Andes, para que se vincularan a este estudio. De este modo, se fortalece la

contribución de la comunidad académica en proyectos que tienen como objetivos base la eco-

sostenibilidad y el aporte a la sociedad.

1.4 LIMITACIONES

A continuación, se presentan algunas de las limitaciones que acontecieron a lo largo del desarrollo

del proyecto:

Limitación de datos para análisis estadístico: Debido a que al tomógrafo empleado le

quedaban 250 horas de vida útil, sólo se tomaron las reconstrucciones tomográficas para

las secciones mostradas en la Figura 7. Aunque suene un tiempo considerable, cada

reconstrucción tomográfica duraba en promedio 12 horas y ya se habían utilizado

aproximadamente 24 horas para el diseño del método empleado.

Limitación de espacios: Inicialmente se había propuesto llevar a cabo el ensayo de

hemocompatibilidad, pero no se ejecutó debido a que no fue aprobado por el Comité de

Ética de la Universidad de los Andes. El argumento que se dio fue que la universidad no

cuenta con un espacio autorizado para la extracción de sangre. Aunque existía la posibilidad

de extraer la sangre en un espacio externo autorizado, no hubo suficiente tiempo para el

diligenciamiento correspondiente, ya que esta información se dio a conocer después de la

reunión de octubre del año 2018 en la que se evalúo y rechazó la propuesta de extraer

sangre dentro de la institución.

2. OBJETIVOS

2.1. GENERAL

Realizar pruebas mecánicas y biológicas in vitro al tejido vegetal Manicaria Saccifera Gaertn, como

el primer paso para determinar la viabilidad de usarse como refuerzo de materiales compuestos en

aplicaciones clínicas (biocompatibilidad).

5

2.2. ESPECÍFICOS

Caracterizar a tensión el tejido vegetal Manicaria Saccifera Gaertn en la dirección de las fibras, transversal a estas y orientadas a 45°.

Calcular con precisión el área efectiva, es decir, el área que realmente está soportando las cargas a tensión.

Identificar un método de esterilización que se adecúe al tejido vegetal Manicaria Saccifera Gaertn.

Desarrollar pruebas de Citotoxicidad por el método de MTT en el tejido vegetal Manicaria Saccifera en su estado natural y tratado químicamente.

3. MARCO TEÓRICO

3.1 PRUEBAS MECÁNICAS

Definiciones conceptuales

Material anisotrópico: un material anisotrópico es aquel cuyas propiedades, como las mecánicas,

son dependientes de la dirección. En general, las propiedades mecánicas de un material

anisotrópico no presenta simetría con respecto a ningún eje o plano [8].

Linealidad: Que presenta linealidad geométrica [9].

Elástico: La deformación debido a cargas externas son completamente e instantáneamente

reversibles cuando se remueve la carga (Material Lineal) [9].

Definiciones matemáticas

Esfuerzo de ingeniería:

𝜎 =𝑃

𝐴𝑜 (1)

Deformación ingenieril:

𝜀 =∆𝐿

𝐿𝑜 (2)

Módulo de Young:

𝐸 = 𝜎

𝜖 (3)

Curvas típicas de esfuerzo contra deformación

6

Figura 3. Curva típica de esfuerzo contra deformación para un acero ASTM A36 [9].

Figura 4. Descripción de diferentes curvas de esfuerzo contra deformación [9].

3.2 PRUEBAS DE BIOCOMPATIBILIDAD

La norma ISO 10993 fue desarrollada por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), con el fin de determinar potenciales adversidades biológicas cuando dispositivos o materiales se encuentran en contacto directo o indirecto con el cuerpo humano. En la norma se especifican diferentes pruebas que se deben realizar, dependiendo de las aplicaciones para las que se quiere usar el dispositivo clínico. Las pruebas que se especifican en la norma son las de citotoxicidad, sensibilización, irritación, hemocompatibilidad, pirogenicidad, implantación, genotoxicidad, carcinogenicidad, toxicidad reproductiva y de desarrollo y degradación. En este proyecto de grado sólo se llevó a cabo la prueba de citotoxicidad.

7

3.2.1 ESTERILIZACIÓN

El tejido vegetal Manicaria Saccifera tiene una temperatura de degradación de aproximadamente

220[°C] [4], esta temperatura se utilizó como parámetro principal para las condiciones de

esterilización por el método de autoclave. El proceso de esterilización por autoclave se realizó con

ayuda de un equipo de alta presión y temperatura, que se emplea para esterilizar con vapor de agua

como medio de presión y un rango de temperatura que puede variar dependiendo del equipo

utilizado. El principio de esterilización por el método de autoclave es el de la coagulación de las

proteínas de los microorganismos, a partir de la acción conjunta de la temperatura y el vapor de

agua. Las proteínas son esenciales para la vida y reproducción de los microorganismos, por lo que

cuando se coagulan provocan la destrucción de los mismos [10].

Debido a que es la primera vez que se realiza el proceso de esterilización del tejido, se trabajó con

diferentes temperaturas y métodos de protección del material. Para cada uno de los métodos de

protección del material se programó el equipo de autoclave a las temperaturas de 121[°C] y 134[°C].

Además, el material de prueba se protegió mediante los métodos de wrapped y tubo (ver Figura

13).

El otro método que se probó para la esterilización del material fue el de radiación ultra violeta. Este

método utiliza radiación electromagnética con longitudes de onda baja (entre 400 𝑛𝑚 y

15 𝑛𝑚) para matar o inactivar microorganismos mediante la destrucción de los ácidos nucleicos y

la alteración del ADN, lo que provoca la incapacidad de llevar a cabo funciones celulares vitales [11].

3.2.2 ENSAYO DE MTT

El ensayo de MTT se llevó a cabo basados en diferentes artículos y la metodología expuesta por la

empresa ATCC [10, 11, 12, 13]. Este ensayo se basa en la reducción metabólica del Bromuro de 3-

(4,5-dimetiliazol- ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) realizada por la enzima mitocondrial succinato-

dishidrogenasa en un compuesto coloreado azul (formazán) que permite determinar la

funcionalidad mitocondrial de las células tratadas. La concentración del colorante azul-violeta

formazán es proporcional al número de células vivas. El resultado intracelular púrpura formazán

puede ser solubilizado y cuantificado por medios espectrofotométricos. Así pues, el ensayo de MTT

mide la viabilidad celular, es decir cuántas células continúan vivas y con actividad metabólica

después de estar expuestas al material/reactivo de interés. El reactivo MTT es de color amarillo, así

pues, cuando se reduce a formazán, se vuelve azul/violeta. De este modo, para cada tipo de célula

existe una relación lineal entre el número de células y la señal de absorbancia producida, lo que

permite una cuantificación precisa de la tasa de viabilidad celular.

3.3 RECONSTRUCCIÓN TOMOGRÁFICA

Sensor Medipix

Los sensores Medipix son detectores de pixeles híbridos de conteo de fotones. Estos consisten de

capas de sensores semiconductores constituidos por varios materiales. El tamaño de un pixel es de

55 [𝜇𝑚], con lo que se obtiene un área activa de aproximadamente 2 [𝑐𝑚2] en una imagen de 256

x 256 pixeles. El contador de fotones y la resolución de energía se lleva a cabo mediante dos

umbrales [16].

8

Tamaño del foco y distancias representativas

Para el cálculo del tamaño del foco de la fuente (ver Figura 5) se emplea el método de borde que

se puede representar mediante la siguiente ecuación,

𝑂𝐹̅̅ ̅̅

𝐷𝑂̅̅ ̅̅ + 𝑂𝐹̅̅ ̅̅=

𝑤𝐹

𝑤𝐹 + 𝑤𝐷 (4)

Figura 5. Distancias representativas para el cálculo del tamaño del foco de la fuente [16].

Alineación del objeto

Los ejes de rotación que se emplean para alinear el objeto (ver colores en la Figura 6) son:

Paralelo al detector plano

Paralelo a la columna del detector

Proyectado en la columna central del detector

Figura 6. Sistema de rotación [16].

9

Procesamiento de datos

A continuación, se presenta el orden que se debe seguir para el procesamiento de los datos [16] :

1) Corregir pixeles muertos con valores de pixeles vecinos.

2) Normalizar la tasa de conteo con valores de pixeles del ROI no cubierto.

3) Aplicar el FFC.

4) Supresión de artefactos en el anillo.

5) Reconstrucción con proyección posterior filtrada. Para este proyecto se utilizó el software

Octopus Reconstruction®.

3.4 BINARIZACIÓN Y CÁLCULO DE ÁREAS

El número de las escalas de grises es usualmente una potencia de 2, por lo que 𝐺 = 2𝐵, donde B es

el número de bits en la representación binaria de los niveles de luminosidad. Así pues, cuando B>1

hablamos de una imagen en escala de grises y cuando B=1 hablamos de una imagen binarizada. En

una imagen binarizada existen sólo dos niveles de grises que se pueden referir a “blanco” (“1”) o

“negro” (“0”) [17].

Ahora bien, una forma de calcular las áreas de una sección específica en una imagen, que se distinga

porque presenta diferentes escalas de grises, es mediante un proceso de velarización. Para ello se

emplea un software (como Matlab®) que permita clasificar y contar, a partir de los valores de la

escala de grises, los pixeles “blancos” de la sección específica. Así pues, si se conoce el tamaño de

cada pixel es posible calcular el área de la sección de la imagen estudiada [18].

4. METODOLOGÍA

4.1. MATERIAL

El material caracterizado consiste de ramas de Manicaria Saccifera Gaertn entre 0.8 y 1.2 metros de

longitud, obtenidas manualmente por una comunidad del departamento de Chocó. Dichas ramas

están constituidas por un material fibroso que forman un tejido con numerosos entrecruzamientos

y que exhiben diferentes puntos de bifurcación. Para la caracterización del tejido se tomaron 4

secciones diferentes (ver Figura 7), ya que a lo largo de la hoja se presentan variaciones de densidad

de fibra.

Figura 7. Representación gráfica de las secciones de estudio del tejido vegetal Manicaria Saccifera.

4.2. PROPIEDADES MECÁNICAS

4.2.1 PRUEBA DE TENSIÓN EN LA DIRECCIÓN DE LAS FIBRAS

La prueba de tensión en la dirección de las fibras se llevó a cabo de acuerdo a la norma ASTM D5035,

con el uso del equipo de pruebas especiales Instron 3367 del departamento de Ingeniería Mecánica

de la Universidad de los Andes. La máquina se encuentra equipada con una celda de carga de 30 𝑘𝑁

y un extensómetro para medir la deformación. Las condiciones atmosféricas de prueba se hicieron

10

bajo norma y correspondían a 22.1 ± 0.1 °𝐶 y 59 ± 5% 𝐻𝑅. Debido a que el tejido de prueba no

se puede desenredar con facilidad para obtener fibras individuales, el proceso más adecuado para

hacer una caracterización a tensión es el conocido como corte de tira (en inglés cut strip). En este

método se fabrican probetas de 25 𝑚𝑚 𝑋 150 𝑚𝑚 (ver Figura 8), que se cargan longitudinalmente

(paralela a la dirección de la carga) hasta que fallen. La longitud calibrada, para el cálculo de la

deformación, corresponde a 75 𝑚𝑚 (longitud inicial nominal de prueba). Por otro lado, la máquina

de prueba se configuró para que trabajara a una velocidad de 10 𝑚𝑚/𝑚𝑖𝑛 [4], con esto se

conseguía un tiempo de rotura de fibra de 20 ± 3 𝑠. Para evitar errores de prueba como el

deslizamiento o la rotura en los puntos de sujeción de la probeta, se diseñaron unos tabs en madera

(25 𝑚𝑚 𝑋 10 𝑚𝑚) pegados con adhesivo instantáneo en cada uno de los extremos del espécimen

de prueba (ver Figura 8).

Tabla 3. Parámetros de prueba norma ASTM D5035

Figura 8. Probeta de tensión en la dirección de las fibras. Todas las dimensiones están en milímetros.

Equipo Instron 3367

Celda de carga 30 [kN]

Velocidad 10 mm/min [4]

Dimensiones

probeta

25 mm X 150 mm

Dimensiones

sujetadores

25 mm X 10 mm

Medidor de la

deformación

Extensómetro

11

Figura 9. Montaje de prueba de tensión en la dirección de las fibras.

4.2.2 PRUEBA DE TENSIÓN EN LA DIRECCIÓN TRANSVERSAL A LAS FIBRAS Y ORIENTADAS A 45°

Las pruebas mecánicas que se llevaron a cabo fueron diseñadas basados en la norma ASTM D5035.

El equipo de prueba (instron 3367) y algunas condiciones como la velocidad de carga (300 ±

10 𝑚𝑚/min ) y las condiciones atmosféricas (22.1 ± 0.1 °𝐶 y 59 ± 5% 𝐻𝑅) se mantuvieron bajo

norma. Sin embargo, debido a la naturaleza anisotrópica del material de estudio, se tuvieron que

cambiar: la celda de carga (a una de 500 [𝑁]) , la geometría de la probeta (ver Figura 10) y el

método de medición de la deformación (ver Tabla 4). Para evitar errores de prueba como el

deslizamiento o la rotura en los puntos de sujeción de la probeta, se diseñaron unos tabs de

25.4 𝑥 50.8 𝑚𝑚 (ver Figura 10) en madera, pegados con adhesivo instantáneo en cada uno de los

extremos del espécimen de prueba.

Tabla 4. Parámetros de prueba de tensión en la dirección transversal a las fibras y orientadas a 45°.

Equipo Instron 3367

Celda de carga 500 [N]

Velocidad 300 [mm/min]

Dimensiones

probeta

50.8 [mm] X 152.4

[mm]

12

Dimensiones

sujetadores

25.4 [mm] X 50.8 [mm]

Medidor de la

deformación

Software Tracker Video

Analysis®

Figura 10. Probeta diseñada para la prueba de tensión en la dirección transversal a las fibras y orientadas a 45°. La zona blanca corresponde a los tabs de madera y la zona café al tejido vegetal. Todas las dimensiones están en milímetros.

El montaje de prueba se muestra en la Figura 11. Para medir la deformación de las probetas se

utilizó la cámara de alta velocidad IDS UI 1540-LE-M-GL. Para medir el desplazamiento relativo se

utilizaron dos marcadores ubicados en el centro de la probeta, que se utilizaron como referencia

para medir la deformación del material de estudio con ayuda del software Tracker Video Analysis®

(ver Figura 12). La prueba se llevó a cabo hasta la rotura del material.

13

Figura 11. Montaje de prueba diseñado para medir la deformación del material de estudio transversal a las fibras y orientadas a 45°.1. Sistema de adquisición de imágenes 2. Cámara de alta velocidad. 3. Máquina de tensión (instron 3367) 4. Sistema de iluminación. 5. Sistema de adquisición de datos de la máquina de tensión. 6. Probeta de prueba.

Figura 12. Medición de la deformación con ayuda del Software Tracker Video Analysis®.

14



4.3.1.1 AUTOCLAVE

La esterilización del tejido vegetal Manicaria Saccifera se llevó a cabo por el método de autoclave

con ayuda del equipo BIOBASE class B (Ver Figura 13). Para comprobar el método más adecuado de

esterilización por autoclave se probaron 4 métodos diferentes, en los que se varió la envoltura del

material (wrapped y tubo) y las temperaturas de autoclave (134 [°𝐶]𝑦 121[°𝐶]). Es decir, se realizó

la esterilización por wrapped a 121[°C], tubo a 121[°C], wrapped a 134[°C] y tubo a 121[°C] (Ver

Figura 13). La presión se mantuvo constante y correspondió a 120 [𝑘𝑃𝑎]. El tiempo de autoclave

fue de 2 horas por método.

Figura 13. a) Equipo de autoclave b) Envolturas por wrapped (izquierda) y tubo (derecha).

4.3.1.2 RADIACIÓN ULTRAVIOLETA (UV)

El proceso de esterilización por el método de UV se hizo con ayuda de una cabina de extracción

como la que se muestra en la Figura 14. El material se introdujo en forma de discos de 6 ± 0.5 [𝑚𝑚]

de diámetro y un peso aproximado de 7.4 ± 0.8 [𝑚𝑔](ver Figura 16). El material se expuso a la

radiación UV durante 30 minutos.

Figura 14. Cabina de extracción.

a) b)

15

4.3.1.3 COMPROBACIÓN DE LA ESTERILIZACIÓN

Para comprobar la esterilización del material se tomaron dos muestras circulares de 6 ± 0.5 [𝑚𝑚]

de diámetro y un peso aproximado de 7.4 ± 0.8 [𝑚𝑔] (ver Figura 16). Dichas muestras se ubicaron

en cajas de Petri con agar1 selladas con parafilm, para posteriormente llevarse a incubación con

agitación media de 150 [𝑟𝑝𝑚] y a 37 [°C] (ver Figura 15). Finalmente, se revisó si había crecimiento

de bacterias para descartar la muestra.

Figura 15. a) Agar en agitación b) caja de petri con agar y muestras de Manicaria Saccifera.

4.3.2 CITOTOXICIDAD

A continuación, se presenta un resumen de los componentes (ver Tabla 5) e instrumentos

requeridos (ver Tabla 6) para llevar a cabo la prueba de citotoxicidad por MTT. Además, se presenta

un paso a paso del procedimiento que se llevó a cabo con el material de estudio.

Tabla 5. Componentes necesarios para la prueba de MTT.

MTT

DMSO

Vero ATCC® CCL-81™, en pase 19 (P19) PBS

Tabla 6. Instrumentos necesarios para la prueba de MTT.

Lector de microplacas con filtro entre 650 y 570 [nm] Microplacas de 96 pozos

Microscopio invertido Tubos esterilizados (5 [mL])

Pipeta multicanal Pipetas Serológicas

Incubadora 37[ºC] Puntas de pipetas estériles

Cabina de flujo laminar

1 El agar se prepara en una solución de 32 gramos por cada litro de agua. Cabe destacar que cuando el agar se enfría presenta una consistencia gelatinosa, por lo que debe introducirse a las cajas de Petri una vez se saca de la autoclave.

a)

Muestras

16

Pre-laboratorio

1. Estilizar manicaria mediante autoclave por el método de tubo y wrapped a 134 [°C] y 120

[kPa].

Laboratorio

1. Realizar discos con ayuda de un punch como se muestra a continuación,

Figura 16. Discos de material obtenidos con ayuda de un punch.

2. Preparar los extractos. Los extractos se prepararon en medio DMEM y 1% de penicilina

extractomisina (ver Figura 17) con una concentración de 100𝜇𝐿

𝑑𝑖𝑠𝑐𝑜. Se recomienda tomar 20

discos y un volumen de 2 [mL] de medio para tener suficientes extractos para realizar las

pruebas.

Figura 17. Medio DMEM con 1% de penicilina extractomisina.

3. Filtrar los extractos con un filtro de jeringa de 0.22[µm].

4. Preparar una suspensión celular con una densidad aproximada de 100 000 células/mL en

DMEM, 10% SBF, y 1% P/S. Se siembran 100 µL de la suspensión en una microplaca de 96

pozos. Es decir, en cada pozo se evalúan aproximadamente 10.000 células (ver Figura 18).

5. Las microplacas se incuban a 37 [°C] y 5% de CO2 durante 24 horas para permitir que las

células se adhieran y cubran completamente la superficie del pozo (estén confluentes).

17

6. Remover el medio de cultivo de todos los pozos sembrados y agregar 100 [µL] de PBS

estéril a cada pozo, para lavar las células y limpiar rastros de SBF.

7. Retirar el PBS y agregar 100 [µL] del extracto a cada pozo que le corresponda (prueba

indirecta). Se agrega 100 [µL] de medio sin SBF y un cilindro del material a cada pozo que

le corresponda (prueba directa). Se utiliza medio sin SBF como control negativo y medio

sin SBF + 10% DMSO como control positivo.

8. Las microplacas se incuban a 37 [°C] y 5% CO2 durante 24 horas (efecto agudo).

9. Finalizado el tiempo de exposición, se agregan 10 [µL] de MTT (5[mg]/[mL] en PBS) a cada

pozo a evaluar. Se incuba por 3 horas protegido de la luz para permitir la formación de

cristales de formazán. Cabe aclarar que el MTT se degrada con la luz, así que se recomienda

hacer todo el proceso con una mínima cantidad de luz.

10. Descartar el sobrenadante y añadir 100 [µL] de DMSO para disolver los cristales.

11. Dejar los cultivos a temperatura ambiente y sin entrada de luz hasta que los cristales de

formazán sean disueltos completamente.

12. Leer la absorbancia a 595 [nm].

Figura 18. Distribución en la microplaca de 96 pozos para el ensayo de MTT.

4.4 RECONSTRUCCIÓN TOMOGRÁFICA El montaje de la reconstrucción tomográfica se muestra en la Figura 20. Las probetas utilizadas

consisten de secciones rectangulares de 1[𝑐𝑚]𝑥[2𝑐𝑚] (ver Figura 21). Las imágenes se obtienen a

dos umbrales (ver Tabla 10), para eliminar los fotones de alta energía que no contribuyen a generar

contraste. Para lograr una corrección efectiva, se aplicó un Flat Field Correction (FFC) obtenido de

láminas de acetato de celulosa como calibrador. Además, se aplicó la metodología de auto-CT, ya

que permite mayor tiempo de exposición por proyección, sin estar pendiente de la toma de

imágenes, con lo que se ahorra tiempo y esfuerzo.

A continuación, se presentan los parámetros de prueba que se utilizaron para la reconstrucción

tomográfica del tejido vegetal Manicaria Saccifera.

18

Distancias representativas

Tabla 7. Distancias representativas del montaje de prueba de la reconstrucción tomográfica.

Ítem Valor Unidades Distancia Fuente-Sensor 40x10−2 m

Distancia Fuente-Objeto 37x10−2 m

Condiciones de la fuente de rayos X

Tabla 8. Condiciones de la fuente de rayos X empleada para la reconstrucción tomográfica.

Ítem Característica/Valor Unidades Marca Hamamatsu N/A

Modelo L10321 N/A Ánodo W N/A

Ventana Berilio N/A Voltaje Fuente 40x103 𝑉

Corriente Fuente 180x10−6 𝐴 Diámetro exterior del colimador 2.5x10−3 𝑚

Largo del colimador 3.2x10−2 m Filtro N/A N/A

Configuración del sensor

Tabla 9. Configuración del sensor MediPix 3.

Ítem Característica/Valor Unidades Tipo MPX3RXV1 N/A

Pixel pitch 55x10−3 m Modo de operación SPM N/A

Ganancia del pre-amplificador High Gain Mode N/A Número de serie 𝑊108_𝐼4 N/A

Polaridad del sensor N-ON-P N/A Voltaje sensor -100 V

Corriente sensor 2.5x10−6 A

19

Figura 19. Sensor Medipix 3.

Tiempos de exposición

Para la reconstrucción tomográfica del material de estudio se tomaron tiempos de 25 𝑠/

𝑝𝑟𝑜𝑦𝑒𝑐𝑐𝑖ó𝑛. Debido a que se querían 1200 proyecciones por probeta, el tiempo promedio de

reconstrucción de cada una de las secciones fue de 30000 𝑠.

Para el Flat Field Correction (FFC), se sacó una imagen a Open Beam. Esto, porque estamos

suponiendo que el objeto es de baja absorción. El tiempo de exposición del calibrador, lámina de

celulosa obtenida por acetato, fue de aproximadamente 10000 𝑠, 400 veces más el tiempo de

exposición.

Umbrales de energía

Para el correcto tratamiento de los datos, es necesario convertir los valores de energía presentados

en la Tabla 10, por medio de la calibración con fluorescencia de materiales.

Tabla 10. Umbrales de energía empleados en el software pixelman®.

Ítem Valor Umbral Bajo 21 Umbral Alto 35

20

Figura 20. Montaje tomografía.

Figura 21. Probetas tomografía.

4.5 BINARIZACIÓN Y CÁLCULO DE ÁREA

4.5.1 IMPLEMENTACIÓN DEL CÓDIGO Una vez se tienen las reconstrucciones tomográficas, se procede a calcular las áreas de las secciones

transversales con ayuda del software Matlab®. El algoritmo implementado en código (ver página

39) se resume a continuación,

1. Importar las reconstrucciones tomográficas.

2. Contar el número de reconstrucciones tomográficas.

3. Inicializar el contador de pixeles.

Fuente Colimador

Objeto

Sensor

Sistema de movimiento

21

4. Crear un iterador capaz de binarizar (ver Figura 22), contar pixeles y calcular el área

promedio de una reconstrucción tomográfica.

Figura 22. Binarización de una reconstrucción tomográfica.

4.5.2 ANÁLISIS DE DATOS Por probeta se tenían 256 secciones transversales, lo que representaba 256 áreas diferentes. Por

tal motivo, se utilizó el software Minitab® para verificar, mediante un ajuste de bondad, si los datos

seguían una distribución de probabilidad. El ajuste de bondad empleado por Minitab es el de

Anderson-Darling (AD) [19], la hipótesis que se quería comprobar se expresa como sigue,

𝐻0 = 𝑆𝑖𝑔𝑢𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑡𝑟𝑖𝑏𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑏𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑

Para comprobar dicha hipótesis, el programa indica para cada distribución un valor p (P) para la

prueba de Anderson-Darling (AD). Ahora bien, para comprobar la hipótesis se compara el valor p de

cada distribución con el nivel de significancia. Generalmente, un nivel de significancia de 𝛼 =

0.05 representa un riesgo de 5% de concluir que los datos no siguen la distribución. De este modo,

se puede resumir el dictamen de rechazo de la hipótesis nula como sigue,

𝑃 ≤ 𝛼: 𝑙𝑜𝑠 𝑑𝑎𝑡𝑜𝑠 𝑛𝑜 𝑠𝑖𝑔𝑢𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑡𝑟𝑖𝑏𝑢𝑐𝑖ó𝑛 (𝑟𝑒𝑐ℎ𝑎𝑧𝑎 𝐻0)

𝑃 > 𝑁𝑜 𝑝𝑢𝑒𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑙𝑢𝑖𝑟 𝑞𝑢𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑑𝑎𝑡𝑜𝑠 𝑛𝑜 𝑠𝑖𝑔𝑢𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑠𝑡𝑟𝑖𝑏𝑢𝑐𝑖ó𝑛 (𝑁𝑜 𝑝𝑢𝑒𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑐ℎ𝑎𝑧𝑎𝑟 𝐻0)

En este último caso se puede presuponer que los datos siguen la distribución [19].

5. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

5.1 PROPIEDADES MECÁNICAS

5.1.1 PRUEBRA DE TENSIÓN EN LA DIRECCIÓN DE LAS FIBRAS La curva de esfuerzo contra deformación en la dirección de las fibras presenta un comportamiento

similar para las cuatro secciones estudiadas (ver Figura 7). Esta se puede dividir en 3 secciones

representativas. En primer lugar, una zona lineal-elástica que llega hasta aproximadamente el 0.7%

de la deformación y es con la que se calcula el módulo de Young. Después de esta región, se llega a

una zona no-lineal que representa la zona de mayor deformación y se extiende hasta la tercera zona

22

que es la ruptura de la probeta de prueba. Cabe destacar que la ruptura de la probeta se caracteriza

porque empiezan a romperse alguna de las fibras, por lo que se presenta una caída de los esfuerzos

de forma gradual y con una deformación significativa, debido a que las fibras empiezan a

desenredarse tras el rompimiento de alguna de ellas.

Figura 23. Diagrama de esfuerzo contra deformación en la dirección de las fibras.

Ahora bien, propiedades mecánicas como el módulo de elasticidad varía significativamente de una

sección a otra (ver Tabla 11), pero esta condición depende de las condiciones del tejido de prueba.

Por ejemplo, el módulo de Young de la sección 1 (𝐸 = 6.81 [𝐺𝑃𝑎]) es más del doble de la sección

4 (𝐸 = 3.02 [𝐺𝑃𝑎]). Sin embargo, dicha diferencia se da en esta hoja en particular, pues en el

trabajo de Porras y Marañón se comprobó que la relación de propiedades mecánicas de una sección

a otra no variaba significativamente [4]. Por último, cabe destacar que dichas relaciones se pueden

comprobar de igual forma con el esfuerzo máximo y la deformación en la fractura [4] .

Tabla 11. Propiedades mecánicas del tejido en la dirección de las fibras.

Sección Esfuerzo

Máximo(MPa)

Módulo de

Young(GPa)

Deformación en la

fractura (%)

S1 95.42 6.81 1.89

S2 64.78 5.93 2.68

S3 87.40 3.52 3.52

S4 104.64 3.02 4.17

5.1.2 PRUEBRA DE TENSIÓN EN LA DIRECCIÓN TRANSVERSAL A LAS FIBRAS Las probetas de la prueba de tensión en la dirección transversal a las fibras para cada una de las

secciones de estudio (ver Figura 24) se desarrollaron para que la falla se hiciera por el centro y no

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Esfu

erz

o(M

Pa)

Deformación (%)

Sección 1

Sección 2

Sección 3

Sección 4

23

por el borde. Es decir, el tamaño de forma fue el parámetro más importante para la elaboración de

los especímenes. Una vez se probaron a tensión, se encontró que el comportamiento para cada una

de las secciones presenta cuatro partes representativas (ver Figura 26). En primer lugar, al inicio de

la prueba el material presenta un comportamiento lineal elástico que se extiende hasta alrededor

del 18% de la deformación. En esta zona es donde se propone calcular el módulo de Young una vez

se calculen las áreas que están soportando los esfuerzos. La segunda sección corresponde a una

zona no-lineal que va desde donde acaba la primera zona y se extiende hasta donde el material

empieza a presentar variaciones en el esfuerzo. En esta parte del ensayo las fibras se tensionan,

pero aún no se rompen ni se desenredan entre sí. La siguiente zona corresponde a las variaciones

en los esfuerzos que se producen porque las fibras se empiezan a desenredar entre sí. Esta zona

empieza desde donde el material presenta variaciones en los esfuerzos en la zona no-lineal hasta la

carga máxima que es donde se presenta la ruptura de la probeta. Por último, una vez se alcanza la

carga máxima, la probeta falla por completo. Cabe destacar que las deformaciones pueden llegar a

ser de hasta el 300% en la ruptura del material y las cargas de hasta 9 [N].

Figura 24. Probetas de tensión en la dirección transversal a las fibras.

Figura 25. Probetas falladas a tensión en la dirección transversal a las fibras.

24

Figura 26. Curva de carga contra deformación del ensayo de tensión en la dirección transversal a las fibras.

Cuando se orientan las fibras en la dirección transversal a la dirección de la carga, el parámetro más

importante es la densidad de fibras, número de fibras por área, ya que las cargas van a estar

soportadas por los interbloqueos entre fibras (ver Figura 27). Así pues, es de esperarse que, a mayor

cantidad de fibras, mayor número de interbloqueos, lo que representará mayores deformaciones y

mayores esfuerzos. Sin embargo, la alta variabilidad en el comportamiento (bifurcación e

interbloqueos) y densidad de las fibras hace que las propiedades mecánicas en cada una de las

secciones varíe considerablemente (ver Figura 26).

Figura 27. Bifurcación e interbloqueo de fibras [4].

5.1.3 PRUEBRA DE TENSIÓN CON LAS FIBRAS ORIENTADAS A 45°+ La curva de carga contra deformación cuando las fibras se orientan a 45° se puede dividir en 3

secciones representativas. En primer lugar, se tiene una región lineal elástica que se extiende hasta

el 12% de la deformación y es donde se propone calcular el módulo de Young. Después, se tiene una

región no lineal que presenta variaciones en las cargas y se extiende hasta la carga máxima. Dichas

variaciones en las cargas se pueden explicar porque el material a lo largo de esta región está en

constante separación entre fibras. Así pues, a diferencia de las otras pruebas, las fibras no se

tensionan hasta la ruptura, sino que esta vez las fibras se están desenredando entre sí durante la

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500

Car

ga(N

)

Deformación(%)

Sección 1

Sección 2

Sección 3

Sección 4

Bifurcación de fibras

Interbloqueo entre

fibras

25

prueba. Por último, la zona de ruptura del material muestra que una vez se alcanza la carga máxima,

las fibras interbloqueadas que no lograron separarse, se rompen. Cabe destacar que el

comportamiento para cada una de las secciones presenta magnitudes tanto de esfuerzo como de

deformación de alta dispersión, por lo que uno de los trabajos futuros consiste en realizar esta

prueba con un número representativo de probetas.

Figura 28. Curva de carga contra deformación del ensayo de tensión con las fibras orientadas a 45°.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

Car

ga(N

)

Deformación(%)

Sección 1

Sección 2

Sección 3

Sección 4

26

Figura 29. Probeta fallada en la prueba de tensión con las fibras orientadas a 45°.



5.2.1.1 AUTOCLAVE Tras llevar a cabo la esterilización por el método de autoclave para cada uno de los métodos

correspondientes a wrapped a 121[°C], wrapped a 134[°C], tubo a 121[°C] y tubo a 134[°C], se

encontró que no había crecimiento de bacterias para ninguno de los casos (ver Figura 30), por lo

que este método de esterilización funciona correctamente y es el que se escogió para las pruebas

de citotoxicidad que se muestran más adelante. Cabe destacar que las pruebas de citotoxicidad se

llevaron a cabo únicamente con el método de tubo, porque era más fácil de manipular para

mantener el material esterilizado.

28

Figura 30. a) 121[°C] método wrapped b) 121[°C] método wrapped réplica c) 134[°C] método wrapped d) 134[°C] método wrapped réplica e) 121[°C] método tubo f) 121[°C] método tubo réplica g) 134[°C] método tubo h) 134[°C]

método tubo réplica.

5.2.1.2 RADIACIÓN ULTRAVIOLETA

Después de haber realizado el proceso de esterilización por el método de UV durante 30 minutos,

se comprobó que este tiempo no es suficiente para que el material quede esterilizado

correctamente. Debido a que lo que se buscaba era un método en el que se consiguiera una correcta

esterilización del material, y no una esterilización óptima, se decidió continuar el proceso con el

material esterilizado por autoclave. En la Figura 31 se muestra que hubo crecimiento de bacterias

tras la comprobación de la esterilización del material.

29

Figura 31. Material esterilizado por el método de UV.

5.2.2 CITOTOXICIDAD Después de llevar a cabo la prueba de citotoxicidad por el método de MTT por extractos, se encontró

que el porcentaje de viabilidad fue del 99.12%. Cabe destacar que el tejido estaba en estado natural,

por lo que nos permite tener una idea para el desarrollo de materiales compuestos con materiales

biocompatibles como el PLA (ácido poliláctico). El método de esterilización que se empleó fue el de

autoclave en tubo a 121[°C]. En la Figura 32 se muestran las células empleadas para la prueba.

Tabla 12. Resultados de la prueba de citotoxicidad.

Condición del tejido Método esterilización Temperatura Viabilidad

Estado natural Autoclave en tubo 121[°C] 99.12%

30

Figura 32. Células Vero expuestas.

5.3 RECONSTRUCCIÓN TOMOGRÁFICA Para cada una de las probetas reconstruidas tomográficamente (ver Figura 21) se tenían 256

imágenes correspondientes a las secciones transversales obtenidas con el Octopus Reconstruction

Imaging Software®. En cada una de las imágenes (ver Figura 33) se alcanza a percibir que las fibras

son huecas, por lo que este hecho también se tuvo en cuenta a la hora de calcular las áreas que

realmente estaban soportando los esfuerzos. Después de analizar la imagen que se presenta en la

Figura 34, se encontró que el porcentaje de área de la fibra correspondiente a material era del

31.09%, por lo que es importante, a la hora de calcular las áreas que realmente están soportando

los esfuerzos a tensión, considerar que las fibras son huecas.

Figura 33. Sección transversal reconstruida tomográficamente.

31

Figura 34. Sección transversal de una fibra obtenida con un microscopio electrónico de barrido a una escala de X1000 y posteriormente binarizada [5].

Por último, como una idea de trabajos futuros, en la Figura 35 se muestra la reconstrucción 3D del

tejido vegetal Manicaria Saccifera, realizado con ayuda del Fiji-ImageJ Software®.

Figura 35. Reconstrucción 3D del tejido vegetal Manicaria Saccifera.

5.4 BINARIZACIÓN Y CÁLCULO DE ÁREA A continuación, se presentan los histogramas y los resultados de los ajustes de bondad para cada

una de las secciones reconstruidas. Cabe destacar que después de hacer un ajuste de bondad con

un nivel de confianza del 95%, se encontró que las áreas efectivas no siguen ninguna distribución

parametrizada. Este hecho nos da una idea de la alta aleatoriedad de distribución de área

transversal a lo largo de la hoja, por lo que los esfuerzos pueden variar significativamente de una

sección a otra. Sin embargo, se sabe que el mejor estimador en este caso corresponde a la media,

por lo que este valor fue el que se usó para el cálculo de los esfuerzos en la curva que se presenta

en la Figura 23.

Sección S1

32

Figura 36. Histograma de áreas de la sección 1.

Tabla 13.Estadísticas descriptivas sección 1.

N Media

(𝒎𝒎𝟐)

Desv.Est.

(𝒎𝒎𝟐)

Mediana

(𝒎𝒎𝟐)

Mínimo

(𝒎𝒎𝟐)

Máximo

(𝒎𝒎𝟐)

256 7.04450 0.463347 7.24348 5.90773 7.53029

Tabla 14. Prueba de bondad del ajuste sección 1.

Distribución AD P

Normal 16.366 <0.005

Transformación Box-Cox 11.369 <0.005

Lognormal 17.860 <0.005

Lognormal de 3 parámetros 16.402 *

Exponencial 103.745 <0.003

Exponencial de 2 parámetros 43.794 <0.010

Weibull 11.349 <0.010

Weibull de 3 parámetros 10.170 <0.005

Valor extremo más pequeño 10.146 <0.010

Valor extremo por máximos 21.631 <0.010

33

Gamma 17.391 <0.005

Gamma de 3 parámetros 16.962 *

Logística 13.657 <0.005

Loglogística 14.798 <0.005

Loglogística de 3 parámetros 13.659 *

Sección S2

Figura 37. Histograma de áreas de la sección 2.

Tabla 15. Estadísticas descriptivas sección 2.

N Media

(𝒎𝒎𝟐)

Desv.Est.

(𝒎𝒎𝟐)

Mediana

(𝒎𝒎𝟐)

Mínimo

(𝒎𝒎𝟐)

Máximo

(𝒎𝒎𝟐)

256 5.47551 0.123469 5.47651 5.21267 5.79688


Distribución AD P

Normal 1.199 <0.005


Lognormal 1.169 <0.005


5,85,75,65,55,45,35,2

30

25

20

15

10

5

0

Media 5,476

Desv.Est. 0,1235

N 256

Área S2 [mm^(2)]

Fre

cu

en

cia

Histograma de Área S2 [mm^(2)]Normal

34



Weibull 2.864 <0.010

Weibull de 3 parámetros 0.860 0.021



Gamma 1.197 <0.005


Logística 1.699 <0.005



Transformación de Johnson 0.262 0.703

Sección S3

Figura 38. Histograma correspondiente a las áreas de la sección 3 del tejido.

Tabla 17. Estadísticas descriptivas para S3.

N Media

(𝒎𝒎𝟐)

Desv.Est.

(𝒎𝒎𝟐)

Mediana

(𝒎𝒎𝟐)

Mínimo

(𝒎𝒎𝟐)

Máximo

(𝒎𝒎𝟐)

256 6.85217 0.181737 6.85317 5.77615 7.23479

7,27,06,86,66,46,26,05,8

60

50

40

30

20

10

0

Media 6,852

Desv.Est. 0,1817

N 256

Área S3 [mm^(2)]

Fre

cu

en

cia

Histograma de Área S3 [mm^(2)]Normal

35

Tabla 18.Prueba de bondad del ajuste para S3

Distribución AD P

Normal 2.154 <0.005






Weibull 3.369 <0.010

Weibull de 3 parámetros 2.974 <0.005



Gamma 2.355 <0.005




Loglogística de 3 parámetros 2.515 <0.005

Sección S4

Figura 39. Histograma correspondiente a las áreas de la sección 4 del tejido.

36

Tabla 19. Estadísticas descriptivas sección 4.

N Media

(𝒎𝒎𝟐)

Desv.Est.

(𝒎𝒎𝟐)

Mediana

(𝒎𝒎𝟐)

Mínimo

(𝒎𝒎𝟐)

Máximo

(𝒎𝒎𝟐)

256 6.22586 0.145244 6.24352 5.90618 6.52243


Distribución AD P

Normal 1.683 <0.005

Transformación Box-Cox 1.122 0.006





Weibull 0.796 0.040

Weibull de 3 parámetros 0.930 0.008

Valor extremo más pequeño 0.866 0.025


Gamma 1.826 <0.005





Transformación de Johnson 0.329 0.514

6. CONCLUSIONES

Como se explicó previamente, este es el primer paso para determinar la viabilidad de usar el tejido

vegetal Manicaria Saccifera como refuerzo de materiales compuestos en aplicaciones clínicas. Por

tal motivo, en este proyecto de grado se llevó a cabo únicamente la prueba de citotoxicidad, ya que

esta prueba nos permite descartar pruebas biológicas in vivo. Al final de la prueba se encontró que

el material es no citotóxico, por lo que este hecho nos permite tener una idea de la posible

biocompatibilidad del material de estudio y, por tanto, se puede proceder con las pruebas in vivo

recomendadas por la norma ISO 10993. Por otro lado, la prueba de caracterización mecánica que

mejor se adaptaba a las condiciones del tejido era la prueba de tensión, que se llevó a cabo en 3

diferentes direcciones y nos permitió entender la naturaleza anisotrópica del tejido de estudio.

Ahora bien, gracias a la reconstrucción tomográfica que se llevó a cabo con ayuda del sensor Medipix

37

3, encontramos que las 256 áreas transversales de las cuatro secciones estudiadas no siguen una

distribución parametrizada, por lo que nos da a entender la alta aleatoriedad de distribución de área

a lo largo de la hoja y, por ende, la alta distribución de esfuerzos en la misma. Así pues, el mejor

estimador que se tenía para cada una de las secciones de estudio era la media, por la que esta área

fue la que se utilizó para el cálculo de los esfuerzos en la dirección de las fibras. Por último, cabe

destacar que en este proyecto de investigación se logró encontrar un método de esterilización

efectivo para el tejido, correspondiente a la esterilización con autoclave por el método de tubo a

121[°C] y 120 [kPa], que no afectan de ninguna forma la composición del material de estudio, ya

que de acuerdo a lo encontrado por Marañón y Porras, la temperatura de degradación del tejido

vegetal Manicaria Saccifera es de 220[°C] [4].

7. RECOMENDACIONES Y TRABAJOS FUTUROS

A futuro se debe llevar a cabo la búsqueda de aplicaciones clínicas para el tejido vegetal Manicaria

Saccifera. Una vez se haya determinado una posible aplicación, se recomienda llevar a cabo las

pruebas biológicas in vivo recomendadas por la norma ISO 10993. Adicional a lo anterior, se deben

calcular los esfuerzos que soporta el tejido vegetal en las direcciones transversal a las fibras y con

las fibras orientadas a 45°, para posteriormente construir la curva de esfuerzo contra deformación.

De esta forma se podrá comprobar con certeza la naturaleza anisotrópica del tejido vegetal

Manicaria Saccifera.

Por último, se recomienda para trabajos futuros llevar a cabo un número representativo de pruebas

mecánicas en las direcciones transversal a las fibras y con las fibras orientadas a 45°. Además, se

deben realizar reconstrucciones tomográficas de mayor resolución de imagen para estimar con

mayor precisión los esfuerzos que soporta el material.

8. REFERENCIAS

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TEDx, 2017.

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2005.

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http://www.tropicos.org/Name/2400938. [Último acceso: 23 Agosto 2018].

[4] A. Porras, A. Marañon y I. Ashcroft, «Characterization of a novel natural cellulose fabric

from Manicaria Saccifera Palm as possible reinforcement of composite materiles,»

Composites part B, pp. 66-73, 2015.

[5] A. Porras, A. Maranon y I. Ashcroft, «Thermo-mechanical characterization of Manicaria

Saccifera natural fabric reinforced poly-lactic acid composite lamina,» Composites: Part A,

vol. 81, pp. 105-110, 2016.

38

[6] B. M. Cheriana, A. L. Leãoa, S. Ferreira de Souza y L. M. Manzine Costa, «Cellulose

nanocomposites with nanofibres isolated from pineapple leaf fibers for medical

applications,» Carbohydrate Polymers, vol. 86, p. 1790–1798, 2011.

[7] R. J. Pinto, P. A. Marques, C. P. Neto, T. Trindade, S. Daina y P. Sadocco, «Antibacterial

activity of nanocomposites of silver and bacterial or vegetable cellulosic fibers,» Acta

Biomaterialia, vol. 5, p. 2279–2289, 2009.

[8] J. N. Reddy, An Introduction to Continuum Mechanics, Cambridge: Cambridge University

Press , 2008.

[9] J. P. Casas Rodriguez, Introducción Módulo de Elasticidad- Mecánica de Medios Continuos,

Bogotá D.C: Universidad de los Andes, 2018.

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[11] National Institute for Occupational Safety and Health, « Word of the Month: Ultraviolet

Germicidal Irradiation (UVGI),» NIOSH eNews, 2008.

[12] ATCC, «MTT Cell proliferation assay instruction guide,» ATCC, Manssas.

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tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.,» Journal of

Immunologic methods, vol. 89, nº 2, pp. 271-277, 1986.

[14] C. Cordero y F. Aristizábal, «In vitro preliminary cytotoxicity testing of vegetal extracts, using

colorometric methods,» Revista Colombiana de Biotecnología, vol. 4, nº 1, pp. 100-106.

[15] T. Mosmann, «Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to

Proliferation and Cytotoxicity Assays,» Journal of Immunological methods, vol. 65, pp. 55-63,

1983.

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Photon Counting Computed Tomography,» IEEE Nuclear Science Symposium Conference

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[18] MathWorks®, «im2bw,» MathWorks®, [En línea]. Available:

https://www.mathworks.com/help/images/ref/im2bw.html. [Último acceso: 15 Enero

2019].

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[En línea]. Available: https://support.minitab.com/es-mx/minitab/18/help-and-how-

to/quality-and-process-improvement/quality-tools/how-to/individual-distribution-

identification/interpret-the-results/all-statistics-and-graphs/goodness-of-fit/. [Último

acceso: 5 Diciembre 2018].

39

9. ANEXOS

Código cálculo de área.

%1. Importar reconstrucciones tomográficas file = dir('C:\Users\jd.chaux10\CTs Manicaria Saccifera\4. CT_1\1.

Cortes Reconstruidos'); file = file(~[file.isdir]); %2. Contar número de reconstrucciones tomográficas. NF = length(file); %3. Inicializar contador en cero. ctr = 0; %4. Binarizar, contar pixeles, calcular área de una reconstrucción

tomográfica y sumar. Al final se obtiene el área promedio de todas las

secciones transversales obtenidas. for k = 1 : NF A = imread(fullfile('C:\Users\jd.chaux10\CTs Manicaria

Saccifera\4. CT_1\1. Cortes Reconstruidos', file(k).name)); % Procesar la imagen % Obtener figura(k) close(gcf); b = imbinarize(A); ctr = ctr+sum(b(:)); dim_pixel = 0.050899; A_pixel = dim_pixel^(2); A_tot = A_pixel*ctr/NF; end

caracterizaciÓn del tejido vegetal manicaria …

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