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Índice

1. Introducción 31.1. ¿Qué es Cultivo de Tejido Vegetal? 31.2. Infraestructura requerida para el cultivo de tejido 4

2. Descripción de las especies en estudio 42.1. Astrophytum myriostigma 42.2. Mammillaria candida 5

3. Objetivo de las actividades desarrolladas3.1. Objetivo

64. Materiales y métodos 6

4.1. Preparación de medio basal de Murashige y Skoog (MS) 64.2. Preparación de ¼ MS con 1 % PEG4.3. Preparación de medio basal Woody Plant Medium (WPM) 64.4. Preparación de medio ½ WPM con 1 % PEG y 1 % de CA 64.5. Siembra de especie A. myriostigma en medios de cultivo

sólido7

4.6. Transferencia de las especie M. cándida a suelo estéril 77

5. Resultados y discusiones 88

6. Conclusiones 9

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1. Introducción

El cultivo de tejidos vegetales fue desarrollado a partir de la investigación de botánicos y fisiólogos vegetales desde 1950. Actualmente se ha convertido en una herramienta internacional importante en la selección, cruzamiento, control de enfermedades y producción masiva de cultivos de valor comercial que incluye tanto especies hortícolas, forestales y frutales.

La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen al conocimiento sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de microbiología a través de las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios de cultivo estériles para su multiplicación e identificación. Desde estas dos fuentes provino la tecnología por la cual las plantas u órganos de plantas se pueden multiplicar en gran número, haciendo crecer pequeños trozos de tejido vegetal sobre medios sintéticos en condiciones asépticas.

1.1 ¿Qué es el cultivo de tejidos vegetales?

El punto de partida para el cultivo in vitro es la asepsia del tejido a fin de cultivar posteriormente el material vegetal in vivo en un medio de cultivo estéril. Este proceso requiere la disección del explante de la planta, su tratamiento con agentes biocidas a fin de no introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán pueden generar una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo; en otros casos se formarán estructuras reconocibles como tallos, órganos, raíces, bulbos u otros órganos.

Los tejidos in vitro están ahora dentro de un microcosmos estéril, en un recipiente de vidrio o de plástico y están protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo que penetre crecerá a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos vegetales.

Los tejidos pueden crecer sobre la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o ellos pueden colocarse en un medio líquido. En ambos casos deben suministrarse los elementos minerales nutritivos esenciales (sales de nitrato, potasio y calcio) para el crecimiento vegetal. También se añaden las medias vitaminas, azúcares como fuente de energía y un cocktail de hormonas vegetales, las cuales controlan el crecimiento y desarrollo de los tejidos. Es conveniente preparar este medio nutritivo incorporando los elementos químicos dentro del gel o líquido, ajustando el pH alrededor de 6 y esterilizando este medio de cultivo ya sea dentro del recipiente para cultivo o en uno separado.

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Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo en general es necesario el suministro de luz, pero a intensidades menores que la luz solar. De los carbohidratos agregados al medio provendrá la fuente de energía más que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios unos latos niveles de luz. Una temperatura controlada también es necesaria para estabilizar el crecimiento y mejorar la predictibilidad del desarrollo de los tejidos.

1.2 Infraestructura requerida para el cultivo de tejido

Para realizar el cultivo de tejidos se requiere de una habitación limpia en la que se localizen las campanas de flujo laminar. En éstas campanas el aire que circula pasa a través de filtros por lo que el material puede manejarse sin riesgos de contaminación por el operador y transferirse en forma segura a medios nutritivos frescos. La transferencia, manipulación y subdivisión del material se hace usando escalpelo y pinzas previamente desinfectadas o flameadas en el mechero.

Otra zona importante es el cuarto de crecimiento que consiste en una habitación iluminada, con aire acondicionado y con alto estándar de higiene en el cual los cultivos de tejidos pueden crecer y desarrollarse en forma segura por períodos de semanas o meses. Para mantener el régimen de iluminación y temperatura óptimos se requiere un suministro de electricidad confiable y adecuado, ya que cada planta producida puede consumir unos 0,5 Kw de energía.

2. Descripción de las especies en estudio.

Dentro del laboratorio se cuenta con una gran variedad de cactáceas, que requieren de mantenimiento para su preservación. Como parte del desempeño de actividades del servicio social trabaje con dos de ellas, las cuales se describen a continuación.

2.1. Astrophytum myriostigma

Descripción:

La especie, conocida popularmente como birrete de obispo, es de tallo globular, deprimido en el ápice, mide entre 10 y 25 cm. de diámetro y puede presentarse un tanto columnar cuando el ejemplar es adulto. Es de color verde aunque está cubierta de manera abundante por escamosidades blancas muy pequeñas que le confieren un aspecto blanco grisáceo. Las costillas habitualmente son cinco, aunque también existen formas de cuatro a ocho costillas, muy prominentes y agudas. Las aréolas son muy pequeñas y están muy juntas. Son completamente inermes y están cubiertas generalmente de pelos parduscos. Las flores miden alrededor de 6 cm de

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diámetro y son de color amarillo. Existen diversas variedades entre ellas, quadricostatum, con sólo cuatro costillas y nudum, de tallo color verde, sin restos de escamas (Figura 1).

Figura 1. Aspecto de una planta de A. myriostigma en floración.

2.2. Mammillaria candida

Descripción:

La planta es de forma globular al comienzo, aunque con la edad se vuelve cilíndrica, midiendo entre 10 y 14 cm. de diámetro. Tiene el ápice ligeramente deprimido y amacolla por la base en edad adulta. Los tubérculos están muy cerca entre sí, son cilíndricos, prominentes y de su base aparecen pelos blancos de la misma longitud que aquellos, que se vuelven más densos en la parte apical. Las espinas radiales se presentan en número de 40 o más, de color blanco y casi 1 cm. de longitud. Están entrecruzadas entre sí escondiendo casi por completo el tallo. Las espinas centrales son entre 8 y 12, aciculares, de color blanco con la extremidad amarronada y miden entre 4 y 7 mm de longitud.Las flores son de color blanco con la parte central rosada, miden 2 cm de longitud y 1,5 cm de diámetro. Aparecen en forma de corona entre las espinas alrededor del ápice (Figura 2).

Figura 2. Aspecto de una planta de M. cándid.

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3. Objetivo de las actividades desarrolladas3.1Objetivo

Ver el efecto del AIB y de las diferentes tapas usadas en el enraizamiento y la compactación de los explantes.

4. Materiales y métodos

4.1 Preparación de medio basal de Murashige y Skoog (MS).

La concentración de los componentes del medio MS corresponde a la escrita originalmente por Murashige y Skoog (1962) y se describe a continuación:

Solución I. Pesar 18 g de CaCl2, disolver en agua desionizada y aforar hasta 50ml.Solución II. Pesar 9.25 g de MgSO4 .7 H2O, 4.25 g de KH2PO4, disolver en agua desionizada y aforar hasta 250 ml.Solución III. Pesar 0.557 g de FeSO4.7H2O, 0.672 g de Na2EDTA o 0.744g de Na2EDTA.2H2O disolver en agua desionizada y aforar hasta 100 ml.Solución IV. Pesar 2.23 g de MnSO4. 4 H2O, 0.86 g de ZnSO4.7H2O, 0.62 g H3BO3, 0.083 g de KI, 0.025 g de Na2MoO4.H2O, 0.0025g CuSO4.5H2O; 0.0025 g de CoCl2.6H2O, disolver en agua desionizada y aforar hasta 100 ml.Solución V. Pesar 0.05 g de glicina, 0.0125 g de piridoxina HCl, 0.025 g de tiamina, HCl, 2.5 g de mio-inositol, 0.0125 g de ácido nicotínico, disolver en agua desionizada y aforar hasta 250 ml.Todas las soluciones se filtraron a través de papel Whatman No. 1 y se

almacenaron a 4 °C, a excepción de la solución V que se almacenó en congelador a -20 °C.

Una alternativa para preparara este medio es usar medio MS (Murashige y Skoog) preparado comercialmente para lo cual se pesan 4.4 g del polvo comercial por litro de meido.

4.2. Preparación de ¼ medio basal con 1% PEG.

1. Se pesaron 4.4 g de medio MS (o se agregaron 1 ml de la solución I, 10 ml de la solución II, 5 ml de la solución III, 1 ml de la solución IV y 10 ml de la solución V).

2. Se añadieron 10 g de polietilenglicol (PEG) y 30 g de sacarosa.3. Se aforó a 1 L, se agregaron 4.2 g de agar y 2.2 g de phytagel y se

fundió en placa de calentamiento.

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4. Se vació el medio en frascos medianos y se esterilizaron en autoclave por 15 min, a una presión de 120 lb/pulg2 y a una temperatura de 121 °C.

Nota: para preparar ¼ MS se dividen todas las cantidades entre 4, excepto el agar y el phytagel.

4.3. Preparación de medio basal Woody Plant Medium (WPM).

Para preparar el medio WPM se prepararon las siguientes soluciones:Solución I. Pesar 0.95 g de CaCl2. 2 H2O, 3.86 g de nitrato de calcio, disolver en 100 ml de agua desionizada.Solución II. Pesar 9.25 g de MgSO4. 7H2O, 4.25 g de KH2PO4 disolver en 250 ml de agua desionizada.Solución III. Pesar 3.73 g de EDTA- Na2 y adicionar CuSO4.5H2O, disolver en 100 ml de agua desionizada.Solución IV. Pesar 2.23 g de MnSO4.H2O, 0.86 g de ZnSO4, 0.62 g de H3BO3, 0.025 g de Na2MoO4. 2H2O, 17 g de K2HPO4, 99 g de K2SO4, disolver en 1 L de agua desionizada.Solución V. Pesar 50 mg de Glicina, 12.5 mg de piridoxina-HCl, 2.5 mg de Tiamina- HCl, 2.5 g de mio-inositol, 12.5 mg de ácido nicotínico, disolver en 250 ml con agua desionizada.Nota: Todas las soluciones con excepción de la IV, se filtraron a través

de papel Whatman No. 1 y se almacenaron a 4 °C.

4.4. Preparación de ½ WPM con 1% PEG y 1% de carbón activado (CA).

1. Se pesaron 0.4 g de NH4NO3, se agregaron las soluciones indicadas (10 ml de solución I, 5 ml de solución II, 0.5 ml de solución III, 5 ml de solución IV y 10 ml de solución V) y se

2. Mezclaron con 10 g de PEG (Polietilenglicol), 10 g de CA (carbón activado) y 20g de sacarosa.

3. Se aforo a 1 L y se fundió para agregar 4.2 g de agar y 2.2 g de phytagel.

4. Se coloco en frascos medianos y se esterilizaron en autoclave por 15 min, a una presión de 120 lb/puldas2 y una temperatura de 121 °C.

Nota: para preparar ½ WPM se dividieron todas las cantidades entre dos, excepto el agar y el phytagel.

4.5. Siembra de la especie A. myriostigma en medios de cultivo sólido.

Una vez seleccionado el material a resembrar se transfiere a los medios en campana de flujo laminar, en condiciones de asepsia, utilizando un mechero pinzas bisturí y alcohol para la desinfección del material. La resiembra se realiza con sumo cuidado para evitar que se contaminen los

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frascos por bacterias debido a la mala esterilización del material o al mal manejo. Para resembrarlos es necesario sumergir las pinzas y bisturí en alcohol, y pasarlos por el mechero, después de esto se puede tomar cada explante. Una vez resembrado todo el material los frascos se sellan con vitafilm y se llevar al cuarto de crecimiento.

Se evaluó la formación de callo, hidratación y el color del brote de acuerdo a los siguientes parámetros:

Desc

rip

ció

n

Callo Hidratación Color

0 I II III

0 I II III

Vo

Vc

Vcf

s/ca

llo

Pequ

eño

Med

iano

Gra

nde

Com

pact

o

Poco

hid

rata

do

Mod

erad

amen

te h

idra

tado

Muy

hid

rata

do(tr

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cido

Verd

e ob

scur

o

Verd

e cla

ro (A

lgo

de

hidr

atac

ión)

Verd

e ca

feso

so (a

lgo

de

oxid

ació

n)Para evaluar el efecto del AIB, los brotes se sumergieron en una solución

de AIB en una concentración de 1 mg/ml por 1 min. y después se transfirieron al medio. Con el fin de incrementar la ventilación se usaron tapas perforadas a las cuales se les colocó un tapón de algodón (5 frascos) o a tapón de microporo (5 frascos). Como testigos se usaron frascos con tapa normal.

4.6. Transferencia de las especie M. cándida a suelo estéril.

Las plantas de M. cándida que eran demasiado grandes y no cabían en la maceta se transfirieron a tierra estéril de la siguiente manera:

a) En el fondo de la maceta se colocó una pequeña capa de grava y después una cantidad moderada de la mezcla de tierra estéril.

b) Se humedeció la raíz de la planta en una mezcla de agua con enraizador Raizone Plus de la marca FAX.

c) Se colocó la planta en la maceta y se rodeó perfectamente con la tierra estéril, cuidando de que la tierra no la cubriera por completo.

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d) Las plantas se pasaron a un recipiente con agua para que fueran regadas de manera ascendente.

5. Resultados y discusión.

Los resultados de los experimentos para evaluar el efecto del AIB y de la ventilación se presentan en los siguientes cuadros. Se observó que en el medio control (1/4 MS + 1 % PEG) conforme pasa el tiempo, los brotes no formaron callo pero aumentó la hidratación de los brotes de nivel I a nivel II (Cuadro 1).

Cuadro 1. Crecimiento de brotes de A. myriostigma en medio control sin AIB.

Con el medio de ¼ de MS + 1% PEG + AIB y tapa con tapón de algodón se observó que ninguno de los explantes formo callo, a demás que la hidratación disminuyo considerablemente hasta obtener un 66.6 % de hidratación tipo 0 y por consiguiente mayor compactación y un mejor color (Vo) (cuadro 2).

Cuadro 2. Crecimiento de brotes de A. myriostigma con AIB y tapas con tapón de algodón.

Tiempo

(días)

Callo (%) Hidratación (%)

Color (%)

0 I II

III

0 I II III

Vo Vc Vcf

0 100

20 70 30 50 20

Tiempo

(días)

Callo (%) Hidratación (%)

Color (%)

0 I II

III

0 I II III

Vo

Vc Vcf

0 100

100

50

50

30 100

50 50 100

57 100

25 75 100

89 100

100

100

120 100

100

1000

9

30 100

30 70 30 40 30

57 100

60 40 40 40 20

89 100

66.6

16.6

16.6

83.3

16.6

120 100

66.6

33.3

83.3

16.6

Al usar las tapas con microporo con medio ¼ MS +1 % PEG + AIB, observamos que los explante no presentaron callo y la hidratación disminuye pero solo un poco (cuadro 3).

Cuadro 3. Crecimiento de brotes de A. myriostigma con AIB y tapas con tapón microporo.

Tiempo

(días)

Callo (%) Hidratación (%)

Color (%)

0 I II

III

0 I II III

Vo Vc Vcf

0 100

100

30 20 50

30 100

25 75 12.5

75 12.5

57 100

25 75 25 75

89 100

25 50 25

12.5

62.5

25

120 100

12.5

62.5

25

87.5

12.5

A continuación se presenta un grafico general de crecimiento de la raíz para A. myriostigma, donde se puede observar que el mejor crecimiento fue dentro de los frascos que tenían tapa de algodón.

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Figura 3. Comparación de las diferentes tapas en el crecimiento de la raíz.

Además se pudo apreciar que existe una mayor contaminación en los frascos con tapa de microporo, tal vez por que el poro es muy grande como para dejar pasar algunas esporas.

6. Conclusiones

1. Las tapas de microporo presentan mayor contaminación que las de algodón.

2. Las tapas de algodón permiten un mejor crecimiento del explante y mayor compactación.

3. El AIB permite un mayor crecimiento de de raíz en comparación de los que no fueron introducidos en este.

4. Por lo que es recomendable trabajar con tapas con tapón de algodón en otros experimentos.