caracterización de lisados tumorales antigénicos para la
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Caracterización de lisados tumorales antigénicos para la activación
ex- vivo de células dendríticas contra el cáncer de ovario
Tesis entregada para optar al grado de Doctor
en Biotecnología
Iván Flores Colmann
Directora de Tesis: Dra. Mercedes López
Santiago-Chile
Agosto, 2018
II
III
VICERRECTORIA DE INVESTIGACIÓN Y DOCTORADO
ACTA EXAMEN PUBLICO PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIOTECNOLOGIA
En Santiago, el día 16 de Agosto del 2018, en ceremonia solemne se efectúa la defensa pública de la Tesis presentada por el Sr. Iván Esteban Flores Colmann titulada “Caracterización de lisados tumorales antigénicos para la activación ex vivo de células dendríticas contra el cáncer de ovario” como el último requisito para la obtención del grado de Doctor en Biotecnología de la Universidad Andrés Bello. La comisión examinadora está integrada por su Director de Tesis Dra. Mercedes López, además de los Doctores Mario Rosemblatt, Jaime Villegas, Rodrigo Pacheco e Iván Alfaro. Esta ceremonia es co-presidida por el Vicerrector de Investigación y Doctorado, Doctor Ariel Orellana y por el Decano de la Facultad de Ciencias de la Vida, Doctor Alfredo Molina y la Directora Académica de Doctorados Dra. Erika Poblete. Luego de escuchar la defensa de la Tesis expuesta por el Sr. Iván Flores, la comisión ha decidido aprobarla y manifestar sus felicitaciones.
Por lo anterior, se otorga el grado de
Doctor en Biotecnología
A
Iván Esteban Flores Colmann
________________ ________________ Dra. Mercedes López
Director de tesis Universidad De Chile
Dr. Iván Alfaro Evaluador Externo
Fundación Ciencia & Vida
________________
Dr. Jaime Villegas Universidad Andrés Bello
________________
Dr. Rodrigo Pacheco Universidad Andrés Bello
________________
Dr. Mario Rosemblatt Ministro de Fe Universidad Andrés Bello
IV
..” La manzana no puede ser vuelta a poner
de nuevo en el árbol del conocimiento; una
vez que empezamos a ver, estamos
condenados y enfrentados a buscar la fuerza
para ver más, no menos”. ...-A. Miller.
V
AGRADECIMIENTOS
No tengo como agradecer el apoyo brindado por mi familia en este proceso, sin duda,
sin el apoyo de mi hermano, mamá y papá no me hubiera atrevido a comenzar este camino. A
mi compañera de vida, Daniela, por soportar me en los momentos difíciles, amarme, apoyarme
y ser mi cable a tierra en la vida. Finalmente a mi hija, por ser mi motor de superación y mi
más grande mentora.
A la Dra. Mercedes López, por creer en mí, por enseñarme no solo la rigurosidad
científica sino que también su visión de la ciencia y la academia. Al Laboratorio de Regulación
e Inmunología del Cáncer: Fabián, Cristián, Felipe, Jimena, Ignacio, Daniel, Claudio, Cristina,
Nicolás, Lía, Camila, Ana Delia, Patricia, Carolina, Gisselle, Gabriel, Paulina y Dafne, gracias,
de verdad muchas gracias por compartir conmigo, enseñarme sus vidas, experiencias y alegrar
mis 6 años de estadía. Al laboratorio de Inmunología Antitumoral, liderado por el Dr. Flavio
Salazar y su equipo de trabajo: Marcos, Israel, Andrés, Gabriela, Pereda, Marisol, Ignacio,
Mariela, Francisca, Juan Pablo, Omar. Al laboratorio de la Dra. Osorio y su equipo compuesto
por: Cristóbal, Bernardita, Dominique, Sandra y Felipe. También agradecer a Don Felix, por
sus conversaciones de futbol en las mañanas y por no retarme tanto cuando el llegaba a trabajar
en la mañana y yo ya estaba sentado en el gabinete de cultivo celular.
A la comisión Doctoral, por darse el tiempo de evaluar y darme consejos para
perfeccionar este trabajo. Al Dr. Villegas por enseñarme por primera vez los conceptos
canónicos de biología celular en el 2007. Al Dr. Rosemblatt por guiarme en el doctorado,
compartir su amor por la inmunología. Al Dr. Pacheco por confiar en mí dándome la
oportunidad de impartir junto a él, el curso InmunoBiotecnología en la Universidad Andrés
Bello y sus consejos en el transcurso de esta tesis. Al Dr. Alfaro por incorporarse a la comisión
en esta etapa final y aportar en estas instancias.
Finalmente a las fuentes de financiamientos, Beca Doctoral UNAB, Beca Doctorado
Nacional CONICYT, Instituto Milenio de Inmunología e Inmunoterapia, CONICYT y
FONDEF.
VI
INDICE DE ABREVIATURAS
AcMo: Anticuerpo monoclonal.
ADN: Ácido desoxirribonucleico.
APC: Células presentadoras de antígenos (Antigen Presenting Cells) / aloficocianina
(Allophycocyanin).
ARN: Ácido ribonucleico.
CCR1: Receptor de quimioquina tipo 1 (con motivo C-C). (CD191).
CCR5: Receptor de quimioquina tipo 5 (con motivo C-C). (CD195).
CCR7: Receptor de quimioquina tipo 7 (con motivo C-C). (CD197, BLR2).
CD4: Correceptor de señalización y adhesión de linfocitos T restringido a MHC-II.
CD8: Correceptor de señalización y adhesión de linfocitos T restringido a MHC-I.
CD11c: Integrina αx. (Subunidad 4 del receptor del componente 3 del complemento).
CD28: Receptor de CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2).
CD40: Integrina de membrana, molécula de activación de linfocitos T.
CD40L: Ligando del receptor CD40, integrina α5β1 y αIIbβ3. (TRAP, CD154, TBAM,
TNFSF5). .
CD80: Molécula co-estimuladora B7.1, ligando de CD28.
CD83: Molécula de activación en células dendríticas.
CD86 Molécula co-estimuladora B7.2, ligando de CD28.
CO: Cáncer de Ovario
CpG: Regiones del ADN altamente ricas en citosina y guanina.
VII
CTLA-4: Antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4). Receptor
de CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2). (CD152)
CTL: Linfocitos T Citotóxicos (Cytotoxic T Lymphocytes).
CRT: Calreticulina
DAMPs: Patrones moleculares asociadas al daño (Damage Associated Patterns).
DC: Célula Dendrítica (Dendritic Cells).
DTH: Respuesta de hipersensibilidad retardada o tipo IV (Delayed Tipe IV
Hipersensibility).
FasL: Ligando del receptor de apoptosis FAS. (CD95L).
FITC: Isotiocianato de fluoresceína (Fluorescein isothiocyanate).
GM-CSF: Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (Granulocyte Monocyte
Colony Stimulating Factor).
HMGB1: Proteína de alta movilidad del grupo 1 (High-Mobility Group Box 1 protein).
iDC: Célula Dendrítica Inmadura.
IFN-α: Interferon-alpha, interferón de tipo I.
IFN-γ: Interferon-gamma, interferón de tipo II.
IL: Interleuquina.
IL-17R: Receptor de interleuquina 17.
IMF: Intensidad de fluorescencia media.
LPS: Lipopolisacárido.
LT: Linfocitos T.
MLOV1: Mezcla de Lisado de Ovario 1.
MLOV2: Mezcla de Lisado de Ovario 2.
VIII
PAMPs: Patrones moleculares asociados a patógenos (Patogen Associated Molecular
Patterns).
PBL: Linfocitos de sangre periférica (Peripheral Blood Lymphocytes).
PBMC: Células mononucleares de sangre periférica (Peripheral Blood Mononuclear cell).
PBS: Fosfato buffer salino (Phosphate Buffer Saline).
PD-1: Proteína de muerte celular programada 1 (Programmed cell Death protein 1).
Receptor de PD-L1.
PD-L1: Ligando de muerte programada 1(Programmed death-ligand 1) Ligando de PD-1.
PE: Ficoeritrina.
PFA: paraformaldehído.
PMA: Acetato Miristato de forbol (Phorbol Myristate Acetate).
PRR: Receptor de reconocimiento de patrones (Pattern Recognition Receptor).
rhGM-CSF: Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos recombinante
humana.
rhIL: Interleuquina recombinante humana.
TAPCells: Células Presentadoras de Antígenos Tumorales (Tumor Antigen Presenting Cells).
Tol DCs: Célula presentadora de antígenos tolerogénica basada en TRIMEL.
TCR: Receptor linfocito T (T Cell Receptor).
TGF-β1: Factor de transformación y crecimiento beta 1(Transforming Growth Factor Beta 1).
TH: Linfocitos T helper (T Helper lymphocytes).
TH 1: Linfocitos T helper tipo 1 (T Helper lymphocytes type 1).
TH 2: Linfocitos T helper tipo 2 (T Helper lymphocytes type 2).
TH3: Linfocitos T helper 3 (T Helper lymphocytes type 3).
IX
TH17: Linfocitos T helper tipo 17 (T Helper lymphocytes 17).
TLR: Receptor tipo Toll (Toll Like Receptor).
TNF: Factor de necrosis tumoral (Tumor Necrosis Factor).
TRIMEL: Lisado de Líneas de Melanoma
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INDICE
1. RESUMEN ....................................................................................................................1
2. ABSTRACT ...................................................................................................................2
3. INTRODUCCIÓN ...........................................................................................................3
3.1. Cáncer de ovario ........................................................................................................... 3
3.2. Inmunología del cáncer ................................................................................................. 4
3.3. Sistema inmune en el carcinoma epitelial de ovario .................................................... 6
3.4. Inmunoevasión del cáncer de ovario ............................................................................ 8
3.5. Inmunoterapia en cáncer de ovario ............................................................................ 10
3.6. Inmunoterapia basada en células dendríticas maduradas con lisados antigénicos tumorales
………………………………………………………………………………………………………………………………...11
4. HIPOTESIS ................................................................................................................. 14
5. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................... 14
6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 14
7. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................... 15
8. RESULTADOS ............................................................................................................. 22
8.1. Lisados sometidos a estrés térmico obtenidos desde líneas de cáncer de ovario contienen
antígenos asociados al carcinoma de ovario y elevan producción de DAMPS. .......................... 22
8.3 DCs maduradas con lisados celulares sometidos a estrés térmico de carcinoma de ovario,
activan linfocitos CD4+ y CD8+ ..................................................................................................... 28
8.4. DCs maduradas con mezclas de lisados de carcinoma de ovario indujeron una respuesta
linfocitaria efectora reactiva contra células de carcinoma de ovario. ........................................ 34
9. DISCUSIÓN ................................................................................................................ 39
10. BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................... 46
1
1. RESUMEN
El cáncer de ovario presenta una alta mortalidad en estadios avanzados debido a que las
terapias actualmente en uso carecen de efectividad. Sabemos que el sistema inmune juega un
rol fundamental ya que puede favorecer o limitar el crecimiento tumoral y con ello, determinar
el curso de esta enfermedad. Actualmente, diversas terapias basadas en la manipulación del
sistema inmune están siendo probadas en este tipo de cáncer, como por ejemplo, el uso de
anticuerpos monoclonales y vacunas de células dendríticas (DCs) que han mostrado resultados
alentadores en diversos tipos de cáncer como melanoma, cáncer de próstata, cáncer de colón y
cáncer de pulmón entre otros.
La inmunoterapia, es una de las herramientas más promisorias aplicadas en tratamientos
oncológicos. Nuestro laboratorio ha realizado estudios clínicos de fase I y II en pacientes con
melanoma avanzado y carcinoma de próstata, utilizando DCs activadas con lisados tumorales
sometidos a estrés térmico. Nuestros estudios demostraron que componentes derivados de líneas
celulares provenientes de estos cánceres, potencian la respuesta inmunológica de las DCs e
inducían aumento en la sobrevida de los pacientes tratados. En esta tesis, planteamos que,
lisados celulares condicionados derivados de líneas de carcinoma de ovario poseen el potencial
de inducir la maduración fenotípica y funcional de DCs y una eficiente activación de la respuesta
inmune celular contra cáncer de ovario. Para esto, caracterizamos la expresión de antígenos
asociados a tumor y la generación de señales de peligro en respuesta al condicionamiento con
shock térmico de 4 líneas celulares de cáncer de ovario. Nuestros análisis demostraron que una
de las líneas posee antígenos que se han relacionado a cáncer de ovario y observamos que
producto del shock térmico, en todas las líneas celulares estudiadas se indujo la expresión de
DAMPS, como HGMB1 y calreticulina. Al combinar las líneas para elaborar los lisados
celulares, estas mezclas activaron eficientemente las DCs. Finalmente, demostramos que estas
DCs maduradas con las diferentes mezclas de lisados de cáncer de ovario, son capaces de
activar, de manera alogénica y autóloga, linfocitos T CD4+ y CD8+ con la capacidad de
reconocer y eliminar células tumorales. Este estudio ofrece una oportunidad de contribuir al
desarrollo específico de vacunas efectivas contra esta neoplasia.
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2. ABSTRACT
Ovarian cancer has a high mortality in advanced stages because the therapies currently
in use lack effectiveness. We know that the immune system plays a fundamental role since it
can favor or limit tumor growth and with it, determine the course of this disease. Currently,
various therapies based on manipulation of the immune system are being tested in this type of
cancer, such as the use of monoclonal antibodies and dendritic cell (DC) vaccines that have
shown encouraging results in various types of cancer such as melanoma, prostate cancer, colon
cancer and lung cancer among others.
Immunotherapy is one of the most promising tools applied in oncological treatments.
Our laboratory has conducted phase I and II clinical studies in patients with advanced melanoma
and prostate carcinoma, using activated DCs with conditioned tumor lysates. Our studies
showed that components derived from cell lines derived from these cancers, potentiated the
immunological response of the DCs and induced an increase in the survival of the treated
patients. In this thesis, we propose that conditioned cell lysates derived from ovarian carcinoma
lines have the potential to induce the phenotypic and functional maturation of DCs and an
efficient activation of the cellular immune response against ovarian cancer. Thus, we
characterize the expression of tumor-associated antigens and the generation of danger signals in
response to the thermal shock conditioning of 4 ovarian cancer cell lines. Our analyzes showed
that one of the lines has antigens that have been related to ovarian cancer and we observed that
thermal shock, in all the cell lines studied, the expression of DAMPS was induced, such as
HGMB1 and calreticulin. By combining the lines to make the cell lysates, these mixtures
efficiently activated the DCs. Finally, we demonstrate that these DCs matured with the different
mixtures of ovarian cancer lysates, are able to activate, in an allogeneic and autologous manner,
CD4+ and CD8+ T lymphocytes with the ability to recognize and eliminate tumor cells. This
study offers an opportunity to contribute to the specific development of effective vaccines
against this neoplasm.
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3. INTRODUCCIÓN
3.1. Cáncer de ovario
El carcinoma epitelial de ovario es altamente agresivo y afecta a la población femenina
durante y posterior a la menopausia. Posee una incidencia anual de 237.000 nuevos casos en el
mundo (Ferlay et al., 2012). En Estados Unidos representa la quinta causa de muerte en las
mujeres afectadas por algún tipo de cáncer (Siegel, Miller and Jernal, 2015). Adicionalmente, a
nivel mundial éste tipo de cáncer ocupa el séptimo lugar en mortalidad en la población femenina
con más de 150.000 muertes por año (Ferlay et al., 2012). En nuestro país esta enfermedad posee
una incidencia de 7,4 casos por 100.000 habitantes y una mortalidad de 3,8 por 100.000
habitantes (Globocan, 2018)
Los ovarios son órganos endocrinos localizados en la cavidad pélvica, en contacto
directo con la tuba uterina. Este órgano puede verse comprometido con diferentes tipos de
tumores, debido a la gran variedad de células que lo componen. El carcinoma epitelial de ovario
(CEO) es el más frecuente, representando entre el 85 a 90% de los casos diagnosticados
(Kurman and Shih, 2010; Jayson et al., 2014) con una mortalidad de 4,5 muertes por 100.000
habitantes.
Habitualmente, el cáncer de ovario se diagnostica en mujeres menopáusicas o
perimenopaúsicas en estadios III y IV, debutando clínicamente por los síntomas derivados de
metástasis peritoneales (Cannistra et al., 2004). Esto se debe a que los síntomas más
característicos de las etapas tempranas de la enfermedad, como dolor abdominopélvico y
distensión abdominal, son inespecíficos y se asocian comúnmente a otras patologías. Por esta
razón, la sobrevida global del CEO es baja, los estudios más conservadores señalan una
sobrevida de 45% a 5 años (Howlander et al., 2014), aunque si desglosamos por estadios, esto
varía considerablemente, alcanzando un 92% en estadio I en comparación al 27% para estadios
avanzados (McPhail et al, 2015; Wright et al, 2015).
Al ser diagnosticado, la citoreducción sigue siendo la primera opción de tratamiento
(Chang et al., 2015; Bacalbasa et al., 2015; Neil et al., 2015) con un impacto positivo en la
enfermedad (Bacalbasa et al., 2015). Sin embargo, incluso cuando la cirugía logra una resección
4
macroscópica completa, las pacientes tienden a recaer en el tiempo, requiriendo así futuras
intervenciones (Bacalbasa et al., 2015) incluyendo quimioterapia con cisplatino y taxanos
(Canistra et al., 2004). Este último tratamiento posee varios efectos adversos como lo son:
vómitos, pérdida de peso, caída de pelo, entre otros, además que un gran porcentaje de las
pacientes tratadas no ven efectos positivos en su sobrevida (Neil et al., 2015) Debido a esto, es
necesario desarrollar nuevos estudios de terapias que puedan generar efectos clínicos más
favorables a los pacientes.
3.2. Inmunología del cáncer
El sistema inmune es una red compleja de diferentes órganos, células y moléculas que
interaccionan en una fina y coordinada manera con el fin de responder de forma eficiente sobre
la protección del organismo frente a elementos externos e internos dañinos, como patógenos y/o
células tumorales (Fridman et al., 2012).
El sistema inmune ejerce su acción anti-tumoral mediante la activación de una serie de
mecanismos tanto de la inmunidad innata como la adaptativa que buscan eliminar el tumor. Este
proceso se divide en tres fases claramente definidas que reflejan la interacción temporal entre el
sistema inmune y el cáncer. La fase de eliminación, se caracteriza porque el sistema inmune
logra erradicar la mayor parte de las células neoplásicas. La segunda etapa es llamada fase de
equilibrio, en la que el sistema inmune no puede eliminar completamente el tumor, ya que éste
se va adaptando continuamente. La ruptura del equilibrio, lleva a la fase de escape, donde el
sistema inmune es incapaz de controlar el crecimiento tumoral, y la enfermedad termina
matando al paciente (Shore, 2015). En este contexto, el tumor induce un microambiente
inmunosupresor caracterizado por la presencia de diferentes tipos celulares como linfocitos T
reguladores, células mielodes y macrófagos tipo M2, además de la presencia de diferentes
citoquinas inmunosupresoras como IL-10 o TGF- (Gallois and Bhardwaj ., 2013).
Publicaciones recientes demuestran la capacidad que poseen las células tumorales de captar
glucosa y acidificar el microambiente en que el tumor se desarrolla, lo cual reduce el
metabolismo de los linfocitos T y con ello, su capacidad de secretar la citoquina anti-tumoral,
5
interferón gamma (Chang et al., 2015). Junto a la producción de citoquinas inmunosupresoras
y a la deprivación de glucosa en el microambiente tumoral, el equilibrio linfocitario se desplaza
hacia un aumento de la producción y la sobrevida de linfocitos T reguladores y de macrófagos
M2, debido a su capacidad de adquirir energía a través del metabolismo de ácidos grasos, cuando
la glucosa es limitada (Tingting et al., 2014).
La interacción entre el sistema inmune y el tumor presenta varios elementos. Las células
presentadoras de antígenos (APC, como por ejemplo, células dendríticas) son capaces de
capturar antígenos asociados a tumor (TAA) y sensar patrones moleculares asociados a daño
(DAMPs) con el fin de activar la inmunidad adaptativa contra el tumor, mediante la presentación
de antígenos tumorales, la expresión de moléculas co-estimuladoras (CD80, CD83 y CD86) y
la producción de citoquinas como IL-12 (Fridman et al., 2012). El reconocimiento de los
DAMPs es mediado por receptores que reconocen patrones moleculares (PRR) como los TLR
(toll-like receptors) entre otros, los cuales son expresados por DCs y otras células inmunes
(Aguilera et al., 2011, González et al., 2014). Los DAMPs incluyen calreticulina (CRT),
proteínas de shock térmico, ácidos nucleicos y proteínas asociadas a ellos como HMGB1, todos
reconocidos por TLRs, C-type lectins, NOD-like receptors, RIG-I like receptors, integrinas o
receptores tipo scavenger (Zitvogel et al., 2010; Aguilera et al., 2011,). Nuestro laboratorio ha
demostrado que la translocación de calreticulina y liberación de HMGB1, durante la generación
de los lisados celulares, se asocian a una óptima maduración y presentación antigénica sobre
DCs terapeúticas ex vivo. Del mismo modo, el bloqueo de la translocación de calreticulina inhibe
la expresión de MHC clase II y moléculas co-estimuladoras, al igual que la capacidad de
activación de linfocitos T CD8+ para reconocer antígenos tumor específicos (Aguilera et al.,
2011; González et al., 2014; Rojas et al., 2018). El bloqueo de la liberación de HMGB1 por su
parte, inhibe la expresión de MHC clase I y la presentación cruzada que ocurre en las DCs, lo
que demuestra el papel relevante que juega en la maduración de este tipo celular (Aguilera et
al., 2011).
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3.3. Sistema inmune en el carcinoma epitelial de ovario
Se ha demostrado que el sistema inmune juega un rol importante en la patogénesis y la
progresión de este tipo de cáncer (Goyne and Cannon, 2013). En 1971, Fathalla et al describió
por primera vez que en cada ciclo menstrual, se daña la superficie del ovario induciendo la
respuesta inflamatoria e incrementando el riesgo de trasformaciones malignas por la activación
de factores de transcripción como NF-kB, que induce la secreción de moléculas
proinflamatorias. Esta teoría fue respaldada por análisis epidemiológicos que mostraron una
estrecha asociación de factores como: el número de ciclos menstruales producidos por una mujer
en edad fértil, la cantidad de partos, uso de anticonceptivos orales, edad de inicio de menopausia
y periodo de amamantamiento; con la incidencia de este tipo de cáncer (Charbonneau et al.,
2013). En la actualidad, esta teoría ha perdido fuerza debido a la gran cantidad de nuevas
evidencias que sugieren que el primer sitio de carcinogénesis no es el ovario, sino la fimbria de
la tuba uterina (Nezhat et al., 2015). Esto podría implicar que este mecanismo no juega un rol
relevante en la formación de tumores.
Una vez que el tumor se ha establecido, el sistema inmune juega un rol importante en su
progresión. Se ha demostrado que la infiltración tumoral de linfocitos T está asociada con un
mejor pronóstico, junto con una mayor sobrevida, y que la presencia de linfocitos T reguladores
(Treg) tanto en el sitio tumoral como en el líquido ascítico de los pacientes se correlaciona con
un mal pronóstico (Curiel et al., 2006; Liao and Disis, 2013). Además, Zhang, observó que la
infiltración por LT en pacientes con cáncer de ovario epitelial, se correlaciona con una mayor
sobrevida en estadios III y IV de la enfermedad. Incluso, establecieron que la extracción
completa del tumor y un mayor porcentaje de células CD3+ predicen de mejor manera la
sobrevida de los pacientes (Zhang et al., 2003). En el año 2012, Hwang publicó un meta-análisis
donde se revisaron 10 publicaciones que mostraron que los pacientes que tienen baja infiltración
de linfocitos CD3+ y CD8+ en los tumores, tienen dos veces más la posibilidad de morir por esta
enfermedad (Hwang et al., 2012).
Por otro lado, la inmunidad innata también tiene un rol en la progresión del tumor. Se ha
descrito que bajos niveles de TNF- en ascitis de pacientes, pueden predecir un aumento en la
sobrevida libre de enfermedad. Sin embargo, pacientes que tienen altos niveles de IL-6 poseen
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un peor pronóstico, en comparación con aquellos que tienen altos niveles de IL-6 y TNF-,
sugiriendo un rol del sistema inmune innato en la regulación del microambiente tumoral
(Kolomeyeyskaya et al., 2015). Reportes previos muestran que IL-6 puede promover el
crecimiento tumoral, convirtiéndola de esta forma en un posible blanco para inmunoterapia (Liu
et al., 2010). Interesantemente, el bloqueo de TNF- al usar RNAi puede reducir el crecimiento
tumoral in vitro, posiblemente al afectar la angiogénesis mientras que también inhibe el
reclutamiento de células mieloides en el nicho tumoral, las cuales podrían suprimir linfocitos T
(Hardwick et al., 2016).
Adicionalmente, diversos estudios se han centrado en describir los antígenos asociados
al carcinoma epitelial de ovario, demostrando que estos tumores poseen una alta expresión de
moléculas como HER2/neu, MUC1, OA3, TAG-72, Mesotelina, Ny-eso-1 (Liu et al., 2010),
NASP y RCAS1 (Ali-Fehmi et al., 2010) entre otras. MUC 1 se ha asociado no solo al cáncer
de ovario sino que también se ha evidenciado su sobreexpresión en cáncer de colon y vesícula
biliar, entre otros (Ali-Fehmi et al., 2010). El antígeno ErbB2 o también conocido como
HER2/neu es un protooncogen cuya función es ser un receptor con actividad tirosina quinasa
del factor de crecimiento de tipo epidérmico humano, siendo así clave para el crecimiento y
división de células humanas. Es un importante biomarcador para cáncer de mama y un blanco
de diversos tratamientos oncogénicos. Finalmente se ha asociado también a cáncer de estómago,
neuroblastoma y ovario (Liu et al., 2010). A diferencia de los antígenos mencionados hasta
ahora CA125 es el único que se ha relacionado fuertemente con cáncer de ovario. Fue ocupado
por mucho tiempo como biomarcador de la enfermedad, sin embargo, con el paso de los años,
se ha sugerido que su presencia en la sangre puede ser modificado por otras enfermedades y
también depende de la etapa del ciclo menstrual que se encuentre la paciente. Actualmente, hay
diversos estudios clínicos de terapias e inmunoterapias que utilizan como blanco la proteína
CA125 (Felder et al., 2014). La proteína CEA (Antígeno Carcino Embrionario), se presenta
normalmente en estadios temprano de desarrollo embrionario, sin embargo, en algunos tipos de
cáncer como colon, su expresión se vuelve a activar. Survivina es una proteína que posee una
estrecha relación con el ciclo celular, debido a que es capaz de inhibir la apotosis uniéndose a
caspasa 3 y 7 y de esta forma evitar la ruptura del DNA (Liao et al., 2013). Por otra parte la
familia de antígenos MAGE, BAGE y GAGE son antígenos asociados a tumor que se suelen
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expresar en carcinoma de mama, melanoma y colon, además se presentan en complejo de mayor
histocompatibilidad de clase 1 a linfocitos citotóxicos (Zhang et al., 2010).
3.4. Inmunoevasión del cáncer de ovario
El cáncer de ovario es capaz de emplear numerosas estrategias para suprimir
efectivamente la inmunidad anti-tumoral. Múltiples estudios han demostrado que la generación
de respuestas linfocitarias, capaces de montar una respuesta temporal contra el carcinoma de
ovario, constantemente son controladas por factores inmunosupresores, además, de condiciones
presentes en el microambiente tumoral (Cornejo-Garcia et al., 2004; Barnett et al., 2005;
Cubillos-Ruiz et al., 2009).
Las neoplasias agresivas, como el cáncer de ovario, son capaces de inducir inflamación
local y sistémica a través de miolopeiesis de emergencia, proceso que media la rápida expansión
y movilización de células mieloides. Este mecanismo es crítico para combatir infecciones
bacteriales y virales en respuesta a citoquinas inflamatorias, sin embargo, los tumores explotan
este proceso para promover el “hominng” de progenitores mieloides a tejidos linfáticos y
también hacia el tumor (Ostrand-Rosenberg et al., 2009; Gabrilovich et al., 2012). Las -
defensinas secretadas por las células tumorales epiteliales del ovario reclutan precursores de
DCs hacia el microambiente tumoral gracias al receptor de quimioquina 6 (CCR6) (Cornejo-
Garcia et al., 2004). La sobreexpresión del factor de crecimiento vascular endotelial A (VEGF-
A) por el tumor, transforma las poblaciones de DCs que reclutadas en células pro angiogénicas
que facilitan la vascularización tumoral y crecimiento de este. Estás DCs son capaces de captar
señales derivadas del tumor y expresar relativamente altos niveles de moléculas co-
estimuladoras, sin embargo, poseen una capacidad de presentación antigénica deplorable y una
potente actividad inmunosupresiva, evitando la activación local y expansión de linfocitos
intratumorales capaces de montar una respuesta anti-tumoral (Scarlett et al., 2009; 2012).
Debido a estas particulares funciones, las DCs asociadas al cáncer de ovario han sido
clasificadas como reguladoras/tolerogenicas/disfuncionales (Cubillos-Ruiz et al., 2017). En
modelos murinos, se ha visto que la depleción in vivo de DCs CD11c+, retrasa la progresión del
cáncer de ovario, reduciendo la angiogénesis tumoral mientras, en conjunto, se realiza
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transferencia adoptiva de linfocitos T antitumorales, lo que finalmente gatilla la regresión
tumoral (Huarte et al., 2008; Scarlett et al., 2012).
Otra forma en que el cáncer epitelial de ovario es capaz de evadir el sistema inmune es
a través del complejo PD-1/PD-L1. El receptor PD-1 se expresa tanto en linfocitos T como B,
células NKT, monocitos activados y células dendríticas. PD-1 posee 2 ligandos biológicos: PD-
L1 y PD-L2. La unión de estas moléculas a su receptor resulta en la fosforilación de tirosinas
intracelulares en complejos ITIM y ITSM que al unirse a SHP-1 y SHP-2 conllevan señales
inmunosupresoras que afectan a los linfocitos reduciendo sus niveles de activación,
diferenciación y modificando la expresión de Bcl-XL, complejo importante en la regulación de
la apoptosis. PD-L1 es frecuentemente expresado por linfocitos activados, DCs, NK,
monocitos/macrófagos y células endoteliales vasculares activadas, entre otras. La expresión de
este ligando también se encuentra en carcinoma de pulmón, ovario, colon y melanoma (Dong et
al., 2002). Por otro lado, existe actividad linfocitaria que desencadena la producción de IFN-γ,
la que comúnmente ejerce un efecto antitumoral, sin embargo, promueve también la regulación
de PD-L1 en células tumorales promoviendo así la progresión tumoral.(Abico et al., 2015)
Los checkpoints inmunológicos, correspondientes a vías inhibitorias, resultan
necesarios para mantener la tolerancia a antígenos propios, modular la duración y amplitud de
las respuestas inmunes fisiológicas. Sin embargo, los tumores utilizan estratégicamente estas
moléculas para evadir la respuesta linfocitaria antitumoral (Pardoll et al., 2012). Recientemente,
anticuerpos terapéuticos dirigidos contra CTLA-4 y la proteína de muerte programada celular-
1 (PD-1), dos checkpoints inmunológicos muy relevantes, inducen respuestas clínicas efectivas
en un grupo de pacientes con melanoma y cáncer de pulmón (Sharma and Allison., 2015). La
transferencia adoptiva de linfocitos T reactivos contra tumor ha mostrado también inducir
respuestas antitumorales bastantes robustas que llevan al control de tumores incurables con otros
tratamientos. Desafortunadamente, la tasa de respuesta en pacientes tratados con bloqueantes de
checkpoints es menos del 15% en cáncer de ovario (Hamanishi et al., 2015) y las
inmunoterapias de trasferencia adoptivas también han resultado poco efectivas en este tipo de
cáncer (Kershaw et al., 2006). Además, las pacientes con cáncer de ovario parecieran ser
refractarias a vacunas terapéuticas basadas en la transferencias DCs autólogas cargadas con
antígenos (Kandalft et al., 2013)
10
3.5. Inmunoterapia en cáncer de ovario
Un amplio abanico de inmunoterapias se ha probado para el tratamiento de carcinoma
ovárico. Hasta la fecha, en el Instituto Nacional de Salud de US (National Institute of Health of
the US), hay alrededor de 60 ensayos clínicos basados en inmunoterapias para tratar pacientes
con cáncer de ovario (www.clinicaltrials.gov).
Las primeras inmunoterapias utilizadas fueron las citoquinas recombinantes; desde los
años 80´s, interferón alfa ha sido probado para el tratamiento de estos pacientes (Einhorn et al.,
1982; Freedman et al., 1983; Berek et al., 1985), pero con resultados contradictorios.
Actualmente, para el tratamiento del carcinoma de ovario se están probando diferentes
anticuerpos monoclonales, como el Catumaxomab, dirigido contra la molécula de adhesión
celular epitelial (EpCAM), que es sobreexpresada en las células del carcinoma de ovario;
Abagovomab y Oregovomab, son moléculas que reconocen a CA-125, la que es sobreexpresada
en células cancerígenas; Daclizumab y Ontack que son anticuerpos anti CD25, presente en
linfocitos T reguladores; y finalmente Ipimilumab que es un anticuerpo anti CTLA-4, molécula
capaz de inhibir las respuestas efectoras de los linfocitos T (Tse et al., 2013). Este último
acercamiento ha mostrado resultados contradictorios (Hardwick et al., 2016). Debido a los
resultados variables y el alto costo de estas aproximaciones, la investigación de nuevas terapias
inmunes o combinaciones de ellas, continúan en investigación activa.
Las terapias basadas en células dendríticas tienen el potencial de generar una respuesta
antitumoral a través de la activación de linfocitos T (Vasaturo et al., 2013) y se han aplicado
sobre diferentes tipos de tumores (Banchereau et al 2005), como melanoma y cáncer de próstata
(López et al, 2009, Aguilera et al, 2011, Reyes et al., 2013). El grupo de Jialin Gong en el 2000,
realizó uno de los primeros ensayos con vacunas de células dendríticas. El estudio mezcló
células de cáncer de ovario con DCs autólogas resultando en la formación de
thererokaronocitos, los cuales expresaban el antígeno CA-125 y moléculas co-estimuladoras
clásicas de DCs. Las células fusionadas lograron estimular la proliferación de linfocitos T
autólogos e inducir actividad citotóxica (Gong et al., 2000). Por otro lado, Brossart (Brossart et
al 2000), utilizó DCs autólogas cargadas con HER-2/neu o péptidos derivados de MUC-1 en 10
pacientes que padecían cáncer de ovario y cáncer de mama. En 5 de los 10 pacientes, los
11
linfocitos citotóxicos péptido específicos (CTLs) fueron detectados en la sangre periférica y
pudieron responder contra células tumorales, ya sea produciendo IFN- o bien induciendo
citotoxicidad ex vivo contra células cancerígenas.
Otro interesante acercamiento ha sido el uso de lisados de tumores autólogos o
alogénicos, como fuente de maduración y de antígenos para las DCs. En el presente, un ensayo
clínico de fase I/II basado en DCs cargadas con lisados tumorales autólogos se utilizó una terapia
anti-angiogénica (Bevacizumab). A través de esta combinación, se buscó incrementar la
eficiencia clínica de la vacuna basada en DCs para el tratamiento de pacientes de cáncer de
ovario (Kandalaft et al., 2013). Por otra parte, Baek y cols, están actualmente tratando 10
pacientes con cáncer epitelial de ovario, usando DCs autólogas cargadas con lisado tumoral
autólogo y el adyuvante KLH. Después de cada inoculación de DCs, adicionan IL-2 por 14 días
consecutivos, como un adyuvante inmune. En 3 de los 10 pacientes estudiados se vio remisión
completa (Baek et al., 2015). Por último, en un estudio clínico de 25 pacientes (Tanyi, et al.,
2018) demostró que la inmunoterapia basada en DCs cargadas con lisado autólogo en conjunto
con Bevacizumab (anti-VEGF) y bajas dosis de ciclofosfamida ,extendió por 2 años la sobrevida
de las pacientes tratadas, en comparación a aquellas que solamente recibieron DCs y
Bevacizumab. Según estas evidencias, pareciera ser que la inmunoterapia basada en células
dendríticas podría ser capaz de romper la tolerancia del microambiente tumoral de ovario si es
que llegase a ser sumamente efectiva, de no serlo necesitaría ser administrada en conjunto con
otro acercamiento terapéutico.
3.6. Inmunoterapia basada en células dendríticas maduradas con lisados antigénicos
tumorales
Desde hace ya más de 10 años, nuestro laboratorio ha desarrollado una inmunoterapia
autóloga dirigida contra melanoma maligno, denominada TAPCells (Tumor Antigen Presenting
Cells). El método consiste en utilizar DCs generadas ex vivo y cargarlas con lisados de
melanoma alogénicos, con el fin de lograr la activación específica del sistema inmune de los
pacientes, logrando en una gran mayoría de los casos generar una respuesta antitumoral efectiva
(Schadendorf et al., 2006; You et al., 2007; López et al., 2009; Kim et al., 2014).
12
En el año 2009 nuestro laboratorio finalizó el primer ensayo clínico de fase I/II utilizando
células dendríticas cargadas con lisados de melanoma alogénicos, denominadas TAPCells, con
el fin de activar el sistema inmune de pacientes con melanoma avanzado (López et al., 2009;
Aguilera et al., 2011). En este estudio que involucró a 50 pacientes, se observó ausencia de
reacciones adversas y un aumento de la mediana de sobrevida de los pacientes en comparación
con los datos históricos (López et al., 2009).
Una forma de evaluar la respuesta favorable a la terapia empleada, es mediante la
respuesta de hipersensibilidad retardada contra antígenos tumorales (DTH) que indica el
desarrollo de memoria inmunológica in vivo. A raíz de este análisis, hemos podido diferenciar
dos grupos de pacientes, un grupo que genera memoria inmunológica contra antígenos
tumorales luego de las inoculaciones de DCs, el que hemos denominado respondedores (DTH+)
y otro grupo que no genera memoria inmunológica contra antígenos tumorales y que
denominamos no respondedores (DTH-). El 60,98% de los pacientes tratados son
respondedores, mientras que el 39,02% son no respondedores. Clínicamente, ambos grupos
difieren en que aquellos respondedores mostraron una sobrevida tres veces superior (33 meses)
respecto del grupo no respondedor (11 meses). En este último grupo de pacientes hemos
establecido un elevado y sostenido aumento en la proporción de linfocitos T reguladores TH3,
productores del factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) (López et al., 2009). Estos
prometedores resultados se han mantenido sin variaciones, al analizar más de 300 pacientes con
melanoma avanzado tratados con esta terapia.
Adicionalmente hemos observado que TRIMEL, no sólo otorga antígenos necesarios
para la activación de una respuesta inmune antitumoral específica, sino que también DAMPs,
elementos fundamentales para la adecuada maduración de las TAPCells, favoreciendo una
respuesta antitumoral efectiva (López et al., 2009; González et al., 2014). En este aspecto, en el
año 2011, se caracterizó que TRIMEL posee diversos DAMPs, entre ellos calreticulina y la
proteína “High Motility Group Box 1” (HMGB1), que están involucrados en la maduración de
TAPCells, en su capacidad de presentación cruzada y además, en el favorecimiento de la
secreción de IFN- proveniente de los linfocitos T activados (Aguilera et al., 2011; González et
al., 2014). Estudios similares han sido desarrollados en lisados provenientes de cáncer de
próstata y cáncer de vesícula biliar (Reyes et al 2013; Rojas et al 2018).
13
Los lisados tumorales, además de contener una fuente relevante de antígenos tumorales,
son una fuente importante de DAMPs, que incluyen la secreción de ATP, HMGB1, DNA-RNA
mitocondrial y la exposición de calreticulina, F-actina, y ribonucleoproteínas, entre otros
(Zitvogel et al., 2010). En este contexto, nuestros resultados indican que mediante un
tratamiento de shock térmico, es posible detectar la presencia de calreticulina, HMGB1 y ATP
en TRIMEL (Aguilera et al., 2011; Rojas et al 2018), señales necesarias para la inducción de
una eficiente respuesta inmune adaptativa antitumoral. Reportes recientes indican que el tipo de
muerte inducida, es decir la forma en que estos lisados condicionados son desarrollados,
particularmente la necroptosis de las células tumorales, es esencial para una respuesta
antitumoral eficaz (Aaes et al., 2016). Asimismo, Alberts y colaboradores muestran que la
coordinación entre las señales inflamatorias y el tipo de muerte celular inducida son importantes
para coordinar la respuesta inmune generada (Yatim et al., 2015). Nuestros datos indican que
los estímulos utilizados durante proceso de generación de los lisados tumorales resulta un punto
crítico para definir su inmunogenicidad (Aguilera et al., 2009; Rojas et al., 2018). Por lo tanto,
no todos los lisados tumorales son iguales, ni se les puede atribuir una eficacia a priori. Es
importante desarrollar estudios que nos permitan caracterizar y optimizar lisados tumorales cada
vez más eficaces para mejorar las estrategias terapeúticas basadas en DCs.
El cáncer de ovario es una enfermedad que afecta a un porcentaje importante de mujeres
en nuestro país, además, no posee alternativas de tratamiento eficaz una vez metastizado.
Debido a la larga experiencia que nuestro laboratorio tiene en inmunoterapia celular en
melanoma y el cáncer de próstata, creemos que podemos expandir está estrategia al tratamiento
de cáncer de ovario.
14
4. HIPOTESIS
Lisados celulares de cáncer de ovario sometidos a estrés térmico, poseen señales de peligro que
inducen la maduración de células dendríticas derivadas de monocitos humanos, generando la
activación de linfocitos T reactivos a células tumorales de ovario.
5. OBJETIVO GENERAL
Estudiar el efecto de los lisados celulares de cáncer de ovario, en la capacidad de células
dendríticas humanas de estimular linfocitos T reactivos contra este tipo de cáncer.
6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1.- Caracterizar la expresión de antígenos tumorales en líneas celulares de cáncer de ovario.
2.- Caracterizar la expresión de DAMPS en líneas celulares de cáncer de ovario al ser
sometidas a estrés térmico.
3.- Caracterizar fenotípica y funcionalmente DCs, derivadas de monocitos humanos, al ser
activadas con distintos lisados celulares derivados de cáncer de ovario.
4.- Evaluar la capacidad de las DCs generadas de monocitos para activar linfocitos T reactivos
contra cáncer de ovario.
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7. MATERIALES Y MÉTODOS
Líneas celulares de cáncer ovárico y generación de lisados: Se utilizaron las líneas comerciales
de cáncer ovárico: HEY, SKOV-3, A7280 y CAOV3 las cuáles fueron donadas por el Dr. Garett
Owen, Pontificia Universidad Católica, Chile.
Las líneas fueron cultivadas en medio de cultivo DMEM (Corning, USA) suplementado con
10% de SFB y 1% de antibióticos de amplio espectro (penicilina 100U/L, estreptomicina
100μg/ml), en botellas de cultivo de 175 ml, hasta una confluencia de un 85% aproximadamente.
Posteriormente, fueron cosechadas usando PBS/EDTA0.05% (Corning, USA), lavadas con
buffer PBS 1X y cuantificadas utilizando una cámara de Neubauer.
Para la elaboración de lisados individuales de las líneas HEY, SKOV-3, A7280 y CAOV-3 se
llevaron a una concentración final de 4x106 células/ml en AIM-V (Thermo Fisher Scientific,
USA). Estos lisados se guardaron en criotubos (Thermo Fisher Scientific, USA) hasta su uso.
Posteriormente, las células fueron sometidas a estrés térmico (Heat Shock), con el objetivo de
inducir una mayor expresión de DAMPs. Este proceso se realizó incubando las células a 42° C
por 1 hora y posteriormente a 37°C por 2 horas en un baño termorregulado. Luego de inducir el
estrés térmico, son lisadas mediante ciclos de congelación y descongelación en nitrógeno
líquido y 37°C respectivamente. En el caso de las Mezcla de Lisados Ovario 1 y Mezcla de
Lisado Ovario 2 (MLOV1 y MLOV2) se procedió en adicionar en partes iguales las líneas
CAOV3, SKOV-3 y HEY ó A2780 respectivamente (concentración final de 4x106 células/ml)
para luego continuar de la forma previamente descrita.
La concentración proteica fue cuantificada, mediante el método colorimétrico de micro
Bradford utilizando un espectrofotómetro (Eppendorf, USA). Los lisados obtenidos, fueron
guardados a -20°C hasta su uso.
Expresión de antígenos tumorales en líneas celulares de cáncer de ovario: La caracterización de
los marcadores tumorales en las distintas líneas celulares se realizó mediante citometría de flujo
en el citómetro BD FACSVerse (BD bioscience, USA) utilizando los anticuerpos monoclonales
anti-CEA (clon COL-1, Thermo Fisher Scientific, USA), MUC-1 (clon HMFG1, Abcam, USA),
c-erbB2 (clon 3B5, Thermo Fisher Scientific, USA), CA125 (clon SPM110, Abcam, USA) y
16
survivina (clon 8E2, Thermo Fisher Scientific, USA). Para los marcajes extracelulares (MUC-
1 y CA125), las células fueron despegadas de las botellas de cultivo e incubadas con los
respectivos anticuerpos por 30 min a 4°C en oscuridad, posteriormente se lavaron y se incubaron
por el mismo periodo de tiempo con un anticuerpo secundario anti-IgG (clon G18-145, BD
Pharmingen). Finalmente, las células fueron centrifugadas a 2600 rpm por 6 min, y re-
suspendidas en 300 l de PBS+2% SFB para su adquisición en el citómetro de flujo. Incluimos
como controles positivos, líneas celulares de distinto origen que expresen los antígenos
mencionados. Para CEA, c-erbB2, Survivina, MAGE, GAGE y BAGE. Para CEA, c-erbB2 y
survivina, se realizó un marcaje intracelular. Para esto, las células se permeabilizaron con Buffer
Fix/Perm (BD bioscience, USA) por 30 min a 4°C y oscuridad. Luego las células se lavaron y
centrifugaron a 3200 rpm por 8 min para posteriormente ser incubadas con el anticuerpo
primario y secundario según lo descrito en párrafo anterior. La determinación de la presencia
del ARNm asociado a los antígenos MAGE, GAGE y BAGE se realizó mediante RT-PCR
utilizando los siguientes partidores: sense 5’-CGGCCGAAGGAACCTGACCCAG-3’ y
antisense 5’- GCTGGAACCCTCACTGGGTFGCC-3’ para MAGE-1; sense 5’-
ATGCCTCTTGAGCAGAGGAG-3’ y antisense 5’-GAGCCCTCATCGGATTGTC-3’ para
MAGE-2; sense 5’-TGGAGGACCAGAGGCCCCC-3’ y antisense 5’-
GGACGATTATCAGGAGGCCTGC-3’ para MAGE-3; sense 5'-
GACCAAGACGCTACGTAG-3’ y antisense 5'- CCATCAGGACCATCTTCA-3’ para
GAGE-1/2 y sense 5'-TGGCTCGTCTCACTCTGG-3’ y antisense 5'-
CCTCCTATTGCTCCTGTTG-3’ para BAGE. Para esto, se extrajo ARN total de las células
utilizando el reactivo TRIzol (Life Technologies, USA) de acuerdo a las instrucciones del
fabricante. A partir del ARN extraído, se sintetizo ADN complementario usando el kit First
strand cDNA síntesis (Roche, SW). Posteriormente y utilizando los partidores antes
mencionados se procedió a amplificar las secuencias mediante PCR convencional.
Determinación de expresión de calreticulina en líneas celulares de cáncer de ovario: Las células
fueron centrifugadas y recolectadas anterior y posterior al shock térmico descrito anteriormente.
Se realizaron tinciones extra celulares como intracelulares ocupando un anticuerpo primario
anti-calrreticulina (Abcam, USA) conjugado a un secundario IgG APC. La tinción intracelular
se realizó con el buffer de tinción intracelular (eBiosciences, USA). Posterior a la incubación
17
con los anticuerpos, las células se resuspendieron en l de buffer FACS y fueron analizadas
en el citómetro de flujo FACSverse (BD Biosciences, USA). Los resultados fueron analizados
usando el programa FlowJo 8.7 y expresados tanto en forma de dotplots, como de histograma
para la intensidad media de fluorescencia de las moléculas analizadas.
Determinación de liberación de HMGB1 en Líneas celulares de cáncer de ovario: Para su
cuantificación se utilizó un kit de ELISA de HMGB1 (IBL International), utilizando el
sobrenadante previo y posterior al shock térmico de cada una de las líneas celulares: SKOV-3,
A2780, HEY, CAOV-3 y como control la línea MEL2 al ser sometidas al estrés térmico. En una
placa de microtitulación, se agregó 10 µL de cada estándar, el control positivo y sobrenadante
y se incubó por 24 horas a 37°C. Al día siguiente, se lavó la placa con el buffer de lavado y se
incubó con el conjugado enzimático por 2 horas a 25°C. Se lavó nuevamente la placa y se incubo
con la solución de color por 30 min a 25°C. La reacción del color se detuvo con la solución de
stop y se midió la densidad óptica en un espectrofotómetro a 450 nm. La concentración de
HMGB1 en el sobrenadante se determinó a partir del análisis de la curva estándar.
Generación de células dendríticas humanas: Se obtuvieron Buffys Coats desde donante sanos,
previo consentimiento informado, a través del convenio con el banco de sangre del Hospital
Metropolitano de Santiago. Desde los Buffys Coats se extrajo células mononucleares de sangre
periférica (Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC), mediante una separación por
gradiente con Ficoll-Hypaque (Axis-Shield, Oslo, Norway). Éstas se cultivaron en placas de
seis pocillos (Becton Dickinson, Hershey) a 37°C y 5% de CO2, a una densidad de 2-4 x 107
células/mL de medio de cultivo AIM-V (Thermo Fisher Scientific, USA), por dos horas. A
continuación se retiró el sobrenadante que contiene linfocitos de sangre periférica (Peripheral
Blood Lymphocytes, PBL), manteniendo las células adherentes, monocitos, las que fueron
incubadas a 37°C con 5% de CO2, adicionando medio de cultivo AIM-V(Thermo Fisher
Scientific, USA), enriquecido con 500 U/ml de rh-IL-4 (USBiological) y 800 U/ml de rhGM-
CSF (USBiological). Al segundo día de cultivo, las células fueron estimuladas, por 24 horas,
con los distintos estímulos para obtener las diferentes células dendríticas a analizar. Para evaluar
el efecto de los lisados condicionados con estrés térmico de las líneas HEY, SKOV-3, A2780 y
CAOV3 en las DCs, éstas se estimularon con 10, 100 y 200 μg/ml de cada línea celular
mencionada. Para evaluar el efecto de las mezclas de lisados 1 y 2 (MLOV1 y MLOV2) se
18
estimularon las DCs con 100 ug/ml de cada estimulo. Otro grupo de DCs fueron estimuladas
con 100 μg/ml de TRIMEL y 10 μg/ml de TNF- como control positivo de maduración de
células dendríticas (TAPCells) además del control positivo madurado con LPS 10 ng/ml (LPS).
En un pocillo no se agregó ningún estímulo de maduración con el objetivo de obtener células
dendríticas inmaduras (iDC). En otro pocillo se adicionó al día 1 y al día 2 dexametasona para
generar el control negativo de células dendríticas tolerogénicas (Tol DCs). Finalmente, las
células dendríticas fueron recolectadas y contadas con cámara Neubauer.
Caracterización fenotípica de células dendríticas: Las células dendríticas fueron caracterizadas
fenotípicamente mediante citometría de flujo. Brevemente las distintas condiciones (iDC, Tol
DCs, TRIMEL DCs, LPS y HEY DCs, SKOV3 DCs, A2780 DCs CAOV3 DCs, MLOV1 y
MLOV2) fueron lavadas con PBS 1X e incubadas por 30 minutos a 4°C, con los siguientes
anticuerpos monoclonales (AcMo): anti-CD11c conjugado con (Allophycocyanin, APC
eBioscience, USA); anti-HLA A, B, C, anti-HLA DR, DQ, DP, anti-CCR7 (conjugado a PE,
eBioscience, USA) y anti-CD86 conjugado con isotiocianato de fluoresceína
(Fluoresceinisothiocyanate, FITC), anti-CD83 conjugado a PECy7, CD80 conjugado a FITC
(eBioscience, USA), anti-PDL1 conjugado a APC (eBioscience, USA) y CD40 ( FITC,
eBioscience, USA) . Luego éstas fueron lavadas con PBS 1x para eliminar el exceso de
anticuerpo y finalmente las células se resuspendieron en 300 l de buffer FACS y se analizaron
en el citómetro de flujo FACSverse (BD Biosciences, USA). Los resultados fueron analizados
usando el programa FlowJo 8.7 y fueron expresados tanto en forma de dotplots, como de
histograma para la intensidad media de fluorescencia de los distintos marcadores.
Co-cultivos DC: linfocitos alogénicos: Los co-cultivos alogénicos entre DCs, previamente
estimuladas y PBL (proveniente de buffy coats), se realizaron en RPMI suplementado con 10%
SFB y 1% PS por 5 días en placas de 48 pocillos en una relación DCs: PBL de1:10 y a una
concentración de 1x106 células/mL. Al quinto día de co-cultivo, las células fueron estimuladas
por 4 horas con Acetato Miristato de Forbol (Phorbol Myristate Acetate, PMA)/ Ionomicina y
Golgi Stop (eBioscience, USA) para posteriormente, analizar la inducción de distintos perfiles
de linfocitos TH a partir del contacto con las DCs, mediante citometría de flujo.
19
Caracterización de las poblaciones linfocitarias alogénicas: Los linfocitos obtenidos de los co-
cultivos alogénicos, previamente descritos, fueron estimulados con Acetato Miristato de Forbol
(Phorbol Myristate Acetate, PMA) (25ng/ml) / Ionomicina (1μg/ml) y 1 μg/ml de Golgi Stop
(eBioscience, USA) durante 4 horas. Posteriormente, se evaluó las poblaciones linfocitarias
efectoras por citometría de flujo. Para esto, se incubó 1x106 células con Human TH1/TH2/TH17
Phenotyping Kit, el que consta de Fixation Buffer, BD Perm/WashTM Buffer y los anticuerpos
anti-CD4 Percp Cy5.5, anti-IL-4 APC, anti-IFN- FITC, anti-IL17a PE y se adicionara anti-
CD8 APC-h7 (eBioscience, USA).Como control de isotipo se utilizará IgG1 de ratón conjugado
con FITC, PE, PerCPCy5.5 y con APC (eBioscience, USA). Las células muertas se descartaron
con la utilización de Live/Dead AQUA (Lifes Technologies, USA). Finalmente las células
fueron analizadas en el citómetro de flujo FACSVerse (BD Biosciences, USA). Los resultados
se evaluaron usando el programa FlowJo 8.7 y fueron expresados tanto en forma de dotplots,
como de histograma para la intensidad media de fluorescencia de los distintos marcadores.
Co-cultivos autólogos DCs - linfocitos: Linfocitos de sangre periferica proveniente de donantes
sanos, fueron co-cultivado de forma autóloga con distintos tipos de células dendríticas autólogas
generadas de la forma que se vio anteriormente en razón 10:1 en placa de 48 pocillos, con RPMI
10% SFB, 1% PS y, además, suplementado con 150 UI/ml de rhIL-2 por 7 días. El PBL fue re-
estimulado con las mismas DCs que fueron co-cultivados anteriormente en una razón 10:1
(Linfocitos: DCs) por un ciclo adicional de 7 días. Al cabo de cada ciclo, se contó por cámara
Neubauer la cantidad de linfocitos y viabilidad de las distintas muestras. Posteriormente se
separaron las poblaciones CD4+ y CD8+ por tecnología “Cell Sorting”. También se evaluó el
grado de activación de linfocitos T CD4+ y T CD8+ a través de la incubación con anticuerpos
anti-CD25 FITC (eBioscience, USA) y su posterior análisis en el citómetro FACSverse (BD
Biosciences, USA). Los resultados fueron analizados usando el programa FlowJo 8.7 y se
expresó tanto en forma de dotplots, como de histograma para la intensidad media de
fluorescencia de los distintos marcadores.
Secreción de IFN-por linfocitos CD4+ estimuladas por DCs autólogas: Para determinar la
frecuencia de linfocitos CD4+, pre co-cultivados con DCs cargadas con mezcla de lisado de
líneas celulares de ovario, capaces de secretar IFN- al reconocer líneas celulares de cáncer de
ovario, se generó un enriquecimiento de linfocitos CD4+ desde los co-cultivos autólogos de PBL
20
con DCs a través de la tecnología “cell sorting” ocupando el anticuerpo anti- CD4 FITC
(eBioscience, USA). De forma paralela durante la noche, se recubrieron las placas ELISPOT
con mAb IFN-γ (BD Biosciences, USA). También se trataron las líneas celulares que fueron las
células blanco del experimento (HEY, CAOV3, MEL 1, K562) con 500 Ui/ml de IFN-γ. El día
del ensayo, la placa se lavó con PBS, se bloqueó la reactividad inespecífica con PBS/BSA al
1% por 2 h a 37°C. Posteriormente se generó el co-cultivo entre las distintas condiciones de
linfocitos CD4+ y las diversas líneas celulares previamente mencionadas, las cuales fueron
tratadas con IFN-γ en una relación 10:1 y 5:1 en un volumen final de 200µl por pocillo. La placa
se incubó a 37°C por 24 h para luego ser lavada con PBS/Tween al 0,05% e incubada con un
anticuerpo secundario biotinilado específico para el IFN-γ unido a 4°C por 2 h. Finalmente la
placa fue lavada e incubada con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina a temperatura
ambiente por 1 h. Una vez que se desarrolle el color de la fosfatasa alcalina, las células
formadoras de puntos (CFP) fueron cuantitativamente analizadas usando un lector de placa de
ELISPOT (BD Biosciences, USA).
Ensayo de citotoxicidad mediado por linfocitos CD8+: Con el fin de poder cuantificar la
actividad citotóxica de los linfocitos CD8+, co-estimulados autologamente con DCs cargadas
con las mezclas de lisado de cáncer de ovario, frente a líneas celulares de cáncer de ovario, se
generó un enriquecimiento de linfocitos CD8+ desde los co-cultivos autólogos de PBL con DCs
a través de la tecnología “cell sorting” ocupando el anticuerpo anti-CD8 PE (eBioscience, USA).
Se generaron co-cultivos de linfocitos CD8+, previamente co-estimulados con las distintas DCs
anteriormente descritas, con las diferentes líneas celulares blanco (HEY, CAOV3, Mel 1, K562),
las cuales, fueron tratadas previamente con 500Ui/ml de IFN-γ por toda la noche. El co-cultivo
fue realizado en medio de cultivo RPMI suplementado con 5% SFB y 1%PS con un volumen
final de 150µl, con un periodo de incubación de 5 h. Al finalizar el co-cultivo se procedió a
evaluar el efecto citotoxico de los linfocitos CD8+ mediante el kit “Cytotox96 Non-Radioactive
Cytotoxicity Assay” (Promega, USA) con el cual se procedió según las especificaciones del
fabricante. Finalmente para determinar el % de citotoxicidad se ocupó la siguiente formula:
% 𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 = (𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙−𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑡𝑎𝑛𝑒𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟−𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑡𝑎𝑛𝑒𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜
𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜−𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑡𝑎𝑛𝑒𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜)x 100
21
Análisis Estadístico: Los resultados obtenidos fueron analizados con el programa
GraphPadPrism 5, utilizando como medida de comparación el porcentaje de células positivas y
la intensidad media de fluorescencia para los distintos marcadores. Se utilizó test t student ó
one-way ANOVA para realizar las comparaciones entre las condiciones, considerando como
significativo un p-value<0,05, utilizando significancia estadística con una cola y un intervalo de
confianza del 95%. Los resultados fueron expresados en media ± desviación estándar.
22
8. RESULTADOS
8.1. Lisados sometidos a estrés térmico obtenidos desde líneas de cáncer de ovario
contienen antígenos asociados al carcinoma de ovario y elevan producción de DAMPS.
En esta investigación se trabajó con 4 líneas celulares de cáncer de ovario: HEY,
SKOV3, A2780 y CAOV3, sobre las cuales caracterizamos parte de los antígenos reportados
para cáncer de ovario. Debido a que los antígenos seleccionados se han descrito tanto para líneas
celulares de cáncer de ovario como para los tumores de ésta patología, la elección de estas líneas
se basó en la expresión de antígenos necesarios para direccionar la respuesta inmune a la
eliminación del tumor.
La expresión de los antígenos: CEA, ERB2, Survivina, MUC1 y CA125 fueron medidas
por citometría de flujo (figura 1 A). La proteína CEA se evaluó, al igual que los otros antígenos,
en 6 líneas tumorales siendo SW480 (adenocarcinoma de colon) y Mel 2 (melanoma) controles
de expresión. La expresión de CEA fue mayor en la línea A2780 en comparación a HEY,
SKOV3 y CAOV3. Respecto de éstas últimas 3 líneas, no hay diferencias significativas en la
expresión de esté antígeno. La detección del antígeno ERB2 mostró niveles similares de
expresión en HEY y SKOV3, las cuales a su vez poseen una mayor expresión de esta proteína
en comparación con A2780 y CAOV3. Survivina se encontró en todas las líneas evaluadas, sin
embargo, la línea que expresó los mayores niveles fue SKOV3. No se detectó diferencias
significativas entre HEY, A2780 y CAOV3. Finalmente, para los antígenos MUC1 y CA125,
solo la línea celular CAOV-3 mostró expresión de estas proteínas, lo que sugiere que esta línea
celular debe considerarse en la mezcla final debido a que es la única línea celular de cáncer de
ovario que expresa antígenos fuertemente asociados a esta enfermedad.
En B se muestra una tabla resumen de la expresión de mRNA por RT-PCR de los
antígenos Mage1, Mage 3, Bage y Gage 1-2. En conjunto, las líneas de ovario analizadas poseen
una pobre expresión de estos antígenos, a excepción de la línea celular HEY que mostró señal
positiva para la expresión de Mage 3, Bage y Gage 1-2 al compararla con el control positivo
correspondiente a la línea celular Mel1.
23
Luego de evaluar la presencia de antígenos asociados a carcinoma de ovario, estudiamos
si el estrés térmico, de 42°C durante 1 hora, era capaz de inducir los DAMPs HMGB1 y hCRT,
importantes para madurar eficientemente a las células dendríticas (Figura 2). La Figura 2A
muestra que tres (CAOV3, HEY y SKOV3) de las cuatro líneas celulares estudiadas,
translocaron significativamente hCRT hacia la membrana luego del estrés térmico. Sin embargo
no se encontraron diferencias significativa al comparar la línea celular A2780 con su control a
37°C (Figura 2A). En la Figura 2B, se grafica el resultado obtenido mediante ELISA al
cuantificar los niveles de HMGB1 presente en los sobrenadantes de los cuatro tipos de líneas
celulares analizadas luego del condicionamiento por estrés térmico. Sin embargo, no se encontró
diferencias significativas entre ellas. En ambos experimentos se ocupó la línea celular de
melanoma Mel 1 como control positivo.
24
Mel
2
A27
80Hey
Sko
v3
CAOV3
0
2
4
6
8
10
******
******
IMF
MU
C1
(No
rmalizad
o a
l co
ntr
ol)
Figura 1. Caracterización de antígenos y transcritos asociados a tumor en líneas celulares de
cáncer de ovario: A) Las líneas celulares de cáncer de ovario A2780, HEY, SKOV3 y CAOV3
fueron incubadas con los anticuerpos CEA, Erb2, Survivina, Muc1 y CA 125 con el fin de evaluar
mediante citometría de flujo la expresión en membrana de estas proteínas. B) La presencia de los
RNAm que codifican para antígenos asociados a tumor Mage 1 y 3; Bage; Gage 1 y 2, fue evaluada
mediante RT-PCR en las 4 líneas celulares de cáncer de ovario. Los datos corresponden al promedio
± SD. Experimentos con un = 3. *** = p<0.001; **= p< 0.01; *=p<0.05.
HEY SKOV3 A2780 CAOV-3
Mage 1 - - - -
Mage 3 + - - -
Bage + - + -
Gage 1,2 + - - -
SW
480
Mel
2Hey
A27
80
Sko
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***
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ol)
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Mel
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A27
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20
30
40
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*****
*
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SW
480
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A27
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***
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CA
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0
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10
15
20Control
Heat Shock*
*
**
***
HM
GB
1
(ng
/mL
)
B
Figura 2. El estrés térmico aplicado a las líneas de carcinoma de ovario aumenta los DAMPS
hCRT y HMGB1. Las distintas líneas fueron sometidas a estrés térmico con el fin de evaluar la
expresión de DAMPs producido por esta condición. La cuantificación del porcentaje de las células
que presentan calreticulina en membrana de las distintas líneas celulares (A), se realizó mediante
citometría de flujo ocupándose la línea MEL 1 como control positivo. La cantidad de HMGB1 (B)
en el sobrenadante de las líneas celulares después del acondicionamiento térmico fue cuantificada
por ELISA, ocupándose como control positivo la línea Mel 1. Los datos corresponden al promedio
± SD. Experimentos con un = 3. *** = p<0.001; **= p< 0.01; *=p<0.05.
26
8.2 Lisados sometidos a estrés térmico inducen la expresión de marcadores de
maduración de células dendríticas.
Como se ha observado, el estrés térmico aplicado a los lisados de carcinoma de ovario
indujo la producción/liberación de DAMPs, ligados fuertemente a la maduración de las células
dendríticas, como por ejemplo HMGB1. Por lo tanto, el siguiente paso fue evaluar la
maduración de células dendríticas (DCs) pulsadas con 10, 100 y 200 µg/ml de lisado por 24 h.
Una vez transcurrido el tiempo, analizamos mediante citometría de flujo la expresión de CD86,
CD80 y MHC-II mediante la intensidad media de fluorescencia (IMF, Figura 3).
En la Figura 3A se muestran “dot plots” representativos de la estrategia de selección de
la población a estudiar mediante citometría de flujo. Finalmente, dentro de la población de
células CD11c+ viables (de acuerdo a la ausencia del marcaje de viabilidad Live/Dead) se evaluó
el efecto de los cuatro lisados condicionados sobre las DCs. La Figura 3B muestra que el lisado
HEY indujo un aumento en la expresión de CD86 y CD80 de forma significativa a partir de los
100 µg/ml respecto de la condición sin estímulo, iDCs (DCs inmaduras). El lisado condicionado
de SKOV3 (Figura 3C) generó un aumento significativo de CD86 y CD80, como también de
MHC-II, a partir de los 100 ug/ml respecto de iDCs. El lisado condicionado de A2780 (Figura
3D), generó un aumento significativo de la expresión de CD86, CD80 y MHC-II. Finalmente,
el lisado condicionado de CAOV3 indujo sólo las moléculas co-estimuladoras CD86 y CD80
(Figura 3E).
Los cuatro lisados provenientes de las líneas de carcinoma de ovario sometidas a estrés
térmico, modificaron la expresión de moléculas de superficie de las DCs. Sin embargo, para
considerar una eficiente activación/maduración de las DCs, las mezclas finales de lisados deben
aumentar los niveles de MHC-II, ya que posee un rol significante en el proceso de presentación
cruzada de antígenos tumorales (Aguilera, et al., 2011), además de poder presentar antígenos a
linfocitos T CD4+. Por este motivo y a raíz de estos resultados, las líneas SKOV3 y A2780 serían
elementos fundamentales en la composición del lisado final, debido a que son las únicas que
inducen significativamente MHC-II y además, CD86 y CD80.
27
.
Figura 3. Lisados condicionados provenientes de líneas celulares de carcinoma de ovario
activan células dendríticas. A) Estrategia de selección de la población de células mediante
citometría de flujo. (B-E) Medición de la expresión de las moléculas CD86, CD80 y MHCII en DCs
maduradas con los lisados provenientes de HEY, SKOV3, A2780 y CAOV3, respectivamente. Los
datos corresponden al promedio ± SD. Experimento con n=4. **= p< 0.01; *=p<0.05.
A
iDC
TAPCells
10ug
/ml
100u
g/m
l
200u
g/m
l
0
1
2
3
4
**
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(iD
Cs)
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10ug
/ml
100u
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l
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Induction C
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iDC
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g/m
l
200u
g/m
l
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Fold
Induction M
HC
II
(iD
Cs)
B
iDC
TAPCel
ls
10ug/m
l
100u
g/ml
200u
g/ml
0
1
2
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ld In
du
cti
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CD
86
(iD
Cs)
iDC
TAPCel
ls
10ug/m
l
100u
g/ml
200u
g/ml
0
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2
3
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Fo
ld In
du
cti
on
CD
80
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Cs)
iDC
TAPCel
ls
10ug/m
l
100u
g/ml
200u
g/ml
0.0
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**
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ld In
du
cti
on
M
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II
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Cs)
C
iDC
TAPCel
ls
10ug/m
l
100u
g/ml
200u
g/ml
0.0
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2.5 **
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cti
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CD
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iDC
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10ug/m
l
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200u
g/ml
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cti
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80
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200u
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0.5
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old
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du
cti
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D
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iDC
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l
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g/ml
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du
cti
on
MH
C II
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Cs)
E
FSC FSC FSC
SSC
Live
/Dea
d
CD
11
c
28
8.3 DCs maduradas con lisados celulares sometidos a estrés térmico de carcinoma de
ovario, activan linfocitos CD4+ y CD8+
Basado en los resultados obtenidos en los puntos anteriores se generaron 2 mezclas de
lisados de carcinoma de ovario (MLOV): MLOV1 y MLOV2; con el fin de abarcar un mayor
número de antígenos, y posibles señales presentes en los lisados, que no fueron objeto de estudio
en este trabajo como por ejemplo otros DAMPs. La MLOV1 fue preparada con las líneas
celulares CAOV3, SKOV3 y HEY; mientras que MLOV2 fue compuesta con CAOV3, SKOV3
y A2780. La línea celular CAOV3 podría ser fundamental en las dos mezclas debido a que es la
única que presentó MUC1 y CA125, antígenos que están asociados a esta enfermedad. Además,
posee los DAMPs CRT y HMGB1 al ser estresada térmicamente. SKOV3, como se ha
mencionado, es otra línea que podría ser relevante en la composición de las mezclas debido a
que indujo MHC-II además de liberar altos niveles de HMGB1, por lo cual podría generar un
inducción de esta molécula mayor de histocompatibilidad como una correcta activación y
maduración en la célula dendrítica. HEY en MLOV1 entrega antígenos embrionarios (MAGE
3, BAGE y GAGE), de esta forma ampliamos los posibles antígenos que se puedan presentar.
En MLOV2, estuvo presente la línea A2780 que también indujo MHC-II, además, una
característica importante de esta línea, es que a diferencia de sus pares, posee un crecimiento
celular elevado, lo que resulta muy relevante para poder escalar esta tecnología a altas
cantidades de producción en el futuro.
Las DCs fueron estimuladas con 100 µg/ml de MLOV1 o MLOV2, y se estudió un panel
de marcadores de activación/maduración más amplio (Figura 4).
MLOV1 y MLOV2 indujeron significativamente la expresión de moléculas co-
estimuladoras CD80, CD83, CD86 y CD40 respecto de iDCs. Notablemente, este aumento fue
muy similar al control positivo canónico LPS y al control positivo de TAPCells, la cual
conforma la terapia de vanguardia del uso de lisados condicionados, aplicada por nuestro grupo
de investigación. Los MHCs I y II también fueron inducidos por ambas mezclas de forma
significativa llegando hasta 2 veces más intensidad de fluorescencia que el control de iDCs,
alcanzando niveles similares de inducción, respecto de TAPCells, el cual ha demostrado ser
clínicamente efectivo. La expresión del receptor de quimioquinas CCR7, asociado a la
29
migración de las DCs activadas hacia el linfonodo, aumentó de forma significativa luego de la
estimulación por ambas mezclas de lisados. Finalmente, la expresión del ligando de la proteína
de muerte programada 1 (PD-L1) también se incrementó luego de la estimulación por ambos
lisados, efecto que se suele gatillar naturalmente una vez que las DCs se activan.
Debido al conocimiento que se ha generado con los años de aplicación de terapias
antitumorales basadas en DCs cargadas con lisados de melanoma condicionados, por nuestro
grupo de investigación, esperamos que en este trabajo las DCs maduradas con lisados de cáncer
de ovario, activen linfocitos y los polaricen hacia células efectoras con capacidad anti-tumoral.
Para evaluar este punto, generamos co-cultivos alogénicos entre DCs y linfocitos por 5 días. Los
linfocitos resultantes se sometieron a citometría de flujo para cuantificar su activación tardía a
través de la expresión de CD25; como también sus perfiles efectores para LT CD4+ y CD8+.
La Figura 5A, muestra “dot plots” representativos de los linfocitos CD4+ seleccionados.
En la Figura 5B, vemos que ambas mezclas inducen un aumento en el porcentaje de células
CD25+, como también en la IMF, respecto del co-cultivo con iDCs. Las DCs maduradas con las
mezclas de lisados, aumentaron el número de linfocitos CD4+ IFN-γ+, en comparación, al co-
cultivo con iDCs. Sin embargo, no encontramos diferencias significativas en el porcentaje de
linfocitos CD4+ IL-17+ ni en poblaciones CD4+ IL-4+ (Figura 5C).
El efecto de las DCs, estimuladas con las mezclas de lisado de ovario, sobre el fenotipo
de los linfocitos CD8+ fue estudiado mediante citometría de flujo y la estrategia de selección
para la población a estudiar (Figura 6A), fueron linfocitos CD8+ en una selección previa de
células vivas CD3+ CD4- en donde se cuantificaron los porcentajes de células IFN-γ+, Perforina+
y Granzima B+, como también, su grado de activación mediante la expresión de CD25. El co-
cultivo entre DCs cargadas con la mezclas de lisados y los linfocitos, demostró que hubo un
mayor porcentaje de células que expresan CD25, en comparación al co-cultivo con iDCs (Figura
6B). Sin embargo, solo las DCs que fueron estimuladas con MLOV2 indujeron un incremento
significativo en la IMF de esta molécula (Figura 6B). En la Figura 6C se muestra que las DCs
estimuladas con MLOV1 y MLOV2, co-cultivadas con linfocitos CD8+, incrementaron
significativamente, respecto del co-cultivo con iDCs, el porcentaje de la población CD8+ IFN-
30
γ+; CD8+ Perforina+ ; y CD8+ Granzima B+, todos de forma similar a lo obtenido con controles
positivos: LPS y TAPCells.
En conjunto, estos resultados sugieren que ambas mezclas de lisados de líneas celulares
de cáncer de ovario fueron capaces de activar DCs y estas a su vez, entregaron señales
suficientes a los linfocitos para inducir linfocitos T CD4+ IFN- y, por otro lado, linfocitos
CD8+ IFN-γ+ Perforina+ Granzima B+.
31
Figura 4. Mezcla de lisados de líneas celulares de cáncer de ovario condicionados inducen
maduración de DCs. Células dendríticas fueron maduradas con los siguientes estímulos:
Dexametasona y TRIMEL (TOL DCs); LPS (LPS); Trimel y TNF- (TAPCells); lisados
condicionados de CAOV3, SKOV3 y HEY (MLOV1); lisados condicionados de CAOV3, SKOV3
y A2780 (MLOV2). Posteriormente se evaluó mediante citometría de flujo la expresión en superficie
de los marcadores CD80, CD83, CD86, CD40, MHCI, MHC II, CCR7 y PD-L1. Los datos
corresponden al promedio ± SD. Experimentos con n = 5. *** = p<0.001; **= p< 0.01; *=p<0.05.
iDC
Tol DCs
LPS
TAPCel
ls
MLO
V1
MLO
V2
0.0
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****
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***
***
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du
cció
n
(CD
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V1
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2
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LT
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MLO
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**
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CD
4+ I
FN
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LT
IDCs
TOLD
Cs
LPS
TAPCel
ls
MLO
V1
MLO
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0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
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% L
info
cit
os
CD
4+ I
L17
+
LT
IDCs
TOLD
Cs
LPS
TAPCel
ls
MLO
V1
MLO
V2
0
1
2
3
% L
info
cit
os
CD
4+IL
4+
Figura. 5. DCs maduradas con MLOV1 y MLOV2 activan linfocitos T CD4+ y promueven un
perfil predominantemente TH1. DCs maduradas mezclas de lisados fueron co-cultivadas con PBL
alogénico por 5 días. Finalmente, la activación y expresión de citoquinas por parte de los linfocitos
fue evaluada mediante citometría de flujo. A) Dots plot de citometría de flujo representativos sobre
el gate Vivas/ CD3+ (no mostrado). Histograma representativo (b) de la intensidad media de
fluorescencia (MFI) y su correspondiente cuantificación. C) Porcentaje de linfocitos CD4+ que
fueron activados por las distintas DCs en co-cultivo alogénico de 5 días. (D-F) Los perfiles
linfocitarios evaluados fueron TH1, TH17 y TH2 mediante la detección de expresión de las citoquinas
IFN-γ, IL-17 e IL-4, respectivamente, mediante citometría de flujo. Los datos corresponden al
promedio ± SD. Experimentos con un = 4. *** = p<0.001; **= p< 0.01; *=p<0.05.
IL-4
A
IFN
-
IL-1
7
LT
IDCs
TOLD
Cs
LPS
TAPCel
ls
MLO
V1
MLO
V2
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10
20
30
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*
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cit
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CD
4+ C
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+
LT
IDCs
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Cs
LPS
TAPCel
ls
MLO
V1
MLO
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0
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100
150
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*
IMF
CD
25
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D4
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B
C
FSC FSC FSC FSC
33
LT
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TolDCs
LPS
TAPCel
ls
MLO
V1
MLO
V2
0
5
10
15
20
**
**
% L
info
cit
os
CD
8+
Gra
nzB
+
Figura 6. DCs maduradas con MLOV1 y MLOV2 activan LT CD8+ e inducen una mayor
producción de agentes citotóxicos. DCs maduradas con mezclas de lisados fueron co-cultivadas
con PBL alogénico por 5 días. Finalmente, la activación y expresión de citoquinas por parte de los
linfocitos fue evaluada mediante citometría de flujo. A) Dots plot de citometría de flujo
representativos sobre el gate Vivas/ CD3+ (no mostrado). Histograma representativo (b) de la
intensidad media de fluorescencia MFI y su correspondiente cuantificación. C) Porcentaje de
linfocitos CD8+ activados por las distintas DCs en co-cultivo alogénico de 5 días. (D-F) Se evaluó
la expresión de IFN-γ, Perforina y Granzima B. Los datos corresponden al promedio ± SD.
Experimentos con un n = 6. *** = p<0.001; **= p< 0.01; *=p<0.05.
LT
IDCs
TolDCs
LPS
TAPCel
ls
MLO
V1
MLO
V2
0
10
20
30
40
*
*
*
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info
cit
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CD
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D25
+
LT
IDCs
TolDCs
LPS
TAPCel
ls
MLO
V1
MLO
V2
0
50
100
150
*
IMF
CD
25
(Lin
focit
os C
D8
+)
B
LT
iDCs
TolDCs
LPS
TAPCel
ls
MLO
V1
MLO
V2
0
10
20
30
40
50
*
*
****
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info
cit
os
CD
8+ I
FN
- +
LT
IDCs
TolDCs
LPS
TAPCel
ls
MLO
V1
MLO
V2
0
5
10
15
20*
*
***
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info
cit
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CD
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C
Gra
nzi
ma
B
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A
CD8
CD8
CD8
CD
8
CD8
34
8.4. DCs maduradas con mezclas de lisados de carcinoma de ovario, indujeron una
respuesta linfocitaria efectora reactiva contra células de carcinoma de ovario.
Los resultados previos sugieren que las DCs maduradas con mezclas de lisados
condicionados, inducen un aumento de linfocitos CD4+ y CD8+ productores de IFN-γ al co-
cultivarlas con PBL alogénico. Sin embargo, una aproximación más fisiológica utilizaría un
modelo autólogo que evalúe el efecto que tienen estos linfocitos sobre las células tumorales.
Para ello, DCs maduradas con diversos estímulos fueron co-cultivadas de manera
autóloga con PBL durante 14 días, para luego enriquecer las poblaciones de linfocitos T CD8+
y CD4+ mediante “cell sorting”. Evaluamos la capacidad efectora que poseen los linfocitos T
CD8+ de eliminar células de carcinoma de ovario, mediante ensayo de citotoxicidad por
liberación de Cr, como también la capacidad que poseen los linfocitos T CD4+ de reconocer y
liberar IFN-γ al entrar en contacto con células tumorales de ovario, mediante el ensayo de
ELISPOT.
Adicionalmente, al finalizar el co-cultivo, se evaluó el grado de activación de los
linfocitos, mediante la expresión de CD25 y CXCR3. De este modo, observamos que tanto
linfocitos CD4+ como CD8+ luego del co-cultivo autológo con las DCs estimuladas con MLOV1
y MLOV2, aumentaron significativamente los niveles de expresión de CD25 en comparación
con los linfocitos que fueron co-cultivados con iDCs. Al evaluar la expresión de CXCR3 por
citometría de flujo, los resultados muestran que la población CD4+ que fue co-cultivada con las
DCs cargadas con las mezclas de lisados de ovario, mostraron un aumento de este receptor
inclusive a niveles similares que nuestro control positivo TAPCells (Figura 7). Sin embargo, en
linfocitos T CD8+, observamos un efecto diferencial, ya que aquellos linfocitos co-cultivados
con las DCs cargadas con MLOV1 presentaron una mayor inducción de CXCR3 que los que
fueron co-cultivados con DCs cargadas con MLOV2 (Figura 7).
Además, estudiamos la repuesta citotóxica de los linfocitos CD8+ previamente sorteados
desde el PBL resultante del co-cultivo autólogo con las DCs estimuladas con MLOV1 y
MLOV2. Los linfocitos T CD8+ sorteados, se co-cultivaron durante 5 h con diversas líneas
celulares: HEY y SKOV3 (ovario), Mel 1 (melanoma); y como control negativo se utilizó K562
35
(leucemia crónica) ya que no presenta MHC-I. Cabe destacar que para asegurar el correcto
reconocimiento de antígenos, tanto los donantes como las líneas celulares fueron HLA-A2+. Los
resultados mostrados en la Figura 8 muestran una alta capacidad de lisis por parte de los
linfocitos CD8+ autólogos activados con DCs cargadas con MLOV1 o MLOV2, cuando las
líneas tumorales blanco pertenecen a carcinoma de ovario. No se observó una diferencia
significativa en la lisis celular, al comparar linfocitos co-cultivados con MLOV1 y MLOV2
independientemente, si la línea blanco fue HEY o CAOV3.
La capacidad que poseen los linfocitos T CD4+ de secretar IFN-γ una vez que reconocen
la célula blanco, fue cuantificada mediante ELISPOT. Brevemente, al finalizar los co-cultivos
entre CD4+ y DCs cargadas con lisados ováricos, los linfocitos CD4+ resultantes fueron
sorteados y co-cultivados por 16 h con HEY y CAOV3 (Figura 9). Además, se incluyó Mel 1
y K562, al igual que el experimento anterior. Al finalizar el ensayo, obtuvimos que los linfocitos
co-cultivados con MLOV1 o MLOV2 fueron capaces de reconocer las células tumorales blanco
HEY y CAOV3, en comparación a los LT que fueron co-cultivados con iDCs. Cabe destacar,
que cuando la línea HEY fue blanco, los linfocitos co-cultivados con MLOV1 secretan mayor
cantidad de IFN-γ que los que fueron co-cultivados con MLOV2 lo que demostraría una mayor
capacidad de reconocimiento hacia la célula tumoral.
En base a todos los resultados aquí expuestos, sugerimos que las mezclas de lisados
celulares condicionados de carcinoma de ovario podrían actuar como una fuente de antígenos e
inducir la activación/maduración de DCs humanas. A su vez, las DCs maduradas con estos
lisados inducirían la activación de los linfocitos T CD4+ y CD8+, diferenciándolos hacia
fenotipos comprometidos con la eliminación de células tumorales. Estos resultados avalan la
capacidad de las DCs en poder dirigir una respuesta inmune cuando son estimuladas con lisados
tumorales, lo que abre la posibilidad de un nuevo enfoque terapéutico para esta enfermedad.
36
LT
iDC
s
TA
PC
ells
HE
Y
ML
OV
1
ML
OV
2
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
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* * *
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iDC
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1
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0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
Me
an
CD
4+
CX
CR
3 * *
*
* *
*
Figura 7. Linfocitos cocultivados de forma autóloga con DCs cargadas con MLOV1 o MLOV2
son activados y aumentan la expresión en superficie de CXCR3. PBL fue co-cultivado de forma
autóloga con DCs durante 14 días. Finalmente, se analizó mediante citometría de flujo el MFI de
CD25 y CXCR3. A) dot plot representativo de la estrategia de gating dentro de la población
vivas/CD3+ . B) MFI de CD25 en linfocitos CD4+. C) Mean de CXCR3 en linfocitos CD4+. D) MFI
de CD25 en linfocitos CD8+. C) Mean de CXCR3 en linfocitos CD8+. Los datos corresponden al
promedio ± SD. Experimentos con un = 4. *** = p<0.001; **= p< 0.01; *=p<0.05.
LT
iDC
TA
PC
ells
Hey
ML
OV
1
ML
OV
2
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
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CD
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CD
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+
* *
*
*
LT
iDC
TA
PC
ells
Hey
ML
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1
ML
OV
2
0
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
IMF
lin
foc
ito
s
CD
4+
CD
25
+
*
* *
*
*
37
Figura 8. Linfocitos CD8+ cocultivados de forma autóloga con DCs cargadas con MLOV1 o
MLOV2 eliminar células tumorales de carcinoma de ovario. PBL fue co-cultivados con DCs
maduradas con diversos estímulos de forma autóloga por 14 días. Luego se enriqueció la población
de linfocitos CD8+ mediante “cell sorting”. Finalmente se elaboró un co-cultivo con diversas líneas
tumorales y se evaluó el porcentaje de lisis mediado por los linfocitos con el kit de citotoxicidad no
radioactiva de Promega. Las líneas celulares target fueron: HEY, CAOV3 Mel 1 y K562. Los datos
corresponden al promedio ± SD. Experimentos con un = 4. *** = p<0.001; **= p< 0.01; *=p<0.05.
C A O V 3
10:1
5:1
0
2 0
4 0
6 0
LT
iD C
T rim e l
H E Y
M L O V 1
M L O V 2
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**
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5:1
0
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**
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M L O V 2% o
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10:1 5:
1
0
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60
80
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RatioEfector:Blanco
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MLOV1
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***
***
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/ 100.0
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10:1 5:
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40
60
80
100
RatioEfector:Blanco
LT
iDC
TAPCells
HEY
MLOV1
MLOV2
***
***
***
***
Sp
ots
/ 100.0
00
lin
focit
os C
D4
+
Mel 1
10:1 5:
1
0
20
40
60
80
100
RatioEfector:Blanco
LT
iDC
TAPCells
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MLOV2***
***
***
***
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/ 100.0
00
lin
focit
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D4
+
K562
10:1 5:
1
0
10
20
30
40
50
RatioEfector:Blanco
LT
iDC
TAPCells
HEY
MLOV1
MLOV2
Sp
ots
/ 100.0
00
lin
focit
os C
D4
+
Figura 9. Linfocitos CD4+ co-cultivados de forma autóloga con DCs cargadas con MLOV1 y
MLOV2 liberan IFN-luego de reconocer células tumorales de carcinoma de ovario. PBL fue
co-cultivado con DCs maduradas con diversos estímulos de forma autóloga por 14 días. Luego se
enriqueció la población de linfocitos CD4+ mediante “cell sorting”. Finalmente se elaboró un co-
cultivo con diversas líneas tumorales y se evaluó la liberación de IFN- mediada por los linfocitos
al reconocer las células tumorales. Las líneas celulares target fueron: HEY, CAOV3 Mel 1 y K562.
Los datos corresponden al promedio ± SD. Experimentos con un = 3. *** = p<0.001; **= p< 0.01;
*=p<0.05.
39
9. DISCUSIÓN
Los resultados expuestos en este estudio sugieren que el tratamiento de shock térmico,
aplicado durante la producción de lisados de carcinoma de ovario, favorece la generación y
liberación de DAMPs. Las DCs en cultivo cargadas con estos lisados se activan, maduran y,
además, pueden montar respuestas característicamente antitumorales induciendo LT CD4+IFN-
γ+ y LT CD8+ IFN-γ+.
Estos DAMPs, corresponden a moléculas que son reconocidas por el sistema inmune
como señales de peligro. Fisiológicamente, las DCs actúan como centinelas residentes en el
tejido manteniendo la tolerancia periférica a los antígenos y moléculas propias. Sin embargo,
cuando se desarrolla un proceso inflamatorio, por un agente patógeno, o bien, daño tisular, las
DCs se activan y actúan como puentes entre la inmunidad innata y adaptativa, polarizando
linfocitos hacia perfiles inmunogénicos TH1 o TH17, y montando respuestas citotóxicas
encargadas de la eliminación de células infectadas o tumorales (González., et al., 2014). La
comunicación anterior se debe a que las DCs son altamente versátiles, capaces de procesar
múltiples y variadas señales ambientales, presentes en la periferia, y traducirlas mediante
durante la sinapsis inmunológica a los linfocitos T. De esta manera, influyen directamente sobre
la activación y diferenciación linfocitaria, modulando la estrategia inmune necesaria para
responder frente a una patología.
Por este motivo, la inmunoterapia basada en DCs surge como un tratamiento promisorio
para aumentar la sobrevida del paciente y/o reducción tumoral. Esta inmunoterapia se basa en
educar ex vivo DCs autólogas entregándoles antígenos tumor-específicos purificados, lisados
tumorales condicionados, o transfectando DCs para que sobre-expresen antígenos asociado a
tumor o citoquinas como GM-CSF (Palucka and Banchereau .,2012; Anguille et al., 2015;
Muldoon et al., 2016) de modo que al transferir las DCs activadas al paciente, monten una
respuesta linfocitaria con mayor potencia, sorteando en gran medida el efecto inmunosupresor
ejercido por el ambiente tumoral del paciente (Chae, et al., 2017). Respecto de esto último,
existen casos en que esta terapia dependiente de DCs no resulta exitosa, precisamente porque al
igual que en otras terapias moldean el tumor, eliminando las células sensibles y dejando las
células resistentes. De esta forma se selecciona las células resistentes y el tumor logra escapar
40
al control inmune. Además en el cáncer de ovario los tumores usan la capacidad de las DCs
para modular la inmunidad adaptativa, logrando convertir linfocitos con propiedades
antitumorales en pro- tumorales, a través de mecanismos tolerogénicos de las DCs.
En relación al cáncer de ovario, la literatura recopilada a la fecha es contradictoria con
respecto a la eficacia de la inmunoterapia. Cubillos, y colaboradores describieron que el
microambiente tumoral de esta enfermedad es tolerogénico ya que posee altos niveles de PD-
L1, hay abundancia de células inmunosupresoras, y además, es hipóxico/anóxico y de bajo pH,
entre otros factores (Fridman et al., 2012; Hanahan., 2014; Shore., 2015; Speiser et al., 2016),
suprimiendo así tanto a los linfocitos intra-tumorales como a los que rodean el tumor. Por lo
tanto, una terapia basada en células dendríticas no resultaría efectiva, debido a que los linfocitos
activados por DCs migrarán hacia el tumor, y una vez en contacto con el tumor, entrarían en
anergia debido al desfavorable microambiente tumoral. No obstante, en un estudio clínico de 25
pacientes (Tanyi, et al., 2018) se demostró que la inmunoterapia basada en DCs cargadas con
lisado autólogo en conjunto con Bevacizumab (anti-VEGF) y bajas dosis de ciclofosfamida
(agente alquilante) extendió por 2 años la sobrevida de las pacientes tratadas, en comparación a
aquellas que solamente recibieron DCs y Bevacizumab. Lo que nos indicaría que para romper
la tolerancia del tumor y lograr una correcta activación de linfocitos que conlleve una eficacia
clínica es plausible poder ocupar terapias combinadas, por ejemplo, activar linfocitos con una
inmunoterapia basada en DCs, mientras que anti-checkpoints, permitan que los linfocitos sigan
activados por más tiempo o bien ocupar un anticuerpo que evite la angiogénesis del tumor como
es el caso del anti-VEFG.
Nuestro laboratorio se ha dedicado por más de 2 décadas al estudio y realización de
estudios clínicos fases I/II para el tratamiento de pacientes con melanoma y cáncer de próstata
a través de la utilización de inmunoterapia basada en células dendríticas (Escobar et al.,2005;
López, et al., 2009; Reyes, et al., 2013), logrando en melanoma, tasa de respuesta inmunológica
(DTH) de alrededor de un 60% y aumentando la sobrevivida de estos pacientes 3 veces más que
los controles (López, et al., 2009). Nuestra inmunoterapia se basa en el condicionamiento de
lisados de melanoma y carcinoma de próstata para favorecer la liberación de DAMPs, los que
son muy relevantes para madurar y activar las DCs.
41
Para poder trasladar esta tecnología de producción de lisados a otras neoplasias, es de
suma relevancia elegir correctamente las fuentes de antígenos y DAMPs, ya que son estás las
señales canónicamente descritas para activar DCs y lograr una correcta presentación antigénica
a los linfocitos T de manera que sean capaces de romper con la tolerancia del tumor.
Los resultados de la presente investigación, demuestran que las diferentes líneas
celulares de carcinoma de ovario expresan antígenos clásicamente descritos, los que además,
son compartidos por otras líneas provenientes de diversos tumores (Garg, et al., 2016; Mukherje
and Nath., 2014). Notablemente, la línea CAOV3, expresa MUC1 y CA125 (Figura 1), dos
antígenos de carcinoma de ovario que conforman el panel de biomarcadores para confirmar el
diagnóstico, y que incluso se utilizan como blanco de inmunoterapias contra esta enfermedad
(Wright et al., 2012; Felder, et al., 2014; Kim, et al.,2015; Wefers et al 2015). En el caso de
CA125, ha sido de relevancia en la historia del cáncer de ovario debido a que es el mejor
marcador para monitorear esta enfermedad en pacientes, y el aumento de sus niveles plasmáticos
se relaciona con el pronóstico de recurrencia. Pese a que sus niveles se ven alterado por otras
condiciones es uno de los pocos antígenos que se han relacionado fuertemente a esta enfermedad
(Felder, et al., 2014). Por otro lado, se demostró en modelo murino que MUC1 y CA125 tenían
un rol inmunosupresor dependiente de TLRs en células epiteliales, mientras que mutantes para
Muc1 liberaron mayores niveles de IL-6 y TNF-α en respuesta a agonistas de TLRs (Menon et
al, 2015). En contraste con lo anterior y aplicado al propósito de esta tesis, Dobrzanski
administro una inmunoterapia de trasferencia adoptiva de linfocitos T CD4+ autólogos cargados
con MUC1 en combinación con IL-2 a pacientes, lo que resulto en un aumento de la sobrevida
de las mujeres que padecen de esta enfermedad con reducción plasmática de CA125
(Dobrzanski et al, 2009). Es por esta razón que la presencia de MUC1 y CA125 podría ser
relevante en la elaboración de un lisado, que al aplicarlo sobre las DCs, estas puedan potenciar
la respuesta linfocitaria anti-tumoral.
Sin embargo, no sólo se requieren antígenos, sino que también moléculas inductoras de
maduración y activación de las DCs. Por este motivo, investigamos si el tratamiento de shock
térmico durante la elaboración de lisados de líneas de carcinoma de ovario, provocaba la
liberación de DAMPs explorados previamente por nuestro grupo de investigación, como
HMGB1, la cual indujo la maduración de las TAPCells (DCs cargadas con lisados tumorales de
42
melanoma), y calreticulina que favorecía la presentación cruzada de antígenos tumorales
(Aguilera, et al., 2011). Estos resultados sugieren que es muy importante que las líneas celulares
seleccionadas para la elaboración final de la mezcla de lisados de carcinoma de ovario, destinado
a inmunoterapia, contenga niveles elevados de HMGB1 y calreticulina. El shock térmico, indujo
la liberación de HMGB1 y translocación de calreticulina en tres de las cuatro líneas de
carcinoma de ovario (CAOV3, HEY y SKOV3), mientras que A2780 solamente mostró
liberación de HMGB1 (Figura 2). La presencia de estos DAMPs en nuestra mezcla de lisados
tumorales de ovario, constituye un gran aporte a nuestra inmunoterapia basada en DCs, debido
a que se ha descrito que calreticulina en membrana de células tumorales es una potente señal de
fagocitosis para las DCs (Zitvogel, et al., 2010). Los resultados obtenidos en esta tesis sugieren
que el lisado tumoral de ovario podría activar la maduración de las DCs gracias a la presencia
de HMGB1 y además, podría inducir la fagocitosis de restos celulares por la presencia de
calreticulina, lo que favorecería también, la incorporación de antígenos.
Para decidir que líneas celulares de carcinoma de ovario eran las apropiadas para
conformar la mezcla de lisado, se estudió la capacidad de madurar y activar DCs in vitro de cada
una de ellas. De este modo, los lisados celulares individuales, condicionados con estrés térmico,
fueron capaces de inducir significativamente los niveles de CD80 y CD86. Sin embargo, las
líneas SKOV3 y A2780 fueron las únicas en generar un aumento significativo en la expresión
de MHC-II (Figura 3). Cabe destacar que la cantidad de lisado individual utilizado, en la que se
observan diferencias en la expresión, es la misma que se emplea para TRIMEL (formado de 3
lisados de melanoma), y los niveles de inducción de los marcadores de maduración, resultaron
prácticamente similares.
Lo anterior indicaría que los lisados serían capaces de entregar a las DCs señales
necesarias para generar un cierto nivel de maduración. En base a todos los resultados expuestos,
se ideó una mezcla de lisados que, pensando en una futura aplicación clínica, obligatoriamente
deberían contener: CAOV3, por tener una abundancia considerable respecto de las otras líneas
de carcinoma de ovario de MUC1 y CA125, y además, por mostrar liberación de HMGB1 y
translocación de calreticulina; y SKOV3, por aumentar los DAMPs mencionados. La tercera
línea que compondría las mezclas fue escogida entre las 2 restantes, HEY y A2780. De esta
forma, se optó por generar 2 mezclas de lisados: MLOV1 y MLOV2; que tendrían una
43
combinación de antígenos y DAMPs más amplia, considerando la existencia de otras moléculas
que estén presentes y no fueron consideradas en este trabajo. Lo observado en nuestros
resultados fue que las mezclas de lisados indujeron la maduración y activación de las DCs in
vitro, de manera muy similar a lo obtenido para las TAPCells, sugiriendo que la tecnología de
preparación de lisados de carcinoma de ovario podría resultar en una inmunoterapia basada en
DCs clínicamente efectiva al inducir fuertemente las moléculas co-estimuladoras y de
presentación antigénica, como también el receptor de quimioquinas CCR7, el cual promueve la
migración de células inmunes hacia órganos linfoides secundarios (Figura 4) (Clatwothry, et
al.,2015). Previamente, y con la elaboración de las TAPCells, nuestro grupo de investigación
demostró que el conjunto de marcadores observados en la Figura 4, ha tenido implicancias en
resultados clínicos promisorios (López, et al., 2009).
El efecto de los MLOV1 y MLOV2 sobre las DCs se tradujo además en una correcta
activación de linfocitos T CD4+ y CD8+ alogénicos, al evaluar el marcador correspondiente
(subunidad alfa del receptor de IL-2, CD25). Sin embargo, y más relevante para nuestro estudio,
fue la polarización de linfocitos T hacia perfiles principalmente tipo TH1 (CD4+ productores de
IFN-y linfocitos T CD8+IFN- y moléculas efectoras como perforina y granzima B (Figura
5 y 6, respectivamente). Desde el punto de vista clínico, la obtención de perfiles asociados a
TH1 debido a que las citoquinas que produce el perfil TH1, serían capaces de activar una gran
variedad de células anti-tumorales como NKs, linfocitos T CD8+, NKT y macrófagos M1 que
en conjunto lograrían montar un respuesta inmune eficaz frente al tumor (Drakes y Stiff ., 2016)
de ser satisfactoria, dicha respuesta, se lograría un control tumoral tal que impactaría de forma
positiva en la sobrevida del paciente (Tanyi et al., 2018). Por otro lado, los linfocitos T CD8+
serían capaces de destruir las células tumorales, mediante la generación de poros en la
membrana de la célula blanco (tumoral) por la perforina, provocando un desbalance osmótico
en la célula, y además, facilitando el acceso de la proteasa Granzima B, lo que activa la ruta de
las caspasas, induciendo la apoptosis del tumor (Enamorado, et al., 2017). Tanto los perfiles
linfocitarios inducidos, como su grado de activación, nos confirman la funcionalidad de las DCs
cargadas con las mezclas de lisados de carcinoma de ovario condicionados.
Los linfocitos obtenidos luego del co-cultivo con las DCs cargadas con MLOV1 o
MLOV2, no sólo mostraron cambios fenotípicos, clásicos de su perfil, sino que también
44
resultaron funcionales en reconocer y montar una respuesta frente a células tumorales. De forma
autóloga, es decir, bajo un mismo contexto de haplotipo lo que se traduce en un experimento
dependiente directamente del reconocimiento de antígenos, tanto las poblaciones CD4+ como
CD8+ fueron activadas (marcador CD25) por las DCs y mostraron un aumento significativo en
la expresión de CXCR3 (Figura 7). Como se mencionó anteriormente, CXCR3 promueve la
migración de células inmunes hacia sitios tumorales, adicionalmente, se ha demostrado que este
receptor está asociado a mejor sobrevida general de los pacientes y a mejores respuestas clínicas
frente a algunas inmunoterapia utilizadas en melanoma y otros cánceres (Mullins et al., 2004).
Cabe destacar, que en un modelo de carcinoma renal, la frecuencia de linfocitos T CD4+
CXCR3+ se incrementan en etapas iniciales del proceso carcinogénico, disminuyendo al
progresar la enfermedad, lo que podría relacionarse con la etapa de escape tumoral observada
en la relación sistema inmune/tumor (Cozar, et al., 2005). Debido a la gran importancia del
receptor de quimioquina CXCR3, no solo en el direccionamiento a sitios inflamados en un
contexto inmune TH1, sino que también, en la misma diferenciación del perfil TH1, al ser un
inductor directo de la producción de IFN- se ha considerado la presencia de linfocitos T
CXCR3+ como un indicador de pronostico tanto en ascitis como en el tumor de ovario
(Windmuller et al., 2017).
Otra arista de la funcionalidad de los linfocitos T generados por co-cultivo con DCs
cargadas con MLOV1 y MLOV2, fue lo observado para linfocitos CD8+ en contacto con las
líneas HEY y CAOV3. La Figura 8 muestra que hubo un alto porcentaje de lisis producido por
la población linfocitaria CD8+. Sin embargo, también se observó lisis de las células blanco
cuando estas provenían de una línea de melanoma (Mel1), como también se observó lisis
producida por los linfocitos co-cultivados con TAPCells sobre las líneas de ovario. Estos efectos
se pueden explicar debido a los antígenos compartidos entre las líneas celulares como Survivina,
por ejemplo (Figura 1). De esta forma un linfocito CD8+ que reconozca específicamente un
antígeno compartido por las líneas y en un contexto de haplotipo adecuado montará una
respuesta inmune efectora (González F.E, et al., 2014). Sin embargo, el mayor efecto de lisis se
da en las condiciones de linfocitos que fueron co-cultivados con las DCs cargadas con MLOV1
y MLOV2 lo que sugiere que estas mezclas estarían entregando señales suficientes, como los
antígenos MUC1 y CA125, para direccionar de mejor manera la respuesta hacia las líneas
45
celulares de cáncer de ovario. Finalmente, el efecto de los linfocitos CD4+ co-cultivados
alogénicamente con las DCs, que fueron pulsadas con MLOV1 y MLOV2, sobre las líneas
celulares de ovario HEY y CAOV3 (Figura 9), se visualizó mediante la elevada secreción de
IFN-luego de reconocer específicamente aquellas células blanco provenientes de carcinoma
de ovario, por sobre la de melanoma. No obstante, en esta interacción también podría darse el
reconocimiento cruzado vía antígeno compartido con la línea de melanoma, Mel1.
La única diferencia encontrada entre las dos mezclas estudiadas es que la mezcla 1
induce mayores niveles de CXCR3 en linfocitos CD8+ en el modelo autólogo (Figura 7), de
esta forma según lo detallado anteriormente, estos linfocitos podrían llegar al nicho tumoral a
montar una respuesta inmune. Es por esta razón que con estos resultados proponemos que la
mejor combinación de lisados para activar DCs y consecuentemente activar linfocitos es la
Mezcla de Lisados de Ovario 1, MLOV1.
Con el desarrollo de esta investigación demostramos que DCs maduradas con MLOV1
o MLOV2, inducen una activación linfocitaria que a su vez es capaz de reconocer y montar una
respuesta inmune efectora frente a células tumorales in vitro. Estos hallazgos muestran que esta
inmunoterapia contra cáncer de ovario podría ser ocupada como alternativa terapéutica en
pacientes en estadios tardíos. Además, con estos resultados la tecnología aplicada a la
fabricación de este tipo de células dendríticas puede ser una potente alternativa contra diversos
tipos de cáncer. Finalmente, en los próximos meses esperamos iniciar un ensayo clínico
utilizando células dendríticas cargadas con la mezcla de lisado 1 en pacientes en etapas tardías
de cáncer de ovario epitelial. Proponemos también el uso combinado de esta terapia junto con
anticuerpos monoclonales como Ipimilumab ó Nivolumab, de esta forma evaluar si la
inmunoterapia generada puede obtener mejores resultados clínicos al desbloquear los
checkpoints inmunológicos con el fin de aumentar las posibilidades de romper la tolerancia
propia del microambiente tumoral del cáncer de ovario.
46
10. BIBLIOGRAFIA
Aaes, T. L., Kaczmarek, A., Delvaeye, T., De Craene, B., De Koker, S., Heyndrickx, L. & Garg,
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