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7/26/2019 Capacitacion_espermatica

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EDUCACIÓN CONTINUADAEN EL LABORATORIO CLÍNICO 2011-2012Ed Cont Lab Clín; 15: 11-21

CAPACITACION ESPERMATICA

Ana Ruiz Martín

F.E.A Análisis Clínicos. Hospital Regional Universitario Carlos Haya. Málaga

Ana Gutiérrez Rueda

F.E.A Análisis Clínicos. Hospital Regional Universitario Carlos Haya. Málaga

INTRODUCCIÓN

Hasta hace relativamente poco tiempo no se había tomado conciencia de la verdadera impor-

tancia de la infertilidad masculina. Estudios epidemiológicos demuestran que un 25 % de los

pacientes que acuden por primera vez a una consulta de esterilidad presentan un claro defecto

funcional de sus espermatozoides. Por otro lado publicaciones recientes sugieren que la calidad

del semen humano se está deteriorando con el paso del tiempo, quizá como resultado de facto-

res ambientales que empezarían a actuar en el desarrollo fetal del individuo.

Todo ello nos lleva a considerar la importancia de aumentar el conocimiento de la biologíacelular del espermatozoide humano y de definir los defectos responsables de la perdida de su

potencial de fecundación.

Los espermatozoides se producen en el testículo en dos etapas:

• Espermatogénesis: producción de espermátidas a partir de la célula madre

• Espermiogénesis: modificación morfológica de la espermátide en espermatozoide.

En los testículos los espermatozoides son inmóviles y no fecundantes. Desde los testículos son

evacuados hacia el epidídimo (72 días después del inicio de la espermatogénesis) a través de losconductos espermáticos intratesticulares (rete testi). Es en el epidídimo donde los espermatozoi-

des adquieren su movilidad progresiva.

En el momento de la eyaculación los espermatozoides son expulsados por el conducto defe-

rente hacia los conductos eyaculadores y hacia la uretra prostática donde se añade la secreción

prostática. En un segundo tiempo al contraerse las vesículas seminales su secreción pasa a los

conductos eyaculadores.

En total el volumen de esperma supone un 5 % de la secreción epididimaria, un 30 % de la pros-

tática y un 65 % de las vesículas seminales.



A. Ruiz, A. Gutiérrez Capacitación espermática

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PROCESOS IMPLICADOS EN LA PREPARACION DEL ESPERMATOZOIDE PARA LA

FECUNDACION

Los espermatozoides presentes en el plasma seminal tras la eyaculación, no están en disposición

inmediata de fecundar al ovocito, incluso estando en contacto con él. El conjunto de cambios

fisiológicos que hacen competente al espermatozoide para la fecundación es lo que conocemos

como CAPACITACION.

Una definición mas exacta sería aquella que describe la capacitación como la serie de cambios

bioquímicos y fisiológicos (tales como la pérdida de proteínas o sustitución por otras de

menor peso molecular, transformación de los fosfolípidos, disminución de la relación colesterol/

fosfolípidos, cambios en los radicales glúcidos de las glucoproteinas, perdida de los glúcidos

complejos, y movilidad de lípidos y proteínas) requeridos por el espermatozoide para li-

berar el contenido acrosomal.

Los fenómenos que conforman el proceso de capacitación son regulados por el estado de oxido-

reducción de las células espermáticas. Las reacciones de óxido reducción inducen la fosforilación

de la tiroxina, un requisito indispensable para la capacitación. Estas reacciones dependen del au-

mento, hasta un nivel crítico, de las concentraciones intracelulares del calcio, debido a la entrada

de calcio extracelular que, se cree, es inducida por la progesterona.

En la capacitación, el espermatozoide adquiere tres características:

1. reacción acrosómica

2. unión a la zona pelúcida del ovocito

3. hipermovilidad

1. Reacción acrosómica

El acrosoma es una organela tipo lisosoma localizada en la región anterior de la cabeza del esper-

matozoide por debajo de la membrana plasmática, como un casquete sobre el núcleo. El acroso-

ma contiene muchas enzimas que quedan al descubierto con la reacción acrosómica, la pérdida

del acrosoma inmediatamente antes de la fertilización. Esta reacción es de exocitosis, la fusiónde una vesícula intracelular de almacenamiento con la superficie interna de la membrana celular,

seguida de la liberación del contenido de la vesícula. Esta reacción requiere la entrada de iones

calcio, la salida de iones hidrógeno, un aumento del pH y la fusión de la membrana plasmática

con la membrana del acrosoma, lo que permite el contacto con las enzimas y favorece la salida

de las retenidas por la membrana interna del acrosoma. Para que un componente de la zona

provoque la reacción acrosómica es necesaria la unión del espermatozoide a la zona pelúcida. Se

cree que este componente es un receptor de glicoproteínas espermáticas que tendría una doble

función: unirse al espermatozoide e inducir la reacción acrosómica.




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2. Unión espermatozoide-ovulo

La capacidad de unión de la membrana plasmática del espermatozoide con la del ovocito se de-

sarrolla durante o tras la reacción acrosómica. El contacto inicial entre espermatozoide y ovocito

es un proceso mediado por receptores. La zona pelúcida está compuesta por glucoproteínas

secretadas por el ovocito llamadas ZP1, ZP2 y ZP3 de las cuales la más abundante es ZP3 y el

principal fijador para el espermatozoide. Para que el espermatozoide se una es necesario que

reconozca el componente carbohidrato de la molécula fijadora de las glucoproteínas específicas

para la especie. Después de la unión, el componente peptídico de la glucoproteína receptora

desencadena la reacción acrosómica. Por lo menos uno de los receptores de la cabeza del es-

permatozoide es una tirosinquinasa activada por la unión a la glicoproteína ZP3 y que inicia la

reacción acrosómica. Esta interacción sigue los principios generales de la unión y actividad hor-

mona-receptor. En el caso del espermatozoide y el ovocito, en el reconocimiento interviene una

enzima de la superficie del espermatozoide que queda expuesta en el proceso de capacitación.

3. Hiperactivación espermática

En cierto momento de la preparación del espermatozoide para la fecundación, éste desarrolla

un movimiento peculiar, llamado hiperactivo, que se caracteriza por una pequeña velocidad de

progresión y un rápido movimiento in situ con un gran desplazamiento lateral de la cabeza. El

aumento de la movilidad, debido al estado de hiperactividad, contribuye al último avance hacia

el ovocito. Es posible que esta movilidad sea en parte el resultado de una interacción con el epi-

telio de la trompa, que imprime mayor velocidad y mejor orientación y también impide que los

espermatozoides se adhieran y queden atrapados en el epitelio de la trompa.

CAPACITACION ESPERMATICA

En la valoración básica del eyaculado deben considerarse tanto el estudio macroscópico (volu-

men, licuefacción, aspecto y viscosidad) como el microscópico (recuento espermático, movilidad

y morfología, así como concentración de otros elementos celulares). Sin embargo el estudio

seminal no nos informa de la capacidad espermática fecundante, y por tanto no traduce las

posibilidades reales de fecundar. Por ello en ocasiones tendremos que realizar el estudio fun-

cional espermático. Existen numerosas pruebas que pretenden evaluar la capacidad fecundanteespermática, y todas ellas se relacionan con alguna fase de la fecundación, pero debemos utilizar

aquellas que por su simplicidad sean fácilmente realizables. En nuestro caso nos centraremos en

la recuperación de espermatozoides móviles (REM) o test de capacitacion.

RECUPERACION DE ESPERMATOZOIDES MÓVILES (REM) O TEST DE CAPACITACIÓN

Si bien la capacitación ha sido definida como la serie de cambios que experimenta el esperma-

tozoide en el aparato reproductor femenino, es evidente que los espermatozoides de algunas

especies, incluida la humana, pueden adquirir la capacidad de fertilizar después de una incuba-

ción en un medio determinado y sin permanencia en el aparato reproductor femenino. Por ello




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es posible lograr la fertilización con técnicas de reproducción asistida. La capacitación in vitro

requiere retirar el plasma seminal y añadir un medio de cultivo que puede ser una solución salina

equilibrada que contenga sustratos energéticos como lactato, piruvato y glucosa, y una proteína

como la albúmina. Los medios de cultivo deben tener una osmolaridad entre 280-300 mOsm/Kg.

El pH debe mantenerse en un rango entre 7.2-7.4, para ello es necesario utilizar medios tam-ponados. Los medios tamponados con bicarbonato necesitan una atmósfera rica en CO

2 y una

temperatura de 37 ºC para que se mantenga el equilibrio iónico, por lo que cuando utilicemos

estos medios debemos hacerlo en estufa con temperatura y CO2 controlados.

Podemos distinguir entre dos tipos de medios:

1. Medios para la preparación de gradientes: los más usados contienen una suspensión

coloidal de partículas de sílice unidas de forma covalente a moléculas de silano y se

preparan en solución isotónica.

2. Medios de lavado y cultivo: contienen proteínas mayoritariamente albúmina que actúa

como captadora y transportadora de moléculas, así como la concentración de sales ne-

cesaria para la homeostasis del espermatozoide y en la mayoría de los casos gentamicina

como bacteriostático.

Es conocido que durante la maduración en el epidídimo los espermatozoides incorporan diferen-

tes glicoproteínas y péptidos que inhiben la capacitación (actuarían como factores descapacitan-

tes). Este estado de descapacitación se mantiene tras la eyaculación debido a estas incorporacio-

nes y a la presencia de otros factores descapacitantes en el plasma seminal.

El plasma seminal es un fluido integrado por elementos celulares (células germinales maduras;

células epiteliales, leucocitos, etc.) y secreciones del testículo, epidídimo, próstata, vesículas se-

minales y glándulas de Cowper. Exposiciones prolongadas (más de 2 horas) de los espermato-

zoides al plasma seminal pueden provocar una pérdida de la capacidad fecundante y ejercer un

efecto negativo sobre su movilidad. Así pues el laboratorio dispone de una serie de metodologías

para separar, con la mayor brevedad posible los espermatozoides del plasma seminal.

El objetivo del procedimiento de capacitación es doble:

1. Obtener una suspensión de espermatozoides móviles libres de plasma seminal

2. Establecer in vitro las condiciones experimentales adecuadas para que los espermato-

zoides sufran el proceso de capacitación (que in vivo ocurre cuando atraviesan el moco

cervical en su recorrido por el tracto genital femenino).

Por tanto la finalidad de este proceso es seleccionar los espermatozoides móviles y mejorar la

calidad de los mismos (porque disminuye la liberación de linfoquinas y reduce la formación de

radicales libres), y será un requisito previo para cualquier técnica de reproducción asistida.

El adecuado procesamiento de la muestra va a influir en la capacidad fecundante del esperma-

tozoide, tanto in vivo como in vitro y será fundamental para el éxito de la reproducción asistida.




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Es muy importante tener en cuenta que las técnicas de capacitación espermática no son

en si mismas pruebas diagnósticas, sino que forman parte de los métodos de trata-

miento del semen. Cuando los parámetros seminales son normales el recuento de espermato-

zoides móviles tras la preparación seminal (REM) no aporta información adicional al estudio de

la pareja estéril (recomendación de la Sociedad Española de Reproducción, Sociedad Españolade Andrología y Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción). Sin embargo el

REM se ha convertido en un referente de gran utilidad para sentar la indicación de inseminación

intrauterina ya que el valor pronóstico que aporta un seminograma anormal es insuficiente. Es

difícil establecer un número mínimo de espermatozoides recuperados para realizar inseminacio-

nes intrautero y obtener una tasa de gestación adecuada. Algunos autores proponen que cada

centro establezca su punto de corte en función de los datos clínicos y de laboratorio de cada

centro. En general se considera de buen pronóstico un REM por encima de 5 millones de esper-

matozoides móviles recuperados por mililitro.

Obtención de la muestra

Para la realización de la capacitación en el laboratorio el método de recogida y transporte de la

muestra seminal será muy importante. Ha de informarse al paciente de forma oral y por escrito

de los siguientes aspectos:

- La muestra ha de recogerse por masturbación en un recipiente estéril

- Debe tener un periodo de abstinencia sexual de 3 a 5 días ( no más de 7 días)

- La muestra ha de recogerse en su totalidad evitando la pérdida sobre todo de laporción inicial

- Debe ser entregada en el laboratorio antes de una hora de su recogida

Una vez recogida la muestra e identificada se incubará durante 15 minutos a una temperatura

entre 20-37 °C hasta obtener la licuefacción completa (esta incubación no será necesaria si la

muestra ha completado la licuefacción en el momento de la entrega).

Tras este periodo se procederá a la evaluación de la muestra según los criterios de la OMS ano-

tándose volumen, concentración y movilidad.

TECNICAS DE CAPACITACIÓN ESPERMÁTICA

A continuación realizaremos el procesado de la muestra. Existen varias técnicas de capacitación

espermática:

1. Método de lavado

2. Métodos de Migración

• Swim- up directo

• Swim inverso




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3. Métodos de Filtrado: fibra de vidrio

4. Método de centrifugación por gradientes de densidad

5. Métodos avanzados: anticuerpos monoclonales, tecnología de microesferas,

electroforesis, ácido hialurónico, dextrano…

1. Método de lavado

Es el más sencillo. No conlleva una mejora de la calidad seminal simplemente una capacitación

y concentración.

Procedimiento

1. Depositar la muestra seminal en un tubo y añadir medio de cultivo en proporción 1:5 o 1:10

para retirar la mayor parte del plasma seminal.

2. Homogeneizar y centrifugar a 500 g durante 10 minutos.

3. Retirar el sobrenadante y añadir 0.5 mL de medio de cultivo.

4. Incubar 20-30 minutos.

2. Métodos de Migración

Técnica del “Swim-up”

Esta basado en la capacidad de desplazamiento de los espermatozoides móviles. Es el más fi-

siológico de todos los procedimientos. Requiere muestra con buenos parámetros seminales y la

muestra se recupera muy limpia. Dentro de esta categoría existen dos formas principales Swim

Up directo y Swim Up convencional

Swin up directo

El semen licuado se deposita debajo o sobre un medio de cultivo y los espermatozoide con buena

movilidad se dirigen al medio de cultivo de forma semejante al proceso in vivo.

Procedimiento

1. Colocar aproximadamente 250 µL de semen licuado en el fondo de un tubo no cónico (para

aumentar la superficie de contacto). Utilizar tantos tubos como sea necesario para mejorar la

recuperación de los espermatozoides.

2. Depositar sobre el semen 500 µL de medio de cultivo, resbalando por las paredes del tubo,

con cuidado de que no se mezcle con el semen.

3. Dejar en un incubador a 37 ºC formando un ángulo de 45º, para aumentar la interfase, du-

rante un tiempo entre 30 a 60 minutos dependiendo de la calidad del semen. No prolongar más

allá de 60 minutos para evitar la contaminación con plasma seminal.




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4. Pasado este tiempo aspirar aproximadamente 300 µL de medio de cultivo, con cuidado de no

aspirar semen (para lo cual durante todo el proceso se debe mantener el ángulo del tubo). Si no

hay más de un tubo de una misma muestra se unifica todo el aspirado en un único tubo.

5. Si el volumen obtenido es mayor de 500 µL, valorar el grado de movilidad y la concentración

de los espermatozoides. Centrifugar y llevar a un volumen final de 300-500 µL para inseminar

Swin up convencional

Procedimiento (Figura 1)

1. Lavar el semen con medio de cultivo en relación 1:1 y centrifugar 10 minutos a 400 g.

2. Retirar el sobrenadante con una pipeta estéril, con cuidado de no aspirar el botón celular.

3. Añadir al sedimento medio de cultivo haciéndolo resbalar lentamente por la pared del tubo

para evitar que se mezclen. El volumen a añadir depende de la calidad de la muestra lo normal

serian 500 µL.

4. Colocar el tubo en un incubador a 37 ºC durante aproximadamente 45 minutos (tiempo ne-

cesario para que los espermatozoides móviles asciendan desde el sedimento).

5. Recuperar 500 µL de la superficie del sobrenadante que contiene los espermatozoides móviles

libres de plasma seminal y células no espermáticas.

6. Evaluar la muestra capacitada (número de espermatozoides móviles recuperados por mL) y

dejar la muestra en el incubador hasta el momento de su utilización.

Figura 1. Swim-up convencional.




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Técnica de Swim- Down

Consiste en depositar un volumen de semen en el fondo del tubo y cuidadosamente verter sobre

el semen el medio de cultivo. El tubo en posición inclinada se coloca en el incubador a 37 ºC

durante 1-2 horas. Los espermatozoides móviles migran desde el semen al medio de cultivo. El

sobrenadante recuperado (próximo a la interfase liquido-aire) se centrifuga y se resuspende en

500 µL de medio de cultivo nuevo. Esta muestra se deja en el incubador hasta su utilización.

3. Método de filtrado

Esta técnica se basa en el hecho de que los espermatozoides muertos o con importantes disrup-

ciones de membrana presentan una clara tendencia a la absorción a determinados materiales

(fibra de vidrio, partículas de vidrio, etc.). Aprovechando esto pueden construirse columnas de

lana de vidrio que permitan filtrar a los espermatozoides obteniéndose la fracción de células via-

bles. Se realiza mediante una malla de fibra de vidrio en porciones de 15-20 mg que situamos

en el interior de una jeringa de insulina hasta la división 0.06 mL. A continuación lavamos el filtro

con 2-3 mL de medio para eliminar las partículas de fibra de vidrio que pudieran estar libres y

procedemos a filtrar aproximadamente 500 µL del semen en fresco o previamente lavado. Des-

pués del filtrado lavaremos el filtro de nuevo con 200-300 µL de medio de cultivo para liberar los

espermatozoides de buena calidad que pudieran quedar en él. Sin embargo se ha indicado que

las columnas de lana de vidrio podrían dañar las membranas de la cabeza de los espermatozoides

y de pequeñas contaminaciones de fragmentos de fibra de vidrio.

4. Gradientes discontinuos

Su fundamento se halla en la selección de los espermatozoides que pueden vencer la dificultad

que presentan los gradientes de densidad y llegar hasta el fondo del tubo, además de actuar

como filtro para plasma seminal, células redondas, detritus y aquellos espermatozoides con mo-

vilidad no progresiva. Los espermatozoides maduros son células compactadas y alcanzan el gra-

diente de mayor densidad (el que se deposita en el fondo del tubo cónico). El plasma seminal

permanece flotando sobre el gradiente de menor densidad y las células, los espermatozoides

inmaduros y los muertos se quedan en la interfase entre los dos gradientes. Actualmente los

gradientes se usan a una concentración de 90 % y 45 % o también de 80 % y 40 % y pueden

adquirirse ya preparados.

Es menos fisiológico que el método de Swim-up y se utiliza fundamentalmente para sémenes con

parámetros bajos y sémenes criopreservados.

Procedimiento (Figura 2)

1. Hacer deslizar un volumen determinado de gradiente de mayor concentración, en nues-

tro caso de 90 % (impregnado las paredes hasta el fondo de un tubo cónico)




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2 Depositar el mismo volumen de gradiente de menor concentración, en nuestro caso de

45 % y dejar caer lentamente igual que el anterior por la pared del tubo evitando que se

mezclen y se rompa la interfase entre ellos (el volumen de los gradientes y del semen de-

penderá de la concentración y movilidad de la muestra pudiendo variar des de 500 a 1.500

µL).

3. Depositar el mismo volumen de semen deslizándolo sobre la pared del tubo lentamente.

4. Centrifugar a 300 g durante 20 minutos y posteriormente con una pipeta Pasteur recu-

perar el sedimento.

5. Añadir medio de cultivo al sedimento y centrifugar a 400 g durante 5 minutos.

6. Eliminar el sobrenadante y añadir 500 µL de medio de cultivo y resuspender el botón.

7. Evaluar la muestra capacitada (número de espermatozoides móviles por mililitro) y dejaren el incubador a 37 ºC hasta el momento de su utilización.

Para calcular el número de espermatozoides con movilidad progresiva se multiplica el porcentaje

de espermatozoides con movilidad progresiva por los millones de espermatozoides recuperados

y por el volumen final.

Figura 2. Gradientes de densidad.




La relación del total de espermatozoides presentes en el eyaculado con el número de esperma-

tozoides móviles recuperados, se expresa como porcentaje de recuperación se calcula con la

siguiente fórmula:

Porcentaje de recuperación = [(VFxCFxREM)] / [(VUxCIxIEM)] x 100

VF: volumen final

CF: concentración final de espermatozoides

REM: espermatozoides recuperados con movilidad progresiva

VU: volumen de semen utilizado

De las técnicas de capacitación anteriormente descritas las más utilizadas en los laboratorios por

su simplicidad y eficacia son el Swim-up y los gradientes de densidad.

Aunque no existe evidencia científica para recomendar una técnica de preparación de semen las

ventajas de cada uno de estos métodos son:

Métodos de migración (swim-up)

• proceso fisiológico

• la muestra capacitada queda más limpia

• es independiente del volumen del eyaculado

Métodos de centrifugación (gradientes)

• mayor capacidad de recuperación

• buenos resultados con muestras pobres o congeladas

• menor tiempo para su realización

Finalmente señalar que han sido múltiples los intentos de realizar una mejora in vitro de los esper-

matozoides mediante la adición de distintos compuestos al medio de cultivo. De ellos destacar

el uso de inhibidores de la fosfodiesterasa (pentoxifilina, teofilina, cafeína, etc.) para estimular la

motilidad espermática. La inhibición de la fosfodiesterasa provoca un aumento de la concentra-ción de adenosin monofosfato cíclico (cAMP). El aumento de cAMP, mediador intracelular, regula

reacciones intracelulares que activan el metabolismo del espermatozoide mejorando parámetros

de movilidad. Muchas son las publicaciones sobre el efecto de la pentoxifilina mientras unos

autores encuentran una mejora de la motilidad al incubar la muestra seminal con pentoxifilina

otros no observan diferencia alguna de ahí que no se haya implantado como rutina en la práctica

clínica del laboratorio.

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EDUCACIÓN CONTINUADA EN EL LABORATORIO CLÍNICO

COMITÉ DE EDUCACIÓN

M.C. Villà (presidenta), D. Balsells, M. Gassó, J.A. Lillo, A. Merino, A. Moreno, M. Rodríguez

ISSN 1887-6463

Noviembre 2011 (recibido para publicación septiembre 2011)

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