capacidad fermentativa
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DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD FERMENTATIVA DE UNA
LEVADURA
I. INTRODUCCIÓN
La fermentación alcohólica es un proceso bioquímico para la obtención de etanol, han
sido utilizadas desde tiempos inmemoriales, ya sea para la elaboración de cerveza, del
vino, entre otros productos. Es por ello la importancia de mejorar los procesos de
fermentación y concerniente a ello, más a la optimización del rendimiento industrial.
Los inóculos de levaduras comerciales son ampliamente usados en la industria de las
bebidas alcohólicas, sin embargo es preferible utilizar cepas autóctonas, las cuales están
adaptadas a los medios de fermentación de cada área. Aunque se han encontrado
muchos géneros de levaduras en fermentaciones, la especie Saccharomyces cerevisiae
es la principal responsable de la fermentación alcohólica, así como de la producción de
la mayoría de los compuestos aromáticos. Algunos de los criterios de selección de las
cepas se basan en su capacidad fermentativa, medida como producción de etanol, acidez
y consumo de azúcares.
Como materia prima para la fermentación alcohólica se utilizan generalmente jugos de
frutas, los cuales contienen mucha glucosa y fructosa; igualmente es fácil de fermentar
el azúcar corriente (sacarosa). Sin embargo, no todos los azucares pueden servir como
substrato para las levaduras, he aquí la importancia de elegir el substrato adecuado así
como las concentraciones adecuadas para un proceso óptimo.
II. OBJETIVOS
Determinar la pérdida de peso y la cantidad de glucosa consumida por las
soluciones de levaduras, así como el CO2 producido.
Determinar el rendimiento real de las levaduras (g. etanol/g glucosa).
Determinar la eficiencia de las levaduras.
III. FUNDAMENTO TEÓRICO
3.1. Glucolisis
La glucolisis es una vía catabólica del citoplasma que existe en casi todos los
organismos, sean aerobios o anaerobios. Es el conjunto de reacciones que degradan
la gluc9osa (C6) transformándola en dos moléculas de ácido pirúvi co (PYR) (C3).
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Estas reacciones se realizan en el hialoplasma de la célula. Es un proceso anaerobio,
que no necesita oxígeno y en el que por cada molécula de glucosa (GLU) se obtienen
2 ATP y 2 NADH + H+ (Tortora, Funke, & Case, 2007).
3.1.1. Balance de la glucolisis
El balance de la glucolisis es sencillo: la glucosa se fragmenta en dos moléculas
de piruvato y además se forman dos moléculas de piruvato y además se forman
dos moléculas de ATP y NADH + H+.
En presencia de oxigeno el piruvato y el NADH + H+ alcanzan la mitocondria y
allí son nuevamente transformados. En condiciones de anaerobiosis a partir del
piruvato y del NADH + H+ deben producirse en el citoplasma productos de
fermentación como el lactato o el etanol para generar el NAD+ necesario para la
continuación de la glucolisis. En esas condiciones la glucolisis es la única
posibilidad de sintetizar ATP de las células animales (Koolman, 2004).
Figura 1. Reacción global de la glucólisis
3.1.2. Fases de la glucolisis
En síntesis, al glucolisis consta de dos fases fundamentales, una preparatoria y
otra de conservación de energía:
a) En primer lugar, en la fase preparatoria se utilizan dos moléculas de ATP
durante el proceso en el que una molécula de glucosa de seis átomos de
carbono experimenta procesos de fosforilación, reestructuración y escición
para formar dos compuestos de tres átomos de carbono cada uno:
gliceraldehído-3-fosfato (GP) y dihidroacetona fosfato (GHAP). La DHAP
experimenta una conversión rápida en GP (también puede tener lugar al
reacción en sentido inverso). La conversión de DHAP en GP significa que a
partir de ese momento de la glucolisis se aportarán dos moléculas de GP en
las reacciones químicas restantes.
b) En la fase de conservación de energía, las dos moléculas de tres átomos de
carbono son oxidadas en varios pasos para formar dos moléculas de acido
pirúvico. En estas reacciones dos moléculas de NAD+
experimenten una
reducción a NADH y se forman cuatro moléculas de ATP por fosforilacion a
nivel del sustrato (Melo & Cuamatzi, 2007).
Dado que para iniciar la glucolisis se necesitaron dos moléculas de ATP y el
proceso genero cuatro moléculas de ATP, se produjo una ganancia neta de dos
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moléculas de ATP por cada molécula de glucosa oxidada. Las reacciones y
productos que surgen en las fases de la glucolisis se observan en la figura 2 y 3
(Koolman, 2004).
3.2. Respiración Aeróbica
Es el proceso en el cual, sus células extraen la energía presente en la glucosa, ácidos
grasos y otros compuestos orgánicos, utilizando oxigeno y produciendo CO2 , H2O y
38 ATP por cada glucosa oxidada. Este proceso se lleva a cabo a nivel celular y lo
realizan casi todos los organismos. Una de las principales vías. La respiración
aerobia se puede resumir en la reacción general.
La respiración aeróbica consta de varias etapas: Glucólisis (ya descrita
anteriormente), Ciclo de Krebs, cadena transportadora de electrones y fosforilación
oxidada (De Abate, 1999).
3.2.1. Ciclo de Krebs
El ciclo de Krebs (conocido también como ciclo de los ácidos tricarboxílicos o
ciclo del ácido cítrico) es un ciclo metabólico de importancia fundamental en
todas las células que utilizan oxígeno durante el proceso de respiración celular. En
estos organismos aeróbicos, el ciclo de Krebs es el anillo de conjunción de las
rutas metabólicas responsables de la degradación y desasimilación de los
Figura 2. Reacciones de la
primera fase de la glucólisis.
Figura 3. Reacciones de la
segunda fase de la glucólisis.
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carbohidratos, las grasas y las proteínas en anhídrido carbónico y agua, con la
formación de energía química.
El ciclo de Krebs es una ruta metabólica anfibólica, ya que participa tanto en
procesos catabólicos como anabólicos. Este ciclo proporciona muchos precursores
para la producción de algunos aminoácidos, como por ejemplo el cetoglutarato y
el oxalacetato, así como otras moléculas fundamentales para la célula (figura 4)
(Garrido & Teijón, 2006).
Figura 4. Reacciones del Ciclo de Krebs.
3.2.2. Cadena transporta de electrones
Los electrones de alta energía son transportados por el NADH y el FADH2 del
ciclo de Krebs, que van cuesta abajo hasta el oxígeno. Se desprenden grandes
cantidades de energía que impulsan el bombeo de protones (iones H+) hacia el
exterior de la matriz mitocondrial. Uno de los portadores de electrones es una
coenzima, los demás contienen hierro y se llaman citocromos. Cada portador esta
en un nivel más bajo de energía que el anterior y la energía que se libera se usa
para formar ATP (Garrido & Teijón, 2006).
3.2.3. Fosforilación oxidativa
En esta última etapa de la respiración celular, un complejo enzimático llamado
ATP sintetasa, produce el ATP que requiere nuestras células para crecer, realizar
transporte activo, dividirse, etc. La fosforilación oxidativa es la transferencia de
electrones de los equivalentes reducidos NADH, NADPH, FADH, obtenidos en la
glucólisis y en el ciclo de Krebs hasta el oxígeno molecular, acoplado con la
síntesis de ATP. Este proceso metabólico está formado por un conjunto de
enzimas complejas, ubicadas en la membrana interna de las mitocondrias, que
catalizan varias reacciones de óxido-reducción, donde el oxígeno es el aceptor
final de electrones y donde se forma finalmente agua. De una molécula de glucosa
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se obtienen 38 moléculas de ATP mediante la fosforilación oxidativa (Garrido &
Teijón, 2006).
3.3. Fermentación
Una vez que la glucosa ha sido degrada para formar acido pirúvico este compuesto
puede experimentar una degradación completa durante la respiración, como se
comento antes, o se puede convertir en un producto orgánico durante la
fermentación, en el transcurso de la cual se regeneran NAD+ y NADP
+ que pueden
ingresar en otro ciclo de glucolisis. La fermentación se puede definir de diversas
maneras, pero nosotros la definimos como un proceso que:
- Libera energía a partir de azucares u otras moléculas orgánicas, como
aminoácidos, ácidos orgánicos, purinas y pirimidinas.
- No necesita oxigeno (pero a veces tiene lugar en su presencia).
- No necesita recurrir al ciclo de Krebs ni a una cadena transportadora de
electrones.
- Utiliza una molécula orgánica como aceptor final de electrones.
- Solo produce pequeñas cantidades de ATP (una o dos moléculas por cada
molécula de material incial) debido a que una gran parte de la energía original
almacenada en la glucosa permanece en los enlaces químicos de los productos
finales orgánicos, como el acido láctico o el etanol (Koolman, 2004).
Durante la fermentación los electrones se transfieren (junto con los protones) desde
coenzimas reducidas (NADH, NADPH) el acido pirúvico o sus derivados. Los
aceptores finales de electrones experimentan una reducción que los convierte en los
productos finales. Una de las funciones esenciales del segundo estadio de la
fermentación consiste en garantizar una provisión constante de NAD+ y NADP
+ para
que pueda continuar el proceso de glucolisis. En la fermentación el ATP se produce
exclusivamente durante la glucolisis. Los microorganismos poseen la capacidad de
fermentar diversos sustratos; los productos finales dependen del tipo de
microorganismo. Del tipo de sustrato y del tipo de enzimas que se encuentran
presentes y en estado de activación. El análisis químico de estos productos finales
ayuda a identificar los microorganismos (Klages, 1998)
3.3.1. Fermentación alcohólica
La fermentación del alcohol también comienza con la glucolisis de una molécula
de glucosa para formar dos moléculas de acido pirúvico y dos moléculas de ATP.
Durante el paso siguiente las dos moléculas de acido pirúvico se convierten en dos
moléculas de acetaldehído y dos moléculas de CO2. Más tarde las dos moléculas
de acetaldehído son reducidas por dos moléculas de NADH para formar dos
moléculas de etanol. La fermentación del alcohol también es un proceso que
produce una escasa cantidad de energía debido a que la mayor parte de la energía
almacenada en la molécula de glucosa inicial permanece en el producto final, es
decir el etanol (Koolman, 2004).
La fermentación del alcohol se observa en numerosas bacterias y levaduras.
Saccharomyces son productos de desecho para las células de la levadura pero son
útiles para el ser humano. El etanol producido por las levaduras es el alcohol
presente en las bebidas alcohólicas y el dióxido de carbono elaborado por las
levaduras es responsable de que la masa del pan aumente de tamaño (“leve”).
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La fermentación alcohólica consiste de 11 reacciones enzimáticas, mostradas en la
figura 5.
Figura 5. Etapas de la fermentación alcohólica.
3.4. Limitaciones del Proceso
La determinación de los factores que limitan la glicólisis fermentativa del etanol son
complejos debido a la interrelación existente y a la naturaleza de los parámetros
intervinientes durante el proceso de fermentación. Alguno de ellos se deben tener en
cuenta en la fermentación alcohólica industrial. En las limitaciones que surgen
durante el proceso se pueden enumerar alguno de los más importantes como son:
Concentración de etanol resultante: una de las principales limitaciones del proceso es
la resistencia de las levaduras a las concentraciones de etanol (alcohol) que se llegan
a producir durante la fermentación, algunos microorganismos como el
saccharomyces cerevisiae pueden llegar a soportar hasta el 20% de concentración
volumen.
Acidez del substrato: el pH es un factor limitante en el proceso de la fermentación ya
que las levaduras se encuentran afectadas claramente por el ambiente, bien sea
alcalino o ácido. Por regla general el funcionamiento de las levaduras está en un
rango que va aproximadamente desde 3.5 a 5.5 pH. Los procesos industriales
procuran mantener los niveles óptimos de acidez durante la fermentación usualmente
mediante el empleo de disoluciones tampón.
Concentración de azúcares: la concentración excesiva de hidratos de carbono en
forma de monosacáridos y disacáridos puede frenar la actividad bacteriana. De la
misma forma la baja concentración puede frenar el proceso.
Contacto con el aire: una intervención de oxígeno (por mínima que sea) en el proceso
lo detiene por completo (es el denominado Efecto Pasteur). Esta es la razón por la
que los recipientes fermentadores se cierren herméticamente.
La temperatura. El proceso de fermentación es exotérmico, y las levaduras tienen un
régimen de funcionamiento en unos rangos de temperatura optimos, se debe entender
además que las levaduras son seres mesofilos. Si se expone cualquier levadura a una
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temperatura cercana o superior a 55ºC por un tiempo de 5 minutos se produce su
muerte.
Ritmo de crecimiento de las cepas: Durante la fermentación las cepas crecen
en número debido a las condiciones favorables que se presentan en el medio, esto
hace que se incremente la concentración de levaduras (Suárez & Íñigo , 2004)
IV. MATERIALES Y METODOLOGÍA
Materiales
- Levadura
- Agua destilada
- Azúcar
- Algodón
- Fiola volumétrica
- Matraz Erlenmeyer.
Equipos
- Balanza semi-analítica
- Refractómetro.
Metodología
- Se pesó los matraces, para poder sacar cálculos posteriores.
- Preparó dos soluciones de sacarosa al 10% y 20%.
- Luego de esto se vertió en las soluciones 1% de levadura, se diluyó en la
solución y se tapó con algodón la boca de los matraces.
- Se tomó el peso y los ºBrix en el tiempo 0, luego se tomó peso cada 24
horas, hasta llegar a peso constante, luego se tomo el peso y los ºBrix
finales.
- Encontrar la pérdida de peso y cantidad de glucosa consumida (ºBrix).
- Determinar el rendimiento real (g etanol/g glucosa).
- Calcular finalmente la eficacia de las levaduras.
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V. RESULTADOS Y DISCUSIONES
En el cuadro 1 observamos los pesos tomados de las soluciones al 8% y 18% durante el
proceso y los grados Brix iniciales y finales.
Cuadro 1. Datos experimentales para determinar capacidad fermentativa.
Tiempo(h) Solución 8% Solución 18%
W(g) °Brix W(g) °Brix
0 105.88 8 95.63 18
18 105.26 - 95.11 -
66 103.21 - 93.23 -
96 101.96 - 92.13 -
116 100.61 - 90.82 -
137 100.03 - 90.15 -
185 99.41 0.5 89.47 9.25
Cuadro 2. Valores encontrados durante la respiración y fermentación.
Valores Solución 8%
Solución 18%
X 5.97 7.81
Y 2.42 1.6
A 2.92 3.82
B 3.55 2.34
X: g Glucosa consumida durante la fermentación
Y: g Glucosa consumida durante la respiración
A: g CO2 producido durante la fermentación
B: g CO2 producido durante la respiración
En el cuadro 2, se indican los resultados de la glucosa consumida durante la
fermentación y respiración, el CO2 también para ambos casos. Podemos darnos cuenta
que para la solución al 18% existe un mayor consumo de glucosa y una menor
producción de CO2 con respecto a la solución del 8%, este resultado indica que la
solución al 18% un mayor porcentaje de la glucosa se degrado por la vía fermentativa y
en menor porcentaje por la respiración aerobia en comparación a la otra solución. Esta
aclaración se justifica en que por cada 180g de glucosa consumida por fermentación se
generan 88g de CO2 mientras que por respiración se producen 264g de CO2 (Suárez &
Íñigo , 2004).
Existen levaduras que prefieren un metabolismo fermentativo incluso en aerobiosis, en
las cuales como máximo un 10% de glucosa se consume por vía oxidativa (Leveaux &
Bouix, 2000). En nuestra práctica, las levaduras, en la solución al 8% de sacarosa
consumieron el 72% de la glucosa por vía fermentativa mientras que el 28% restante por
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respiración, y para la muestra al 18% de la glucosa consumida el 83% fue pro la vía
fermentativa y el 17% por respiración. Aunque para ambos casos hay un exceso de
consumo de glucosa por respiración debido a que no se pudo mantener las condiciones
anaerobias adecuadamente, para la solución al 18 % el consumo por respiración es
menor lo que concuerda con Suárez & Íñigo (2004) que indica que a mayor
concentración de glucosa favorecerá la anaerobiosis dentro de la solución.
En el cuadro 3 se especifican la cantidad de alcohol formado para ambas muestras así
como su rendimiento experimental y la eficiencia.
Cuadro 3. Rendimiento y eficiencia de la Capacidad fermentativa de la levadura.
Variable Solución 8% Solución 18%
g OH formado 3.0513 3.9936
Rendimiento (e) 0.3635 0.4245
Rendimiento (t) 0.51 0.51
Eficiencia 71.28 83.24
( B l ou in & P e yn au d , 20 03 ) La l ev ad ur a Saccharomyces cerevisiae permite
una conversión aproximada del 85% al cabo de 32horas y del 90% al cabo de 75 horas
en la producción de etanol. Sin embargo en la práctica obtuvimos una eficiencia de 72%
para la muestra de 8°Bx iniciales y 83% para la muestra de 18°Bx, esto se debe a
muchos factores que limitan el proceso. La temperatura de fermentación se encuentra
entre 10 y 35 °C, en este intervalo la velocidad se duplica por toda elevación de
temperatura de alrededor de 10°C, para caer espectacularmente por encima de 35°C.
Estos aumentos d temperatura favorecen la presencia de azúcares residuales y de un
rendimiento de alcohol menor (Blouin & Peynaud , 2003).
Otro factor que acondiciona el rendimiento es la concentración de azúcares ya que una
excesiva concentración de hidratos de carbono en forma de monosacáridos y disacáridos
puede frenar la actividad bacteriana. De la misma forma la baja concentración puede
frenar el proceso (Suárez & Íñigo , 2004).
(Leveaux & Bouix, 2000) Una intervención de oxígeno (por mínima que sea) en el
proceso lo detiene por completo (es el denominado Efecto Pasteur). Esta es la razón por
la que los recipientes fermentadores se cierren herméticamente.
En el cuadro 1 observamos además que los grados Brix finales fueron de 0,5 para la
solución del 8% y 9.25 para la solución del 18%, sin embargo Navarro et al (2000)
indican que la concentración final del azúcar debe ser del 2% para todos los azúcares.
Esto quiere decir que hubo un consumo mayor de glucosa sin embargo como no se
manifestó en el rendimiento este consumo excesivo fue por respiración.
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Figura 6. Comportamiento de la producción de CO2 en la muestra de 8 °Bx.
Figura 7. Comportamiento de la producción de CO2 en la muestra de 18°Bx.
En las figuras 6 y 7 podemos observar, la cantidad de CO2 producido durante el proceso
de fermentación. El fin de esta gráfica es relacionar el CO2 producido con la cantidad de
alcohol producido, las gráficas indican un aumento notable del CO2 sin embargo, al
final del proceso este aumento disminuye, y será hasta llegar al punto en donde no habrá
más producción de este.
En el quinto día el proceso fermentativo se encuentra notablemente avanzado, en el
mosto empiezan a escasear determinados nutrientes, el grado alcohólico es lo
suficientemente importante para comenzar a afectar la permeabilidad de la membrana
celular ocasionando la muerte de la levadura (Suárez & Íñigo , 2004).
Según Navarro et al (1986) la producción de etanol a lo largo de la fermentación es
signifivativamente mayor durante las primeras horas de fermentación, eso es debido al a
alta disponibilidad de sustrato en el medio y a medida que éste se va a agotando las
velocidades de producción disminuyen hasta alcanzar un estado estacionario.
0
1
2
3
4
5
6
7
0 30 60 90 120 150 180 210
CO
2 P
rod
uci
do
(g)
Tiempo (h)
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VI. CONCLUSIONES
Se determinó la glucosa consumida para ambas soluciones, siendo para la solución al
8% de sacarosa un consumo de 8,3931g de los cuales 5,97 g fueron consumidos por el
proceso de fermentación y 2,42g por respiración. Para la solución al 10% de sacarosa el
consumo de glucosa fue de 9,4078g, siendo consumidos 7,81g por el proceso de
fermentación y 1,6g por respiración aerobia.
Se determinó además el CO2 producido en ambas soluciones obteniéndose para la
solución al 8% una producción de 6,47g de CO2 del cual le corresponde 2,92g por el
proceso de fermentación y 3,55g por respiración. Para la solución al 18% el CO2
producido fue de 6,16g siendo la producción de CO2 de 3,82g por el proceso de
fermentación y 2,34g por respiración.
También se determinó la cantidad de alcohol producido para ambas soluciones siendo
los valores de 3,0513g en la solución al 8% con un rendimiento experimental de
0.3635g OH/g Glucosa y 3,9936g en la solución al 18% de sacarosa con un rendimiento
experimental de 0.4245g OH/g Glucosa. La eficiencia de las levaduras fueron de
71.28% en la solución al 8% de sacarosa y 83.24% en la solución al 18%.
VII. RECOMENDACIONES
Es recomendable realizar un estudio para optimizar la producción de etanol,
modificando las condiciones de fermentación, mediante adición del sustrato a diferentes
concentraciones, suplementos nutricionales y reciclado de células y utilización de
diferentes cepas que sean tolerantes al etanol.
La fermentación alcohólica aparte de ser un proceso relativamente barato para la
obtención de alcohol, es poco susceptible a contaminación y posee altos rendimientos.
Es por ello que se recomienda buscar un sustrato más barato proveniente de algún
desecho o residuo para evitar gastar mucho en sacarosa.
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VIII. REFERENCIAS
Blouin, J., & Peynaud , B. (2003). Enología práctica: conocimiento y elaboración del
vino. Madrid: Mundi-Prensa Libros.
De Abate, J. (1999). Biología aplicada. San José: EUNED.
Garrido, A., & Teijón, J. (2006). Fundamentos de bioquímica metabólica. Madrid:
Editorial Tébar .
Klages, F. (1998). Tratado de química orgánica. Valencia: Editorial Reverté S.A.
Koolman, J. (2004). Bioquímica: texto y atlas. Madrid: Editorial Médica Panamericana
S.A.
Leveaux, J., & Bouix, M. (2000). Microbiología Industrial. Zaragoza: Editorial Acribia.
Melo, V., & Cuamatzi, Ó. (2007). Bioquímica de los procesos metabólicos. México:
Reverté Ediciones S.A.
Navarro, e. (1986). Producción de etanol por alta concentración de levaduras. Buenso
Aires: Revista Argentina de Microbiología.
Suárez, J., & Íñigo , B. (2004). Microbiología Enológica: fundamentos de vinificación.
Madrid: Ediciones Mundi-Prensa.
Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2007). Introducción a la Microbiología. Buenos
Aires: Ed. Medica Panamericana.
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ANEXOS
Figura 8. Levadura utilizada para el proceso de fermentación.
Figura 9. Soluciones de sacarosa al 8 y 18% en agua.
Figura 10. Fiolas con las soluciones y levaduras durante la fermentación.