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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.

ESTUDIO DE LA CAPACIDAD FERMENTATIVA DE

MICROORGANISMOS SILVESTRES EN CULTIVOS MIXTOS,

PARA LA PRODUCCIÓN DE ALCOHOL A PARTIR DE

RESIDUOS CÍTRICOS

QUE PARA OBTENER EL GRADO

ACADÉMICO DE

MAESTRO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA

EN LA ESPECIALIDAD DE

PROCESOS AGROINDUSTRIALES

MÉRIDA, YUC. DICIEMBRE 2013

PRESENTA

Q. RAZIEL JESÚS ESTRADA MARTÍNEZ

TESIS

TÍTULO

I

TÍTULO

ESTUDIO DE LA CAPACIDAD FERMENTATIVA DE

MICROORGANISMOS SILVESTRES EN CULTIVOS MIXTOS,

PARA LA PRODUCCIÓN DE ALCOHOL A PARTIR DE

RESIDUOS CÍTRICOS

Presenta: Q. Raziel Jesús Estrada Martínez

Directora de Tesis: Dra. Ingrid Mayanín Rodríguez Buenfil

Co-Directora de Tesis: Dra. María de los Ángeles Sánchez Contreras

Asesora: Dra. Neith Aracely Pacheco López

Asesora: M. C. Tania González Flores

RESUMEN

II

RESUMEN

Se estudió la capacidad fermentativa de microorganismos silvestres de la especie Candida

glabrata (LR2, LR5 y T1) y Candida tropicalis (LR4) para la producción de alcohol a partir

de diferentes fuentes de carbono. Estas cepas demostraron tener la capacidad de fermentar

glucosa para producir alcohol. Las mejores condiciones medio ambientales para favorecer el

crecimiento fueron: 35o C y 200 rpm, indistintamente para las cepas empleadas en medio

YPD. Las mejores condiciones medio ambientales para producción de alcohol variaron para

cada cepa, siendo las mejores condiciones de 45o C para Candida glabrata (LR2), 35o C para

Candida tropicalis (LR4), 40o C para Candida glabrata (LR5) sin agitación en los casos

anteriores y para la cepa Candida glabrata (T1) de 35o C y 200 rpm, en medio YPD. Las

cuatro cepas probadas asimilaron de forma adecuada glucosa, fructosa y sacarosa, variando los

resultados de asimilación en el resto de los azúcares. La cepa Candida tropicalis (LR4) tuvo

los mejores resultados en galactosa y la cepa Candida glabrata (T1) en xilosa, produciendo

alcohol a partir de estas fuentes de carbono. La cepa LR4 produjo la mayor concentración de

alcohol en los cultivos individuales empleando una mezcla de azúcares donde, a partir de 100

g/L produjo 35.31 ± 4.78 g/L con una productividad de 3.92 ± 0.53 g/Ld y a partir de 200 g/L

produjo 44.5 ± 0.1 g/L de alcohol con una productividad de 6.4 ± 0.01 g/Ld. El esquema

secuencial para la formulación de cultivos mixtos resultó ser el más adecuado para el

aprovechamiento total de azúcar (200 g/L) consumiendo un 85.2 ± 2.0 % con una producción

de alcohol de 46.8 ± 2.6 g/L (7.8 ± 0.44 g/Ld) a los 6 días de fermentación. Este esquema

consistió en inocular la cepa Candida tropicalis (LR4) al inicio de la fermentación y 24 h

después se inoculó la cepa Candida glabrata (T1), a 35o C y 200 rpm, estas condiciones

resultaron ser las más adecuadas para el consumo de la mezcla de azúcares a nivel matraz ya

que se obtuvo una productividad de 19.02 ± 0.28 g/Ld. En el bioreactor, el cultivo secuencial a

las condiciones mencionadas y con una aireación de 0.25 vvm, resultó ser lo más adecuado

para la fermentación de la mezcla de azúcares, teniendo una producción de alcohol de 34.34 ±

0.25 g/L y una productividad de 15.26 ± 0.11 g/Ld. Al fermentar un hidrolizado de limón

persa se obtuvo un consumo total de azúcar del 98.13 ± 0.04 %, una producción de alcohol de

11.71 ± 0.02 g/L, una productividad de 10.09 ± 0.02 g/Ld,y un rendimiento de 0.44 ± 0.01

g/g., similar a lo reportado en la literatura para residuos lignocelulósicos.

ÍNDICE DE CONTENIDO

III

ÍNDICE DE CONTENIDO TÍTULO ...................................................................................................................................... I RESUMEN ................................................................................................................................ II ÍNDICE DE CONTENIDO ................................................................................................... III ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLA ....................................................................................... VI DEDICATORIAS ................................................................................................................... XI AGRADECIMIENTOS ........................................................................................................ XII 1.- ANTECEDENTES ............................................................................................................... 1 2.- JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................ 3 3.- HIPÓTESIS .......................................................................................................................... 4 4.- OBJETIVOS ......................................................................................................................... 5

4.1 Objetivo general ............................................................................................................... 5 4.2 Objetivos específicos ........................................................................................................ 5

5.- FUNDAMENTACIÓN ........................................................................................................ 6 5.1 Biomasa lignocelulósica ................................................................................................... 6

5.1.1 Composición de la biomasa lignocelulósica ............................................................ 7 5.1.2 Biomasa cítrica para la producción de etanol ...................................................... 10

5.2 Bioetanol ......................................................................................................................... 13 5.2.1 Bioetanol de segunda generación .......................................................................... 15 5.2.2 Sistemas de producción de Bioetanol .................................................................... 16 5.2.3 Estatus actual en la producción de bioetanol ....................................................... 19

5.3 Microorganismos en el proceso de fermentación........................................................ 20 5.3.1 Fermentación de carbohidratos por levaduras .................................................... 23 5.3.2 Rutas metabólicas para la fermentación de carbohidratos ................................ 26 5.3.3 Fermentación en cultivos mixtos ........................................................................... 30

5.4 Factores que afectan en la fermentación de carbohidratos ....................................... 33 5.5 Aplicación Industrial ..................................................................................................... 36

6.- MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................... 38 6.1 Microorganismos ........................................................................................................... 38 6.2 Medios de cultivo ........................................................................................................... 38

6.2.1 Medio de cultivo 1 ................................................................................................... 38 6.2.2 Medio de cultivo 2 ................................................................................................... 38 6.2.3 Medio de cultivo 3 ................................................................................................... 39 6.2.4 Medio de cultivo 4 ................................................................................................... 39

6.3 Determinación de las condiciones medio ambientales para el crecimiento y fermentación de levaduras silvestres a nivel matraz ........................................................ 40

6.3.1 Cinética de fermentación para la obtención de las condiciones adecuadas de crecimiento y producción de alcohol .............................................................................. 41


IV

6.4 Obtención del perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados en medio sintético ..................................................................................................................... 43

6.4.1 Prueba preliminar de asimilación de carbohidratos ........................................... 43 6.4.2 Perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados ................... 44 6.4.3 Cinética de fermentación para la obtención del perfil de asimilación ............... 45 6.4.4 Modificación en el esquema de propagación ........................................................ 45

6.5 Evaluación de la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en mezclas de azúcares ............................................................................................................. 46

6.5.1 Comparación de dos medios de fermentación ..................................................... 46 6.5.2 Fermentación de cultivos individuales y mixtos .................................................. 47 6.5.3 Cinéticas de fermentación de cultivos individuales y mixtos en mezcla de azúcares ............................................................................................................................ 48

6.6 Establecimiento de las condiciones de fermentación con cultivos mixtos en medio sintético a nivel matraz........................................................................................................ 49

6.6.1 Cinéticas para la obtención de las condiciones de fermentación en cultivo mixto ........................................................................................................................................... 50

6.7 Evaluación de la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado a nivel fermentador de 3 L .............................................................................................................. 51

6.7.1 Cinética de fermentación igualando las mejores condiciones obtenidas a nivel matraz ............................................................................................................................... 51 6.7.2 Cinética de fermentación igualando las mejores condiciones obtenidas a nivel matraz con ajuste de pH ................................................................................................. 51 6.7.3 Cinética de fermentación con modificación de aeración y agitación ................. 52

6.8 Métodos de análisis ........................................................................................................ 55 6.8.1 Determinación de la biomasa celular .................................................................... 55 6.8.2 Determinación de peso seco de la biomasa ........................................................... 55 6.8.3 Determinaciones de azúcares y alcohol ................................................................ 56 6.8.4 Cálculo de parámetros cinéticos de crecimiento .................................................. 57 6.8.5 Parámetros cinéticos de producción de etanol ..................................................... 58 6.8.6 Análisis estadístico .................................................................................................. 59

7.- RESULTADOS Y DISCUSIONES ................................................................................... 60 7.1 Microorganismos ........................................................................................................... 60

7.1.1 Aislamiento de los microorganismos .................................................................... 60 7.1.2 Identificación de los microorganismos ................................................................. 61

7.2 Determinación de las condiciones medio ambientales para el crecimiento y fermentación de levaduras silvestres a nivel matraz ........................................................ 61

7.2.1 Crecimiento ............................................................................................................. 61 7.2.2 Fermentación .......................................................................................................... 68

7.3 Obtención del perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados en medio sintético ..................................................................................................................... 76


V

7.3.1 Prueba preliminar de asimilación de carbohidratos ........................................... 76 7.3.2 Perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados ................... 78 7.3.3 Modificación del esquema de propagación .......................................................... 90

7.4 Evaluación de la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en mezclas de azúcares ............................................................................................................. 97

7.4.1 Comparación de dos medios de fermentación ..................................................... 97 7.4.2 Fermentación con cultivos individuales .............................................................. 100 7.4.3 Fermentación con cultivos mixtos ....................................................................... 111

7.5 Establecimiento de las condiciones de fermentación con cultivos mixtos en medio sintético a nivel matraz...................................................................................................... 119

7.5.1 Cinética de crecimiento utilizando diferentes esquemas de inoculación ......... 119 7.6 Evaluar la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado en un hidrolizado de residuos cítricos a nivel fermentador de 3 L .............................................................. 125

7.6.1 Condiciones similares a matraz sin ajuste de pH y con ajuste de pH ............. 126 7.6.2 Cinéticas de crecimiento con diferentes niveles de aireación y agitación ........ 129 7.6.3 Cinética de fermentación de un hidrolizado de limón persa (Citrus latifolia) 135

8.- CONCLUSIONES ............................................................................................................ 139 9.- RECOMENDACIONES .................................................................................................. 141 10.- BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 143 11.- ANEXO 1 TÉCNICAS ANALÍTICAS ......................................................................... 154 12.- ANEXO 2 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................ 159 13.- ANEXO 3 PRESENTACIONES EN CONGRESOS .................................................. 169

ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS

VI

ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLA

Índice de tablas

Tabla 1. Composición de la biomasa lignocelulósica (Ingram y col., 1999) .............................. 7

Tabla 2. Composición química (% materia seca) en diferentes materias primas lignocelulósicas

(Boluda-Aguilar y col., 2013)................................................................................................ 11

Tabla 3. Microorganismos productores de etanol. .................................................................... 23

Tabla 4. Identificación de las levaduras silvestres .................................................................... 38

Tabla 5. Composición elemental para el crecimiento de levaduras en base a 30 g/L ............... 39

Tabla 6. Composición elemental para el crecimiento de levaduras en base a Nitrógeno por litro

(Atlas R., 2010) (Wilkins y col., 2005) ................................................................................. 40

Tabla 7. Diseño experimental 32, para la determinación de las condiciones de crecimiento y

producción de alcohol ............................................................................................................ 41

Tabla 8. Diseño factorial 4 x 7 con los factores, niveles y respuestas analizadas para la

obtención del perfil de asimilación ........................................................................................ 44

Tabla 9. Diseño factorial 4 x 3 para determinar las condiciones de fermentación .................... 50

Tabla 10. Diseño 22, evaluación de la capacidad fermentativa en cultivo mixto a nivel

bioreactor ............................................................................................................................... 52

Tabla 11. Características microscópicas de los microorganismos silvestres utilizados ............ 60

Tabla 12. Parámetros cinéticos para el crecimiento de las diferentes cepas según el diseño 32

.............................................................................................................................................. .64

Tabla 13. Parámetros cinéticos para la producción de alcohol de las diferentes cepas según el

diseño 32 ................................................................................................................................ 70

Tabla 14. Condiciones de fermentación más adecuadas obtenidas a partir de los resultados

cinéticos y estadísticos .......................................................................................................... 75

Tabla 15. Orden de asimilación de las distintas fuentes de carbono según cepa ...................... 76

Tabla 16. Resultados cinéticos de crecimiento y de producción para las cepas LR2, LR4, LR5

y T1 en medio mínimo .......................................................................................................... 86

Tabla 17. Resultados cinéticos obtenidos en la comparación de los esquemas de propagación

............................................................................................................................................... 95


VII

Tabla 18. Parámetros cinéticos en la comparación de dos medios de fermentación ................. 99

Tabla 19. Parámetros cinéticos de crecimiento en mezcla de azúcares en cultivos individuales

............................................................................................................................................. 102

Tabla 20. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en el medio con

mezcla de azúcar de las cepas LR2, LR4, LR5 y T1, de forma individual ......................... 104

Tabla 21. Parámetros cinéticos de producción de alcohol en mezcla de azúcares en cultivos

individuales .......................................................................................................................... 105


mezcla de azúcar de las cepas LR4 y T1, de forma individual ........................................... 110

Tabla 23. Parámetros cinéticos de producción de alcohol y velocidades de producción en el

medio con mezcla de azúcar de las cepas LR4 y T1, de forma individual .......................... 110


mezcla de azúcar de las cepas LR4 y T1 en cultivo mixto .................................................. 115

Tabla 25. Parámetros cinéticos de producción de alcohol y velocidades de producción en el

medio con mezcla de azúcar en cultivo mixto ..................................................................... 117


mezcla de azúcar de los tratamientos 5 y 9 ......................................................................... 121

Tabla 27. Parámetros cinéticos de producción de alcohol y velocidad de producción en el

medio con mezcla de azúcar del diseño factorial 4 x 3, en cultivos mixtos ........................ 123


mezcla de azúcar en las cinéticas sin y con ajuste de pH .................................................... 128


mezcla de azúcar de los tratamientos 1, 2, 3 y 4 con variaciones en la aireación ............... 131

Tabla 30. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en el hidrolizado

de limón persa ...................................................................................................................... 136

Tabla 31. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en las cinéticas en

el bioreactor de 3 L con mezcla de azúcares e hidrolizado cítrico ...................................... 137


VIII

Índice de figuras

Figura 1. Estructura de la celulosa .............................................................................................. 8 Figura 2. Estructura de la hemicelulosa ...................................................................................... 9 Figura 3. Estructura de la lignina .............................................................................................. 10 Figura 4. Esquema de producción de bioetanol derivado de material lignocelulósico ............. 16 Figura 5. Estrategia de fermentación de biomasa lignocelulósica (Lynd y col., 2002)............. 18 Figura 6. Catabolismo de las hexosas de Saccharomyces cerevisiae………………………… 28 Figura 7. Catabolismo de la D-xilosa y L-arabinosa en una cepa de S. cerevisiae modificada genéticamente. ........................................................................................................................... 29 Figura 8. Esquema de propagación y cinéticas de fermentación en medio YPD ...................... 42 Figura 9. Esquema del procesamiento de las muestras ............................................................. 43 Figura 10. Esquema de cinética de fermentación de cultivos individuales y mixtos ................ 48 Figura 11. Cinética de fermentación de mezclas de azúcares con cultivos mixtos a nivel de bioreactor de 3 L ........................................................................................................................ 53 Figura 12. Relación filogenética de tres cepas de Candida glabrata ........................................ 61 Figura 13. Cinéticas de crecimiento (peso seco) para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1 ................................................................................................................................................... 62 Figura 14. Gráficas de Pareto para a) Peso seco, b) µmáx, c) Yx/s y d) gráfica de interacción para Peso seco de la cepa LR2 en medio YPD .......................................................................... 65 Figura 15. Gráficas de Pareto para a) Peso seco, b) µmáx, c) Yx/s y d) gráfica de interacción para Peso seco de la cepa LR4 en medio YPD .......................................................................... 66 Figura 16. Gráficas de Pareto para a) Peso seco, b) µmáx, c) Yx/s y d) gráfica de interacción para Peso seco de la cepa LR5 en medio YPD .......................................................................... 67 Figura 17. Gráficas de Pareto para a) Peso seco, b) µmáx, c) Yx/s y d) gráfica de interacción para Peso seco de la cepa T1 en medio YPD ............................................................................ 68 Figura 18. Cinéticas de producción de alcohol para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1 ................................................................................................................................................... 69 Figura 19. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) eficiencia, c) Pmáx y d) gráfica de interacción para producción de alcohol para la cepa LR2 en medio YPD ............... 72 Figura 20. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) eficiencia, c) Pmáx y d) gráfica de interacción para producción de alcohol para la cepa LR4 en medio YPD ............... 73 Figura 21. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) eficiencia, c) Pmáx y d) gráfica de interacción para producción de alcohol para la cepa LR5 en medio YPD ............... 74 Figura 22. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) eficiencia, c) Pmáx y d) gráfica de interacción para producción de alcohol para la cepa T1 en medio YPD .................. 75 Figura 23. Asimilación de los distintos azúcares a 540 nm después de 24 h ............................ 77 Figura 24. Gráfico de medias según cepa en la asimilación de a) fructosa y b) galactosa ........ 77 Figura 25. Cinéticas de crecimiento (peso seco) para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes fuentes de carbono. .............................................................................................. 79


IX

Figura 26. Cinéticas de crecimiento (peso seco) para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes fuentes de carbono. .............................................................................................. 80 Figura 27. Cinéticas de producción de alcohol para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes fuentes de carbono. .............................................................................................. 81 Figura 28. Cinéticas de producción de alcohol para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes fuentes de carbono. .............................................................................................. 82 Figura 29. Cinéticas de consumo de carbohidratos para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes fuentes de carbono. ........................................................................................ 83 Figura 30. Cinéticas de consumo de carbohidratos para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes fuentes de carbono. ........................................................................................ 85 Figura 31. a) Gráfica de Pareto y de b) interacción para la respuesta de peso seco en base al diseño 4x7 .................................................................................................................................. 88 Figura 32. a) Gráfica de Pareto y de b) interacción para la respuesta de producción de alcohol en base al diseño 4 x 7 ............................................................................................................... 88 Figura 33. Perfil de asimilación de diferentes fuentes de carbono en base al peso seco ........... 89 Figura 34. Perfil de asimilación de diferentes fuentes de carbono en base a la producción de alcohol ....................................................................................................................................... 90 Figura 35. Cinéticas de crecimiento (Peso seco) en la modificación del esquema de propagación para la cepa a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1. ....................................................... 91 Figura 36. Cinéticas de producción de alcohol en la modificación del esquema de propagación para la cepa a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1.. .......................................................................... 93 Figura 37. Cinéticas de consumo de carbohidratos en la modificación del esquema de propagación para la cepa a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1. ....................................................... 94 Figura 38. Gráfica de medias para a) peso seco y b) producción de alcohol en glucosa comparando el esquema de propagación ................................................................................... 96 Figura 39. Gráfica de medias para a) peso seco y b) producción de alcohol en galactosa comparando el esquema de propagación ................................................................................... 96 Figura 40. Gráficas de a) crecimiento (Peso seco), b) producción de alcohol y c) consumo de carbohidratos en la comparación de dos medios de fermentación. ........................................... 98 Figura 41. Gráfica de medias para a) peso seco y b) producción de alcohol en galactosa comparando el esquema de propagación ................................................................................. 100 Figura 42. Cinéticas de crecimiento en mezcla de azúcares en cultivos individuales............. 101 Figura 43. Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para la cepa a) LR2 y b) LR4, c) LR5 y d) T1............................................................................................. 103 Figura 44. Gráfica de medias para a) peso seco, b) µmáx, c) producción de alcohol y d) Pmáx en mezcla de azúcares en los cultivos individuales empleados ............................................... 106 Figura 45. Cinéticas de crecimiento en mezcla de azúcares en cultivos individuales............. 107 Figura 46. Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para la cepa a) LR4 y b) T1. ........................................................................................................................ 109


X

Figura 47. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para el cultivo mixto CC1.. ................................................................................................................. 112 Figura 48. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para el cultivo mixto CC2. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras. ................................................ 114 Figura 49. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para el cultivo mixto CC3. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras. ................................................ 116 Figura 50. Gráfica de medias para a) producción de alcohol y b) Pmáx en mezcla de azúcares en los cultivos individuales y mixtos empleados.................................................................... 118 Figura 51. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para el tratamiento 5. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras. ........................................................ 120 Figura 52. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para el tratamiento 9. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras. ........................................................ 122 Figura 53. Gráfica de Pareto para a) producción de alcohol, b) Pmáx, c) Yp/s y d) Consumo total de azúcar en mezcla de azúcares variando el tiempo de inóculo ................................... 124 Figura 54. Gráfica de interacción para a) producción de alcohol y b) Pmáx en mezcla de azúcares variando el tiempo de inóculo ................................................................................... 125 Figura 55. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol a las mejores condiciones obtenidas a nivel matraz sin ajuste de pH. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras.. ................................................................................................................................ 127 Figura 56. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol a las mejores condiciones obtenidas a nivel matraz y ajuste de pH. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras.. ................................................................................................................................ 129 Figura 57. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol en el tratamiento 1. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras. ........................................................ 130 Figura 58. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol en el tratamiento 2. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras. ........................................................ 131 Figura 59. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol en el tratamiento 3. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras. ........................................................ 132 Figura 60. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol en el tratamiento 4. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras. ........................................................ 133 Figura 61. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) Yp/s, c) Pmáx y d) gráfica de interacción para producción de alcohol el diseño 22 en mezcla de azúcares ........................... 134 Figura 62. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol en el hidrolizado de limón persa. b) Porcentaje de mezcla de las levaduras.................................... 135 Figura 63. Gráfica de medias para a) Producción de alcohol y b) Pmáx de todos los sistemas probados a nivel bioreactor de 3 L .......................................................................................... 138

DEDICATORIAS

XI

DEDICATORIAS

A mi madre y mis hermanos, quienes siempre creyeron

en que podría alcanzar estas metas que me he trazado y

que nunca me retiraron su apoyo, confianza y sobre todo

el amor.

A Dios que me brindó la oportunidad de culminar otra

etapa en mi vida.

AGRADECIMIENTOS

XII

AGRADECIMIENTOS

Al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco A. C., Unidad Sureste, por la facilidades otorgadas para la realización de este proyecto. Al CONACYT por la beca otorgada, con numero de apoyo 327301. Al Fondo Mixto CONACYT-Gobierno del Estado de Yucatán, Convocatoria 2011-C09 (Clave de proyecto 169165), por el apoyo para realizar esta tesis. A la Dra. Ingrid Mayanin Rodríguez Buenfil, por su constante dirección, apoyo, consejo, dedicación, esfuerzo, confianza, amistad y comprensión en los momentos difíciles este trabajo no habría sido posible. A la Dra. María de los Ángeles Sánchez Contreras, por su constante apoyo y colaboración en la realización de la tesis. A la Dra. Neith Aracely Pacheco López, por su guía, apoyo, comprensión, amistad, consejo y tiempo brindado en la realización de este trabajo. A la M. C. Tania González Flores, por su apoyo, amistad y colaboración en el desarrollo de la tesis. A mi comité tutorial. A los Doctores de la unidad sureste por el apoyo brindado y las enseñanzas compartidas. A mis amigos y compañeros de laboratorio con los que tuve el privilegio de empezar este camino y con los que tuve el privilegio de trabajar.

ANTECEDENTES

1

1.- ANTECEDENTES

La producción de bioetanol (CH3CH2OH) a partir de biomasa lignocelulósica ayudaría a

reducir el consumo de petróleo crudo y la contaminación del medio ambiente (Lang y col.,

2001). Sólo en los últimos años debido al aumento de las preocupaciones ambientales y las

crisis periódicas en algunos de los países más grandes exportadores de petróleo, se ha

convertido el bioetanol, a partir de residuos biomásicos, en una viable y realista alternativa en

el mercado de la energía (Cardona y col., 2007).

Los residuos biomásicos contienen mayoritariamente celulosa, hemicelulosa y pectinas,

moléculas que han sido muy atractivas desde el punto de vista energético, ya que pueden ser

hidrolizadas para la obtención de glucosa y otros azúcares que posteriormente pueden ser

fermentados alcohólicamente (Baig y col., 2004). En el Estado de Yucatán los residuos

cítricos representan una importante fuente de biomasa lignocelulósica ya que se obtienen en

abundancia y a bajo costo. Debido a que la industria citrícola solo aprovecha el 50 % de la

materia prima, se obtienen toneladas de residuos que podrían ser utilizados para la

implementación de un proceso de fermentación.

Wilkins y col., (2005), Widmer y col., (2010) y Boluda-Aguilar y col., (2013) indican que los

azúcares presentes en los hidrolizados cítricos son: glucosa y fructosa principalmente y en

menor proporción galactosa, xilosa, arabinosa, ramnosa y sacarosa. Por lo que es necesario

que los microorganismos utilizados en la fermentación asimilen con alta eficiencia las hexosas

y pentosas presentes en los hidrolizados lignocelulósicos (Hickert y col., 2013).

La gran mayoría de los microorganismos han sido aislados del suelo, materia vegetal en

descomposición, efluentes industriales, residuos municipales, estiércol y rumen (Ten y col.,

2004), donde adquieren la capacidad de asimilar otros tipos de azúcares, por ejemplo las

pentosas (Fromanger y col., 2010), mejorando los rendimientos y productividad en la

fermentación.

ANTECEDENTES

2

También la modificación de algunos de los factores fisicoquímicos en el proceso de

fermentación, como por ejemplo la temperatura, la agitación, pH y la aireación, tienen un

efecto notable, ya que si las condiciones no son las adecuadas, puede disminuir o aún impedir

la formación del metabolito de interés (Arellano y col., 2008).

La levadura Saccharomyces cerevisiae utilizada a nivel industrial, no puede asimilar pentosas

como fuente de carbono. Se ha reportado que levaduras como la Scheffersomyces (Pichia)

stipitis, Pachysolen tannophilus y Candida guilliermondii que asimilan xilosa, presentan una

baja tolerancia a inhibidores, necesitan un suministro controlado de oxígeno para la

producción de etanol y son muy sensibles a este metabolito (Kuhad y col., 2011).

Por lo tanto este trabajo tiene como objetivo determinar la capacidad fermentativa de

microorganismos silvestres en cultivos mixtos, para la producción de alcohol a partir de

residuos cítricos.

JUSTIFICACIÓN

3

2.- JUSTIFICACIÓN

Debido al inminente agotamiento de las reservas petroleras, aunado a la problemática mundial

de emisiones de gases de invernadero a la atmósfera y el consecuente calentamiento global, las

tendencias actuales están enfocadas hacia la producción de etanol y otros alcoholes

combustibles a través de procesos fermentativos, empleando preferente biomasa

lignocelulósica. Debido a los bajos rendimientos de producción de alcohol en la industria este

no ha sido un sustituto de la gasolina convencional. Para poder aumentar los rendimientos en

la fermentación es necesario emplear cepas microbianas que asimilen con alta eficiencia

hexosas y pentosas produciendo etanol a partir de ellas.

La mayoría de los microrganismos de uso industrial están patentados y no están disponibles

para su uso libremente, lo que dificulta la expansión de los procesos de fermentación. Por lo

tanto, existe una necesidad real de disponer de cepas microbianas silvestres o cultivos mixtos,

aisladas de sustratos regionales, que tengan una alta capacidad fermentadora para la

producción de etanol. Estos microrganismos deberían tener, a las condiciones adecuadas, la

capacidad de producir el metabolito de interés, de crecer y sintetizar el producto a gran escala.

Además tener la capacidad de poder crecer en un medio líquido relativamente barato y en

diferentes fuentes de carbono que se puedan obtener en grandes cantidades, como la biomasa

lignocelulósica desecho de la industria, fuente renovable de energía y de bajo costo. Dentro de

la materia prima que podría utilizarse como sustrato están los cítricos sembrados en la

península de Yucatán. Ésta industria genera mucho desperdicio de cáscara, semilla y bagazo

ya que el fruto no se aprovecha en su totalidad. Por lo tanto, el uso de microorganismos

adecuados para la hidrólisis y fermentación de los residuos cítricos, subproductos industriales,

sería un proceso viable para el aprovechamiento y la generación de alcohol a partir de estos

desechos.

HIPÓTESIS

4

3.- HIPÓTESIS

El uso de microrganismos con un amplio perfil de asimilación de carbohidratos permitirá

obtener un proceso fermentativo eficiente con altos rendimientos de producción de alcohol a

partir de residuos cítricos.

OBJETIVOS

5

4.- OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Determinar la capacidad fermentativa de microrganismos silvestres en cultivos mixtos, para la

producción de alcohol a partir de residuos cítricos.

4.2 Objetivos específicos

1.- Determinar las condiciones medio ambientales para el crecimiento y fermentación de

levaduras silvestres a nivel matraz.

2.- Obtener el perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados en medio

sintético.

3.- Evaluar la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en mezclas de

azúcares.

4.- Establecer las condiciones de fermentación con cultivos mixtos en medio sintético a nivel

matraz.

5.- Evaluar la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado en un hidrolizado de

residuos cítricos a nivel fermentador de 3 L.

FUNDAMENTACIÓN

6

5.- FUNDAMENTACIÓN

5.1 Biomasa lignocelulósica

La producción de alcohol a partir de la biomasa, es una forma de reducir el uso de derivados

del petróleo y de tecnologías costosas para su conversión (Demirbas, 2005). El término

biomasa incluye toda la materia orgánica que tiene su origen inmediato en un proceso

biológico. La biomasa vegetal se forma a partir de luz solar mediante la fotosíntesis, con lo

que se producen moléculas de alto contenido energético en forma de energía química. Los

combustibles procedentes de biomasa lignocelulósica son muy atractivos, ya que permiten un

rendimiento más alto por hectárea de combustible y tienden a proyectar mejor la economía.

Las materias primas obtenidas a partir de la biomasa requieren menos energía adicional para el

crecimiento y la cosecha, y puede ser aumentado en muchas circunstancias diferentes, en

contraste con los cultivos anuales, que requieren específicamente de buena calidad de la tierra

(Hamelincka y Faaij, 2006). Una razón adicional para la introducción de residuos agrícolas

como posibles fuentes de energía renovables es que los métodos actuales para su eliminación

han causado problemas ambientales (Demirbas y col., 2006).

La introducción de biocombustibles sería especialmente importante para el sector del

transporte, ya que es responsable del 18 % del consumo de energía primaria en todo el mundo.

Los procesos de conversión de la biomasa lignocelulósica se puede dividir en dos grandes

categorías: biológicos (fermentación y digestión anaerobia) y termoquímicos (combustión,

gasificación y pirólisis). Por estos métodos se transforma a la celulosa, hemicelulosa y pectina,

moléculas que se han vuelto muy atractivas desde el punto de vista energético debido a que

pueden ser hidrolizadas para la obtención de glucosa y otros azúcares que son fermentados

posteriormente, como se observa en la tabla 1 (Baig y col, 2004). El alcohol obtenido a partir

de azúcares simples y almidón es llamado de primera generación mientras que el alcohol

obtenido a partir de material lignocelulósico (también denominado biomasa) es llamado de

segunda generación (Canto, 2007). Con base en esto, Cannell (2003) destaca que una hectárea

de cultivos ricos en energía usada para la producción de biocombustibles líquidos (etanol)

puede evitar la emisión de 0.2 – 2.0 toneladas de carbono a la atmósfera en comparación con

FUNDAMENTACIÓN

7

el empleo de combustibles fósiles. Esta reducción de carbono sería favorable debido a que

disminuirían las consecuencias del efecto invernadero, entre otros factores, a nivel global.

Tabla 1. Composición de la biomasa lignocelulósica (Ingram y col., 1999)

Fracción Contenido en lignocelulosa (%) Monómeros Celulosa 33-51 Glucosa

Hemicelulosa 19-34 Glucosa, manosa, galactosa,

xilosa, y arabinosa Lignina 20-30 Alcoholes aromáticos

Pectina 2-20 Ácido galacturónico y

ramnosa

Hay una amplia variedad de materias primas potenciales para la producción principalmente de

etanol combustible. Árboles de rápido crecimiento, hierba, plantas enteras, subproductos

industriales, plantas acuáticas, productos de desecho (incluida la agricultura, la industria del

papel y los residuos forestales), municipales, todos representan ejemplos de recursos

lignocelulósicos y derivados. La naturaleza y disponibilidad de las materias primas

lignocelulósicas en diferentes partes del mundo depende del clima y otros factores

ambientales, las prácticas agrícolas y desarrollo tecnológico (Van Maris y col., 2006).

5.1.1 Composición de la biomasa lignocelulósica

La lignocelulosa (celulosa, hemicelulosa y lignina) es el principal y más abundante

componente de la biomasa producida por la fotosíntesis, anualmente se forman 200,000

millones de toneladas en el mundo (Ragauskas y col., 2006). La pared celular de las plantas

está formada por lignocelulosa, la composición y porcentajes de los polímeros varían entre las

especies de plantas, incluso entre la edad y la etapa de crecimiento.

5.1.1.1 Celulosa

La celulosa (figura 1) es un componente lineal estructural de la pared celular de una planta

que consiste en una cadena larga de monómeros de glucosa con enlaces β (1-4)- glicosídicos

que pueden alcanzar varios miles de unidades de glucosa en longitud. Los extensos enlaces de

hidrógeno entre las moléculas conducen a una estructura de matriz fuerte y cristalina

FUNDAMENTACIÓN

8

(Ebringerova y col., 2005). Esta retícula de numerosos grupos hidroxilo constituyen las

microfibrillas que dan a la molécula más fuerza y capacidad. A pesar de que materiales de

almidón requieren temperaturas de sólo 60-70o C para ser convertidos de la textura cristalina a

amorfa, la celulosa requiere de 320o C así como de una presión de 25 MPa para cambiar de un

estado cristalino rígido a una estructura amorfa en agua (Deguchi y col., 2006).

La celulosa es el polímero orgánico más abundante, con una composición de

aproximadamente del 30% en plantas. Algodón, lino y pastas químicas representan las fuentes

más puras de celulosa (85-95% y 60-80%, respectivamente) mientras que maderas blandas y

duras contienen aproximadamente un 45 % de celulosa (Demirbas. 2005).

Figura 1. Estructura de la celulosa (Deguchi y col., 2006)

5.1.1.2 Hemicelulosa

La hemicelulosa (figura 2) es una estructura amorfa y variable formada de heteropolímeros

incluyendo a las hexosas (D-glucosa, D-galactosa y D-manosa), así como de las pentosas (D-

xilosa y L-arabinosa) y puede contener ácidos de azúcares (ácidos urónicos), como el D-

glucurónico, D-galacturónico y ácidos metilgalacturónicos.

La cadena principal se compone principalmente de xilano con enlaces β(1-4) que incluyen

xilosa (casi 90%) y arabinosa (aproximadamente un 10%) variando en porcentaje dependiendo

de su naturaleza. Debido a la diversidad de azúcares presentes en la hemicelulosa, se requiere

de una amplia gama de enzimas para ser completamente hidrolizada en monómeros simples

(Girio y col., 2010).

FUNDAMENTACIÓN

9

Figura 2. Estructura de la hemicelulosa (Girio y col., 2010)

5.1.1.3 Lignina

La lignina (Figura 3) es un heteropolímero amorfo, aromático, rígido, tridimensional y

ramificado con un peso molecular de 10,000 Daltons formado por alcoholes aromáticos que

gracias a sus enlaces covalentes al xilano de la hemicelulosa da soporte estructural, rigidez,

impermeabilidad y protección a los polisacáridos estructurales (celulosa y hemicelulosa) y es

altamente resistente a la degradación química y biológica.

La molécula de lignina presenta un elevado peso molecular, que resulta de la unión de varios

ácidos y alcoholes fenilpropílicos (cumarílico, coniferílico y sinapílico). El acoplamiento

aleatorio de estos radicales da origen a una estructura tridimensional, polímero amorfo,

característico de la lignina (Aro y col., 2005).

La lignina es el polímero natural más complejo en relación a su estructura y heterogeneidad.

Por esta razón no es posible describir una estructura definida de la lignina; sin embargo, se han

propuesto numerosos modelos que representan su estructura.

FUNDAMENTACIÓN

10

Figura 3. Estructura de la lignina (Aro y col., 2005)

5.1.2 Biomasa cítrica para la producción de etanol

Los cítricos son uno de los más abundantes cultivos en el mundo, con una producción anual de

aproximadamente de 102 millones de toneladas métricas en el 2007 (González-Molina y col.,

2010). Los principales cultivos cítricos son la naranja, la mandarina y el limón.

En el estado de Florida (EUA) se generan alrededor de 10 millones de toneladas de naranja al

año con un desecho de alrededor de 5 millones de toneladas (Wilkins y col., 2005). Los

desechos cítricos están formados principalmente de las cáscaras, semillas y membranas del

fruto. La biomasa obtenida es convertida en pulpa de cítricos, pero debido a su bajo costo en el

mercado, los investigadores se han enfocado a la conversión de este desecho en azúcares

fermentables por hidrólisis enzimática y su posterior fermentación. Los desechos obtenidos de

la mandarina y del limón son otro tipo de materia prima con una alta producción a nivel

mundial y con potencial para la obtención de etanol (Boluda-Aguilar y col., 2010) debido a su

alto contenido de carbohidratos como se demuestra en la tabla 2.

FUNDAMENTACIÓN

11

Utilizando residuos cítricos, Wilkins y col. (2005), Boluda-Aguilar y col., (2010, 2013)

concluyeron que los carbohidratos que principalmente se obtienen de los residuos son: glucosa

y fructosa como carbohidratos mayoritarios, y en menor proporción sacarosa, galactosa,

xilosa, arabinosa y ramnosa. Con base en los carbohidratos obtenidos, Wilkins y col., (2005)

calcularon el rendimiento de azúcares que fermentarían diferentes organismos obteniendo un

40.7 % para la cepa S. cerevisiae y para la E. coli, un 59.03 %.

Tabla 2. Composición química (% materia seca) en diferentes materias primas lignocelulósicas (Boluda-Aguilar y col., 2013)

Cenizas Azúcar Grasas Proteína Pectina Lignina Celulosa Hemicelulosa Cáscara de mandarina

5.0 10.1 1.6 7.5 16.0 8.6 22.5 6.0

Cáscara de limón

2.5 6.5 1.50 7.0 13.0 7.6 23.1 8.1

Cáscara de naranja

2.6 9.6 40 9.1 23.0 7.5 37.1 11.0

Cáscara de toronja

8.1 8.1 0.5 12.5 8.5 11.6 26.57 5.60

Cáscara de soya

1.0-2.8 ND ND 9.0-14.0 6.0-15.0 1.0-4.0 29.0-51.0 10.0-20.0

Rastrojo de maíz

4.0-8-0 ND ND 4.0-9.0 ND 16.0-23.0 31.0-41.0 20.0-34.0

Paja de trigo

1.0-10.0 ND ND 2.0-6.0 ND 5.0-19.0 32.0-49.0 23.0-39.0

ND: no detectado

Con estos porcentajes calcularon el etanol teórico obteniendo de 5.07 a 5.46 % y 6.43 a 6.76

% en peso, respectivamente. Con los datos anteriores, observaron que la segunda cepa daba

mejores rendimientos al fermentar los carbohidratos, aunque fue constante la producción de

alcohol en la fermentación de los residuos naranja para ambas cepas.

Boluda-Aguilar y col., en (2010) y (2013), estudiaron la fermentación de residuos de

mandarina y limón obteniendo como producto etanol y como co-productos ácido

galacturónico y D-Limoneno. En ambos casos la materia prima recibió un tratamiento de

explosión a vapor con la finalidad de eliminar la mayor cantidad de aceites esenciales ya que

son inhibitorios para el crecimiento de los microorganismos. En ambos casos, con la ayuda de

este pretratamiento, se obtuvo un contenido de aceites esenciales por debajo del 0.05 % (v/w)

reportado como la concentración mínima inhibitoria para la producción de etanol en levaduras

a 37o C (Wilkins, 2009). El máximo contenido de etanol obtenido en la fermentación de

FUNDAMENTACIÓN

12

mandarina fue de 50-60 L/1000 kg de cáscara de mandarina fresca y de D-Limoneno de 0.02

% (v/w) y para el caso del limón se obtuvo una producción de 60 L/1000 kg de cáscara de

limón fresco y de D-Limoneno de 0.025 % (v/w). El Estado de Yucatán es uno de los

principales productores de cítricos a nivel nacional, entre los diversos frutos podemos

encontrar la naranja dulce, naranja agria, limón persa, limón italiano, toronja y mandarina. La

producción citrícola anual en el estado de Yucatán alcanza las 249 mil 351 toneladas, con una

superficie de cultivo de 19 mil 603 hectáreas y más de 13 mil productores dedicados a este

rubro. Y se estima una producción nacional estimada para el 2013 de 6 millones de toneladas

de cítricos.

De la actividad citrícola local se pueden obtener diferentes productos como lo son los frutos

frescos, el jugo y aceites naturales que es su mayor porcentaje son comercializados a nivel

nacional e internacional. Las plantas destinadas a la elaboración de estos productos de

consumo humano solo aprovechan la mitad de la materia prima, lo que implica 125 mil

toneladas de residuos como corteza, semillas y pulpa (SIAP, 2012). La rápida fermentación de

estos subproductos debido a las condiciones atmosféricas que prevalecen en el estado (altas

temperaturas y humedad) convierten a estos desechos en un foco de contaminación de suma

importancia. Los subproductos cuentan con un alto contenido energético que podrían ser

aprovechados para la producción de combustible mediante la fermentación de ésta biomasa

(Osorio y col. 2003). El interés en la utilización de residuos frutícolas se justifica por el bajo

costo de estos materiales y la naturaleza renovable (Lozano, 2008).

En relación a este tema, Zhou y col. (2008) plantearon una vía para el aprovechamiento

integral de las cáscaras de cítricos, en el que el proceso utiliza la levadura Saccharomyces

cerevisiae para la hidrólisis y la fermentación simultánea con agitación continua, a un pH de

4.2 - 4.8 en planta piloto. En este estudio se recuperaron subproductos como el D-limoneno y

los residuos finales fueron utilizados como alimento para rumiantes. Entre los resultados

obtuvieron de la cáscara de cítricos un 4 % de etanol (w/v) y afirman que esta nueva

tecnología ofrece una alternativa para el aprovechamientos de las cáscaras del sector citrícola

usando diversos microorganismos fermentadores.

FUNDAMENTACIÓN

13

En otro estudio, Lennartsson y col. (2012) utilizaron una cepa zigomicetes, Mucor indicus,

que tiene la capacidad de crecer en hidrolizados de cítricos y resistir hasta 2% de D-limoneno

considerado como un inhibidor de crecimiento. Además esta cepa tiene la capacidad de

asimilar ácido galacturónico proveniente de la degradación de la pectina en condiciones

aeróbicas. Este hongo asimila glucosa, fructosa y produce glicerol.

5.2 Bioetanol

Para reducir el consumo de petróleo crudo y la contaminación del medio ambiente, la

producción de bioetanol (CH3CH2OH) a partir de biomasa surge como una alternativa viable

para tratar de erradicar estos problemas (Lang y col., 2001). La consideración primordial

consiste, en la producción de bioetanol a partir de recursos renovables y la determinación de la

viabilidad económica y técnica de uso de alcohol como combustible de automoción mezclado

con gasolina (Goldstein, 1981) ya que el etanol representa, en los últimos años, un importante

combustible renovable líquido para vehículos de motor (Lewis, 1996).

El uso de gasohol (etanol y la mezcla de gasolina) es una de las alternativas que se ha

empleado para reducir la contaminación ambiental en todo el mundo provocada por los

combustibles fósiles. Su producción nacional y el uso de etanol como combustible puede

ayudar a disminuir la dependencia al petróleo y además de reducir el déficit comercial, crear

puestos de trabajo en las zonas rurales, reducir la contaminación atmosférica y reducir el

cambio climático global debido a la acumulación de dióxido de carbono.

El etanol, a diferencia de la gasolina, es un combustible oxigenado que contiene 35% de

oxígeno, lo que reduce emisiones de partículas y de NOx de la combustión. Cuando se quema,

etanol derivado de los procesos de fermentación no produce aumento neto de dióxido de

carbono en la atmósfera. También, éste combustible, es un aditivo que mejora el octanaje y

elimina el agua libre que se genera al conectar las líneas de combustible en climas fríos o por

contaminación directa (Lang y col., 2000).

FUNDAMENTACIÓN

14

El uso de bioetanol como combustible de transporte se refiere a la combustión de la mezcla de

combustible (5, 10 hasta un 85% de etanol en gasolina) utilizando un vehículo con motor de

combustión interna. El tubo de salida de emisiones en este caso es el aspecto más importante a

considerar ya que la mezcla de etanol y gasolina pura, sin duda producen diferentes emisiones.

Hasta en un 10% de etanol en la mezcla de combustible puede ser utilizado en un vehículo

convencional, mientras que un combustible con una mezcla del 85 % necesita un motor

modificado (Flexfuel).

De acuerdo con Festel (2008), la densidad energética del bioetanol (21.14 MJ/L) es de

alrededor del 33-34% menor que la de la gasolina convencional (32 MJ/L). Sin embargo, la

eficiencia en la combustión de una mezcla de combustible en términos de distancia recorrido

en kilómetros es determinada también por el tipo de vehículo, tipo de carretera, composición

del combustible y la velocidad del vehículo. Un alto porcentaje de etanol en la mezcla de

combustible parece ser más útil para ver claramente el desempeño del bioetanol en

comparación con la gasolina actualmente empleada (Bai y col., 2010).

Sin embargo, la producción de etanol es un proceso complicado. La transformación de

recursos biomásicos, cultivos ricos en energía, exige el acondicionamiento o pre-tratamiento

de la materia prima para la fermentación de los azúcares y convertirlos en etanol (Lozano,

2008). La complejidad de este proceso explica en parte por qué el etanol no ha jugado un

papel de liderazgo en comparación con los combustibles más baratos derivados del petróleo.

La formación de etanol utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae a partir de sustratos

como la caña de azúcar, el trigo, el maíz y los cítricos han sido ampliamente estudiados

(Alberts y col., 2009) (Widmer y col., 2010). Sin embargo, existe una necesidad de desarrollar

técnicas que contemplen a los residuos lignocelulósicos con la finalidad de evitar el uso de

sustratos del mercado de los alimentos.

FUNDAMENTACIÓN

15

5.2.1 Bioetanol de segunda generación

Una característica importante del bioetanol de segunda generación en comparación con el de

primera generación está en el tipo de materia prima empleada. El bioetanol de primera

generación utiliza azúcar comestible y almidón como materias primas, mientras que el

bioetanol de segunda generación utiliza biomasa lignocelulósica no comestible. El término de

biomasa se utiliza a menudo en un sentido más amplio.

Por ejemplo, Lal (2005), adopta una definición de biomasa renovable a toda materia orgánica

incluyendo materiales vegetales, productos animales y estiércol, subproductos del

procesamiento de alimentos y agricultura, así como desechos urbanos. La conversión de la

biomasa en bioetanol consiste en varios pasos de procesamiento (figura 4), tales como

tratamiento previo para reducir el tamaño de partícula, eliminar lignina u otros inhibidores, la

hidrólisis de la hemicelulosa a pentosas, la hidrólisis de la celulosa para producir hexosas y la

fermentación para convertir ambos azúcares en bioetanol.

La levadura es utilizada convencionalmente para convertir principalmente glucosa, pero

recientemente algunos microorganismos son conocidos por ser capaces de consumir tanto

pentosas como hexosas, dando un rendimiento más alto de bioetanol (Kuhad y col., 2011)

Diferentes configuraciones se pueden organizar para la obtención del bioetanol como pueden

ser SHF (hidrólisis y fermentación separada), la SSF (sacarificación y fermentación

simultáneas), la SSCF (sacarificación y co-fermentación simultánea) o el más avanzado

proceso CBP (bioproceso consolidado). Estos diferentes procesos representan un nivel

creciente en la tecnología. La co-fermentación de hexosas y pentosas junto con el proceso

CBP en teoría darán un mayor rendimiento y requerirán menos energía. Sin embargo, estos

procesos avanzados todavía están en etapas de desarrollo y se clasifican como tecnologías a

mediano y largo plazo. El inconveniente del uso de tales tecnologías del futuro es que ninguna

se podrá validar ya que no existen procesos comerciales similares (Wiloso y col., 2012).

FUNDAMENTACIÓN

16

Figura 4. Esquema de producción de bioetanol derivado de material lignocelulósico (Sandoval, 2010)

Las enzimas celulolíticas utilizadas para hidrolizar los polímeros de la biomasa lignocelulósica

en monómeros de azúcar son conocidas por ser un factor dominante en costo global de la

producción de bioetanol. El proceso para la producción de las enzimas es muy costoso. El

proceso de destilación y la deshidratación del etanol utilizados para aumentar la pureza del

compuesto requieren una gran cantidad de energía, esto resultaría de gran impacto sobre el

balance neto de energía y en los costos de producción de bioetanol (Wiloso y col., 2012).

5.2.2 Sistemas de producción de Bioetanol

Cuatro procesos biológicos son empleados en el proceso de producción de etanol a partir de

biomasa lignocelulósica. 1) La producción de enzimas celulolíticas, 2) la hidrólisis de

materiales celulósicos, 3) la fermentación de hexosas y 4) la fermentación de pentosas. Para

que este proceso se lleve a cabo se han reportado diferentes configuraciones, que difieren en el

grado de consolidación de los cuatro pasos. En la figura 5, se presentan diferentes estrategias

FUNDAMENTACIÓN

17

donde una fracción de la biomasa lignocelulósica se utiliza para producir celulasas, pero la

mayoría se utiliza directamente en el proceso de producción de etanol.

El proceso más simple es la hidrólisis y la fermentación separada (SHF), donde los pasos se

realizan independientemente y es posible utilizar diferentes organismos en cada una. La

ventaja es que cada paso puede realizarse a las condiciones óptimas de la misma. Sin embargo,

la glucosa y celobiosa podrían ser productos inhibidores en la actividad enzimática

disminuyendo los rendimientos de hidrólisis, también se ha observado la contaminación

microbiana asociado al proceso de fermentación a escala industrial (Talebnia y col., 2010). La

sacarificación y fermentación simultánea (SSF) combina la hidrólisis y la fermentación de

hexosas en un solo paso. El proceso tiene la ventaja que los azúcares no inhiben las celulasas

durante la hidrólisis por que se utilizan de inmediato por los microorganismos de

fermentación. Los azúcares inhiben el proceso de mucho más que el etanol.

Con la SSF se tienen los mayores rendimientos de etanol y la necesidad energética es mucho

menor, pero también necesita más enzimas, que son una de las piezas más costosas en todo el

proceso. También, disminuye el número de reactores y por lo tanto en el costo de inversión.

Sin embargo uno de los principales inconvenientes es que la temperatura óptima necesaria

para la sacarificación rara vez es la más adecuada para la fermentación, reduciendo la

eficiencia de hidrólisis (Hasunuma y Kondo, 2012). Un enfoque más consolidado, es la

sacarificación y co-fermentación simultánea (SSCF), donde la hidrólisis y la fermentación de

hexosas y pentosas se producen en un solo paso. Uno de los principales problemas de este

sistema es que los microorganismos que utilizan pentosas también prefieren hexosas como

principal sustrato.

Por lo que si un microorganismo, como por ejemplo, la S. cerevisiae es inoculado junto a otro

microorgnismo existe una competencia en el consumo de las hexosas y pentosas, lo que suele

dar como resultado un rendimiento de etanol más bajo. Para superar este efecto secuencial de

fermentación de hexosas y pentosas se ha propuesto, que los microorganismos que fermenten

pentosas sean añadidos al sustrato después de que se completó el consumo de las hexosas,

pero en el mismo reactor.

FUNDAMENTACIÓN

18

Figura 5. Estrategia de fermentación de biomasa lignocelulósica (Lynd y col., 2002)

Sin embargo, los rendimientos de etanol de fermentación secuencial siguen siendo bajos.

Reportes demuestran el uso de microorganismos modificados genéticamente como la S.

cerevisiae o Z. mobilis, que tienen altos rendimientos y tolerantes al etanol, para que

fermenten las pentosas junto con las hexosas (Cardona y col., 2007).

El proceso que se conoce como bioproceso consolidado (CBP), trata de integrar los cuatro

procesos un uno solo. La tendencia en la tecnología de procesamiento de la biomasa entra en

este bioproceso ya que se cree que tiene el mayor potencial en ahorro de costos. La razón

principal de esto es que la producción de celulasas puede constituir más del 50 % de todo el

proceso en costos, además, no se necesita sustrato adicional para la producción de enzimas

(Lynd y col., 2002).

FUNDAMENTACIÓN

19

5.2.3 Estatus actual en la producción de bioetanol

Durante los últimos diez años, ha habido un aumento dramático en la producción de bioetanol

a partir de 16.9 billones de litros en el 2000 hasta billones de litros en el 2009 (Sorda y col.,

2010). La producción está dominada por los EE. UU. y Brasil con base en el grano de maíz y

jarabe de caña de azúcar, respectivamente. Pero su uso como combustible, ha sido retardado

por las crecientes preocupaciones de competencia con los alimentos, la producción real de

energía neta, y las consecuencias relacionadas con el cambio de uso del suelo (De Olivera y

col., 2005).

La competencia con los alimentos en EE. UU. se refleja en la reasignación de 20 % de maíz a

la producción de etanol en el 2006, y esta asignación se ha culpado en parte por el aumento de

los precios en los alimentos en los últimos años (Sorda y col., 2010). En Brasil, el costo de

producción de etanol a partir de caña de azúcar es muy alto y viene dado por el precio de las

materias primas que representan el 70% del costo total de la producción (Soccol y col., 2010).

Teniendo en cuenta esto, existe una necesidad de explorar nuevas materias primas alternativas,

como la biomasa lignocelulosa.

Este tipo de materia prima disponible en abundancia en muchos países, y su utilización sólo

compite con los recursos alimenticios de forma limitada. En muchos casos, este tipo de

materia prima no necesita de tierra fértil y extensa para su generación, de modo que su

potencial es muy alto y se espera reducir el impacto ambiental y social en gran medida con la

generación de biocombustibles. Otra motivación para explotar tales biocombustibles basados

en lignocelulosa es mejorar el balance de emisiones de gases de efecto invernadero. Aunque

hay mucho potencial para la biomasa lignocelulósica como materia prima, la producción de

bioetanol en muchos países hasta ahora ha sido desalentadora.

En los EE. UU., por ejemplo, los altos costos de producción hacen que el bioetanol como

biocombustible de transporte sigue siendo muy caro (Schnoor, 2011). La razón de estos altos

costos se debe en parte a las características de la biomasa ya que se necesitan tecnologías de

procesamiento avanzadas, incluyendo pretratamiento, hidrólisis de la celulosa y hemicelulosa,

FUNDAMENTACIÓN

20

y co-fermentación de los azúcares obtenidos (Hamelinck y col., 2005). Como resultado de

ello, recientemente, el gobierno de EE. UU. ha reducido el mandato de etanol celulósico de

250 a 6 millones de galones por año (Schnoor, 2011).

Esto sugiere que la tecnología de conversión para la producción de bioetanol en la etapa

comercial sigue siendo insuficiente. Todavía se necesita más tiempo para el desarrollo de

tecnología avanzada y eficiente. En conclusión Phalan (2009), menciona que la promesa de

la situación de los biocombustibles todavía pueden no ser aplicables en gran medida en

algunos países, pero en general puede contribuir a diversificar la oferta y reducir la

dependencia neta de los combustibles fósiles.

5.3 Microorganismos en el proceso de fermentación

La fermentación etanólica es un proceso biológico, en el cual el material orgánico es

convertido por microorganismos en compuestos más simples, como los carbohidratos. Éstos

posteriormente son fermentados para producir etanol, dióxido de carbono, y otros compuestos

tales como hidrógeno y ácidos orgánicos; dependiendo del tipo de microorganismo y la ruta

metabólica de conversión. Durante todo el proceso de conversión de biomasa lignocelulósica

en etanol, existen principalmente dos tipos de microorganismos, los que convierten los

carbohidratos fermentables a etanol y los que producen enzimas para catalizar las reacciones

de hidrólisis del material lignocelulósico (Lin y col., 2006).

Las levaduras silvestres aisladas de la materia orgánica pueden ser utilizadas en varios campos

industriales y biotecnológicos gracias a los múltiples mecanismos de adaptación que han

desarrollado, así como para la producción de etanol. Levadura, es un nombre genérico que

agrupa a una variedad de especies tanto patógenas para plantas y animales, como especies no

solamente inocuas sino de gran utilidad. Las levaduras son hongos unicelulares y la mayoría

son ascomicetos. Generalmente, son células ovales o cilíndricas y su división es habitualmente

por gemación. Durante el proceso de gemación, se origina una pequeña yema que aumenta de

tamaño gradualmente y se separa de la célula.

FUNDAMENTACIÓN

21

Las levaduras normalmente no desarrollan un micelio, sino que permanecen en estado

unicelular durante todo el ciclo de crecimiento, aunque algunas pueden presentar crecimiento

micelar. Los microorganismos, en este caso las levaduras, nos ayudan a realizar el proceso de

fermentación y obtener el etanol. La fermentación alcohólica implica la degradación de las

hexosas, por la vía glucolítica, hasta piruvato y, posteriormente, la actuación de las llamadas

enzimas alcohologénicas, que producen etanol como producto final de la fermentación,

regenerando el poder reductor, en forma de NAD. En términos químicos se establece la

ecuación formulada por Gay-Lussac en el año 1820:

C6H12O6 2(CH3-CH2OH) + 2CO2

Glucosa Etanol Anhídrido carbónico

Por lo tanto es importante conocer la cinética de crecimiento de los cultivos microbianos para

pronosticar la evolución del cultivo, el consumo del sustrato y la acumulación de etanol. La

modificación de algunos de los factores físicos, como por ejemplo la temperatura, agitación y

el pH, tiene un efecto notable sobre un proceso fermentativo, ya que si el valor utilizado no es

adecuado puede disminuir o aún impedir la formación de un determinado metabolito (Arellano

y col., 2008). La mayoría de las levaduras tolera un rango de pH entre 3 y 10, pero prefieren

un medio ligeramente ácido con un pH de 4.5 a 6.5. Los microorganismos utilizados en la

industria para la producción de etanol, son seleccionados para proporcionar la mejor

combinación posible de características para el proceso y equipo usado. Las características

deseadas en el proceso industrial de producción de etanol dependen del microorganismo usado

en la fermentación.

Las características deseadas de los microorganismos para la producción de alcohol son:

� Altos rendimientos de producto por unidad de sustrato consumido

� Velocidades de fermentación altas

� Tolerancia a una elevada concentración de etanol

� Viabilidad a temperaturas elevadas

� Estabilidad bajo condiciones de fermentación adecuadas

� Tolerancia a pH ácido

FUNDAMENTACIÓN

22

Los microorganismos degradadores de carbohidratos proceden de diversas fuentes, la gran

mayoría de ellos han sido aislados del suelo, materia vegetal en descomposición, efluentes

industriales, residuos municipales, estiércol y rumen (Ten y col., 2004). El rumen es una

adaptación simbiótica entre la vaca y un ecosistema microbiano, que facilita el

almacenamiento y procesamiento de diferentes nutrientes durante su consumo. Las tres

grandes poblaciones que predominan en el ecosistema ruminal son las bacterias, los

protozoarios y los hongos. El rumen tiene un tamaño relativamente grande, con una capacidad

de 100 a 150 litros en una vaca o 6 litros en una oveja, y se encuentra a una temperatura de 38-

42°C (Yokoyama y col., 1988) y a un pH de 5.5 – 7 (Krause y col., 2006).

Los microorganismos que viven en el rumen son capaces de digerir las paredes celulares de las

plantas (celulosa y hemicelulosa) que consumen los bovinos para producir azúcares simples

(glucosa) como fuente de energía. Entre los microorganismos del rumen se pueden mencionar

la especie bacteriana Ruminococcus albus que fermenta celulosa, celobiosa y glucosa, entre

otros carbohidratos, originando como principal producto de fermentación ácido acético, etanol

y en menor proporción los ácidos láctico y fórmico (Grudsky y col., 1983). La diversidad de

microorganismos del rumen es importante porque la presencia de especies distintas aporta un

conjunto mayor de genes y complemento de enzimas, así como reacciones bioquímicas

precisas para una conversión máxima de productos alimenticios en células microbianas y

productos de fermentación.

De la misma forma los microrganismos que viven en el intestino de las termitas tienen

enzimas eficientes que son capaces de transformar celulosa en azúcares para la producción del

etanol. El tracto intestinal de las termitas comprende uno o varios compartimentos dilatados

del intestino grueso, que albergan la mayor parte de la microbiota intestinal y son

considerados como cámara de fermentación análoga a la del rumen de las ovejas y del ganado

(es decir, ambientes anóxicos o anaerobios, con una microbiota sensible al oxígeno).

Las actividades metabólicas más importantes, que tradicionalmente se atribuyen a la

microbiota intestinal son, primero, la hidrólisis de la celulosa y hemicelulosa, en segundo

lugar, fermentación de los productos de despolimerización de cadena corta, ácidos grasos, que

FUNDAMENTACIÓN

23

luego son reabsorbidos por el huésped, y tercera, la fijación de nitrógeno intestinal. (Breznak y

Brune, 1994) (Brune A., 1998).

5.3.1 Fermentación de carbohidratos por levaduras

La cinética de crecimiento y el consumo de azúcar dependen cualitativamente y

cuantitativamente en la especie de levadura, tipo y concentración del azúcar, la disponibilidad

de oxígeno, y otros parámetros ambientales, que incluyen temperatura, pH, composición del

medio, y la presencia de metabolitos. Durante la fermentación, pentosas (5C) y hexosas (6C)

son transformadas a etanol en condiciones anaeróbicas o aeróbicas, históricamente la levadura

(Saccharomyces cerevisiae) se ha usado para fermentar hexosas, principalmente glucosa.

Otros microorganismos como Zymomonas mobilis o E. coli se han utilizado para fermentar

tanto hexosas y pentosas (Dwivedi y col., 2009). Muchas revisiones han sido publicados en la

producción de etanol por microorganismos fermentativos, muchas bacterias y levaduras has

sido reportadas por su capacidad de asimilar diferentes fuentes de carbono y producir etanol a

partir de ellas (tabla 3).

Tabla 3. Microorganismos productores de etanol.

Microorganismo Tipo de

microorganismo Sustrato

asimilable Rendimiento

(%) Referencia

Saccharomyces cerevisiae

Levadura Glucosa, galactosa, maltosa, sacarosa

43-87 Siqueira y col.,

(2008)

Pichia stipitis Levadura Glucosa, xilosa,

arabinosa, manosa 83-92

Drapcho y col., (2008)

Candida shehatae levadura Glucosa, xilosa, arabinosa, manosa

75-90 Kumar y col., (2007)

Candida tropicalis levadura

Glucosa, xilosa, sacarosa,

celobiosa, sorbitol, maltosa

76-85 Jamai y col.,

(2007)

Pachysolen tannophilus

levadura Glucosa, xilosa,

glicerol 75-80

. Zhao y col., (2008)

Kluyveromyces marxianus

Levadura Glucosa 70-80 Kádár y col.,

(2004) Zymomonas

mobilis Bacteria

Glucosa, xilosa, fructosa, sacarosa

80-92 Davis y col.,

(2006)

Además de un alto rendimiento, un problema importante en la fermentación es la tolerancia de

los microorganismos al producto de fermentación en sí. Una estrategia para superar esto es

FUNDAMENTACIÓN

24

tener un sistema en el que el etanol se elimine continuamente para mantener una baja

concentración dentro del sistema. Otro problema son los compuestos inhibidores que se

producen durante el pretratamiento termoquímico. Estos pueden ser reducidos en un paso de

detoxificación adicional, pero esto tiene un costo elevado.

El mejoramiento de la tolerancia de los microorganismos a estos inhibidores, sería otra

estrategia (Van maris y col., 2006). La levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido el

principal microorganismo utilizado para la obtención de etanol industrial; pero una de sus

limitantes es que no fermentan las pentosas por lo que son modificadas genéticamente para

producir alcohol a partir de xilosa o arabinosa (Karhumaa, 2007). Muchos trabajos se centran

en la búsqueda de levaduras que fermenten pentosas, los mejores resultados en rendimiento y

productividad la dan la Candida shehatae y la Pichia stipitis (Hahn y col, 2006), teniendo

mejor rendimiento la Candida shehatae que produce 44 g/L de etanol.

En relación a esto, Govindaswamy y Vane (2006) utilizaron una cepa de Saccharomyces

cerevisiae 424A (LNH-ST) modificada genéticamente donde se introdujeron genes de Pichia

stipitis para la fermentación de glucosa y xilosa. Las tasas de crecimiento y producción de

alcohol se realizaron en diferentes medios de peptona, extracto de levadura, glucosa y/o xilosa

(20 ± 0.8 g/L de sustrato).

Obteniendo las tasas más bajas de crecimiento en medios que contenían xilosa pura en

comparación a los medios que contenían mezclas de xilosa y glucosa o glucosa pura. También

se tuvo una µmáx de 0.291 h-1 en medio de YPD en comparación al medio YPX (0.206 h-1),

donde ambos contenían 20 g/L de sustrato. En los medios que contenían glucosa y xilosa, la

glucosa se agotó primero y después la xilosa. La producción de alcohol máxima se obtiene en

el medio YPD con 7.9 g/L y la producción más baja en el medio YPX con 4 g/L. En otro

estudio Zhao y col. (2008) observaron cómo se comportaba la cepa Pachysolen tannophilus

1771 en la asimilación de diferentes mezclas de glucosa y xilosa.

En los sustratos mixtos la glucosa fue el azúcar preferido y el consumo de la xilosa empieza al

terminarse el primer sustrato, presentando una etapa de adaptación en el consumo de la xilosa.

FUNDAMENTACIÓN

25

La tasa de consumo de glucosa (1.28 g L-1 h-1) fue superior a la tasa de consumo de la xilosa

(0.34 g L-1 h-1) en la fermentación de éstos azúcares reductores. La más alta concentración de

etanol (6.90 g/1) se obtuvo en la 12da hora en la fermentación de 100 % de glucosa, mientras

que la menor concentración de etanol (2.70 g/L) se obtuvo a las 48 horas de fermentación de

xilosa al 100 %.

Sin embargo el crecimiento presentó resultados diferentes obteniendo los valores más altos

(6.65 g/L) en la fermentación de xilosa pura y la más baja (5.22 g/L) en la fermentación de

glucosa pura. Entre las cepas silvestres más prometedoras se encuentra la Pichia stipitis que

puede asimilar tanto glucosa como xilosa y un amplio rango de sustratos donde resalta la

celobiosa (Agbogbo y col., 2006) y la cepa Kluyveromyces marxianus que aparte de poder

asimilar xilosa, es un microorganismo termotolerante el cual podría ser usado en zonas

tropicales donde la temperatura es elevada (Kumar y col., 2009).

Actualmente López-Álvarez y col., (2012) utilizan la cepa Kluyveromyces marxianus UMPe-1

en la fermentación de agave en la industria tequilera. Esto es debido a que mejora las

propiedades organolépticas y los rendimientos en la producción de alcohol en comparación a

la cepa Saccharomyces cerevisiae, utilizada comúnmente en éste tipo de ingenios. A nivel

industrial, la levadura UMPe-1 muestra una velocidad máxima de consumo de azúcar

fermentable de 2.27 g/L h-1 y la producción de etanol es de 1.38 g/L h-1, proporcionando 58.78

g/L de etanol a 72 h de fermentación, que corresponde al 96% de rendimiento.

Martín y col. (2010) proponen el uso de la cepa Candida tropicalis NBRC 0618 para la

producción de etanol y xilitol como subproducto, a partir de residuos de la poda de árboles de

olivo (producto renovable, bajo costo y residuo agroindustrial), que añade un valor a la

viabilidad económica del proceso. La materia fue tratada con una hidrolisis con temperatura

(200o C) buscando obtener azúcares fermentables. A las condiciones de 30o C, una agitación

de 500 rpm y un pH de 5.0 tuvieron un rendimiento de 0.44 g g-1 de etanol y 0.13 g g-1 de

xilitol. Watanabe y col. (2010) utilizan la cepa Candida glabrata NFRI3164 silvestre y la

misma cepa modificada genéticamente suprimiendo la respiración con el fin de realizar una

comparación en la producción de etanol. Reportan que esta cepa tiende a tolerar temperaturas

FUNDAMENTACIÓN

26

de entre 40 a 50o C, por lo que la que la convierte atractiva para su uso en sistemas airados y

con altas temperaturas.

Obtuvieron que la cepa modificada genéticamente, a las condiciones de 42o C y una agitación

150 rpm, obtiene 17.0 g/l de etanol a las 48h con un rendimiento teórico del 66.6 % y una

productividad de 0.35g l-1 h-1 que son los mejores resultados de la comparación realizada.

Fromanger y col. (2010), estudiaron la cinética en fed-batch de la levadura Candida shehatae

fermentando xilosa y glucosa por separado como fuente de carbono. Las condiciones de

crecimiento fueron en medio aeróbico a pH de 4.5 y con temperatura de 30o C. Considerando

al oxígeno como un parámetro importante por controlar, se obtuvo utilizando a la xilosa y con

1.19 mmolO2 g/ peso seco celular (DCW) h una máxima producción de etanol de 48.81g/L y

utilizando glucosa con 0.30 mmolO2 g/DCW h una máxima producción de etanol de 54.19

g/L.

5.3.2 Rutas metabólicas para la fermentación de carbohidratos

En muchos procesos de fermentación, la oxidación de azúcares simples bajo condiciones

anaerobias involucra dos fases: la oxidación de la glucosa y el metabolismo de piruvato. El

metabolismo de la glucosa ocurre de la misma manera tanto en la respiración aerobia como en

la respiración anaerobia y se da frecuentemente a través de la vía glucolítica de Embden–

Meyerhof–Parnas o EMP (Bai y col., 2008). A través de esta ruta una molécula de glucosa es

metabolizada y dos moléculas de piruvato son producidas. Bajo condiciones anaerobias, el

piruvato es posteriormente reducido a etanol con emisiones de CO2 obteniéndose un

rendimiento estequiométrico teórico de 0.511g de etanol y 0.489g de CO2 por 1g de glucosa

metabolizada (Kosaric y col., 2001).

En la glucólisis se producen dos moléculas de ATP los cuales son empleados para llevar a

cabo la biosíntesis de las células de la levadura lo cual involucra una variedad de

bioreacciones que requieren energía. Además, la producción de etanol está estrechamente

ligada al crecimiento celular del microorganismo, lo que significa que la biomasa se obtiene

como un subproducto. Sin el consumo continuo de ATP por parte del microorganismo que

FUNDAMENTACIÓN

27

está en crecimiento, el metabolismo glucolítico se vería interrumpido inmediatamente, debido

a la acumulación intracelular de ATP, causando una inhibición a la fosfofructoquinasa (PFK),

una de las enzimas de regulación más importantes en la glucólisis (Kosaric y col., 2001).

Como se ha mencionado anteriormente, la levadura Saccharomyces cerevisiae es la especie de

levaduras utilizada por excelencia para la obtención de etanol a nivel industrial puesto que es

un microorganismo de fácil manipulación y recuperación, no es exigente en cuanto a su

cultivo, no presenta alto costo, tolera altas concentraciones de etanol, en la fermentación

produce bajos niveles de subproductos, es osmotolerante, capaz de utilizar altas

concentraciones de azúcares, por lo que en este caso se utilizará para conocer como una

levadura puede asimilar diferentes carbohidratos.

De forma silvestre fermenta glucosa, el azúcar predominante en todos los hidrolizados

lignocelulósicos con altos rendimientos incluso en condiciones anaeróbicas. La asimilación de

la glucosa solo requiere un gradiente de concentración a través de la membrana plasmática.

Después de la absorción, entra a la vía EMP, ésta oxida la glucosa a dos piruvatos, dando

como resultado la formación neta de dos ATP por glucosa (Figura 6).

En anaerobiosis, el NADH formado por el gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa es

reoxidado a través de la fermentación alcohólica. Este equilibrio redox consiste en la

combinación de la actividad de la enzima piruvato descarboxilasa y de la alcohol

deshidrogenasa. Pero, obviamente, la glucosa no es sólo el carbohidrato presente en los

hidrolizados. Para que se puedan fermentar carbohidratos tres criterios tienen que ser

cumplidos (Van Maris y col., 2006):

� La presencia de un transportador funcional en la membrana plasmática,

� La presencia de la enzima(s) que introducen los carbohidratos a la ruta glucolítica y

� El mantenimiento de un equilibrio redox cerrado.

La manosa y la fructosa son dos isómeros de la glucosa que se producen en los hidrolizados de

la biomasa lignocelulósica y que pueden ser fermentados por la cepa silvestre S. cerevisiae,

FUNDAMENTACIÓN

28

después de la fosforilación por la hexoquinasa, la manosa-6-fosfato se isomeriza en fructosa-

6-fosfato gracias a la fosfomanosa isomerasa, codificada por el gen PMI40.

Figura 6. Catabolismo de las hexosas de Saccharomyces cerevisiae. Números subrayados representan enzimas

en el metabolismo. Los nombres de los genes que codifican las enzimas se dan entre paréntesis. Glucosa: 2.7.1.1, la hexoquinasa (HXK1/HXK2); 2.7.1.2, glucoquinasa (GLK1); Galactosa: (a través de la ruta de Leloir) 2.7.1.6,

galactoquinasa (Gal 1); 2.7.7.12, galactosa-1-fosfato-uridilitransferasa (Gal 7); 5.1.3.2, UDP-glucosa-4-epimerasa (Gal 10; 5.4.2.2, fosfoglucomutasa (Gal5/PGM2). Manosa: 2.7.1.1, hexoquinasa I (HXK1); 5.3.1.8, manosa-6-fosfato isomerasa (PMI40). G-3-P; gliceraldehido-3-fosfato; DHAP, dihidroxi-acetona-fosfato; PEP, fosfoenol

piruvato, PPP, ruta de las pentosas fosfato (Van Maris y col., 2006)

La hexoquinasa es también responsable de la fosforilación de la fructosa en fructosa-6-fosfato,

que se metaboliza posteriormente a través de la glucólisis. Como la manosa y glucosa pueden

competir por los mismos transportadores de hexosas, las cinéticas de utilización mixtas de

sustrato se determinan por su concentración en el hidrolizado. La galactosa es otro azúcar que

puede ser fermentado pero antes es asimilado utilizando al transportador galactosa permeasa

(Gal2p), y posteriormente convertida en glucosa-6-fosfato a través de la ruta de Leloir (Leloir,

1951).

Esta vía, que une a la galactosa en la ruta glucolítica, consiste en tres reacciones. Después de

la fosforilación de la galactosa por la galactoquinasa (Gal1p), la galactosa-1-fosfato

FUNDAMENTACIÓN

29

uridililtransferasa (Gal7p) convierte la UDP-glucosa y la galactosa-1-fosfato a UDP-galactosa

y glucosa-1-fosfato. La UDP-galactosa se reconvierte en UDP-glucosa por la uridina

difosfoglucosa-4-epimerasa (Gal10p; Van Maris y col., 2006). Por último, la glucosa-1-fosfato

se convierte a glucosa-6-fosfato por la fosfoglucomutasa (figura 6). En la cepa K .marxianus,

la alta cantidad de glucosa presente en los hidrolizados generalmente llevan a la represión del

metabolismo de la galactosa, evitando el consumo simultáneo de glucosa y galactosa. No es el

caso en la mezcla glucosa y fructosa que son asimilados de forma simultanea (Fonseca y col.,

2013).

Figura 7. Catabolismo de la D-xilosa y L-arabinosa en una cepa de S. cerevisiae modificada genéticamente. Los nombres de genes correspondientes a las enzimas se da entre paréntesis en la leyenda de esta cifra. 1.1.1.21,

aldosa / xilosa reductasa (Gre3/xyl1); 1.1.1.9, xilitol deshidrogenasa (Xyl2/xyl2); 2.7.1.17, xiluloquinasa (Xks1/xyl3); 5.3.1.5, xilosa isomerasa (xylA); 1.1.1.12, arabinitol 4-deshidrogenasa (Lad1); 1.1.1.10, L -

reductasa xilulosa (lxr1); 5.3.1.4, L-arabinosa isomerasa (araA); 2.7.1.16, L-ribuloquinase (araB), 5.1.3.4, L-ribulosa-5-fosfato de 4-epimerasa (Arad). G-3-P, gliceraldehído-3-fosfato; PPP, ruta de las pentosas fosfato (Van

Maris y col., 2006)

La xilosa es uno de los componentes importantes de la biomasa lignocelulósica, pero pocas

levaduras son capaces de fermentar xilosa a etanol. El metabolismo de las pentosas se da en la

vía de las pentosas fosfato donde la xilosa es transformada a partir de xilulosa-5-fosfato hasta

fructosa-6-fosfato o gliceraldehido-3-fosfato para la producción de etanol (Figura 7).

FUNDAMENTACIÓN

30

En las levaduras que fermentan xilosa, dos oxidorreductasas están involucradas en el proceso,

xilosa reductasa (XR) y xilitol deshidrogenasa (XDH). Los cofactores que utilizan estas

enzimas son diferentes NADP+ y NADH, respectivamente. NADPH y NAD+ necesitan ser

regenerados para mantener el equilibrio redox. Bajo condiciones aeróbicas la NADH se puede

reoxidar a través de la cadena respiratoria con oxígeno molecular. Por cada NADH que es

reoxidado por XR un xilitol es producido como subproducto (Van Maris y col., 2006).

La L-arabinosa se metaboliza a través de las reacciones catalizadas por la aldosa (xilosa)

reductasa, L–arabinitol-4-deshidrogenasa, L-xilulosa reductasa, D-xilulosa reductasa y D-

xiluloquinasa (figura 7). Esta vía consiste en dos oxidaciones de NAD+ y dos reducciones

NADPH, lo que resulta un desequilibrio redox por los cofactores en condiciones anaeróbicas.

La sobreexpresión de todos los genes estructurales de la vía de L-arabinosa fúngica (Xyl1,

Lad1, Lxr1, Tyl2 y Xks1) dio como resultado la primera cepa capaz de fermentar L-arabinosa

a etanol. Las levaduras recomendadas para la fermentación de mezclas de D-glucosa y D-

xilosa son la Candida tropicalis y Candida glabrata que produce tanto etanol y xilitol

(Sánchez y col., 2008, Wang y col., 2013). La Candida tropicalis, tiene la capacidad para

metabolizar compuestos fenólicos (Yan y col., 2005) y así cualquiera de los productos de

degradación de la lignocelulosa, éstos inhibidores parecen no tener influencia en el proceso de

fermentación.

5.3.3 Fermentación en cultivos mixtos

En la actualidad, hay muchos casos en que la utilización de cultivos mixtos parece ser

ventajoso sobre un solo microorganismo. Podemos observar las biotransformaciones en la

naturaleza que tienen lugar por la combinación de las vías metabólicas de diferentes

microorganismos. Un cultivo mixto es definido como la incubación anaeróbica o aeróbica

ocasionalmente de microorganismos no especificados, en condiciones sépticas. Algunos

ejemplos de la coexistencia de diferentes microorganismos son los suelos de los bosques, las

pilas de compost, las zonas aerobias y anaerobias del agua, las fermentaciones espontáneas de

los jugos azucarados y la piel humana (Barder y col., 2010).

FUNDAMENTACIÓN

31

En un hábitat natural, diferentes microorganismos pueden competir por sustratos, como actuar

de forma simbiótica. Para una degradación eficiente de la celulosa, hemicelulosa y pectina, no

siempre se presenta de forma natural en un solo microorganismo, por lo que se ha recurrido

tanto a la ingeniería genética como a los cultivos mixtos, en donde crecen simultáneamente

dos o más cepas, de tal forma que sus efectos sinérgicos se vean reflejados en una mejor

perspectiva de degradación de sustratos con mezclas complejas de carbohidratos. Los

microorganismos que tienen un amplio rango de asimilación de sustratos son interesantes

debido a que un metabolismo rápido y eficiente de los azúcares que incluya tanto las

fracciones de celulosa como de hemicelulosa es crítico para una conversión eficiente de la

biomasa lignocelulósica para la obtención de biocombustibles.

En la actualidad, la cooperación natural de diferentes microorganismos se utiliza en sólo unas

pocas aplicaciones en la industria biotecnológica. En algunos casos los microorganismos son

utilizados para el tratamiento de aguas residuales, producción de biogás, recuperación

biológica de suelos y la producción de alimentos tradicionales (Barder y col., 2010). Algunos

ejemplos del uso de cultivos mixtos en la industria alimentaria son la producción de queso,

yogur, chucrut, kéfir, salami, el whisky, la cerveza belga Lambic, entre otros. El crecimiento

microbiano y la formación del producto no se realizan a través de la regulación externa, sino

por la modificación de las condiciones interna, tales como las concentraciones disponibles de

oxígeno, pH, sustrato y el producto deseado en los ejemplos antes mencionados. Una de las

ventajas adicionales de los cultivos mixtos es la posibilidad de la utilización de productos

secundarios (por ejemplo, suero de leche o melazas) ya que son más baratos que la glucosa

como sustrato para la producción biotecnológica de productos químicos. Por otra parte, los

procesos a partir de cultivos mixtos pueden ayudar a encontrar nuevas sustancias de interés

industrial, debido a que un número de vías metabólicas secundarias que se llevan a cabo por

las características del microorganismos o por la sinergia generada el cultivo mixto (Oh y col.,

2007)

La producción de etanol por fermentación de almidones y los materiales celulósicos está

ganando creciente interés debido a la economía cada vez mayor de producción de bioetanol

causada por el alto precio del petróleo. Abate y col. (1996) describe la producción de etanol

FUNDAMENTACIÓN

32

por un co-cultivo de Zymomonas mobilis y Saccharomyces sp. con mayores rendimientos y

tasas de producción que con cualquiera de microorganismos en cultivo puro. La utilización de

inulina de alcachofa como un sustrato para la producción de etanol por un cultivo mixto de Z.

mobilis y Kluyveromyces fragilis fue descrita por Szambelan y col. (2004), donde se logró una

conversión de 94% del máximo teórico.

En el caso de sorgo como un sustrato para la producción de etanol, Mamma y col. (1996)

sugiere un proceso de fermentación cultivo mixto con Saccharomyces cerevisiae y Fusarium

oxysporum, en donde la hidrólisis de la celulosa y la fermentación de los azúcares liberados se

producen simultáneamente en este ejemplo. La utilización de materiales celulósicos para la

producción de etanol se ve obstaculizada por la falta de un progreso adecuado en la

producción de monosacáridos a partir de celulosa y una eficiente utilización de todos los

azúcares formados. Dado que los productos de hidrólisis a menudo causan la inhibición por

retroalimentación de las enzimas utilizadas para la hidrólisis, se propone realizar la hidrólisis y

fermentación simultáneas de los diferentes sustratos.

Entre las ventajas de este proceso está evitar la acumulación de glucosa y disacáridos y no

producir una inhibición por producto de las enzimas celulolíticas (Sun y Cheng, 2002). La

conversión simultánea de glucosa y xilosa a etanol por el cultivo mixto de Z. mobilis y P.

stipitis se informó por Fu y col. (2009). Maki y col., (2009) informó sobre las aplicaciones de

Clostridium thermocellum junto con otras cepas de Clostridium sp. o Termoanaerobacterium

saccharolyticum. Donde la cepa C. thermocellum sólo puede metabolizar glucosa, mientras

que los otros microorganismos pueden utilizar las pentosas derivadas de la hemicelulosa. Al

utilizar este cultivo mixto en el proceso de fermentación de un hidrolizado lignocelulolítico

mejora la formación de producto debido a que se evita la competencia por sustrato entre las

especies.

La mezcla de S. cerevisiae y Pichia stipitis o C. shehatae se ha estudiado en el trabajo de

Kordowska y Targonski (2002), donde la producción de etanol a partir de glucosa varió de

0.38 hasta 0.45 g/g. Al introducir xilosa en el medio con glucosa se obtuvieron rendimientos

de 0.28 hasta 0.40 g/g, siendo más bajos que al utilizar solo la hexosa. También la Candida

FUNDAMENTACIÓN

33

tropicalis ha sido utilizada en cultivo mixto con la cepa Zymomonas mobilis para el

aprovechamiento de residuos agroindustriales de bajo costo en la producción de etanol. Patle y

Lal (2008) utilizan este cultivo mixto para la fermentación de los residuos sólidos, producto de

la elaboración de la tapioca, conocidos como thippi (complejo de almidón, pectina, fibra y

proteínas). Después de un proceso de hidrólisis enzimática y a escala de un fermentador de 1

L, obtuvieron una producción de 72. 8 g/L de etanol que corresponde el 93.18 % de

rendimiento teórico, usando el cultivo mixto; cuando solo utilizaron la Z. mobilis tuvieron una

producción de 65.3 g/L de etanol (rendimiento 82.83 %) y al utilizar C. tropicalis fue una

producción de 61.2 g/L (rendimiento 76.58 %). Ya en escala de fermentador de 10 L el

rendimiento teórico para la producción de etanol fue de 78.82 %. En otro estudio, el proceso

de fermentación se llevó a cabo mediante un cultivo mixto de Trichoderma harzianum,

Phanerochaete chrysosporium, Mucor hiemalis, y la levadura, S. cerevisiae. El proceso se dio

de la siguiente forma: donde en el primer paso fue la desintegración del material

lignocelulósico de su estructura compleja por hongos lignocelulolíticos (Trichoderma

harzianum y/o Phanerocheate chrysosporium). El segundo paso es la despolimerización de

carbohidratos complejos (celulosa y hemicelulosa) en azúcares reductores (glucosa, fructosa,

xilosa, etc.), utilizando enzimas celulolíticas producidas por hongos celulolíticos (T.

harzianum / Mucor hiemalis), y el tercer paso la fermentación de los azúcares por la levadura

(S. cerevisiae) para la producción de etanol. Concluyen que con la mezcla de las cepas T.

harzianum y S. cerevisiae se obtiene el mayor rendimiento con 4% w/v o 31.6 g/L de etanol

(Zahangir y Nassereldeen, 2009).

5.4 Factores que afectan en la fermentación de carbohidratos

Idealmente, la producción de etanol a partir de hidrolizados lignocelulósicos requerirá que los

microorganismos fermentadores de pentosas y hexosas realicen este proceso en presencia de

compuestos inhibidores producidos durante la hidrólisis. Los compuestos inhibidores podrían

ser ácidos débiles, tales como ácido acético, furaldehidos y otros compuestos fenólicos,

principalmente furfural e hidroximetilfurfural, como resultado de varias reacciones complejas

durante el tratamiento fisicoquímico de la biomasa (Mussato y Roberto, 2006).

FUNDAMENTACIÓN

34

De los ácidos orgánicos que se producen en los hidrolizados lignocelulósicos, el ácido acético

es el más común de los hidrolizados de la hemicelulosa, mientras que los ácidos

hidroxicarboxílicos como el ácido glicólico y el ácido láctico también están presentes cuando

se lleva a cabo una hidrólisis alcalina. Además, el ácido fórmico se genera de la degradación

de la lignina (Klinke y col., 2002). El citosol de las levaduras tienen generalmente un pH más

elevado que el medio circundante, pero al existir ácidos orgánicos débiles en el medio, éstos se

difunden fácilmente a través de las membranas biológicas causando una acidificación

citosólica que puede inducir a la apoptosis (Ludovico y col., 2001).

Los derivados del furano, principalmente furfural y el 5-HMF, se derivan de la deshidratación

de pentosas y hexosas durante la hidrólisis, éstos son considerados de los inhibidores más

fuertes en los hidrolizados lignocelulósicos. Aunque el furfural es más tóxico que el 5-HMP,

los dos compuestos actúan sinérgicamente para suprimir el crecimiento de la levadura (Liu y

col., 2004). Por lo general, los furanos se han implicado en una amplia gama de efectos,

incluyendo la inhibición del crecimiento celular y la utilización de glucosa, reducción de la

actividad enzimática y en la productividad de etanol, daño en el ADN y la inhibición en la

síntesis de proteínas y ARN (Liu y col., 2004).

Wahlbom y Hahn-Hägerdal (2002) informaron que durante la fermentación de xilosa,

disminuyó la producción de xilitol después de la adición de furfural, posiblemente debido a

que NADH se oxida a NAD+ durante su reducción a alcohol furfurílico, lo que sugiere que el

furfural presente en los hidrolizados lignocelulósicos podría ser beneficioso para la

fermentación de xilosa a etanol. También mencionaron que el 5-HMF, que requiere NADPH

para su reducción, no afectó en la producción de xilitol.

También, los procesos fermentativos requieren de condiciones de operación que garanticen el

buen desempeño de los microorganismos. A partir de esto, se ha visto que el manejo de estos

microorganismos presenta ciertas dificultades, específicamente en las condiciones de medios

de cultivos y del proceso de fermentación a nivel industrial. Debido al interés generado en la

producción de etanol a altas concentraciones, se ha visto como este factor afecta el desempeño

de los microorganismos fermentadores causando inhibición en el crecimiento microbiano y la

FUNDAMENTACIÓN

35

reducción en el rendimiento producto/sustrato. En general, una concentración de etanol mayor

al 6 % (p/v) tiene un efecto inhibitorio sobre todos los microorganismos.

La mayoría de las cepas toleran una concentración de 5.5 % (p/v) de etanol en el medio de

cultivo (Sridhar y Rao, 2004). Otro de los factores a considerar es la temperatura,

microorganismos tales como la Zymomonas mobilis crecen entre 25 y 40º C, con un

crecimiento optimo a 30º C. La composición y la estructura de la membrana plasmática y la

concentración de fosfolípidos se afecta cuando la bacteria alcanza una temperatura de 40º C, lo

cual conlleva a una pérdida de la integridad de la membrana. Posteriormente, la elevada

temperatura resulta en la acumulación de etanol dentro de la célula, lo cual tiene un

significativo efecto en la viabilidad de las células (Petersson y col., 2007).

En el caso de levaduras como las especies del género Saccharomyces la velocidad de

producción de alcohol incrementa de forma estable hasta los 30º C y de forma suave hasta los

36º C, pero disminuye a temperaturas superiores a los 37° C. Algunas cepas son capaces de

crecer a temperaturas por encima de los 37º C y son comúnmente nombradas como

termofílicas, mientras que otras tienen una temperatura máxima superior a los 45º C y son

comúnmente llamadas termotolerantes (Sridhar y Rao, 2004).

También muchos microorganismos crecen en condiciones anaeróbicas y el oxígeno en exceso

tiene un efecto negativo sobre la producción de etanol. En las bacterias, por ejemplo, la

aireación induce la producción de subproductos incluyendo acetatos, acetaldehídos y lactatos y

además, el oxígeno tiene un efecto inhibitorio sobre el consumo de sustrato y el crecimiento

microbiano. A bajas concentraciones de sustrato, las velocidades de crecimiento y el

rendimiento de biomasa son independientes de la presencia de oxígeno. De forma opuesta, a

altas concentraciones de sustrato, decrecen los parámetros de crecimiento (Chandraraj y col.,

2004).

FUNDAMENTACIÓN

36

5.5 Aplicación Industrial

En la actualidad existen procesos patentados donde se ha demostrado los diversos procesos de

fermentación utilizando levaduras como monocultivo modificado o cultivos mixtos como

medio para la obtención de etanol a nivel industrial con altos rendimientos.

Spindler y col., (1992) en la patente U.S. No. 5100791, demuestran un proceso de

fermentación utilizando la levadura Brettanomyces custersii que tiene la capacidad de

fermentar celobiosa y glucosa a etanol, debido a que produce su propia enzima β-glucosidasa.

Esta levadura realiza un proceso de sacarificación donde degrada hemicelulosa y celulosa,

transformándolas en D-celobiosa, D-glucosa, manosa y D-galactosa. Las condiciones de

crecimiento fueron utilizando un rango de pH de 3.5 a 6.0 y de temperatura de 30 a 39o C,

donde con la temperatura optimizada a 37o C y utilizando 15 % de celobiosa en medio

sintético obtuvieron 65 g/L de etanol. Como se ha visto, el uso de cultivos mixtos para la

mejor degradación de los azúcares fermentables, son un medio para mejorar la eficiencia del

proceso de fermentación. Con base en esto, podemos observar en la solicitud de patente U.S.

No. 0151532 A1 (2011) que implementa un proceso para la producción de etanol, un producto

de la fermentación del co-cultivo de un miembro del género Paenibacillus genéticamente

modificado y un microorganismo etanologénico, como podría ser una levadura o la E. coli. El

uso de este cultivo mixto generó una producción máxima de etanol a las 96 h de 46.3 g/L

utilizando como sustrato material lignocelulósico pre-tratado de pino.

Debido a que muchas veces no se alcanzan los rendimientos deseados en el proceso de

producción de alcohol, la patente U.S. No. 0201093 (2011) propone una solución a los bajos

rendimientos en la producción de alcohol. La invención implementa un proceso para el

aumento de crecimiento y mejorar el metabolismo de la levadura. El uso de iones de

bicarbonato aumenta el rendimiento de las levaduras y por esta acción mejoran los productos

de la fermentación en general, por ejemplo, fermentación de etanol, la industria del queso, de

la cerveza y el vino. Se cree que los bajos niveles del ión bicarbonato desencadenan un

ambiente de pH óptimo, que permite a las células de levadura reproducirse eficientemente

consumiendo por ejemplo, glucosa.

FUNDAMENTACIÓN

37

Los mecanismos responsables de este efecto pueden ser: 1) los bajos niveles de bicarbonato

alteran la permeabilidad de la membrana, permitiendo que más glucosa entre en la célula y por

lo tanto más producción de etanol. 2) Los niveles bajos de la sal puede reducir los protones en

el exterior de la mitocondria en la levadura, estimulando los procesos que buscan mantener

este gradiente, ya que es importante para la generación de energía celular (éste proceso mejora

el metabolismo de la glucosa en la levadura).

Se comenta que la estimulación o el retraso en el crecimiento de la célula depende de la

cantidad de bicarbonato de sodio que se utilice en el medio. Las condiciones para que esto se

dé son: una fermentación anaerobia de 35 a 60 h, una temperatura de 30 a 40o C y un pH de 4 a

5. Los microorganismos utilizados en el proceso de fermentación de esta patente (U.S. No.

0201093 (2011)) pueden ser cualquiera capaz de convertir los carbohidratos complejos a

carbohidratos simples, por ejemplo, las especies Kluyveromyces, Candida, Pichia,

Bretanomyces y Saccharomyces. Los resultados que obtuvieron fue que al utilizar un medio

sintético (25 g de glucosa, 1 mL de urea (45%) en 250 mL de agua) y entre 200 y 500 ppm de

bicarbonato de sodio como fuentes de carbono para la Saccaromyces cerevisiae se tiene 2.4

g/L con 0 rpm y 4.8 g/L con 200 y 500 rpm, manteniendo una concentración de 2.4 g/L de la

levadura durante 48 h. La producción de alcohol pudo estar restringida por el bajo porcentaje

de glucosa como fuente de carbono. Debido a que la fuente de carbono que comúnmente se

utiliza es la obtenida de la biomasa vegetal, la solicitud de patente WO. No. 127545 A1

(2011), propone un proceso para la obtención de alcohol a partir de residuos biomásicos

provenientes de fibras celulósicas (madera), en donde la sacarificación por hidrólisis

enzimática y la fermentación se da en un solo reactor. Al final del proceso comentan que la

concentración residual de azúcares se encuentra entre el rango de 0 a 20 g/L y de etanol está

en 40 a 120 g/L usando la cepa Saccharomyces cerevisiae y como agente hidrolítico la

Zymomonas mobilis que fueron modificadas genéticamente.

MATERIALES Y MÉTODOS

38

6.- MATERIALES Y MÉTODOS

6.1 Microorganismos

Se utilizaron 3 cepas de levaduras silvestres (LR2, LR4 Y LR5) aisladas de líquido ruminal de

bovino fistulado del Estado de Yucatán, y 1 cepa silvestre aislada de termita de madera (T1)

identificadas como se muestra en la tabla 4:

Tabla 4. Identificación de las levaduras silvestres Cepa Levadura NRRL*

LR2 Candida glabrata -

LR4 Candida tropicalis Y-50876

LR5 Candida glabrata -

T1 Candida glabrata Y-50877

*NRRL (ARS Culture Collection, USA): Número de registro en el banco de cepas.

6.2 Medios de cultivo

6.2.1 Medio de cultivo 1

Para la determinación de las condiciones medio ambientales en el crecimiento y fermentación

de levaduras silvestres a nivel matraz se utilizó el medio YPD, el cual está constituido por

dextrosa (20 g/L), extracto de levadura (10 g/L) y peptona de caseína (20 g/L).


Para la obtención del perfil de asimilación preliminar e individual de azúcares de los

microorganismos aislados en medio sintético se utilizó el siguiente medio (tabla 5):


39

Tabla 5. Composición elemental para el crecimiento de levaduras en base a 30g/L

ELEMENTOS (g/30g de Cel)

Requerimiento de las levaduras (g/L)

REACTIVO PESO (g/L) Aporte real

del elemento (g/L)

Carbono 28.2

Glucosa (C6H12O6) 70.5

28.2 de C

Fructosa (C6H12O6) 70.5 Ramnosa (C6H12O5) 64.2 Galactosa (C6H12O6) 70.5

Arabinosa (C5H10O5)

70.5

Xilosa (C5H10O5) 70.5 Sacarosa

(C12H22O11) 66.5

Nitrógeno 2.7 Sulfato de amonio

(NH4)2SO4 12.72

2.7 de N 3.1 de S

Oxígeno 9.6 - - - Hidrógeno 1.95 - - -

Fósforo 0.78 Fosfato de amonio

(NH4PO3) 2.4

0.78 de P 0.35 de N

Azufre 0.07 Sulfato de magnesio MgSO4

0.75 0.2 de S

Magnesio 0.15 0.15 de Mg

Potasio 1.2 Cloruro de potasio

KCl 2.3 1.2 de K

Sodio 0.003 Cloruro de sodio

NaCl 0.0075 0.003 de Na

Calcio 0.09 Cloruro de calcio

CaCl2 0.25 0.09 de Ca

Hierro 0.002 Sulfato ferroso

FeSO4 0.0004

0.002 de Fe 0.0009 de S


Para evaluar la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en mezcla de

azúcares, así como para establecer las condiciones de fermentación con cultivos mixtos en

medio sintético a nivel matraz se empleó el medio de cultivo establecido en la tabla 6.


Para evaluar la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado a nivel de 3 L, se utilizó

un hidrolizado de harina integral (cáscara, semillas, bagazo, etc) de limón persa (Citrus

latifolia) proporcionado por el CIATEJ Unidad Sureste; el hidrolizado se obtuvo mezclando 1

L de una solución de HCl al 3 % con 100 g de harina libre de polifenoles y pectina,

posteriormente se esterilizó a 120o C por 15 min. Una vez estéril, se ajustó el pH a 4.8


40

utilizando 1 L de buffer de citrato. Por último, para la reacción de sacarificación enzimática el

medio se ajustó hasta obtener una proporción 1:20 (harina:agua), se adicionó la enzima

Novozymes en una concentración de 1.7 mg/mL de medio. Las condiciones de la

sacarificación enzimática fueron de 50o C por 60 h a 120 rpm. El hidrolizado presentó el

siguiente perfil de carbohidratos en g/L: Sacarosa, 1.09 ± 0.01; Glucosa, 11.98 ± 0.61; Xilosa,

2.18 ± 0.40; Arabinosa, 4.74 ± 0.44; Fructosa. 6.83 ± 0.34; lo que representa un total de 26.83

± 0.36 g/L de azúcares fermentables. No se detectó galactosa en el hidrolizado. El hidrolizado

tuvo una concentración de fósforo de 150.31 + 1.82 mg/L y de nitrógeno-amino libre 168.21 +

2.94 mg/L.

Tabla 6. Composición elemental para el crecimiento de levaduras en base a Nitrógeno por litro (Atlas R., 2010) (Wilkins y col., 2005)

Fuentes de carbono (%) Sales (g ó mg/L)

Glucosa 51 (NH4)2SO4 5.0 g

KH2PO4 1.0 g

Fructosa 30 MgSO4-7H2O 0.5 g

NaCl 0.1 g

Galactosa 8 CaCl2-2H2O 0.1 g

KI 1.0 mg

Arabinosa 7 H3BO3 0.5 mg

ZnSO4-7H2O 0.4 mg

Xilosa 2 MnSO4-4H2O 0.4 mg

FeCl3 0.2 mg

Sacarosa 2 Na2MoO4-4H2O 0.2 mg

CuSO4-5H2O 0.04 mg

6.3 Determinación de las condiciones medio ambientales para el crecimiento y

fermentación de levaduras silvestres a nivel matraz

Se realizó un diseño factorial 32 con 9 tratamientos llevando a cabo los ensayos en orden

aleatorio. Los factores evaluados fueron (Tabla 7) la temperatura (35, 40 y 45 °C) y la

velocidad de agitación (0, 100 y 200 rpm).


41

Tabla 7. Diseño experimental 32, para la determinación de las condiciones de crecimiento y producción de alcohol

FACTORES CODIFICADOS FACTORES SIN CODIFICAR

NÚMERO DE

CORRIDA

ORDEN DE

CORRIDA

A B

Temperatura (°C)

Agitación (rpm)

1 5 - - 35 0

2 7 O - 40 0

3 8 + - 45 0

4 3 - O 35 100

5 9 O O 40 100

6 2 + O 45 100

7 4 - + 35 200

8 1 O + 40 200

9 6 + + 45 200

6.3.1 Cinética de fermentación para la obtención de las condiciones adecuadas de

crecimiento y producción de alcohol

El preinóculo (1 mL de glicerol, para cada cepa por duplicado) fue cultivado en 10 mL en tubo

con medio de YPD (medio 1) y crecidas por 24 h a las condiciones establecidas en el diseño

experimental. A partir de 10 mL de YPD con la cepa ya crecida, después de 24 h, se

inocularon matraces Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio YPD previamente ajustado

a pH de 4.5 (Figura 8). Se tomaron distintas muestras a lo largo de la cinética y se

almacenaron en viales en congelación a -20o C, para la determinación posterior de biomasa,

azúcares consumidos y producción de etanol.


42

Figura 8. Esquema de propagación y cinéticas de fermentación en medio YPD

Para el procesamiento (Figura 9) de las muestras se recolectaron 10 mL del medio líquido a

diferentes tiempos durante 24 h. De estos, se tomó 1 mL de muestra para su cuenta al

microscopio en una cámara Neubauer, los 9 mL restantes se centrifugaron a 4o C, 5300 rpm

por 20 min para la separación de las células.

El sobrenadante fue congelado para la determinación posterior de los azúcares reductores

libres y la determinación de etanol. El paquete celular producto de la centrifugación fue

utilizado para la determinación del peso seco, éste se realizó en charolas de plástico a peso

constante previamente taradas, a las cuales se les colocó la muestra y fueron secadas en un

horno a 60o C por 24 h y posteriormente se calculó el peso seco por la diferencia de peso.


43

Figura 9. Esquema del procesamiento de las muestras

6.4 Obtención del perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados en

medio sintético

6.4.1 Prueba preliminar de asimilación de carbohidratos

Se tomaron viales Eppendorf de las cepas (LR2, LR4, LR5 y T1 mantenidos a -20o C) y se

adicionaron por duplicado a tubos que contenían 9 mL de los diferentes azúcares, glucosa,

xilosa, fructosa, ramnosa, galactosa, arabinosa y sacarosa utilizando el medio de cultivo 2. Se

incubaron durante 24 h y se tomó lectura del crecimiento por densidad óptica (D.O.) a 540 nm.

Para obtener las diferencias de crecimiento se le resto al tiempo final, la densidad óptica del

tiempo inicial.


44

6.4.2 Perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados

Para poder corroborar si los microrganismos tenían la capacidad de producir alcohol se

realizaron cinéticas de crecimiento y producción de alcohol en el medio 2, según el diseño

factorial 4 x 7 que comprende dos factores (tabla 8), el primer factor cepa (LR2, LR4, LR5 y

T1) y el segundo factor azúcares (glucosa, fructosa, sacarosa, xilosa, arabinosa, galactosa,

ramnosa), todos los experimentos fueron realizados por duplicado. El esquema de trabajo fue

similar al presentado en la figura 8.

Tabla 8. Diseño factorial 4 x 7 con los factores, niveles y respuestas analizadas para la obtención del perfil de asimilación

Factores Niveles Respuestas

Cepa

LR2 Crecimiento poblacional (x106 cel/mL)

LR4

LR5 Peso seco (g/L)

T1

Azúcares

Glucosa Producción de alcohol (g/L)

Sacarosa

Fructosa Eficiencia (%)

Galactosa

Xilosa

Arabinosa

Ramnosa


45

6.4.3 Cinética de fermentación para la obtención del perfil de asimilación

El preinóculo (1 mL de cada cepa mantenida en glicerol a -20oC, por duplicado) fue cultivado

en un tubo con 10 mL de medio mínimo de sales (medio 2) donde la única fuente de carbono

fueron los distintos azúcares y se crecieron por duplicado por 10 h a las condiciones de 35o C

y 200 rpm. A partir de los 10 mL del medio mínimo con la cepa ya crecida, después de 10 h,

se inocularon en matraces Erlenmeyer de 500 mL con 250 mL del medio mínimo de sales

(medio 2) previamente ajustado a pH de 4.5 y se ajustaron a las mejores condiciones para

producción de alcohol.

Se tomaron distintas muestras (10 mL) a lo largo de la cinética y se almacenaron en viales en

congelación a -20o C, para la determinación posterior de biomasa, azúcares consumidos y

producción de etanol.

De estos, se tomó 1 mL de muestra para su cuenta al microscopio en una cámara Neubauer,

los 9 mL restantes se centrifugaron a 4o C, 5300 rpm por 20 min para la separación de las

células (Figura 9). El sobrenadante fue congelado para la determinación posterior de los

azúcares reductores libres y la determinación de etanol. El paquete celular producto de la

centrifugación fue utilizado para la determinación del peso seco.

6.4.4 Modificación en el esquema de propagación

Debido al estrés que podría generarse a las levaduras por realizar un preinóculo en un medio

mínimo de sales (medio 2), se realizaron ensayos de comprobación donde se modificó el

esquema de propagación. El preinóculo (1 mL de glicerol, para cada cepa por duplicado) fue

cultivado en un tubo con 10 mL de medio YPD y se crecieron por duplicado durante 24 h a las

condiciones de 35o C y 200 rpm.

Ya crecido el microorganismo, se centrifugó a 4o C, 5300 rpm por 20 min, el sobrenadante fue

desechado, y el paquete celular se lavó por duplicado con solución salina al 0.85%. El paquete

celular libre de medio YPD, fue resuspendido con 25 mL de medio mínimo (medio 2) y se


46

inoculó en matraces Erlenmeyer de 500 mL con 250 mL del medio mínimo de sales

previamente ajustado a pH de 4.5, a las mejores condiciones para producción de alcohol

determinadas previamente en la sección 6.3.1.El análisis de las muestras se realizó según el

esquema que se presenta en la figura 9.

6.5 Evaluación de la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en mezclas

de azúcares

6.5.1 Comparación de dos medios de fermentación

Con la finalidad de mejorar los rendimientos de producción de alcohol en las dos cepas

propuestas como más adecuadas para su mezcla en cultivo mixto se realizó una comparación

en el medio mínimo de sales (tabla 5) y un medio modificado de crecimiento de levaduras en

base al contenido de nitrógeno (tabla 6), al medio se le eliminaron los aminoácidos con la

finalidad de que la única fuente de carbono sean los azúcares (Atlas, 2010).

El preinóculo (1 mL de glicerol, para cada cepa por cuadriplicado) fue cultivado en un tubo

con 10 mL de medio YPD y se crecieron por duplicado durante 24 h a las condiciones de 35o

C y 200 rpm.

Ya crecido el microorganismo, se centrifugó a 4o C, 5300 rpm por 20 min para separar las

células, el sobrenadante fue desechado, y el paquete celular se lavó por duplicado con solución

salina al 0.85%. El paquete celular libre de medio YPD, fue resuspendido con 25 mL de medio

mínimo de sales (medio 2) y del medio base nitrógeno (medio 3), y se inocularon en matraces

Erlenmeyer de 500 mL con 250 mL de ambos medios previamente ajustado a pH de 4.5 que

contenían cada uno glucosa (70 g/L) como única fuente de carbono, a las mejores condiciones

para producción de alcohol, determinadas en la sección 6.3.1. El análisis de las muestras se

realizó según el esquema que se presenta en la figura 9.


47

6.5.2 Fermentación de cultivos individuales y mixtos

Para la fermentación de cultivos individuales y en cultivo mixto empleando mezcla de

azúcares como fuente de carbono, se seleccionó el medio a base de nitrógeno (tabla 6). Se

utilizaron las cuatro cepas en cultivos individuales, donde fueron inoculadas al 100 % al inicio

de la fermentación en la mezcla de carbohidratos.

Se formularon tres cultivos mixtos con las dos cepas que produjeron una mayor concentración

de alcohol (LR4 y T1), en el primer cultivo mixto se inoculó al 60 % la cepa LR4 y al 40 % la

cepa T1 (CC1) al inicio de la fermentación, el segundo se inoculó al 20 % la cepa LR4 y al 80

% la cepa T1 (CC2) al inicio de la fermentación y el tercero se inoculó al 100 % la cepa LR4

al inicio de la fermentación y posteriormente de forma secuencial (48h) se inoculó al 100 % la

cepa T1 (CC3).

Se utilizaron las condiciones de 35o C y 0 rpm (cultivo estático) para la cepa LR4 y el cultivo

mixto CC1 donde en mayor proporción se encuentra la cepa LR4, estas condiciones fueron las

más adecuadas para producir alcohol de acuerdo a la sección 6.3.1. Para la cepa T1 y el cultivo

mixto CC2 donde en mayor proporción se encuentra la cepa T1, fueron 35o C y 200 rpm y para

cultivo mixto CC3 se utilizaron las condiciones de la cepa LR4 hasta las 48 h fueron

modificadas a las condiciones de producción de alcohol para la cepa T1.


48

Figura 10. Esquema de cinética de fermentación de cultivos individuales y mixtos

6.5.3 Cinéticas de fermentación de cultivos individuales y mixtos en mezcla de azúcares

El preinóculo (1 mL de cultivo conservado en glicerol a -20o C, para cada cepa) fue inoculado

en un tubo con 10 mL de medio YPD y se cultivaron por duplicado durante 24 h a las

condiciones de 35o C y 200 rpm (figura 10). Se realizó un segundo pase de propagación

agregando los 10 mL de YPD con las células crecidas a un matraz de 250mL con 100 mL de

YPD durante 10 h a las condiciones de 35o C y 200 rpm.

Una vez crecido el microorganismo, se realizó una cuenta al microscopio para ajustar la

población inicial a 20 x106 cel/mL para cada microorganismo en cultivo individual y en los

cultivos mixtos se ajustó a las diferentes proporciones establecidas para tener una población

inicial total de 20 x106 cel/mL en la mezcla para las cepas LR4 y T1. Una vez obtenido el

volumen necesario para ajustar la población de forma individual y en proporción para la

formulación del cultivo mixto, el microorganismo que fue crecido en medio YPD,


49

posteriormente se centrifugó a 4o C, 5300 rpm por 20 min, el sobrenadante fue desechado, y el

paquete celular se lavó por duplicado con solución salina al 0.85%.

El paquete celular libre de medio YPD, fue resuspendido con 25 mL de medio mínimo base

nitrógeno (tabla 6) y se inoculó en matraces Erlenmeyer de 500 mL con 300 mL del medio

mínimo base nitrógeno previamente ajustado a pH de 4.5, como única fuente de carbono se

utilizaron carbohidratos a las condiciones reportadas por Wilkins (2005) y Boluda-Aguilar

(2013) donde para los cultivos individuales se utilizaron en una concentración final de 100 g/L

y para los cultivos mixtos de 200 g/L de carbohidratos.

Las cinéticas de fermentación se ajustaron a las mejores condiciones para producción de

alcohol para cada cepa o mezcla de microorganismos (de acuerdo a los resultados de la

sección 6.3.1.) y el análisis de las muestras se realizó similar al esquema que se presenta en la

figura 9. Donde la determinación del peso seco solo se realizó para los cultivos individuales y

el consumo de la mezcla de azúcares fue monitoreada por HPLC.

6.6 Establecimiento de las condiciones de fermentación con cultivos mixtos en medio

sintético a nivel matraz

Se realizó un diseño factorial 4 x 3 con 12 tratamientos realizando los ensayos en orden

aleatorio. Los factores evaluados fueron (tabla 9) tiempo de inóculo (1, 2, 4, 6 días) y la

velocidad de agitación (0, 100 y 200 rpm). Las cinéticas fueron realizadas secuencialmente,

inoculándose primero la cepa LR4 a sus mejores condiciones de fermentación (35o C y cultivo

estático) y posteriormente fue inoculada la cepa T1 variándose el tiempo de inóculo y las

velocidades de agitación cuando se ha formado el cultivo mixto.


50

Tabla 9. Diseño factorial 4 x 3 para determinar las condiciones de fermentación en cultivo mixto

TRATAMIENTO Tiempo de

inóculo (días) Agitación (rpm)

1 1 0

2 2 0

3 4 0

4 6 0

5 1 100

6 2 100

7 4 100

8 6 100

9 1 200

10 2 200

11 4 200

12 6 200

6.6.1 Cinéticas para la obtención de las condiciones de fermentación en cultivo mixto

El preinóculo (1 mL de cultivo conservado en glicerol a -20o C, para cada cepa) fue cultivado

en un tubo con 10 mL de medio YPD y se crecieron por duplicado durante 24 h a las

condiciones de 35o C y 200 rpm (figura 10). Se realizó un segundo pase agregando los 10 mL

de YPD con las células crecidas a un matraz de 250 mL con 100 mL de YPD durante 10 h a

las condiciones de 35o C y 200 rpm.


población a 20 x106 cel/mL para la cepa LR4 que se inoculó al inicio de la fermentación, a las

condiciones de 35o C y 0 rpm que son las más adecuadas para la producción de alcohol. El

diseño factorial 4 x 3 se aplicó dependiendo del día de inóculo de la cepa T1, donde una vez

crecido el microorganismo se ajustó la población a 20 x 106 cel/mL. Antes de inocular ambos

microorganismos, el medio de YPD donde fueron crecidos se centrifugó a 4o C, 5300 rpm por

20 min, el sobrenadante fue desechado, y el paquete celular se lavó por duplicado con solución

salina al 0.85%. El paquete celular libre de medio YPD, fue resuspendido con 25 mL de


51

medio mínimo base nitrógeno (tabla 6) y se inoculó en matraces Erlenmeyer de 500 mL con

300 mL del medio mínimo base nitrógeno previamente ajustado a pH de 4.5, como única

fuente de carbono se utilizaron carbohidratos en las proporciones reportadas por Wilkins

(2005) y Boluda-Aguilar (2013) donde la concentración final fue de 100 g/L. Una vez

formado el cultivo mixto se modificaron las condiciones de fermentación a 35o C y 200 rpm

las más adecuadas para la segunda cepa. El análisis de las muestras se realizó similar al

esquema que se presenta en la figura 9. Donde la determinación del peso seco ya no se realizó

para los cultivos y el consumo de la mezcla de azúcares fue monitoreada por HPLC.

6.7 Evaluación de la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado a nivel

fermentador de 3 L

6.7.1 Cinética de fermentación igualando las mejores condiciones obtenidas a nivel

matraz

Buscando igualar la producción de alcohol y la productividad que se obtuvo a nivel matraz en

el mejor tratamiento en cultivo mixto secuencial, las cepas LR4 y T1 fueron propagadas en

medio YPD a las condiciones de crecimiento 35o C y 200 rpm (Figura 11). La cepa LR4 se

inoculó al inicio de la fermentación a sus mejores condiciones de producción de alcohol 35o C

y 0 rpm y la cepa T1 se inoculó pasado un día a las condiciones de 35o C y 200 rpm en un

bioreactor (Applikon Biotechnology). Se tomaron muestras a distintos tiempos durante 4 días

y se analizaron como se ha indicado anteriormente.

6.7.2 Cinética de fermentación igualando las mejores condiciones obtenidas a nivel

matraz con ajuste de pH

Para evaluar el efecto por la disminución en el pH que se presentó en la cinética anterior

realizada, las cepas LR4 y T1 fueron propagadas en medio YPD a las condiciones de

crecimiento 35o C y 200 rpm (Figura 11). La cepa LR4 se inoculó al inicio de la fermentación

a sus mejores condiciones de producción de alcohol 35o C y 0 rpm y la cepa T1 se inoculó

pasado un día a las condiciones de 35o C y 200 rpm en un bioreactor (Applikon


52

Biotechnology) de manera similar a lo descrito en el inciso anterior. Se ajustó el pH a 4.5,

durante toda la fermentación, con HCl 0.5 M y NaOH 0.5 M dosificado automáticamente por

el equipo. Se tomaron muestras a distintos tiempos durante 4 días y se analizaron como se ha

indicado anteriormente.

6.7.3 Cinética de fermentación con modificación de aeración y agitación

Para tratar de obtener una mayor concentración de alcohol y una productividad similar a la

obtenida a nivel matraz, se realizó un diseño factorial 22 con 4 tratamientos realizando los

ensayos en orden aleatorio. Los factores evaluados fueron (Tabla 10) agitación (200 y 300

rpm) y la aireación (0.25 y 0.50 vvm).

Tabla 10. Diseño 22, evaluación de la capacidad fermentativa en cultivo mixto a nivel bioreactor

Tratamiento Codificados Agitación (rpm) Aireación

(vvm*)

1 - - 200 0.25

2 - + 200 0.50

3 + - 300 0.25

4 + + 300 0.50

* vvm: volumen de aire por volumen de medio por minuto (l/l/min).

Para la cinética de fermentación se utilizó un bioreactor de 3 L (Applikon Biotechnology), con

un volumen de mezcla de azúcares y medio de sales con base nitrógeno de 2 L esterilizado.

Debido a que la cepa LR4 se inocula al inicio de la fermentación las condiciones que se

utilizaron fueron 35o C y 0 rpm que son las más adecuadas para la producción de alcohol, la

cepa T1 (35o C) se inoculó 1 día después de inoculada la cepa LR4 y en éste momento se

aplicó el diseño factorial 22.


53

Figura 11. Cinética de fermentación de mezclas de azúcares con cultivos mixtos a nivel de bioreactor de 3 L

El preinóculo (1 mL de cultivo conservado en glicerol a -20o C, para cada cepa) fue cultivado

en un tubo con 10 mL con medio YPD y se crecieron por duplicado durante 24 h a las

condiciones de 35o C y 200 rpm (figura 11). Se realizó un segundo pase agregando los 10 mL

de YPD con las células crecidas a un matraz de 250 mL con 100 mL de YPD durante 10 h a

las condiciones de 35o C y 200 rpm. Se realizó un tercer en un matraz Erlenmeyer de 500 mL

con 300 mL de medio YPD durante 10 h a las mismas condiciones de crecimiento.


población a 20 x106 cel/mL para la cepa LR4 que se inoculó al inicio de la fermentación, y

para la cepa T1 que se inoculó al día posterior, donde una vez crecido el microorganismo se

ajustó también la población a 20 x 106 cel/mL. Antes de inocular ambos microorganismos, el

medio de YPD donde fueron crecidos se centrifugó a 4o C, 5300 rpm por 20 min, el

sobrenadante fue desechado, y el paquete celular se lavó por duplicado con solución salina al

0.85%.


54

El paquete celular libre de medio YPD, fue resuspendido con 250 mL de medio mínimo base

nitrógeno (tabla 6) y se inoculó en un bioreactor de 3 L que contenía 2 L del medio mínimo

base nitrógeno previamente ajustado a pH de 4.5, como única fuente de carbono se utilizaron

carbohidratos en las proporciones reportadas por Wilkins (2005) y Boluda-Aguilar (2013)

donde la concentración final fue de 100 g/L. Se utilizó un antiespumanete (Sigma) para

disminuir la espuma que se formó en la parte superior del medio de fermentación. El análisis

de las muestras se realizó similar al esquema que se presenta en la figura 9. Donde la

determinación del peso seco ya no se realizó para los cultivos y el consumo de la mezcla de

azúcares fue monitoreada por HPLC.

6.7.4 Cinética de fermentación con el hidrolizado de limón persa (Citrus latifolia)

Para la cinética de fermentación con el hidrolizado de limón persa (Citrus latifolia) se utilizó

un bioreactor de 3 L (Applikon Biotechnology), con un volumen de hidrolizado de 1.3 L y se

ajustó el nitrógeno y fósforo a 350 mg/L (Romo, S. 1993). Se pesaron 0.7421 g/L de N4H2PO4

que ajustaría el fósforo, esta cantidad aporta 90 mg/L de nitrógeno, por lo que fue necesario

adicionar 0.43 g/L de (NH4)2SO4 para ajustar el nitrógeno en el hidrolizado a la cantidad

establecida.

Las cepas LR4 y T1 fueron propagadas en medio YPD a las condiciones de crecimiento 35o C

y 200 rpm (Figura 11). Debido a que la cepa LR4 se inoculó al inicio de la fermentación las

condiciones que se utilizaron fueron 35o C y 0 rpm que son las más adecuadas para la

producción de alcohol, la cepa T1 se inoculó 1 día después a las condiciones de 35o C, 200

rpm y 0.25 vvm, las mejores condiciones obtenidas en el diseño anterior planteado (tabla 10).


55

6.8 Métodos de análisis

6.8.1 Determinación de la biomasa celular

La determinación de la población microbiana total se realizó por el método de cuanta directa

al microscopio utilizando una cámara de Neubauer, bajo un microscopio con el objetivo 40X.

Para calcular el número de células se utilizó la siguiente fórmula:

�ú��é�� = ��. é��

��. � �� (�)(�)

Dónde:

D: Dilución efectuada para el conteo;

F: Factor de la cámara (0.25 x 106).

6.8.2 Determinación de peso seco de la biomasa

La biomasa se determinó por gravimetría. Las muestras tomadas durante la cinética se

centrifugaron a 5,300 rpm durante 15 min a 4 oC. El paquete celular lavado (x2, 15 mL de

agua destilada) se secó en estufa a 60o C hasta obtener un peso constante. El cálculo del peso

seco se realizó con la siguiente fórmula:

�� = (�� − � )

!� (1000) Dónde:

Pf: Peso final (g)

Pi: Peso charola sin muestra (g)

Vm: Volumen de muestra (mL).


56

6.8.3 Determinaciones de azúcares y alcohol

La determinación de azúcares reductores libres (anexo 1) se efectuó de acuerdo a la técnica de

Miller (1959), la cual emplea ácido-3,5-dinitrosalicílico (DNS). La curva de calibración se

realizó con glucosa como estándar, en concentraciones de 0.1 a 1 g/L. La determinación de los

azúcares totales (anexo 1) se realizó tomando 1 mL de la solución problema se le adicionó 1

mL de fenol al 5% y enseguida se agregó 5 mL de ac. Sulfúrico para generar el efecto de

hidrólisis. El rango de concentraciones a probar fue de 0.01 a 0.1 g/L, para la curva de

calibración se realizó una solución patrón de 0.1 g/L de sacarosa. Las muestras libres de

células (5 mL) fueron diluidas con 5 mL de agua y destiladas en un microdestilador de vidrio

hasta colectar la primera fracción de 5 mL, a la cual se le determinó el contenido de alcohol

(anexo 1).

Para la determinación de etanol se realizó una reacción con solución de dicromato de potasio

acidificada durante 10 min y se realizó la determinación por espectrofotometría a una longitud

de onda de 585 nm. Para la curva de calibración se utilizó etanol grado reactivo como

estándar, en concentración de 2 a 20 g/L (Bohringer, 1964). Para todas las pruebas

colorimétricas se utilizó un espectrómetro UV-vis (Perkin Elmer, Lambda XLS)

La mezcla de azúcares se monitoreo mediante el uso de un sistema de cromatografía de alta

resolución (HPLC) Thermo Scientific Finnigan Surveyor. El sistema consistió en una bomba

Surveyor LC Plus, automuestreador Surveyor Plus y detector RI Surveyor Plus. La separación

se llevó a cabo usando una columna Phenomenex Rezex RPM-Monosaccharide Pb+2 (8%) de

300 x 7.8 mm.

La temperatura de la columna se mantuvo a 85 oC con un flujo de 0.5 mL/min y la temperatura

del detector fue de 42 oC. Las muestras fueron previamente diluidas 1:50 y filtradas antes de la

inyección utilizando filtros de acrodisco PTFE Millex millipore de 25 mm de diámetro y 0.45

µm de poro. Las concentraciones se determinaron a partir de curvas patrón elaborado con la

mezcla de estándares de azúcares grado analítico (Sigma), a concentraciones de glucosa de 0.1

a 5 g/L y el resto de los azúcares de 0.1 a 1.6 g/L.


57

6.8.4 Cálculo de parámetros cinéticos de crecimiento

Velocidad máxima de crecimiento (µmáx (h-1)). Para calcular la velocidad de crecimiento (o

tasa de crecimiento), se considera el incremento en el número de células (dx) en un intervalo

de tiempo (dt). En este caso, la ecuación que describe la cinética es la siguiente:

�$�� = %$

Resolviendo la ecuación anterior por el método de separación de variables, e integrado, se

obtiene:

&' �$ = %�� ( 1/$ �$ = ( %��

Como la velocidad de crecimiento µ permanece constante a lo largo de la fase exponencial,

entonces ( 1/$ �$ = % ( ��, la cual da lugar a ( 1/$*+*, �$ = %��, finalmente se integra y se

obtiene |ln $ = %�| (evaluada de la biomasa final a la biomasa inicial), despejando µ:

% = ln 0� − ln 0��

La µmáx se calculó introduciendo la fórmula en una hoja de Excel (Office 2010) donde se

graficó µ vs. T donde el valor más alto, corresponde a la velocidad máxima de crecimiento.

Tiempo de duplicación. El tiempo de duplicación de las células se calculó con la siguiente

fórmula:

1� = ��2%

Constante de rendimiento de biomasa (Yx/s).

3'4

=�� ó��6 ��

��7��

��


58

6.8.5 Parámetros cinéticos de producción de etanol

Alcohol producido (EtOH)

(ΔEtOH) = (EtOH)=>?@A(BC) −(EtOH)>?>D>@A(BC)

Constante de rendimiento de producto (Yp/s)

(Yp/s) = Etanolproducido(gL)Consumodesustrato(gL)

Eficiencia de fermentación

T = �UVW �'(&,,)

XY/4Z[ó\]^_ Yp/s teórico = 0.51

Productividad máxima

�� ` � ��á$ � (��á$) = 7 �� á$ �� ℎ��c�� 1 ��c��d��c��e�(ℎ)

Velocidad de consumo de azúcar y producción de alcohol

Se estimó la velocidad de consumo de azúcar y de producción de alcohol en la determinación

del perfil de asimilación y en las cinéticas con mezcla de azúcares por el modelo de Gompertz

usando el programa de regresión no lineal (OriginPro 8 SR0).

f(g) = h[jk(lmg)]


59

Dónde: o(�) es el consumo de azúcar o la producción de alcohol en el tiempo (�); es el

máximo consumo e azúcar (%) o la producción de alcohol (g/L) en � → ∞; 6 es una

constante relacionada con las condiciones iniciales cuando � = 0, entonces o(�) = o, = jr;

s es la velocidad constante de consumo de azúcar o de producción de alcohol (h-1) (Pacheco y

col., 2009).

6.8.6 Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó en cada una de las etapas del trabajo, utilizando para ello el

paquete estadístico Statgraphics Centurion XVI, donde se realizó un análisis de varianza para

determinar si existen diferencias significativas entre los factores, así mismo, el resultado

obtenido fue comprobado con la ayuda de las gráficas de medias, las gráficas de interacción,

los diagramas de Pareto y la prueba de rangos múltiples principalmente.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

60

7.- RESULTADOS Y DISCUSIONES

7.1 Microorganismos

7.1.1 Aislamiento de los microorganismos

Los microorganismos silvestres utilizados fueron aislados por personal del CIATEJ-Unidad

sureste a partir de líquido ruminal (LR2, LR4 y LR5) de bovino fistulado del Estado de

Yucatán y del estómago de termita de madera (T1), buscando que presenten una adaptación a

la zona de aislamiento y les dé una ventaja en la asimilación de diferentes fuentes de carbono

para la producción de alcohol.

Las características observadas al microscopio de las 4 levaduras silvestres se muestran en la

tabla 11. Como se aprecia en la tabla, las cepas LR2 y LR4 que proceden la misma fuente de

aislamiento se diferencian entre sí en tamaño, forma y color de la colonia, mientras que la cepa

LR2 y LR5 son muy similares. Las cepas LR2, LR5 y T1 son muy similares, sin embargo

provienen de fuentes de aislamiento diferente.

Tabla 11. Características microscópicas de los microorganismos silvestres utilizados

Cepa Tamaño Forma Color de la

colonia

Fuente de

aislamiento

LR2 (Candida glabrata) Medio Circular Blanca lechosa Líquido ruminal

LR4 (Candida tropicalis) Grande Ovalada Blanca opaca Líquido ruminal

LR5 (Candida glabrata) Medio Circular Blanca lechosa Líquido ruminal

T1 (Candida glabrata) Medio Circular Blanca lechosa Estómago de termita

Ahora bien, aún con algunas semejanzas o diferencias entre las levaduras que se emplearon

(ya sea por la fuente de aislamiento o por su morfología), se partió con la hipótesis que todas

las levaduras son diferentes y por lo tanto tendrán variación en cuanto a sus parámetros

cinéticos, por tal razón se comenzó a trabajar con todas ellas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

61

7.1.2 Identificación de los microorganismos

La secuencia de los tres fragmentos amplificados de las tres cepas (LR2, LR5 y T1)

presentaron alta similitud con secuencias reportadas para la especie Candida glabrata, como

se observa en la figura 12, la relación filogenética es representada gráficamente por un

cladograma para las tres cepas de levaduras.

Figura 12. Relación filogenética de tres cepas de Candida glabrata

Se separan en dos grupos (A, (B, C)), con una razón de 0.138, con respecto al grupo

independiente de LR2 y un nodo con dos hojas para LR5 y T1. El análisis por distancias,

diferencia las cepas intra nodos con una razón mayor de 0.532, lo que sugiere que a pesar de

ser de la misma especie son cepas independientes con características fermentativas diferentes.

La secuencia amplificada de la cepa LR4 presentó una alta similitud con secuencias reportadas

para la especie Candida tropicalis.

7.2 Determinación de las condiciones medio ambientales para el crecimiento y

fermentación de levaduras silvestres a nivel matraz

7.2.1 Crecimiento

En la figura 13, se presenta las curvas de crecimiento con base en el peso seco para cada una

de las cepas según el diseño factorial planteado (tabla 7) donde se obtuvieron diferentes

resultados. En todas las cepas se obtuvo que el tratamiento 7, que corresponde a las

condiciones de 35o C y 200 rpm, resulto ser el más adecuado para el crecimiento, debido a que

se obtuvo el mayor peso seco en comparación al resto de los tratamientos. La cepa LR4

(figura 13b) presentó el mejor crecimiento donde a las 24 h obtuvo un peso seco de 9.28 ±


62

0.44 g/L, seguido de la cepa LR2 (figura 13a) donde al mismo tiempo se logró un peso seco

de 7.58 ± 0.62 g/L.

a) Candida glabrata (LR2)

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pes

o se

co (

g/L)

0

2

4

6

8

10

b) Candida tropicalis (LR4)

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pes

o se

co (

g/L)

0

2

4

6

8

10

c) Candida glabrata (LR5)

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pes

o se

co (

g/L)

0

2

4

6

8

10

d) Candida glabrata (T1)

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pes

o se

co (

g/L)

0

2

4

6

8

10

Figura 13. Cinéticas de crecimiento (peso seco) para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1. Tratamiento 1

(35o C, 0 rpm, círculo rojo), Tratamiento 2 (40o C y 0 rpm, círculo naranja), Tratamiento 3 (45º C y 0 rpm, triangulo invertido verde claro), Tratamiento 4 (35oC y 100 rpm, triángulo verde oscuro), Tratamiento 5 (40o C y

100 rpm, cuadrado azul turquesa), Tratamiento 6 (45o C y 100 rpm, azul marino), Tratamiento 7 (35o C y 200 rpm, rombo morado), Tratamiento 8 (40o C y 200 rpm, rombo rojo), Tratamiento 9 (45o C y 200 rpm, triángulo

naranja).

Para la cepa LR5 (figura 13c) y T1 (figura 13d), se obtuvo que los tratamientos 7 (35o C y

200 rpm) y 5 (40o C y 100 rpm) podrían ser los más adecuados para tener un buen crecimiento

de estos microorganismos, para la cepa LR5 a las 24 h se obtuvo un peso seco de 6.32 ± 0.62

g/L en el tratamiento 7 y de 7.16 ± 0.56 g/L en el tratamiento 5, para la cepa T1 a las 24 h, se

obtuvo un peso seco de 6.94 ± 0.32 g/L en el tratamiento 7 y 5.92 ± 0.01 g/L en el tratamiento


63

5. En el resto de los tratamiento el crecimiento vario dependiendo de las condiciones

empleadas, se observa en la mayoría una fase exponencial constante durante las 24 h de

fermentación esto podría indicar que los microorganismos están consumiendo otros sustratos

como fuente de carbono debido a que el medio donde se crecieron (YPD) es rico en proteínas

y otras estructuras carbonadas y la glucosa ya se había agotado o se encontraba en baja

concentración. Los resultados menos favorables en general se presentaron con el tratamiento 9

(45o C y 200) las condiciones más altas del diseño factorial, ya que para las cepas LR2, LR4 y

LR5 no presentaron crecimiento, aunque la cepa T1 tuvo un ligero crecimiento. La cepa LR4

también no pudo crecer con las condiciones del tratamiento 3 (45o C y 0 rpm) por lo que una

nula agitación o un exceso de agitación combinado con una alta temperatura desfavorecería su

crecimiento y por consecuencia la producción del metabolito de interés.

Los resultados cinéticos promedio de crecimiento se presentan en la tabla 12 donde se

especifican los datos obtenidos en cada tratamiento probado de las cuatro cepas utilizadas, los

datos corresponden al tiempo en que se obtuvo la mayor producción de alcohol. Se puede

asumir que el tratamiento 7 (35o C y 200 rpm) es el más adecuado para lograr un mayor

población, peso seco y Yx/s para las cuatro cepas. Entre los microorganismos utilizados la cepa

LR2 obtuvo la población más alta de 439 ± 2.83 x 106 cel/mL y la cepa LR4 fue la que más

creció con base en el peso seco 4.72 ± 0.17 g/L. Salmon y col., (1998) y Fromanger y col.,

(2010) comentan que cierta cantidad de oxígeno es necesaria para que el microorganismo

genere ácidos grasos, indispensables para la membrana celular. También una fermentación

aeróbica estimularía el crecimiento e incrementaría la viabilidad celular, condiciones

reportadas por Valero y col., (2001).

Las µmáx (h-1) más altas y los tiempos de duplicación (h) más bajos se alcanzaron para las

cepas LR2 y LR4 en el tratamiento 4 (35o C y 100 rpm) con 0.60 ± 0.00 y 0.69 ± 0.03,

respectivamente, y en el tratamiento 5 (40o C y 100 rpm) para las cepas LR5 y T1 con

0.62±0.02 y 0.71±0.03, respectivamente, donde entre las cuatro cepas la T1 tuvo el valor más

alto de µmáx. El mayor Yx/s se obtuvo en el tratamiento 7 para la cepa LR4 con 0.25 ± 0.01.


64

Tabla 12. Parámetros cinéticos para el crecimiento de las diferentes cepas según el diseño 32.

Trat T (oC)

Agitación (RPM)

CEPAS Pob. Máx. (x106 cel/mL)

Peso seco (g/L)

µmáx (h-1) Td (h) Yx/s

1 35 0

LR2 179±11.31 1.87±0.04 0.34±0.02 2.10±0.07 0.10±0.00 LR4 53±13.43 1.70±0.09 0.34±0.06 2.04±0.38 0.09±0.00 LR5 198±2.12 1.75±0.18 0.55±0.22 1.26±0.45 0.09±0.01 T1 186±7.78 1.72±0.07 0.41±0.10 1.77±0.46 0.09±0.01

2 40 0

LR2 129±7.77 1.73±0.18 0.27±0.00 2.53±0.00 0.09±0.01 LR4 31±1.41 1.70±0.35 0.41±0.32 1.70±1.32 0.09±0.01 LR5 95±0.70 1.38±0.01 0.40±0.18 1.54±0.55 0.07±0.00 T1 164±0.70 1.55±0.09 0.36±0.07 1.93±0.37 0.08±0.00

3 45 0

LR2 227±6.36 1.53±0.14 0.26±0.01 2.63±0.03 0.08±0.00 LR4 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.01 LR5 92±5.65 1.48±0.00 0.46±0.03 1.52±0.11 0.08±0.00 T1 75±4.94 1.40±0.03 0.42±0.05 1.68±0.18 0.09±0.01

4 35 100

LR2 293±5.65 2.80±0.00 0.60±0.00 1.15±0.01 0.15±0.00 LR4 130±1.21 2.99±0.05 0.69±0.03 1.00±0.04 0.16±0.01 LR5 227±20.50 2.46±0.07 0.55±0..05 1.28±0.11 0.13±0.00 T1 453±0.70 3.14±0.17 0.41±0.04 1.72±0.18 0.17±0.01

5 40 100

LR2 248±6.36 2.83±0.07 0.38±0.89 1.81±0.86 0.15±0.00 LR4 95±19.09 2.14±0.38 0.41±0.11 1.70±0.48 0.11±0.02 LR5 199±14.14 1.97±0.06 0.62±0.02 1.13±0.04 0.12±0.00 T1 262±3.53 2.92±0.10 0.71±0.03 0.98±0.04 0.17±0.01

6 45 100

LR2 272±14.14 2.70±0.94 0.58±0.07 1.20±0.15 0.14±0.05 LR4 105±3.53 3.30±0.04 0.55±0.12 1.25±0.26 0.18±0.01 LR5 236±14.14 3.02±0.03 0.56±0.07 1.35±0.02 0.16±0.00 T1 227±12.72 2.79±0.01 0.52±0.15 1.41±0.43 0.15±0.01

7 35 200

LR2 439±2.83 4.22±0.31 0.57±0.04 1.22±0.09 0.22±0.01 LR4 219±13.43 4.72±0.17 0.55±0.05 1.26±0.01 0.25±0.01 LR5 327±34.65 3.84±0.29 0.43±0.01 1.61±0.03 0.20±0.01 T1 388±24.75 3.29±0.33 0.45±0.04 1.55±0.15 0.17±0.01

8 40 200

LR2 124±4.24 3.90±0.20 0.45±0.07 1.55±0.22 0.20±0.01 LR4 142±31.81 3.12±0.77 0.43±0.25 1.63±0.056 0.17±0.01 LR5 170±2.82 1.84±0.52 0.43±0.01 1.60±0.01 0.14±0.04 T1 205±9.89 2.26±0.05 0.51±0.02 1.35±0.08 0.13±0.04

9 45 200

LR2 0±0.00 0±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 LR4 0±0.00 0±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 LR5 0±0.00 0±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 T1 16±0.00 0.15±0.06 0.29±0.14 2.71±1.33 0.04±0.01

LR2, Candida glabrata; LR4, Candida tropicalis; LR5, Candida glabrata; y T1 Candida glabrata.

Los análisis de varianza realizados se resumen con los gráficos de Pareto (figura 14) y de

interacción para cada una de las cepas probadas. En la figura 14a, para la respuesta de peso

seco de la cepa LR2 se observa que el factor de temperatura y la interacción tienen un efecto

significativo en la respuesta. Para la respuesta de Yx/s (figura 14c), se observa que el factor de

temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta, principalmente la

temperatura y para la respuesta de µmáx (figura 14b) no se observa efecto por los factores.


65

Con el gráfico de interacción (figura 14d) se obtuvo que las condiciones más adecuadas para

la obtención del mayor peso seco en promedio sería utilizando una temperatura de 35o C y una

agitación de 200 rpm.

Figura 14. Gráficas de Pareto para a) Peso seco, b) µmáx, c) Yx/s y d) gráfica de interacción para Peso seco de la

cepa LR2 en medio YPD

En la figura 15a, para la respuesta de peso seco de la cepa LR4 se observa que el factor de

temperatura, agitación y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta. La

temperatura es el principal factor que tiene la mayor influencia en la respuesta de peso seco.

Para la respuesta de Yx/s (figura 15c), se observa que el factor de temperatura y la interacción

tienen un efecto significativo en la respuesta, principalmente la interacción y para la respuesta

de µmáx (figura 15b) se obtuvo un efecto significativo por temperatura. Con el gráfico de

interacción (figura 15d) se obtuvo que las condiciones más adecuadas para la obtención del

mayor peso seco en promedio sería utilizando una temperatura de 35o C y una agitación de 200

rpm. Seguido de una temperatura de 45o C y una agitación de 100 rpm, que el microorganismo

logre crecer a altas temperaturas es de gran interés ya que en un proceso a mayor escala los

reactores utilizados para el proceso de fermentación no necesitarían refrigeración por lo que

beneficiaría en el costo del proceso para la producción de alcohol.

Gráfica de pareto para Peso seco (g/L)

Efectos estandarizados0 1 2 3 4

B:Agitación

A:Temperatura

AB

+-

Gráfica de Pareto para µmáx

Efectos estandarizados0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4

B:Agitación

A:Temperatura

AB

+-

Gráficas de Pareto para Yx/s


B:Agitación

AB

A:Temperatura

+-

Temperatura (oC)

Pes

o se

co (

g/L)

Gráfica de interacción

Agitación0100200

0

1

2

3

4

5

35 40 45

a) b)

c) d)


66



En la figura 16a, para la respuesta de peso seco de la cepa LR5 se observa que el factor de

temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta. La interacción es el

principal factor que tiene influencia en el peso seco. Para la respuesta de Yx/s (figura 16c), se

observa que el factor de temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la

respuesta, principalmente la interacción y para la respuesta de µmáx (figura 16b) se obtuvo un

efecto significativo por temperatura y agitación, siendo la agitación la que dé mayor influencia

sobre la variable.



agitación de 200 rpm. Seguido de una temperatura de 45o C y una agitación de 100 rpm, si se

observa los resultados de la temperatura de 45o C para el crecimiento por peso seco se indica

que cierta agitación es necesaria para el crecimiento de este microorganismos pero un exceso

de este factor podría afectar las características en su desarrollo para la obtención de alcohol,

por lo que es importante conocer las condiciones más adecuadas para una buena fermentación.

Gráfica de Pareto para Peso seco (g/L)


AB

B:Agitación

A:Temperatura

+-


0 0.5 1 1.5 2 2.5 3Efectos estandarizados

B:Agitación

AB

A:Temperatura

+-

Efectos estandarizados

Gráfica de Pareto para Yx/s

0 1 2 3 4 5

B:Agitación

A:Temperatura

AB

+-


Temperatura (oC)

Pes

o se

co (

g/L)

Agitación0100200

0

1

2

3

4

5

35 40 45

a) b)

c) d)


67



En la figura 17a, para la respuesta de peso seco de la cepa T1 se observa que el factor de

temperatura y la interacción tienen un efecto significativo en la respuesta. Siendo la

temperatura el principal factor que tiene influencia en el peso seco. Para la respuesta de Yx/s

(figura 17c), se observa que el factor de temperatura y la interacción tienen un efecto

significativo en la respuesta, principalmente la interacción y para la respuesta de µmáx (figura

17b) no se obtuvo un efecto significativo por temperatura y agitación, así como tampoco de la

interacción de estos factores.



agitación de 200 rpm. Seguido de una temperatura de 35o C y una agitación de 100 rpm, estos

dos tratamientos podrían son los más adecuados para el crecimiento de la cepa T1 sin

diferencia significativa.


0 1 2 3 4Efectos estandarizados

B:Agitación

A:Temperatura

AB

+-



0 1 2 3 4

AB

A:Temperatura

B:Agitación

+-


Gráfica de Pareto para Yx/s

0 1 2 3 4

B:Agitación

A:Temperatura

AB

+-


Temperatura (oC)

Pes

o se

co (

g/L)

Agitación0100200

0

1

2

3

4

35 40 45

a) b)

c) d)


68


cepa T1 en medio YPD

7.2.2 Fermentación

En la figura 18, se presenta las curvas de producción de alcohol para cada una de las cepas

según el diseño factorial planteado (tabla 7) donde se obtuvieron diferentes resultados. En el

caso de la cepa LR2 (figura 18a), la producción de alcohol se da constante durante 10 h para

la mayoría de los tratamientos hasta observar una estabilidad por alrededor de 8 h donde a las

20 h empieza a detectarse una disminución en la concentración de alcohol, este descenso en la

concentración podría deberse a un consumo por parte del microorganismo o evaporación

(Zhao y col., 2008). En el tratamiento 3 (45o C y 0 rpm) se observó una baja producción de

alcohol durante 8 h que empieza una constante producción hasta las 16 h donde se obtiene la

mayor concentración de alcohol y para el tratamiento 9 (45o C y 200 rpm) no se obtuvo


Para la cepa LR4 (figura 18b), se destacan los tratamientos 4 (35o C y 100 rpm), el 7 (35o C y

200 rpm) y el 1 (35o C y 0 rpm) donde se observó la velocidad más rápida en la producción de

alcohol, destaca que en éstos tratamientos se mantenga la misma temperatura y la variación

sea por la agitación. En el tratamiento 4, se observa que la producción máxima de alcohol se

obtiene a las 8 h y empieza una caída en la concentración de alcohol donde a las 18 h se tiene


Gráfica de Pareto de Peso seco (g/L)

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

B:Agitación

AB

A:Temperatura

+-


Gráfica de Pareto por µmáx

0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4

A:Temperatura

B:Agitación

AB

+-

Gráfica de Pareto por Yx/s

Efectos estandarizados0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

B:Agitación

A:Temperatura

AB

+-


Temperatura (oC)

Pes

o se

co (

g/L)

Agitación0100200

0

1

2

3

4

35 40 45

a) b)

c) d)


69

menos de 2 g/L. No se presentó una producción de alcohol en el tratamiento 3 (45o C y 0 rpm)

y 9 (45o C y 200 rpm), por lo que la cepa LR4 para poder producir alcohol a 45o C necesita de

cierta agitación (100 rpm) aunque resulta uno de los tratamientos menos indicados para

obtener una alta producción.


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0

2

4

6

8

10

12


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0

2

4

6

8

10

12


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0

2

4

6

8

10

12


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0

2

4

6

8

10

12

Figura 18. Cinéticas de producción de alcohol para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1. Tratamiento 1 (35o C, 0 rpm, círculo rojo), Tratamiento 2 (40o C y 0 rpm, círculo naranja), Tratamiento 3 (45º C y 0 rpm, triangulo

invertido verde claro), Tratamiento 4 (35oC y 100 rpm, triángulo verde oscuro), Tratamiento 5 (40o C y 100 rpm, cuadrado azul turquesa), Tratamiento 6 (45o C y 100 rpm, azul marino), Tratamiento 7 (35o C y 200 rpm, rombo

morado), Tratamiento 8 (40o C y 200 rpm, rombo rojo), Tratamiento 9 (45o C y 200 rpm, triángulo naranja).


70

Para la cepa LR5 (figura 18c) se observó una producción constante de alcohol a partir de las 4

h donde se destaca el tratamiento 5 (40o C y 100 rpm) donde se obtiene la máxima

concentración a las 4 h.

Tabla 13. Parámetros cinéticos para la producción de alcohol de las diferentes cepas según el diseño 32.

Trat T

(oC) Agitación

(RPM) CEPAS Alcohol

(g/L) Yp/s Eficiencia

(%) Pmáx

(g/Lh)

Azúcar consumido

(g/L)

1 35 0

LR2 7.94±0.64 0.43±0.04 84.30±8.32 0.79±0.06 18.45±0.17 LR4 8.00±0.07 0.42±0.01 82.40±2.75 0.80±0.01 19.00±0.42 LR5 8.30±0.36 0.43±0.01 84.31±2.77 0.83±0.04 19.26±0.02 T1 8.80±0.17 0.45±0.01 88.23±1.38 0.73±0.01 19.70±0.11

2 40 0

LR2 7.53±0.51 0.38±0.02 74.50±4.17 0.63±0.04 19.56±0.04 LR4 7.40±2.68 0.39±0.015 76.50±29.08 0.62±0.23 19.20±0.04 LR5 9.31±0.07 0.48±0.00 94.11±0.00 0.78±0.01 19.42±0.16 T1 8.79±0.09 0.45±0.00 88.23±0.00 0.74±0.01 19.48±0.02

3 45 0

LR2 8.70±0.81 0.45±0.05 88.24±9.70 0.54±0.05 19.14±0.22 LR4 0±0.16 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.06 LR5 6.91±0.21 0.39±0.01 76.47±2.77 0.58±0.02 17.64±0.08 T1 7.45±0.04 0.45±0.00 88.23±0.00 0.47±0.01 16.46±0.06

4 35 100

LR2 8.20±0.05 0.43±0.00 84.30±0.00 1.03±0.01 18.90±0.01 LR4 7.62±0.057 0.42±0.02 82.40±4.17 1.10±0.08 18.15±0.23 LR5 8.94±0.13 0.47±0.01 92.15±2.77 0.89±0.01 19.19±0.18 T1 8.90±0.17 0.46±0.01 90.20±1.39 0.89±0.01 19.24±0.11

5 40 100

LR2 7.99±0.41 0.42±0.02 82.40±4.17 0.80±0.04 19.13±0.03 LR4 6.88±0.90 0.36±0.06 70.59±11.08 0.57±0.08 19.12±0.32 LR5 7.06±0.09 0.43±0.00 84.31±0.00 1.77±0.02 16.41±0.28 T1 7.96±0.09 0.45±0.00 88.23±0.00 0.66±0.01 17.58±0.08

6 45 100

LR2 8.04±1.34 0.43±0.06 84.30±12.48 0.67±0.11 18.81±0.21 LR4 5.90±0.42 0.32±0.01 62.70±2.75 0.42±0.03 18.41±0.59 LR5 7.59±0.38 0.40±0.01 78.47±2.77 0.40±0.01 19.06±0.28 T1 8.03±0.22 0.42±0.02 82.35±4.15 0.42±0.01 19.27±0.26

7 35 200

LR2 7.62±0.45 0.40±0.03 78.40±5.58 0.76±0.04 19.00±0.14 LR4 7.80±0.45 0.41±0.04 80.40±6.92 0.78±0.04 18.90±0.43 LR5 8.76±0.13 0.45±0.01 88.24±1.38 0.73±0.01 19.62±0.02 T1 8.90±0.16 0.47±0.02 91.17±4.15 0.89±0.01 19.22±0.22

8 40 200

LR2 9.40±0.21 0.50±0.01 98.03±2.77 0.94±0.02 18.80±0.23 LR4 6.20±0.13 0.33±0.00 64.70±0.00 0.52±00.101 18.63±0.44 LR5 7.39±0.55 0.49±0.04 96.10±6.93 1.23±0.10 15.31±0.42 T1 6.78±0.53 0.37±0.03 72.54±5.55 0.85±0.01 18.37±0.21

9 45 200

LR2 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 LR4 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 LR5 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 T1 1.38±0.19 0.32±0.04 62.75±6.93 0.08±0.03 4.33±0.17


El tratamiento 9, como al igual que la cepa LR2 y LR4, no fue favorable para la producción de

alcohol para la cepa LR5. Se destaca el tratamiento 2 (40o C y 0 rpm) que a las 12 h se obtiene

la mayor concentración en comparación al resto de los tratamientos. Para la cepa T1 (figura


71

18d), las condiciones de 35o C y 200 rpm fueron las más adecuadas para su crecimiento, así

como para la producción de alcohol, ya que obtiene la mayor producción de alcohol a las 4 h

donde mantiene la misma concentración hasta las 20 h donde se observa una ligera

disminución.

Con respecto a los resultados de los parámetros cinéticos de producción (tabla 13), se tiene

que a la cepa LR2 le favorece el tratamiento 8 (40o C y 200 rpm) produciendo 9.40 ± 0.21 g/L

de alcohol seguido por el tratamiento 3 (45o C y 0 rpm) con 8.70 ± 0.81 g/L de alcohol, donde

entre estos tratamientos no hubo una diferencia significativa. Para la cepa LR4 y LR5 les

favoreció el tratamiento 1 (35o C y 0 rpm) donde se obtuvo 8.00 ± 0.07 g/L y el tratamientos 2

(40o C y 0 rpm) con 9.31 ± 0.07 g/L de alcohol, respectivamente. Para la cepa T1 se aprecia

que con el tratamiento 4 (35o C y 100) y el 7 (35o C y 200rpm) se obtiene una concentración

máxima de alcohol de 8.90 ± 0.16 g/L por lo que estos tratamientos favorecerían la producción

de alcohol en medio YPD para esta cepa.

La mayor eficiencia fue para la cepa LR2 en el tratamiento 8 (40o C y 200 rpm) que fue de

98.03 ± 2.77 % seguido de la cepa LR5 donde en el mismo tratamiento obtuvo una eficiencia

del 96.10 ± 6.93 %. Existen reportes de la utilización de microorganismos en medio YPD para

conocer la capacidad de producción de alcohol, la cepa LR2 presenta una eficiencia (98.03 ±

2.77 %) similar a la reportada por López-Álvarez y col., (2012) donde utilizan una cepa

silvestre Kluyveromyces marxianus para la producción de etanol con una eficiencia del 98%.

La cepa LR5 presenta una eficiencia (96.10 ± 6.93 %) ligeramente más baja que la reportada

por Hayashi y col., (2011) que utilizan una cepa mutante Zymomones mobilis con deficiencia

respiratoria, donde obtienen una eficiencia del 97.4 %. Pero ambas cepas (LR2 y LR5)

presentan una eficiencia superior a la cepa Saccharomyces cerevisiae modificada

genéticamente que presenta una eficiencia del 76.5 %, reportada por Govindaswamy y Vane

(2007). Los análisis de varianza realizados se resumen con los gráficos de Pareto (figura 19) y

de interacción para cada una de las cepas probadas. En la figura 19a, para la respuesta de

producción de alcohol para la cepa LR2 se observa que la interacción de la temperatura y


72

agitación tiene un efecto significativo en la respuesta, así como en la eficiencia (figura 19b)

en la producción de alcohol.

Para la producción máxima (Pmáx) (figura 19c) se observa que solo la temperatura tiene un

efecto significativo en la variable. Con el gráfico de interacción (figura 19d) se obtuvo que las

condiciones más adecuadas para la obtención de la mayor producción de alcohol en promedio

sería utilizando una temperatura de 40o C y una agitación de 200 rpm, seguido por las

condiciones de 45o C y 0 rpm.

Figura 19. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) eficiencia, c) Pmáx y d) gráfica de interacción

para producción de alcohol para la cepa LR2 en medio YPD

En la figura 20, para las respuestas de producción de alcohol, Pmáx y eficiencia de la cepa LR4

se observa que la temperatura es el principal factor que influye en éstas respuestas. En la

gráfica de interacción se observa que los mejores resultados de producción de alcohol en

promedio se podrían obtener a las temperaturas de 35, 40 o 45o C con 0 rpm.

En la figura 21a, para las respuestas de producción de alcohol para la cepa LR5 se observa

que la temperatura, la agitación y su interacción tienen un efecto significativo sobre la

respuesta. Para la eficiencia (figura 21b) en la producción de alcohol la temperatura y la

Gráfica de Pareto para producción de alcohol (g/L)


A:Temperatura

B:Agitación

AB

+-

Gráfica de Pareto para Eficiencia


B:Agitación

A:Temperatura

AB

+-

Gráfica de Pareto para Pmáx


B:Agitación

AB

A:Temperatura

+-


Temperatura (oC)

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

Agitación0100200

0

2

4

6

8

10

35 40 45

a) b)

c) d)


73

interacción tienen un efecto significativo sobre la respuesta. En ambas respuestas se observa

que el mayor efecto lo tiene la temperatura.



Para la Pmáx (figura 21c) no se observó un efecto significativo por los factores empleados. Con

la gráfica de interacción (figura 21d) se observa que los mejores resultados de producción de

alcohol en promedio se podrían obtener utilizando las condiciones de temperatura de 40o C y 0

rpm.

Al igual que la cepa LR4, en la cepa LR5 se obtiene la mayor producción sin una agitación en

el sistema, esto podría deberse a que la fermentación alcohólica se da en anaerobiosis (Kosaric

y col., 2001) debido a la baja difusión de oxígeno en el medio evitando que la ruta metabólica

se dirija al crecimiento en alta concentración del microorganismo (Van Maris y col., 2006).


Efectos estandarizados0 1 2 3 4 5

AB

B:Agitación

A:Temperatura

+-

Gráfica de Pareto para eficiencia

0 1 2 3 4 5Efectos estandarizados

AB

B:Agitación

A:Temperatura

+-



AB

B:Agitación

A:Temperatura

+-


Temperatura (oC)

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

Agitación0100200

0

2

4

6

8

10

35 40 45

a) b)

c) d)


74



En la figura 22a, para las respuestas de producción de alcohol para la cepa T1 se observa que

la temperatura, la agitación y su interacción tienen un efecto significativo sobre la respuesta,

donde la temperatura presenta el mayor efecto sobre la producción de alcohol.

Para la eficiencia (figura 22b) en la producción de alcohol se obtuvo que los factores de

temperatura, agitación y su interacción tienen un efecto significativo sobre la respuesta, donde

la agitación presenta el mayor efecto. Para la Pmáx (figura 22c), solo la temperatura y la

agitación tienen un efecto significativo sobre la obtención de la mayor productividad en la


Con la gráfica de interacción (figura 22d) se observa que la temperatura de 35o C con una

agitación de 0, 100 o 200 rpm podría obtener la mayor producción de alcohol en promedio,

seguido de 40o C y 200 rpm, en este caso para la cepa T1 le beneficia una alta agitación.



B:Agitación

AB

A:Temperatura

+-



B:Agitación

AB

A:Temperatura

+-



B:Agitación

AB

A:Temperatura

+-

Temperatura (oC)

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

Agitación0100200


0

2

4

6

8

10

35 40 45

a) b)

c) d)


75


para producción de alcohol para la cepa T1 en medio YPD

Con los resultados cinéticos obtenidos y con base al análisis estadístico correspondiente, se

determinaron las condiciones más adecuadas tanto para el crecimiento como para la

fermentación alcohólica de las distintas cepas (tabla 14).

Tabla 14. Condiciones de fermentación más adecuadas obtenidas a partir de los resultados cinéticos y estadísticos

Cepas Crecimiento poblacional Producción de alcohol

LR2 (Candida glabrata)

35o C, 200 rpm

45o C, 0 rpm

LR4 (Candida tropicalis) 35o C, 0 rpm

LR5 (Candida glabrata) 40o C, 0 rpm

T1 (Candida glabrata) 35o C, 200 rpm

Las cuatro cepas presentaron resultados favorables para el crecimiento utilizando las

condiciones de 35o C y 200 rpm, aunque la cepa LR4 se destaca entre ellas. Mientras que para

la etapa de fermentación hubo una diferencia en las condiciones necesarias para obtener la

mayor concentración del metabolito. La característica de termotolerancia observada en la cepa



AB

B:Agitación

A:Temperatura

+-


Efectos estandarizados0 1 2 3 4 5 6

A:Temperatura

AB

B:Agitación

+-



B:Agitación

AB

A:Temperatura

+-

Temperatura (oC)

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

Agitación0100200


0

2

4

6

8

10

35 40 45

a) b)

c) d)


76

LR2 la hace atractiva para ser empleada en procesos fermentativos a nivel industrial en climas

tropicales.

7.3 Obtención del perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados en

medio sintético

7.3.1 Prueba preliminar de asimilación de carbohidratos

Con base en la prueba preliminar de asimilación de azúcares se observa en la figura 23 que

los mejores resultados de asimilación se obtienen en glucosa (Glu), fructosa (Fru) y sacarosa

(Sac). Los resultados más bajos de asimilación se obtienen en galactosa (Gal), ramnosa (Ram)

y xilosa (Xil). En los resultados para glucosa se observa que se tiene un similar consumo entre

los microorganismos, solo la cepa LR4 presenta una asimilación más baja. La cepa LR2 tiene

la capacidad de crecer mejor que las otras cepas utilizando fructosa como sustrato. La cepa

LR4 tiene la capacidad de asimilar más adecuadamente la xilosa y galactosa, según lo

observado en la figura 23. La arabinosa (Ara) presenta los más bajos resultados de

asimilación, pero se destaca la cepa LR5 que asimila mejor que las cepas LR2 y LR4 donde no

se tienen resultados positivos de consumo en este sustrato. Tomando como base estos

resultados (tabla 15), se tiene el siguiente perfil de asimilación: la cepa LR2 asimila

mayormente y en orden de importancia glucosa, fructosa, sacarosa y en menor proporción

ramnosa, galactosa y xilosa. La cepa LR4 asimila glucosa, sacarosa, fructosa, seguido en baja

cantidad por galactosa, xilosa y ramnosa.

Tabla 15. Orden de asimilación de las distintas fuentes de carbono según cepa

Cepa Glu Xil Ara Sac Fru Gal Ram

LR2 1 6 - 3 2* 5 4 LR4 1 5 - 2 3 4* 6 LR5 1 5 7 2 3 4 6 T1 1 6 7 2 3 5 4

LR2, Candida glabrata; LR4, Candida tropicalis; LR5, Candida glabrata; y T1 Candida glabrata. * Diferencia significativa con un 95 % de confianza.


77

La cepa LR5 asimila glucosa, sacarosa, fructosa y galactosa y en pequeña cantidad ramnosa y

xilosa. Por último la cepa T1 asimila en mejor proporción glucosa, sacarosa, fructosa y le

sigue en orden de importancia ramnosa, galactosa y xilosa. Al observar que los

microorganismos pueden asimilar sacarosa indica que contienen la enzima invertasa que

hidroliza el disacárido y asimila en forma de monosacárido a la glucosa y fructosa (Fonseca y

col., 2013).

Figura 23. Asimilación de los distintos azúcares a 540 nm después de 24 h

En los resultados estadísticos se observó que no existe diferencia significativa entre las cepas

para la asimilación de los azúcares glucosa, xilosa, sacarosa, arabinosa y ramnosa. Con el

gráfico de medias (figura 24) se observa que la cepa LR2 (figura 24a) presenta los mejores

resultados de asimilación para fructosa y la cepa LR4 (figura 24b) para galactosa.

Figura 24. Gráfico de medias según cepa en la asimilación de a) fructosa y b) galactosa

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Glucosa Xilosa Arabinosa Sacarosa Fructosa Galactosa Ramnosa

D.O

. 540

nm LR2

LR4

LR5.1

T1

b) a)


78

7.3.2 Perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados

Con el fin de confirmar el crecimiento de los microorganismos en los azúcares glucosa, xilosa,

fructosa, ramnosa, galactosa, arabinosa y sacarosa y la producción de alcohol a partir de ellos,

se realizaron cinéticas de crecimiento y producción de alcohol a las condiciones determinadas

en la (Tabla 14) para las cuatro cepas. Se realizó un diseño factorial 4 x 3 (tabla 8) con los

siguientes factores, el primer factor cepa (LR2, LR4, LR5 y T1) y el segundo factor azúcares

(glucosa, fructosa, sacarosa, xilosa, arabinosa, galactosa, ramnosa), con duplicados para cada

cepa en cada azúcar. Y las variables a analizar fueron crecimiento poblacional, peso seco,

producción de alcohol y eficiencia.

En la figura 25, se observan las cinéticas de crecimiento con base en el peso seco para las

cuatro cepas empleadas en glucosa, fructosa y sacarosa. La fermentación de estos tres azúcares

se realizó por 24 h debido a que son los azúcares que más fácil asimilan los microorganismos.

La cepa LR2 (figura 25a), presenta un crecimiento exponencial durante las 24 h de

fermentación en los tres azúcares utilizados obteniendo el mayor peso seco a partir de la

sacarosa al final de la fermentación.

En la cepa LR4 (figura 25b), se puede observar, un comportamiento similar que la cepa LR2

donde se presenta un crecimiento exponencial en los azúcares glucosa y sacarosa durante toda

la fermentación obteniendo un peso seco mayor que la cepa LR2 a partir de éstos azúcares en

el caso de la fructosa se observa una estabilidad en el crecimiento a las 16 h.

La cepa LR5 (figura 25c), muestra un crecimiento constante en sacarosa, pero es diferente en

los otros dos azúcares ya que en glucosa tiende a estabilizarse a las 8 h y en fructosa a las 6 h,

esto podría deberse que el microorganismo siguió consumiendo los carbohidratos para la

producción de alcohol ya que en esos tiempos todavía había glucosa en los medio formulados.

Para la cepa T1 (figura 25d), se obtiene un crecimiento con base en el peso seco superior que

el de la cepa LR5, se observa un crecimiento exponencial en glucosa y en fructosa el

microorganismo entra en la fase de estabilidad a las 10 h manteniendo constante el peso seco

obtenido.


79


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pes

o se

co (

g/L)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pes

o se

co (

g/L)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pes

o se

co (

g/L)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

d) Candida glabrta (T1)

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pes

o se

co (

g/L)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Figura 25. Cinéticas de crecimiento (peso seco) para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes

fuentes de carbono. Glucosa (círculo negro), Sacarosa (círculo rojo) y Fructosa (triángulo invertido verde claro)

En el caso de sacarosa, presenta una estabilidad en el crecimiento a partir de las 6 h y hasta las

14 h que sigue creciendo para lograr un peso seco similar al obtenido en glucosa. En la figura

26, se muestran las cinéticas de crecimiento con base en el peso seco de las cuatro cepas

probadas en arabinosa, galactosa, xilosa y ramnosa. Se obtuvo que la LR4 (figura 26b) crece a

partir de la galactosa y la cepa T1 (figura 26d) de xilosa después de 36 h de fermentación.

La galactosa es un azúcar que puede ser asimilado utilizando la galactosa permeasa (Gal2p) y

posteriormente ser convertida en glucosa-6-fosfato a través de la ruta de Leloir (Leloir, 1951).

Pero Fonseca y col., (2013) comentan que es muy difícil que la galactosa sea asimilada con

una alta velocidad debido a que antes de entrar a la ruta glucolítica es necesaria su

transformación a partir de diferentes reacciones mencionadas por la ruta de Leloir, por lo que

es indispensable ampliar el tiempo de fermentación para poder observar si los


80

microorganismos restantes son capaces de asimilar este azúcar y producir alcohol a partir de la

galactosa.


Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Pes

o se

co (

g/L)

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35


Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60P

eso

seco

(g/

L)0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6


Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Pes

o se

co (

g/L)

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30


Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Pes

o se

co (

g/L)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Figura 26. Cinéticas de crecimiento (peso seco) para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes

fuentes de carbono. Arabinosa (círculo negro), Galactosa (círculo rojo), Xilosa (triángulo invertido verde claro) y Ramnosa (triángulo amarillo)

En la figura 27, se observa los resultados obtenidos en la producción de alcohol a partir de

glucosa, sacarosa y fructosa. A partir de la glucosa se obtiene la mayor concentración de

alcohol en todas las cepas utilizadas, en la cepa LR4 (figura 27b) se obtuvo la mayor

concentración de alcohol de 11.02 ± 0.16 g/L. En las cepas LR2 (figura 27a) y LR5 (figura

27c), le siguen en producción de alcohol la fructosa y por último la sacarosa.


81


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0

2

4

6

8

10


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0

2

4

6

8

10

12

14

16


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0

2

4

6

8

10


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0

2

4

6

8

10

Figura 27. Cinéticas de producción de alcohol para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes

fuentes de carbono. Glucosa (círculo negro), Sacarosa (círculo rojo) y Fructosa (triángulo invertido verde claro)

La cepa T1 (figura 27d), muestra que puede producir alcohol a partir de sacarosa similar a lo

obtenido en glucosa, por último asimiló la fructosa. La cepa LR4 no muestra una diferencia

significativa en la producción de alcohol a partir del resto de los azúcares.

En la figura 28, se muestran las cinéticas de producción de alcohol para las cepas utilizadas

en arabinosa, ramnosa, galactosa y xilosa. Se obtuvo que la cepa LR4 (figura 28b) produce

alcohol a partir de galactosa con una fase exponencial de las 36 a las 50 h de fermentación. En

la cepa T1 (figura 28d), se obtuvo una producción de alcohol a partir de xilosa superior a la

producida por la cepa LR4 de galactosa, se observa una fase exponencial de producción de

alcohol a partir de las 48 h.


82


Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0.0

0.5

1.0


Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8


Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0.0

0.5

1.0


Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0

1

2

3

4

5

Figura 28. Cinéticas de producción de alcohol para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes fuentes de carbono. Arabinosa (círculo negro), Galactosa (círculo rojo), Xilosa (triángulo invertido verde claro) y

Ramnosa (triángulo amarillo)

La presencia de las enzimas xilosa reductasa (XR) y xilitol deshidrogenasa (XDH) beneficia la

asimilación de la xilosa y la producción de etanol a partir de ésta fuente de carbono (Van

Maris y col., 2006). En la figura 29, se observa el consumo de la glucosa, sacarosa y fructosas

en todas las cepas utilizadas para obtener el perfil de asimilación. Para la cepa LR2 (figura

29a) se observa una disminución en la concentración de los tres azúcares durante las 24 h de

fermentación donde el azúcar que más se consume es la glucosa con 38.39 ± 0.44 g/L que

representa un porcentaje de consumo del 54.46 ± 0.63 %. Le siguen en consumo la sacarosa

con 39.98 ± 0.05 g/L (52.46 ± 0.07 %) y fructosa con 27.11 ± 0.97 g/L del azúcar consumido

(38.45 ± 1.38 %).


83


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Con

sum

o de

car

bohi

drat

os (

g/L)

20

30

40

50

60

70

80


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

10

20

30

40

50

60

70

80


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Con

sum

o de

car

bohi

drat

os (

g/L)

20

30

40

50

60

70

80


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Con

sum

o de

car

bohi

drat

os (

g/L)

20

30

40

50

60

70

80

Figura 29. Cinéticas de consumo de carbohidratos para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes fuentes de carbono. Glucosa (círculo negro), Sacarosa (círculo rojo) y Fructosa (triángulo invertido verde claro)

En la cepa LR4 (figura 29b) se observa un consumo mayor de la glucosa con 52.36 ± 0.53 g/L

(74.26 ± 0.75 %) que es superior a lo consumido por la cepa LR2, le sigue en consumo la

sacarosa con 37.39 ± 0.15 g/L (53.03 ± 0.21 %) y la fructosa con 28.64 ± 0.04 g/L (40.62 ±

0.06 %). En las cepas LR5 y T1 se observa un consumo similar en glucosa y sacarosa, en

fructosa se observa que a paritr de las 18 h ya no hay consumo del carbohidrato. La cepa LR5

(figura 29c) tuvo un consumo de 38.18 ± 0.83 g/L (54.15 ± 1.18 %) de glucosa, de sacarosa

39.24 ± 0.24 g/L (55.65 ± 0.34 %) y por último de fructosa con 25.46 ± 0.31 g/L (36.12 ± 0.44

%). La cepa T1 que presentó un consumo similar a la cepa LR5 obtuvo un consumo de

glucosa 41.42 ± 5.59 g/L (58.75 ± 7.93 %), de sacarosa 43.11 ± 0.29 g/L (61.14 ± 0.41 %) y

fructosa 25.43 ± 0.35 g/L (36.07 ± 0.50 %). Los consumos de la cepa T1 (figura 29d) en

glucosa y sacarosa fueron superiores a la cepa LR5 con base en los porcentajes de consumo

obtenidos y muy similares sin una diferencia significativa en fructosa.


84

En la figura 30, se observa el consumo de arabinosa, galactosa, xilosa y ramnosa, para la cepa

LR4 (figura 30b) se observa un consumo de la galactosa de 9.57 ± 0.40 g/L que representa un

porcentaje de consumo del 13.57 ± 0.54 %, de resto de azúcares no se observó un consumo

importante. La cepa T1 (figura 30d) presentó un consumo de xilosa 23.22 ± 0.31 g/L (32.93 ±

0.43 %), del resto de los azúcares no se observó un consumo. Para la cepa LR2 (figura 30a) y

LR5 (figura 30b) no se observa un porcentaje de consumo importante en arabinosa, xilosa,

galactosa y ramnosa.

Los resultados cinéticos promedio de crecimiento y producción de alcohol se encuentran en la

tabla 16 donde se especifican los datos obtenidos a las mejores condiciones de producción de

alcohol de las cepas utilizadas. De acuerdo a los parámetros cinéticos obtenidos se sugiere que

las cuatro cepas probadas (LR2, LR4, LR5 y T1) asimilan principalmente glucosa, fructosa y

sacarosa, y tienen la capacidad de producir alcohol a partir de éstas fuentes de carbono.

En glucosa, la cepa LR4 se destaca debido a que obtuvo el mayor peso seco con 1.27 ± 0.06

g/L, el mayor porcentaje de consumo de azúcares con 74.26 ± 0.75 % (52.36 ± 0.53 g/L) a las

24 h de fermentación y con una producción máxima de alcohol de 11.02 ± 0.16 g/L de etanol

que representa una eficiencia del 41.18 ± 0.00 %. Aunque la cepa T1 tuvo el mayor

crecimiento poblacional, esto no se ve reflejado en la eficiencia de producción de alcohol

(24.51 ± 4.16 %) siendo la más baja. En el caso de la sacarosa, la cepa LR4 obtuvo los valores

más altos de peso seco con 1.28 ± 0.01 g/L y la mayor producción de alcohol con 7.63 ± 0.21

g/L que representa una eficiencia del 40.19 ± 1.39 %.


85


Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Con

sum

o de

car

bohi

drat

os (

g/L)

55

60

65

70

75

80


Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Con

sum

o de

car

bohi

drat

os (

g/L)

58

60

62

64

66

68

70

72


Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Con

sum

o de

car

bohi

drat

os (

g/L)

60

62

64

66

68

70

72


Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Con

sum

o de

car

bohi

drat

os (

g/L)

45

50

55

60

65

70

75

Figura 30. Cinéticas de consumo de carbohidratos para las cepas a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1, en diferentes

fuentes de carbono. Arabinosa (círculo negro), Galactosa (círculo rojo), Xilosa (triángulo invertido verde claro) y Ramnosa (triángulo amarillo)

El mayor porcentaje de consumo de azúcar lo obtuvo la cepa T1 con 61.14 ± 0.41 % (43.11 ±

0.29 g/L) a las 24 h, esta asimilación se puede justificar debido a que obtuvo el mayor

crecimiento poblacional, pero este consumo no se refleja en el peso seco ni en la eficiencia de

la fermentación. En la fructosa la cepa LR4 presenta el mayor peso seco con 1.12 ± 0.01 g/L

seguido por la cepa T1 con 1.02 ± 0.02 g/L, el mayor porcentaje de consumo de fructosa lo

tiene la LR4 con 40.62 ± 0.06 % (28.64 ± 0.04 g/L) y también la mayor producción de alcohol

con 7.43 ± 0.15 g/L (eficiencia de 50.98 ± 0.00 %). Como se observa en la tabla 16, solo la

cepa LR4 y T1 lograron asimilar galactosa y xilosa, respectivamente y producir alcohol a

partir de ellas. En ramnosa el consumo fue muy bajo pudo haber sido utilizado solo para

mantenimiento celular ya que no se obtuvo una producción de alcohol y en arabinosa los

microorganismos no lograron fermentar el azúcar.


86

Tabla 16. Resultados cinéticos de crecimiento y de producción para las cepas LR2, LR4, LR5 y T1 en medio mínimo

Azúcar Cepa Pob. Max. (x106 cel/mL)

Peso seco (g/L)

Producción de alcohol (g/L)

Eficiencia (%)

Glu

LR2 60±5.65 0.57±0.04 5.92±0.05 30.39±1.38 LR4 83±7.07 1.27±0.06 11.02±0.16 41.18±0.00 LR5 58±5.65 0.44±0.01 5.51±0.15 28.43±1.39 T1 136±36.76 1.22±0.04 5.05±0.07 24.51±4.16

Sac

LR2 77±14.14 0.62±0.01 5.73±0.11 30.39±1.39 LR4 76±3.94 1.28±0.01 7.63±0.21 40.19±1.39 LR5 86±16.26 0.84±0.01 5.17±0.24 26.47±1.39 T1 159±4.95 1.08±0.01 5.98±0.14 27.45±0.00

Fru

LR2 39±3.53 0.49±0.01 5.41±0.30 39.21±0.00 LR4 73±3.53 1.12±0.01 7.43±0.15 50.98±0.00 LR5 29±8.48 0.57±0.00 5.04±0.30 36.27±4.15 T1 78±8.48 1.02±0.02 2.76±0.07 21.56±0.00

Ara

LR2 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 LR4 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 LR5 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 T1 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00

Gal

LR2 2±0.5 0.02±0.02 0±0.00 0±0.00 LR4 15±2.82 0.47±0.02 1.03±0.03 21.56±0.00 LR5 7±1.01 0.13±0.04 0±0.00 0±0.00 T1 6±1.08 0.11±0.01 0±0.00 0±0.00

Xil

LR2 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 LR4 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 LR5 0±0.00 0±0.00 0±0.00 0±0.00 T1 58±10.10 2.08±0.61 3.93±0.11 27.86±1.64

Ram

LR2 2±2.12 0.01±0.00 0.06±0.02 1.62±0.03 LR4 1±1.41 0.10±0.01 0.03±0.01 0.93±0.03 LR5 0±0.00 0±0.00 0±0.0 0±0.00 T1 13±0.00 0.01±0.01 0.01±0.03 0.34±0.04


Se destaca la cepa LR4 en galactosa debido a que crece en poca proporción 0.47 ± 0.02 g/L en

base al peso seco, pero logra asimilar este carbohidrato mejor del resto de las levaduras.

Obtuvo una producción máxima de alcohol de 1.03 ± 0.03 g/L y se obtiene una eficiencia el

21.56 ± 0.00 %.

La cepa T1 asimiló la xilosa como única fuente de carbono obteniendo un peso seco de 2.08 ±

0.61 g/L con una producción de alcohol de 3.93 ± 0.11 g/L con una eficiencia del 27.86 ± 1.64

%. Las cepas LR4 y T1 son una gran opción para ser utilizadas en cultivos ya que en mezcla

tendrían un perfil de asimilación más amplio, lo que resultaría en un mejor aprovechamiento

de los carbohidratos de los residuos cítricos y aumentaría el rendimiento en la producción. Se


87

ha informado de que algunas levaduras, tales como Pichia stipitis y Candida shehatae son

microorganismos silvestres que fermentan xilosa, y su producción de alcohol (etanol) depende

de sus condiciones de cultivo (Fonseca y col., 2007).

En el caso de la arabinosa no se obtuvieron datos positivos por lo que se podría decir que estos

microorganismos no podrían asimilar dicho azúcar en un medio complejo con diferentes

fuentes de carbono. Resultados similares fueron obtenidos por Rodrussameeet y col., (2011)

quienes observaron la ausencia de producción de etanol en los medios adicionados con

arabinosa de una cepa silvestre Kluvyveromyces marxianus. Fonseca y col., (2007) sugieren

que, para fermentar arabinosa eficientemente existe una necesidad de superar un desequilibrio

en los cofactores de la vía de asimilación, esto está probablemente relacionado con la

dificultad de encontrar microorganismos silvestres que fermenten arabinosa, si se considera

que este carbohidrato se produce en baja concentraciones en ambientes naturales.

Los análisis de varianza realizados se resumen con los gráficos de Pareto y de interacción para

las variables de respuesta de peso seco y producción de alcohol. En la figura 31, se observa

con base en las gráficas de Pareto (figura 31a) que el tipo de azúcar tiene un efecto

significativo en la respuesta de peso seco. Con base en el gráfico de interacción (figura 31b),

se puede observar que el mejor crecimiento lo obtienen las cepas LR4 y T1, la cepa LR4

asimila principalmente glucosa y sacarosa sin diferencia significativa seguido por fructosa,

cabe destacar que la cepa LR4 es la única cepa que asimila la galactosa. En la cepa T1 se

observa que principalmente consume glucosa seguido de sacarosa y fructosa, una de las

ventajas que tiene esta cepa es que asimila xilosa, debido que es una pentosa y solo ciertos

microorganismos pueden asimilarla para la producción de alcohol, hace a la cepa T1

interesante para su uso sobre residuos lignocelulósicos ya que uno de los principales derivados

de la hemicelulosa es éste azúcar (Ingram y col., 1999).


88

Figura 31. a) Gráfica de Pareto y de b) interacción para la respuesta de peso seco en base al diseño 4x7

En la figura 32, se observa con base en las gráficas de Pareto (figura 32a) que el tipo de

azúcar tiene un efecto significativo en la respuesta de producción de alcohol. Con la gráfica de

interacción (figura 32b) se observa que la mayor producción de alcohol se obtiene de la cepa

LR4 al asimilar glucosa como única fuente de carbono, le sigue la cepa LR2 en la producción

de alcohol a partir de glucosa, sacarosa y fructosa, sin diferencia significativa entre sí. La cepa

T1 produce principalmente alcohol a partir de sacarosa, seguido por glucosa y en menor

cantidad a partir de la fructosa.

Figura 32. a) Gráfica de Pareto y de b) interacción para la respuesta de producción de alcohol en base al diseño 4

x 7

En la figura 33, se observa que el mayor peso seco se obtiene de las cepas LR4 y T1

principalemente a partir de glucosa, sacarosa y fructosa a las condiciones establecidas para la

producción de alcohol, la cepa LR4 se destaca en el consumo de la galactosa sobre el resto de

las cepas que logran asimililarlo pero no se ve reflejado en un crecimiento significado y menos



AB

A:Cepas

B:Azúcar

+-


Pes

o se

co (g

/L)

Cepa

0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

LR2 LR4 LR5.1 T1

AzúcarArabinosaFructosaGalactosaGlucosaRamnosaSacarosaXilosa

Gráfica de Pareto para la Producción de alcohol (g/ L)

0 2 4 6 8 10 12Efectos estandarizados

A:Cepas

AB

B:Azúcar

+-


Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (g

/L)

Cepa

-1

2

5

8

11

14

LR2 LR4 LR5.1 T1

AzúcarArabinosaFructosaGalactosaGlucosaRamnosaSacarosaXilosa

a) b)

b) a)


89

en la producción de alcohol. La cepa T1, es la cepa que asimila xilosa despues de 56 h de

fermentación de éste azúcar se obtiene el mayor peso seco de alrededor 2 g/L.

Figura 33. Perfil de asimilación de diferentes fuentes de carbono en base al peso seco

En la figura 34, se observa que la mayor producción de alcohol se da a partir de la glucosa,

sacarosa y fructosa, donde, en estos azúcares la cepa LR4 tiene la capacidad de producir una

mayor cantidad de alcohol a las condiciones establecidas como más adecuadas para su

fermentación seguida de la cepa LR2 en glucosa, T1 en sacarosa y sin una diferencia

significativa las cepas LR2 y LR5 en fructosa.

Se destacan los resultados en galactosa donde la cepa LR4 fue la única capaz de producir

alcohol a partir de este azúcar y de la cepa T1 donde produce el metabolito utilizando a la

xilosa como única fuente de carbono. En arabinosa y ramnosa los microorganismos no

lograron crecer y producir alcohol a partir de estos azúcares, por lo que en un medio complejo

si existiera arabinosa y ramnosa estos microrganismos no tendrían la capacidad de producir

alcohol a partir de esta fuente de carbono, según los resultados que se obtuvieron. Las cepas

LR4 y T1, podrían ser utilizadas en cultivos mixtos ya que producen alcohol de forma

mayoritaria en glucosa, fructosa y sacarosa, y producen a partir de galactosa y xilosa,

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Glucosa Sacarosa Fructosa Galactosa Xilosa Ramnosa Arabinosa

Pes

o se

co (

g/L)

LR2

LR4

LR5.1

T1


90

respectivamente. Wilkins y col., (2005) y Widmer y col., (2010) reportan que los azúcares

presentes después de una hidrolisis enzimática en los residuos cítricos son: glucosa (29.58 %),

Fructosa (17.40 %), galactosa (5.55 %), arabinosa (4.06 %), xilosa (1.16 %), ramnosa (1.16

%) y sacarosa (1.09 %) que representan el 60% en materia seca de éstos residuos, la propuesta

actual es mejorar la eficiencia de producción de alcohol a partir de estos azúcares.

Figura 34. Perfil de asimilación de diferentes fuentes de carbono en base a la producción de alcohol

7.3.3 Modificación del esquema de propagación

Con la finalidad de disminuir el estrés de las células al ser crecidas en tubos con medio

mínimo para inocular en matraz y realizar la cinética de crecimiento y producción de alcohol

con el mismo medio, se realizó una modificación en el proceso de propagación celular.

Primero se inoculó en tubos con medio de YPD con la finalidad de activar y aumentar la

viabilidad celular, luego se inoculó la crema obtenida despues de las 24 h de crecimiento en un

matraz que contenia 250 mL de medio mínimo y se relizó la cinética aumentando el tiempo de

muestreo hasta las 32 h, esperando a que el microorganismo consumiera mejor el azúcar y

aumentara la producción de alcohol.

0

2

4

6

8

10

12

Glucosa Sacarosa Fructosa Galactosa Xilosa Ramnosa Arabinosa

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

LR2

LR4

LR5.1

T1


91

En la figura 35, se observan las curvas de crecimiento con base en el peso seco donde para la

cepa LR2 (figura 35a) se observa que la modificación en el esquema la benefició en el

crecimiento obteniendo un peso seco de 0.91 ± 0.02 g/L en comparación con el crecimiento

establecido que fue de 0.79 ± 0.01 g/L.

a) Candida Glabrata (LR2)

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

Pes

o se

co (

g/L)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0b) Candida tropicalis (LR4)

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

Pes

o se

co (

g/L)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

Pes

o se

co (

g/L)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2d) Candida glabrata (T1)

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

Pes

o se

co (

g/L)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Figura 35. Cinéticas de crecimiento (Peso seco) en la modificación del esquema de propagación para la cepa a)

LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1. Glucosa (círculo rojo), Glucosa con pase en YPD (círculo naranja), Galactosa (triángulo invertido verde claro) y Galactosa con pase en YPD (triángulo verde oscuro).

En la cepa LR4 (figura 35b), se observa un crecimiento mucho más rápido cuando se usa el

esquema normal aunque al final se obtienen pesos secos similares, en este caso se obtuvo un

peso seco final en el esquema normal de 1.59 ± 0.54 /L y en el esquema de propagación

modificado de 1.51 ± 0.05 g/L por lo que no existe una diferencia significativa en el

crecimiento de la cepa LR4.


92

En la cepa LR5 (figura 35c) y T1 (figura 35d) se observa que el esquema de propagación

modificado benefició en el crecimiento obteniendo para la cepa LR5 un peso seco de 1.10 ±

0.02 g/L y para la cepa T1 2.04 ± 0.05 g/L.

En ambas cepas se obtuvo un peso seco menor en el esquema de propagación normal donde

para la cepa LR5 se obtuvo 0.75 ± 0.03 y para la cepa T1 1.41 ± 0.01 g/L. Se obtuvo una

diferencia significativa en los esquemas de propagación para estás dos cepas. La cepa T1

presentó el mayor creciminto con base en el peso seco de las cuatro cepas analizadas. En

galactosa no se presentó una diferencía en el crecimiento ya que ningun microorganismo

presento un aumento en su población significativamente.

En la Figura 36, se presentan las cinéticas de producción de alcohol, en donde la modificación

del esquema de propagación ayudó a la obtención de una mayor concentración del metabolito

en las cuatro cepas analizadas.

Donde la máxima producción de alcohol se obtuvo en la cepa LR4 (figura 36b) con 13.99 ±

0.41 g/L seguido por la cepa LR2 (figura 36a) 11.96 ± 0.44, en la cepa LR5 (figura 36c) se

obtuvo 9.34 ± 0.26 g/L y para la cepa T1 (figura 36d) 7.54 ± 0.17 g/L. La baja producción de

la cepa T1 pudo ser debido a que la mayor cantidad de glucosa consumida fue utilizada por el

microorganismo para su crecimiento. Debido a que en galactosa no se presentó un crecimiento

significativo de todas las cepas probadas no se detectó alcohol ya que es un metabolito

primario asociado al crecimiento.

En la figura 37, se observan las cinéticas de consumo de los carbohidratos glucosa y galactosa

en los dos esquemas de propagación de las cuatro cepas probadas, se observó que el consumo

de la glucosa en el esquema de propagación normal se da con mayor velocidad que con el

esquema modificado con YPD, aunque al final de la cinética de fermentación se obtuvieron

similares consumos.


93


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0

2

4

6

8

10

12

14b) Candida tropicalis (LR4)

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0

2

4

6

8

10

12

14


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0

2

4

6

8

10

12d) Candida glabrata (T1)

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0

2

4

6

8

10

Figura 36. Cinéticas de producción de alcohol en la modificación del esquema de propagación para la cepa a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1. Glucosa (círculo rojo), Glucosa con pase en YPD (círculo naranja), Galactosa

(triángulo invertido verde claro) y Galactosa con pase en YPD (triángulo verde oscuro).

Para la cepa LR2 (figura 37a) se obtuvo un consumo de glucosa de 38.39 ± 0.44 (54.46 ± 0.63

%) y 42.57 ± 0.08 g/L (60.38 ± 0.13 %), para la cepa LR4 (figura 37b) se obtuvo un consumo

de 52.36 ±0.53 g/L (74.26 ± 0.75 %) y 51.92 ± 0.26 (73.64 ± 0.38 %), para la cepa LR5

(figura 37c) se obtuvo un consumo de 38.18 ± 0.83 g/L (54.10 ± 1.18 %) y 41.82 ± 0.08

(59.32 ± 0.13 %) y por último la cepa T1 (figura 37d) obtuvo un consumo de 41.42 ± 5.59

g/L (58.74 ± 7.93 %) y 38.99 ± 0.31 g/L (55.30 ± 0.44 %), primero para el esquema normal y

segundo para el esquema modificado, respectivamente. Se obtuvo un consumo del 50 al 70 %

por lo que ampliando el tiempo de fermentación se esperaría una disminución en la


94

concentración de glucosa. No se presentó un consumo significativo de galactosa para todas las

cepas probadas.

a) Candida glabrta (LR2)

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

Con

sum

o de

car

bohi

drat

os (

g/L)

20

30

40

50

60

70

80b) Candida tropicalis (LR4)

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

Con

sum

o de

car

bohi

drat

os (

g/L)

10

20

30

40

50

60

70

80


Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

Con

sum

o de

car

bohi

drat

os (

g/L)

20

30

40

50

60

70

80d) Candida glabrata (g/L)

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30

Con

sum

o de

car

bohi

drat

os (

gL)

20

30

40

50

60

70

80

Figura 37. Cinéticas de consumo de carbohidratos en la modificación del esquema de propagación para la cepa a) LR2, b) LR4, c) LR5 y d) T1. Glucosa (círculo rojo), Glucosa con pase en YPD (círculo naranja), Galactosa

(triángulo invertido verde claro) y Galactosa con pase en YPD (triángulo verde oscuro).

Los resultados cinéticos promedio de crecimiento y producción de alcohol se encuentran en la

tabla 17 donde se especifican los datos obtenidos a las mejores condiciones de producción de

alcohol (tabla 14) de las cuatro cepas utilizadas. De acuerdo a los parámetros cinéticos

obtenidos las cuatro cepas probadas (LR2, LR4, LR5 y T1) mejoraron la asimilación de la

glucosa con base en el peso seco y la producción de alcohol al cambiar el esquema de

propagación para utilizar una activación en medio YPD, manteniéndose con resultados

similares para la galactosa. Esto sugiere que con una buena formulación del medio de cultivo


95

se podría aumentar el consumo de los azúcares y por consiguiente la cantidad de alcohol

producido para los azúcares que estos microrganismos son capaces de asimilar. Se está

trabajando para corroborar la baja asimilación del resto de los azúcares modificando el

esquema de propagación.

Tabla 17. Resultados cinéticos obtenidos en la comparación de los esquemas de propagación

Cepa Carbohidrato Pob. Max. (x106 cel/mL)

Peso seco (g/L)

Alcohol producido

(g/L)

Eficiencia (%)

LR2

Glu 60±5.65 0.57±0.04 5.92±0.05 30.39±1.38

Glu-YPD 53±12.02 0.69±0.024 11.96±0.44 54.90±2.14

Gal 2±0.5 0.02±0.02 0±0.00 0±0.00

Gal-YPD 3±2.24 0.02±0.01 0.07±0.06 2.94±1.93

LR4

Glu 83±7.07 1.27±0.06 11.02±0.16 41.18±0.00

Glu-YPD 40±4.95 1.32±0.02 13.99±0.41 52.94±1.38

Gal 15±2.82 0.47±0.02 1.03±0.03 21.56±0.00

Gal-YPD 10±2.12 0.29±0.02 0.24±0.01 6.86±0.01

LR5

Glu 58±5.65 0.44±0.01 5.51±0.15 28.43±1.39

Glu-YPD 77±14.84 0.96±0.02 9.34±0.26 44.12±1.18

Gal 7±1.01 0.13±0.04 0±0.00 0±0.00

Gal-YPD 11±0.71 0.16±0.04 0.04±0.01 1.96±0.00

T1

Glu 136±36.76 1.22±0.04 5.05±0.07 24.51±4.16

Glu-YPD 205±40.31 1.96±0.10 7.54±0.17 38.23±0.66

Gal 6±1.08 0.11±0.01 0±0.00 0±0.00

Gal-YPD 2±0.70 0.09±0.04 0±0.00 0±0.00 LR2, Candida glabrata; LR4, Candida tropicalis; LR5, Candida glabrata; y T1 Candida glabrata.

Con base en los resultados cinéticos de crecimiento, se muestra que la mayor población y peso

seco se obtiene en la cepa T1 cuando fue crecida en glucosa con un el esquema de

propagación en YPD, tuvo una población de 205 ± 40.31 x106 cel/mL y un peso seco de 1.96

± 0.10 g/L, la baja producción de alcohol para esta cepa pudo ser debido a que la mayor

cantidad de glucosa fue para el crecimiento del microorganismo. Con base en los parámetros

cinéticos de producción, a partir de la cepa LR4 se obtuvo la mayor producción de alcohol

cuando fue crecida en glucosa con el esquema modificado obtuvo una concentración de

13.99±0.41 g/L. La mejor eficiencia se obtuvo en los resultados obtenidos de la cepa LR2 en

el mismo esquema modificado con 54.90 ± 2.14 %.


96

Figura 38. Gráfica de medias para a) peso seco y b) producción de alcohol en glucosa comparando el esquema de

propagación

El análisis de varianza realizado para estos azúcares demostró una diferencia estadisticamente

significativa (p<0.05) entre las cepas probadas en las respuestas de crecimiento poblacional,

peso seco, producción de alcohol y eficiencia. En la figura 38 se muestra la gráfica de medias

para la respuestas de peso seco (figura 38a) y producción de alcohol (figura 38b) en glucosa

donde se observa claramente que el crecimiento de la cepa T1 en el esquema modificado tiene

una diferencia significativa en comparación al resto de las cepas, todas las cepas presentaron

un mejor crecimiento con base en el peso seco con éste sistema de propagación. También se

observó con el gráfico de medias para la producción de alcohol que el esquema de

propagación modificado sería el adecuado para el consumo de glucosa y aumentar la


Figura 39. Gráfica de medias para a) peso seco y b) producción de alcohol en galactosa comparando el esquema de propagación

a) b)

a) b)


97

En la figura 39, se muestra la gráfica de medias para la respuestas de peso seco (figura 39a) y

producción de alcohol (figura 39b) en galactosa donde se observa claramente que el

crecimiento y la mejor producción de alcohol se obtuvo en la cepa LR4 en el esquema normal

de propagación, por lo que el esquema modificado podría no beneficiar el consumo de los

azúcares que se asimilaron en baja proporción con base al diseño factorial anterior planteado

(tabla 8).

7.4 Evaluación de la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en mezclas

de azúcares

7.4.1 Comparación de dos medios de fermentación

Para conocer si el medio sintético propuesto en la tabla 5 es el más adecuado para realizar las

cinéticas en cultivo mixto, se comparó con un medio con base en nitrógeno (Atlas R., 2010)

(tabla 6) donde la única fuente de carbono en ambos fue glucosa (70 g/L).

En la figura 40, se puede observar las cinéticas de fermentación de la cepa LR4 y T1 en

medio mínimo de sales y en medio mínimo con base en base nitrógeno. Se obtuvo un

crecimiento constante de la cepa LR4 en el medio mínimo de sales durante toda la

fermentación, se obtuvo un peso seco (figura 40a) de 1.37 ± 0.22 g/L con una µmax 0.16 ± 0.05

(h-1) y no se observa la fase estacionaria de crecimiento, la concentración máxima obtenida de

etanol (figura 40b) fue de 13.70 ± 0.29 g/L y el porcentaje de consumo (figura 40c) de la

glucosa fue de un 52.47 ± 10.75 % (40.26 ± 7.58 g/L) a las 32 h. En el medio mínimo base

nitrógeno, se observa un crecimiento constante de la cepa LR4 durante toda la fermentación,

se obtuvo un peso seco de 1.33 ± 0.04 g/L con un µmax 0.24 ± 0.01 (h-1), la concentración

máxima obtenida de etanol fue de 14.90 ± 0.30 g/L y el consumo de la glucosa fue de un 47.16

± 1.06 % (33.19 ± 0.75 g/L) a las 32 h.


98

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

Pes

o se

co (

g/L)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (

g/L)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30 35

Con

sum

o de

car

bohi

drat

os (

g/L)

20

30

40

50

60

70

80

Figura 40. Gráficas de a) crecimiento (Peso seco), b) producción de alcohol y c) consumo de carbohidratos en la comparación de dos medios de fermentación. LR4-Medio 2 (círculo rojo), LR4-Medio 3 (círculo naranja), T1-

Medio 2 (triángulo invertido verde claro) y T1-Medio 3 (triángulo verde oscuro)

En el medio mínimo de sales la cepa T1 tiene un crecimiento constante a partir de las 6 h

donde al final de la fermentación se tiene un peso seco máximo de 2.37 ± 0.18 g/L con una

µmax 0.30 ± 0.13 (h-1), una concentración máxima de alcohol de 7.97 ± 0.03 g/L y donde el

consumo de glucosa fue de un 66.95 ± 3.75 % (34.28 ± 2.64 g/L) a las 32 h. En el medio

mínimo base nitrógeno, se tiene de nuevo un crecimiento constante de la cepa T1 a partir de

las 6 h donde al final de la fermentación se tiene un peso seco máximo de 3.04 ± 0.04 g/L con

una µmax 0.28 ± 0.01 (h-1), una concentración máxima de alcohol de 16.11 ± 0.26 g/ y donde el

consumo de glucosa fue de un 57.73 ± 2.88 % (44.75 ± 2.02 g/L) a las 32 h.

a) b)

c)


99

Los parámetros cinéticos promedio de la cinética de fermentación en el medio mínimo de sales

(medio 2) y en el medio mínimo con base nitrógeno (medio 3) se presentan a continuación. En

la tabla 18, se observa que la cepa T1 tiene los mejores promedios de crecimiento en el medio

2 donde a las 32 h ya tiene un peso seco de 2.37 ± 0.18 g/L con un tiempo de duplicación

(2.54 ± 1.10 h) mucho más bajo que el de la cepa LR4. Con respecto a los parámetros cinéticos

de producción de alcohol la cepa LR4 obtiene la mayor concentración de alcohol con 13.70 ±

0.29 g/L a las 32 h esto representa una eficiencia del 68.62 ± 11.09 % y una productividad

máxima de 0.43 ± 0.01 g/Lh. En ambos casos se observa que el azúcar no fue consumida en su

totalidad.

Tabla 18. Parámetros cinéticos en la comparación de dos medios de fermentación

T (oC)

Agi (rpm)

Cepa

Pob. Max. (x106

cel/mL)

Peso seco (g/L)

µmax (h-1)

Td (h) Producción de Alcohol

(g/L) Yp/s

Pmax

(g/Lh)

Azúcar cons (g/L)

35 0 LR4* 63±26.87 1.37±0.22 0.16±0.05 4.59±1.39 13.70±0.29 0.35±0.04 0.43±0.01 39.71±4.40

LR4** 54±46.69 1.33±0.04 0.24±0.01 2.98±0.17 14.90±0.30 0.45±0.01 0.47±0.00 32.92±1.13

35 200 T1* 288±49.50 2.37±0.18 0.30±0.13 2.54±1.10 7.97±0.03 0.23±0.01 0.25±0.01 35.30±1.87

T1** 322±60.10 3.04±0.04 0.28±0.01 2.45±0.13 16.11±0.26 0.34±0.01 0.51±0.01 47.75±0.01

* Medio 2, ** Medio 3 a las mejores conciones de producción de alcohol.


Con base al medio 3, se tiene que la cepa T1 tiene los mejores promedios para crecimiento

donde a las 32 h ya que alcanza un peso seco de 3.04 ± 0.04 g/L con un tiempo de duplicación

(2.45 ± 0.13h) más bajo que la cepa LR4. Con respecto a los parámetros cinéticos de

producción de alcohol la cepa T1 obtiene la mayor concentración de alcohol con 16.11 ± 0.26

g/L a las 32 h esto representa una eficiencia del 66.66 ± 2.77 % y una productividad máxima

de 0.51 ± 0.01 g/Lh. Aunque la cepa LR4 tuvo una producción más baja de alcohol tiene una

eficiencia mayor con 88.23 ± 2.77 %.

Se realizó un análisis de varianza para determinar si existe una diferencia significativa entre

los medios, a partir del crecimiento y la producción de alcohol, los factores principales cepa y

medios, así como la interacción de éstos tuvieron un efecto significativo sobre la variable de

respuesta. En la figura 41, se observa que en la gráfica de interacción para peso seco (figura


100

41a) existe una diferencia significativa en los medios utilizados, donde el medio mínimo con

base en nitrógeno (medio 3) y la cepa T1 presentan los mejores resultados de crecimiento.

Figura 41. Gráfica de medias para a) peso seco y b) producción de alcohol en glucosa comparando el esquema de

propagación

También, en el medio mínimo con base nitrógeno (medio 3) se obtienen los mejores resultados

en la producción de alcohol con una diferencia significativa entre los medios. La mayor

concentración de alcohol se tiene en la cepa T1 (figura 41b) con una diferencia significativa

entre cepas. Esto podría deberse a que el medio contiene elementos traza como son el calcio,

molibdeno, manganeso, cobre, zinc, entre otros, que no se contemplaron en el primer medio

(medio 2). Estos elementos son importantes ya que tienen diversas funciones en la vía de

producción de alcohol, como por ejemplo, el calcio aumenta la velocidad de crecimiento

(Yx/s), brinda protección y estructura a la membrana plasmática y mantiene la permeabilidad

membranal ante adversidades; el manganeso cofactor de la enzima enolasa, que incrementa el

contenido de nitrógeno en la célula, mejora la síntesis de proteínas, ayuda a una mayor

producción de tiamina (transforma carbohidratos en energía) y aumenta Yx/s; el zinc cofactor

de la enzima alcohol deshidrogenasa importante para la obtención del metabolito (Jones, et al.

1984)

7.4.2 Fermentación con cultivos individuales

Para evaluar la capacidad de asimilación de las cepas LR2, LR4, LR5 y T1 en una mezcla de

azúcares, las cepas fueron crecidas individualmente en un medio que contiene glucosa,

sacarosa, fructosa, galactosa, xilosa y arabinosa en una concentración de 100 g/L a las

Pes

o se

co (g

/L)

MEDIOS23


CEPAS

1.3

1.6

1.9

2.2

2.5

2.8

3.1

LR4 T1


Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (g

/L)

MEDIOS

7.9

9.9

11.9

13.9

15.9

17.9

2 3

CEPASLR4T1

a) b)


101

proporciones reportadas en la literatura (Wilkins y col., 2005 y Boluda-Aguilar y col., 2013)

de residuos cítricos, las fermentaciones se llevaron a cabo durante 10.5 días a las mejores

condiciones para la producción de alcohol ya antes mencionadas (tabla 14). En la figura 42,

se observan las curvas de crecimiento para las cuatro cepas probadas, la cepa T1 tiene un

crecimiento exponencial hasta los 2.5 días y se estabiliza durante todo el tiempo de

fermentación para la producción en esta se obtuvo el mejor crecimiento en la mezcla de

azúcares, ya que los primeros días podría estar desviando su metabolismo hacia el

crecimiento. Le sigue en crecimiento la cepa LR4, el microorganismos presenta un

crecimiento exponencial hasta alrededor de los 3 días de fermentación manteniéndose con el

mismo peso seco en el transcurso del tiempo, el crecimiento de la cepa LR4 fue casi la mitad

que el de la cepa T1. En las cepas LR2 y LR5 se tiene un bajo crecimiento siendo la que

obtuvo los resultados más bajos de crecimiento la primera, este resultado se puede contrastar

con el obtenido en el medio YPD ya que la cepa LR2 obtenía uno de los mejores resultados en

crecimiento, el medio mínimo de sales base nitrógeno con mezcla de azúcares no beneficia el

crecimiento de la cepa LR2.

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10

Pes

o se

co (

g/L)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Figura 42. Cinéticas de crecimiento en mezcla de azúcares en cultivos individuales. LR2 (círculo rojo), LR4

(círculo naranja), LR5 (triángulo invertido verde claro) y T1 (triángulo verde oscuro)

En los parámetros cinéticos de crecimiento (tabla 19) obtenidos de las cepas probadas en base

a la mayor producción de alcohol, se observa que la cepa T1 tiene la mayor población con

240 ± 1.41 x106 cel/mL y el mejor peso seco con 2.07 ± 0.07 g/L a los 8 días de fermentación.

Los valores de µmax (h-1) y Td (h) obtenidos por las cuatro cepas muy por debajo o por arriba,


102

respectivamente a los reportados para la cepa K. marxianus en mezcla de azúcares donde en

glucosa/fructosa una µmax (h-1) de 0.42 con un tiempo de duplicación de 1.65 h en medio

mínimo.

Tabla 19. Parámetros cinéticos de crecimiento en mezcla de azúcares en cultivos individuales

CEPA Pob. Max. (x106 cel/mL)

Peso seco (g/L) µmax (h-1) Td (h) Tiempo (d)

LR2 48±3.53 0.44±0.02 0.11±0.01 7.03±1.28 8 LR4 81±7.78 1.33±0.08 0.13±0.01 5.25±0.57 9 LR5 47±3.53 0.59±0.02 0.22±0.09 3.18±1.30 7 T1 240±1.41 2.07±0.07 0.28±0.14 2.85±1.49 8


En la figura 43, se observa el porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y la producción

de alcohol. En la cepa LR2 (figura 43a) se observa que al primer día se asimilan todos los

azúcares, al 1.5 días la fructosa es el azúcar que más se ha consumido con alrededor del 58 %

en este tiempo se da una estabilidad del azúcar y de la producción de alcohol, la estabilidad en

la producción de alcohol se observa hasta el cuarto día en éste tiempo la xilosa, la galactosa y

arabinosa siguen consumiéndose por lo que podrían ser utilizado por el microorganismo para

su mantenimiento. Se obtuvo un consumo total de azúcares del 71.09 ± 0.01 %. Al octavo día

que se obtuvo la mayor producción de alcohol los azúcares que más se habían consumido son

la xilosa (89.24 ± 0.01 %), fructosa (82.76 ± 0.01 %) y sacarosa (78.32 ± 0.01 %), la glucosa

se asimila en menor proporción que éstos azúcares (65.37 ± 0.01 %). En la cepa LR4 (figura

43b), la glucosa es el azúcar que se asimila principalmente durante los primeros días de

fermentación, a los 3 días se observa un consumo del 82 % y se estabiliza el resto del tiempo

al final de la fermentación la glucosa se asimila alrededor del 99 %. Con respecto a las

pentosas, la xilosa es consumida principalmente donde a los 5.25 días se observa un consumo

del 78 % y tiende a estabilizarse el resto de la fermentación, en el caso de la arabinosa tiene un

consumo lento, similar a la sacarosa, alcanzando un consumo por arriba del 60 %. La cepa

LR4 tuvo un consumo total de azúcares del 90.67 ± 0.17 %. La mayor producción de alcohol

se obtuvo a los 9 días y los principales azúcares consumidos son la glucosa (99.10 ± 0.11 %),

fructosa (89.53 ± 0.37 %), xilosa (88.56 ± 0.01 %) y galactosa (78.15 ± 0.18 %).


103

Tiempo (días)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

10

20

30

a)

Tiempo (días)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

10

20

30

40b)

Tiempo (días)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

10

20

30c)

Tiempo (días)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

10

20

30

d)

Figura 43. Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para la cepa a) LR2 y b) LR4,

c) LR5 y d) T1. Sacarosa (círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo inerso verde claro), Galactosa (triángulo verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado azul marino) y

Etanol (cuadrado con cruz)

En la cepa LR5 (figura 43c), se destaca el consumo de la fructosa alcanzando el consumo

superior al 95 % a los 8 días de fermentación, le siguió en importancia de consumo la glucosa

donde se observa un consumo constante durante los 10.5 días. Se obtuvo un consumo total de

azúcares del 71.04 ± 0.43 %, similar a lo obtenido en la cepa LR2. La mayor producción de

alcohol se obtuvo a los 7 días donde los principales azúcares consumidos son la fructosa

(97.61 ± 0.01 %), glucosa (70.73 ± 1.05 %) y xilosa (68.90 ± 0.33 %). Se observa que la

sacarosa tarda alrededor de 1.5 días para empezar a consumirse aunque al final de la

fermentación se obtuvo un consumo similar al de la glucosa. Por último, en la cepa T1 (figura

43d) se observa un consumo mayoritario de la glucosa con respecto al resto de los azúcares,

seguido por la fructosa que alcanza un consumo de alrededor del 70 % y tiende a estabilizarse

su consumo, también para la xilosa se observa una estabilidad pero obtiene un consumo

máximo a los 5 días de alrededor del 86 %, ambos azúcares se siguen consumiendo pero en


104

poca proporción. La galactosa tardo casi 1.5 días en ser consumido y la arabinosa (68.59 ±

0.01 %) fue el azúcar que menos se consumió similar a lo observado en las otras cepas. Se

obtuvo un consumo total de azúcares del 84.89 ± 0.07 %, por debajo de la cepa LR4. Aunque

no se consumió la totalidad los azúcares en las cuatro cepas usadas se destacan la cepa LR4 y

T1 obteniendo los mayores consumos, esto beneficiaría en el aprovechamiento de la mayor

cantidad de azúcares fermentables presentes en residuos cítricos.

En la figura 20, se observa el consumo total y la velocidad de consumo de azúcar en los

medios individuales para cada cepa.

Tabla 20. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en el medio con mezcla de azúcar de las cepas LR2, LR4, LR5 y T1, de forma individual

Azúcar* CAM*

(%)

Candida glabrata (LR2)

Candida tropicalis (LR4)

Candida glabrata (LR5)

Candida glabrata (T1)

CS** (%)

µs*** (g/Lh)

CS** (%)

µs*** (g/Lh)

CS** (%)

µs*** (g/Lh)

CS** (%)

µs*** (g/Lh)

GLU 51 65.97±1.86 0.039±0.003 99.57±0.03 0.026±0.002 83.78±0.72 0.016±0.001 98.75±0.03 0.030±0.003

FRU 30 88.96±0.27 0.042±0.007 90.53±0.01 0.038±0.004 100±0.02 0.025±0.001 85.28±0.02 0.025±0.002

GAL 8 77.66±0.62 0.023±0.002 77.57±0.04 0.022±0.002 58.58±0.11 0.012±0.002 83.24±0.03 0.027±0.003

SAC 2 93.27±0.03 0.016±0.002 81.96±0.08 0.014±0.002 80.45±0.03 0.012±0.001 87.71±0.04 0.020±0.001

ARA 7 63.09±0.29 0.017±0.003 71.92±0.02 0.022±0.001 57.98±0.08 0.015±0.001 76.81±0.01 0.013±0.001

XIL 2 87.10±0.14 0.024±0.005 91.70±0.01 0.021±0.001 80.65±0.09 0.020±0.001 94.61±0.05 00.021±0.002

*GLU: glucosa, SAC: sacarosa, FRU: fructosa, GAL: galactosa, XIL: xilosa, ARA: arabinosa, CAM: concentración de azúcar en los medios. **CS: el consumo de sustrato en 10.5 días de fermentación ***µ s: Velocidad del consumo de sustrato total determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2> 0.95).

En glucosa, se destaca la cepa LR4 con un consumo total de 99.57 ± 0.03 %, seguido por la

cepa T1 con un consumo de 98.75 ± 0.03 %. En fructosa, la cepa LR5 se destaca con un

consumo total de 100 ± 0.02 % y la cepa LR4 tiene un consumo máximo de 90.53 ± 0.01 %.

Éstos dos azúcares son importantes que se consuman adecuadamente ya que son los

mayoritarios en los hidrolizados cítricos (Wilkins y col., 2005 y Boluda-Aguilar y col., 2013).

En la cepa LR2, el azúcar que se consume más rápido es la fructosa con 0.042 ± 0.007 g/L,

como se puede observar en las gráficas de consumo (figura 43a) donde el azúcar es el

principal consumido. En la cepa LR4, la fructosa es también el azúcar que se consume más

rápido con una velocidad de consumo de 0.038 ± 0.004 g/L, sin una diferencia significativa

con el consumo de la fructosa por la cepa LR2. La cepa T1, asimila la glucosa con una

velocidad de consumo de 0.030 ± 0.003 g/L. Fonseca y col., (2013) reporta la existencia de


105

represión catabólica por glucosa, para el consumo de galactosa, pero no presenta este efecto

entre glucosa/fructosa y fructosa/galactosa en una cepa silvestre de K. marxianus , la represión

se observa en la cepa T1 ya que hasta que la glucosa se consumió alrededor del 40 % es

cuando la galactosa empieza a asimilarse. La fructosa es asimilada con mucha facilidad y a

gran velocidad según lo reportado en la tabla 20. Las cepas LR4 y T1 presentan el mayor

porcentaje de consumo en xilosa y arabinosa, por lo que las hace interesantes para la

asimilación de pentosas en los hidrolizados lignocelulósicos. En la tabla 21, se observan los

parámetros cinéticos de producción de alcohol en la mezcla de azúcares de los cultivos

individuales utilizados.

Tabla 21. Parámetros cinéticos de producción de alcohol en mezcla de azúcares en cultivos individuales

T (oC)

Agi (rpm) Cepa Prod alcohol

(g/L) Yp/s Pmax (g/Ld) µp* (g/Lh) T (d)

45 0 LR2 21.24±1.05 0.32±0.02 2.66±0.13 0.030±0.006 8 35 0 LR4 35.31±4.78 0.42±0.07 3.92±0.53 0.013±0.002 9 40 0 LR5 22.56±0.59 0.33±0.01 3.22±0.08 0.021±0.004 7 35 200 T1 23.08±3.09 0.27±0.03 2.89±0.38 0.047±0.007 8

LR2, Candida glabrata; LR4, Candida tropicalis; LR5, Candida glabrata; y T1 Candida glabrata *µ p: Velocidad de producción de alcohol determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2> 0.95).

Donde los mejores resultados en la producción de alcohol los obtuvo la cepa LR4 con una

producción máxima de alcohol de 35.31 ± 4.78 g/L a los 9 días de fermentación, con un

rendimiento de 0.42 ± 0.07 g/g y una productividad de 3.92 ± 0.53 g/Ld. El rendimiento es

superior obtenido por Hickert y col., 2013 al utilizar una C. shehatae HM 52.2 donde en un

medio mínimo de minerales donde la única fuente de carbono fue glucosa, xilosa y arabinosa

el rendimiento de producción total (Yp/s) fue de 0.40 g/g, pero similar al utilizar un cultivo de

S. cerevisiae y C. shehatae en el mismo medio de sales con la glucosa (20 g/L), xilosa (20

g/L) y arabinosa (10 g/L) como única fuente de carbono. Se realizó un análisis de varianza

para determinar si existe una diferencia significativa entre las cepas probadas en la mezcla de

azúcares.

En la figura 44, se ejemplifica con las gráficas de medias donde se observa una diferencia

significativa en el crecimiento con base en el peso seco (figura 44a) donde la cepa T1 tiene

los mejores resultados y en la producción de alcohol (figura 44c) donde la cepa LR4 se


106

diferencia del resto. Donde no se obtuvo diferencia significativa fue en la µmáx (figura 44b) y

en la Pmáx (figura 44d) por lo que con cualquier microorganismo se pudiera tener una buena

productividad en la producción de alcohol en la mezcla de azúcares a las mejores condiciones

de fermentación para cada cepa. Para mejorar la capacidad de asimilación de las cepas LR4 y

T1 en la mezcla de azúcares, las cepas fueron crecidas en un medio similar a los residuos con

una concentración total de azúcar de 200g/L, la fermentación también se llevó a cabo durante

10.5 días a sus mejores condiciones de producción de alcohol. En la figura 45, se observa el

crecimiento obtenido en peso seco para las cepas LR4 y T1 en una mezcla de azúcares (200

g/L), donde el crecimiento máximo para la cepa T1 en 3.5 días de fermentación fue de

alrededor 2.60 ± 0.24 g/L de peso seco más alto que el valor máximo obtenido por la cepa

LR4 (1.93 ± 0.13 g/L) después de 3 días de fermentación, la velocidad de crecimiento para la

cepa T1 (0.086 ± 0.011 g/Lh) también fue mayor que el obtenido para la cepa LR4 (0.060 ±

0.008 g/Lh).

Figura 44. Gráfica de medias para a) peso seco, b) µmáx, c) producción de alcohol y d) Pmáx en mezcla de

azúcares en los cultivos individuales empleados

a) b)

c) d)


107

Los resultados sugieren que la cepa T1 podría utilizar la fuente de carbono para la producción

de biomasa y mantenimiento celular, en lugar de la producción de metabolitos, que se refleja

en la concentración menor de alcohol.

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10

Pes

o se

co (

g/L)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Figura 45. Cinéticas de crecimiento en mezcla de azúcares en cultivos individuales. LR4 (círculo rojo) y T1

(círculo naranja)

En la figura 46a, se muestran los perfiles de asimilación de los azúcares que se presentan en el

medio y la producción de alcohol en el tiempo de fermentación de la cepa LR4. La cepa fue

capaz de asimilar más del 65 % de cada una de las hexosas y al menos el 40 % de las pentosas

en las concentraciones utilizadas para la fermentación. Después de tres días de fermentación,

los azúcares que se habían consumido mayoritariamente en el medio fueron la glucosa,

fructosa y galactosa con un consumo de 57, 37 y 54 %, respectivamente, representan el 48 %

del total de azúcar consumido.

Después de 7 días la glucosa y la fructosa alcanzaron un equilibrio con 80 y 60 % de azúcar

consumido, respectivamente. La galactosa presenta pequeños incrementos en el consumo hasta

alcanzar su máximo (70 %) después de 10 días de fermentación. La sacarosa se consume

gradualmente durante toda la fermentación hasta un máximo de 80 %. Con respecto a las

pentosas, el consumo de xilosa inició después de 3 días de fermentación con valores de

alrededor de 16 %, que se mantiene constante hasta 5.5 días, luego el consumo aumentó

gradualmente hasta alcanzar el valor más alto de 44 % después de 8 días y se mantuvo

constante hasta que terminó la fermentación. La arabinosa fue ligeramente consumida desde el

primer día hasta el segundo día y medio con un valor del 20 %, después se aumentó


108

rápidamente para un consumo del 40 % a los 3 días de fermentación. En general después de 10

días de fermentación, se observó que el medio contenía un 25.8 % del total de azúcares. De

nuevo los resultados mostraron que la cepa LR4 no presentan represión catabólica por glucosa

en otras hexosas evaluadas, sin embargo, pudiera existir represión catabólica en xilosa debido

a que su consumo se inició después de que se consumió un 57 % de la glucosa.

De Bari y col., (2013) observaron que el consumo de glucosa y xilosa se produce de forma

secuencial para la producción de etanol por Scheffersomyces stipitis, la asimilación de la

xilosa, aumentó significativamente sólo cuando la concentración de glucosa disminuyó.

Govindaswamy y col., (2007) informó que después de la utilización de glucosa, se asimila la

xilosa en la fermentación de un mezcla de azúcares, esto sugiere que la inhibición en la

fermentación de la xilosa es probablemente debido a la competencia para el sistema

transportador de azúcares en la levaduras, ya que la glucosa se transporta a través de la célula

por un sistema transportador de hexosas que se cree que es el mismo para el transporte de

xilosa en levaduras (De Bari y col., 2007).

En el medio de mezcla de azúcares, la asimilación de las pentosas fue mayor en comparación a

cuando se utilizó como única fuente de carbono, se podría deber a la activación de enzimas

que el microrganismo necesita para asimilar este azúcar. Fonseca y col., (2007) observaron la

asimilación de arabinosa para la formación de la biomasa con Candida arabinofermentans en

medios sin agitación. Por otro lado, Schimer-Michel y col., (2008) reportaron que la arabinosa

es metabolizada sólo después del agotamiento de la glucosa y la xilosa.

La cepa T1 (figura 46b) fue capaz de asimilar un 60 % de los azúcares totales presentes en la

fermentación. Después de tres días la glucosa, fructosa y galactosa mostraron valores de

consumo de 47, 43 y37 %, respectivamente, que representan alrededor del 40 % del total del

azúcar en el medio, este valor fue ligeramente menor al obtenido en la cepa LR4 al mismo

tiempo. La fructosa alcanzó un consumo máximo de azúcar (48 %) a los 7 días y la glucosa,

galactosa y sacarosa después de 9 días, obtuvieron valores de 65, 79 y 83 %, respectivamente.


109

Tiempo (días)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

10

20

30

40

50

a)

Tiempo (días)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

10

20

30

b)

Figura 46. Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para la cepa a) LR4 y b) T1. Sacarosa (círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo inverso verde claro), Galactosa (triángulo

verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado azul marino) y Etanol (cuadrado con cruz)

En el consumo de pentosas para la cepa T1, la xilosa comenzó a ser consumida lentamente

después de dos días (5 %), manteniéndose constante hasta el día 5.5 y aumento gradualmente

hasta llegar a alrededor de 48 % del consumo total después de 10 días. La arabinosa mostró la

mitad de su consumo total a los dos días de fermentación y luego un consumo gradual hasta

alcanzar su valor máximo de 52 % en 9.5 días. Este resultado no es similar a lo reportado por

Schimer-Michel y col., (2008) que informaron que la arabinosa se comienza a metabolizar en

una fase posterior, cuando se han agotado tanto la glucosa como la xilosa, perfil metabólico

similar se ha observado para otras especies de Candida. Bettiga y col., (2009) informó de un

consumo paralelo de arabinosa y xilosa en una mezcla que contenía glucosa, sin embargo, se

ha obtenido con una cepa de S. cerevisiae modificada.

Las velocidades de consumo se muestran en la tabla 22, indican que la glucosa para la cepa

LR4 fue de las hexosas que se consumió más rápido (0.023 ± 0.001 g/Lh), seguido de sacarosa

y galactosa, el azúcar que se consumió más lento fue la fructosa. Según las velocidades de

consumo para las pentosas indicaron que la arabinosa fue la pentosa que más se consumió

(0.024 ± 0.003 g/Lh).


110

Tabla 22. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en el medio con mezcla de azúcar de las cepas LR4 y T1, de forma individual

Azúcar* CAM*

(%)

Candida tropicalis (LR4) Candida glabrata (T1)

CS** (%) µs*** (g/Lh) CS** (%)

µs*** (g/Lh)

GLU 51 83.2±0.10 0.023±0.001 65.0±0.31 0.020±0.002

FRU 30 66.3±0.41 0.015±0.002 48.5±0.78 0.031±0.001

GAL 8 70.1±0.01 0.022±0.002 78.9±0.12 0.019±0.002

SAC 2 80.1±0.01 0.022±0.001 82.7±0.05 0.019±0.004

ARA 7 54.3±0.11 0.024±0.003 52.1±0.33 0.014±0.003

XIL 2 43.8±0.06 0.018±0.002 47.5±0.22 0.013±0.002

*GLU: glucosa, SAC: sacarosa, FRU: fructosa, GAL: galactosa, XIL: xilosa, ARA: arabinosa, CAM: concentración de azúcar en los medios. **CS: el consumo de sustrato en 10.5 días de fermentación ***µ s: Velocidad del consumo de sustrato total determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2> 0.95).

La fructosa para la cepa T1, presenta la velocidad de consumo más alto entre los sustratos

(0.031±0.001 g/Lh) el doble a lo obtenido en la cepa LR4 para el mismo azúcar, además,

presentó una diferencia significativa al resto de los sustratos a excepción de la glucosa.

Aunque la cepa T1 presentó una velocidad de consumo de la xilosa inferior (0.013 ± 0.002

g/Lh) a la cepa LR4 (0.018 ± 0.002 g/Lh), una mejor asimilación se observó en la cepa T1. En

la tabla 23, se puede observar que la máxima producción de alcohol para la cepa T1 se

observó a los 7.5 días (28.9 ± 1.3 g/L), el tiempo donde la mayor parte de los azúcares habían

alcanzado el estado de equilibrio con un consumo total de azúcar del 58.1 ± 1.8 % donde la

contribución de las pentosas es del 4.3 %. La producción de alcohol con la cepa LR4 fue 35 %

más alta que la concentración de alcohol obtenida en la cepa T1, que puede ser explicada por

el menor consumo de glucosa y fructosa observado para la cepa T1 y por la influencia de la

agitación que favorece su crecimiento, también se favorece la disolución del oxígeno en el

medio provocando una reducción en la producción de alcohol.

Tabla 23. Parámetros cinéticos de producción de alcohol y velocidades de producción en el medio con mezcla de azúcar de las cepas LR4 y T1, de forma individual

Sistema TAC* (%) Producción

alcohol (g/L)

Yp/s (g/g) µp** (g/Lh)

Produccón máxima Etanol Productividad (g/L.d) t (d) CS*** (%)

LR4 74.2 ± 4.6 44.5 ± 0.1 0.32 ± 0.01 0.025 ± 0.003 7 69.1 ± 0.7 6.4 ± 0.01

T1 60.3 ± 4.4 28.9 ± 1.3 0.26 ± 0.01 0.040 ± 0.006 7.5 58.1 ± 1.8 3.9 ± 0.17

*TAC: Total consumo de sustrato en 10.5 días de fermentación ** µp: Velocidad de producción de alcohol determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2> 0.95). *** CS: Consumo de sustrato que se obtuvo al día que se obtuvo la máxima producción de alcohol


111

Se ha informado de la capacidad de producción de alcohol por la cepa T1 con características

similares con las de Saccharomyces cerevisiae que mostraron el incremento en la

concentración de alcohol bajo condiciones de oxígeno limitado (Watanabe y col., 2008). La

producción de alcohol en ambas cepas se inició después de 0.5 días de fermentación, a pesar

de que la velocidad de producción fue mayor para la cepa T1 (0.040 ± 0.006 g/Lh), una mayor

producción de alcohol de 44.5 ± 0.1 g/L, se obtuvo para la cepa LR4, así como un mayor

rendimiento (Yp/s) y productividad (tabla 23).

Aunque la glucosa y la fructosa son los azúcares mayoritarios presentados en los residuos

cítricos (Wilkins y col., 2005 y Boluda-Aguilar y col., 2013), una completa conversión

eficiente de las hexosas y pentosas presentes en los hidrolizados lignocelulósicos a alcohol es

un requisito para aumentar al máximo la rentabilidad de un proceso industrial para la

producción de bioetanol (Fu y col., 2009).

7.4.3 Fermentación con cultivos mixtos

Debido a que la cepa LR4 mostró la mejor producción de alcohol a partir de las hexosas

evaluadas y la T1 mostró una mejor asimilación de las pentosas se evaluaron diferentes

esquemas de cultivos mixtos para obtener una conversión simultánea de mezcla de azúcares,

aumentar la asimilación total del sustrato y mejorar la producción de etanol. El primer

esquema de fermentación en cultivo mixto (CC1) se preparó con 60% de las células de la cepa

LR4 y 40 % de T1, en el mismo medio de mezcla de azúcares utilizado en las cinéticas con

cultivos individuales, éstas proporciones se ajustaron para tener un inóculo inicial de 20 x106

cel/mL, se utilizaron las condiciones más adecuadas para la fermentación de la cepa LR4 ya

que se encontraba en menor proporción.

En la figura 47a, se muestran los porcentajes de consumo de carbohidratos y la producción de

alcohol en el cultivo mixto CC1. Al igual que en los medios de cultivo con cepas individuales,

se llevó a cabo la fermentación durante 10.5 días, después de este tiempo el 73.1 ± 4.7 % del

total de azúcar que presentaban los medios se consumió, con al menor un 62 % de cada una de

las hexosas, estos valores son más altos que los obtenidos en la cepa T1 individual y similar a


112

los valores obtenidos por la cepa LR4. Después de 3 días la glucosa, fructosa y galactosa

presentan consumos de 58, 54 y 49 %, que representan alrededor del 50 % del total de

azúcares, este valor es mayor al obtenido por las dos cepas en cultivos individuales al mismo

tiempo (medio con 200 g/L de azúcares fermentables). La glucosa después de 4 días presentó

un consumo lento que fue del 24 al 82 % obtenido a los 10.5 día, se observó el mismo

comportamiento para la fructosa que alcanzó el 62.8 ± 2.78 % y la sacarosa que presentó el

74.1 ± 0.02 % al final de la fermentación (tabla 24).

La galactosa fue consumida adecuadamente llegando a un estado estacionario a los 7 días con

el 85 % del azúcar asimilado. Comparando con los azúcares individuales se obtuvo un

consumo similar en glucosa a lo obtenido por la cepa LR4 y el CC1, pero más alto que lo

obtenido en la cepa T1; el consumo de la fructosa fue 3 % superior en la cepa LR4 y 12 % en

la T1, el consumo de la galactosa también fue mayor en el medio con la mezcla de azúcares en

un 10 % para la cepa LR4 y en un 5 % para la cepa T1, sin la sacarosa se consume menos

alrededor del 20 % más bajo a lo obtenido en los cultivos individuales.

Tiempo (días)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

10

20

30

40

50

a)

Teimpo (dias)

0 2 4 6 8 10

Por

cent

aje

de m

ezcl

a de

la c

epa

0

20

40

60

80

100

b)

Figura 47. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para el cultivo mixto CC1. Sacarosa (círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo inverso verde claro), Galactosa (triángulo verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado azul marino) y Etanol (cuadrado con

cruz). b) Porcentaje de mezcla de las levaduras, LR4 (círculo rojo) y T1 (círculo naranja).

En relación al consumo de las pentosas, la asimilación de la xilosa comenzó después de dos

días de fermentación y presenta un consumo similar a la cepa T1 (6 %) para aumentar

gradualmente hasta el 45 %, similar a lo obtenido en los cultivos individuales de ambas cepas


113

(tabla 22). La arabinosa presentó un comportamiento similar que en los cultivos individuales

con un consumo del 52 %.

En la figura 47b, se muestra el comportamiento del porcentaje celular de la cepa LR4 y T1

inoculadas al mismo tiempo. En un principio, el cultivo se inició con 60 % de la cepa LR4 y

40 % de la cepa T1, a través del tiempo se observó un porcentaje más alto celular de la cepa

T1, donde la obtención de alrededor del 70 % de las células totales se presentan después de 1

día. Aunque se inoculó la cepa LR4 en mayor proporción, el porcentaje celular no permaneció

constante como se puede observar con la reducción a un promedio del 30 % durante el resto de

la fermentación. A pesar de las condiciones de crecimiento se estableció para favorecer la

producción de alcohol de la cepa LR4; la variación en la concentración celular de

microorganismo puede deberse a la diferencia en las velocidades de crecimiento de las cepas,

mayor para la T1 que para la LR4. La ausencia de agitación en los medios no afectó el

crecimiento de la cepa T1, la producción de etanol sigue siendo mayor para la cepa LR4.

Un sistema con una concentración inicial más alta de T1 (80 %) y de LR4 (20 %) se propone

con el fin de observar si una mejor asimilación de los azúcares distintos a la glucosa se podría

lograr sin disminuir la producción de alcohol, condiciones de agitación (200 rpm) se utilizaron

con el fin de favorecer a la cepa T1. En la figura 48a, muestra el comportamiento de consumo

de azúcares y producción de alcohol obtenido en el cultivo mixto CC2 con 10.5 días de

fermentación.

Se observó un consumo máximo de 73.5 ± 5.1 %, con una contribución de las pentosas en un

5 %. Después de tres días de fermentación un consumo del 74, 54 y 49 % de glucosa, fructosa

y galactosa se logró, los valores representan alrededor del 60 % del porcentaje total de los

azúcares presentes en el medio. Los valores obtenidos en este tiempo son más altos que los

obtenidos en las cepas individuales y en el CC1.

Al tercer día, se consumió un 3 % de la glucosa para alcanzar un estado estable alrededor del

día 5 con un 75 % con la velocidad de consumo más rápida obtenido en este cultivo mixto

(0.041 ± 0.004 g/Lh) en comparación a los otros dos esquemas propuestos (CC1 y CC3), la


114

fructosas y la galactosa presentan un consumo máximo después de días con valores de 68 y

83, respectivamente.

Tiempo (días)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

10

20

30

40a)

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10

Por

cent

aje

de m

ezcl

a de

la c

epa

0

20

40

60

80

100

b)



La velocidad de consumo más alta en el CC2 se obtuvo en fructosas (0.079 ± 0.003 g/Lh)

(tabla 24). La sacarosa se consume poco a poco hasta un consumo del 92 % a los 9 días, la

velocidad de consumo es el más pequeño en comparación con el resto de los sistemas (0.015 ±

0.001 g/Lh) para éste azúcar.

Con respecto a las pentosas en el CC2, la xilosa mostró un consumo muy lento hasta el día 6,

después, el consumo fue incrementando gradualmente hasta obtener un consumo del 47 %

similar a lo obtenido por la cepa T1 cuando fue evaluada individualmente, en el caso de la

arabinosa, empezó a ser consumido poco a poco hasta alcanzar un valor máximo después del

día 9 con 58 % con una tasa de consumo de 0.028 ± 0.002 g/Lh, este valor fue el más alto

obtenido para éste azúcar entre los sistemas evaluados.

En la figura 48b, se observa el comportamiento celular de los microorganismos a las

proporciones establecidas, los resultados indicaron que la cepa T1 mantiene un porcentaje

celular inicial similar durante toda la fermentación, con una disminución del 10 % al final de

la fermentación, una ligera variación de la cepa LR4 se observó a los 8 días donde el

porcentaje celular más grande se obtuvo con un 42 %. A pesar de una menor concentración de


115

la cepa LR4 y que las condiciones favorecían a la cepa T1, la producción de alcohol no se vio

afectada.

Tabla 24. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en el medio con mezcla de azúcar de las cepas LR4 y T1 en cultivo mixto

Azúcar* CAM* (%)

CC1 (60% LR4;40% T1)

CC2 (20% LR4; 80% T1)

CC3 (100% LR4; 2d later

100% T1) TAC**

(%) µs*** (g/Lh)

TAC** (%)

µs*** (g/Lh)

TAC** (%)

µs*** (g/Lh)

GLU 51 82.3±0.36 0.020±0.003 77.4±0.95 0.041±0.004 95.2±0.36 0.030±0.001

FRU 30 62.8±2.78 0.042±0.002 68.2±0.12 0.079±0.003 77.8±0.01 0.019±0.003

GAL 8 86.0±0.50 0.017±0.001 83.9±0.46 0.022±0.002 83.0±0.11 0.019±0.002

SAC 2 74.1±0.02 0.023±0.003 92.1±0.10 0.015±0.001 83.0±0.51 0.023±0.002

ARA 7 51.6±0.88 0.021±0.004 58.3±0.15 0.028±0.002 57.7±0.62 0.017±0.001

XIL 2 44.9±0.52 0.012±0.003 47.4±0.15 0.012±0.003 51.3±0.15 0.023±0.002

*GLU: glucosa, SAC: sacarosa, FRU: fructosa, GAL: galactosa, XIL: xilosa, ARA: arabinosa, CAM: concentración de azúcar en los medios. **TAC: total de azúcar consumido en 10.5 días de fermentación ***µ s: Velocidad del consumo de sustrato total determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2> 0.95).

Con el fin de aumentar el consumo de azúcar total y la productividad de alcohol, se propuso

un esquema de cultivo mixto secuencial. La cepa LR4 que produce en grandes cantidades el

alcohol, se inoculó inicialmente a una concentración de 20 x 106 cel/mL, para favorecer la

asimilación de las hexosas y la producción de alcohol sin agitación, secuencialmente a los dos

días a la misma concentración se inoculó la cepa T1 y el sistema comenzó a ser agitado a 200

rpm, para mejorar la asimilación de pentosas.

En la figura 49a, se observó un consumo máximo del 85.2 ± 2.0 % del total de azúcar, donde

el 5 % de los azúcares totales consumidos son contribución por pentosas. Después de 3 días de

fermentación, el consumo del 71, 49 y 54 % de glucosa, fructosa y galactosa se logró, que

representan alrededor del 60 % del total de azúcar presentes en el medio, los resultados con

similares a lo obtenido en el sistema CC2 y mayor que los obtenido en las cepas individuales y

CC1.

Se observó un aumento gradual de la asimilación de la glucosa para hasta llegar un consumo

máximo del 95.2 ± 0.36 % con una velocidad de consumo del 0.030 ± 0.001 g/Lh. La fructosa

y galactosa presentan un consumo del 30 % al día 3, a continuación, se observó un incremento

gradual para llegar a valores de 77.8±0.01 y 83.0±0.11 g/Lh, respectivamente, con velocidades


116

de consumo de alrededor de 0.019 ± 0.003 g/Lh. La sacarosa se consume moderadamente para

llegar a 83.0 ± 0.51 después de 8 días, las tasas de consumo de éste azúcar fue similar a la

obtenida en el sistema CC1 (0.023 ± 0.002 g/Lh).

Tiempo (días)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

10

20

30

40

50

a)

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10P

orce

ntaj

e de

mez

cla

de la

cep

a0

20

40

60

80

100

b)



En el CC3, la xilosa mostró un consumo lento durante 4.5 días, que pudo ser debido a la

ausencia de la cepa T1 que fue inoculada hasta el segundo día, incrementando el consumo

gradualmente hasta alcanzar un 51.3 ± 0.15 % con una velocidad de consumo de 0.023 ±

0.002 g/Lh, estos fueron los valores más altos en los consumos de xilosa. La arabinosa

comenzó a ser consumida gradualmente hasta alcanzar un valor máximo de consumo a los 9

días de 57.7±0.62 % con velocidad de consumo de 0.017±0.001 g/Lh, estos valores fueron

similares a los obtenidos en el sistema CC2 (tabla 24). Los resultados concuerdan con lo

reportado por Guan y col., (2013), que evaluó la asimilación en un mezcla de azúcares

utilizando cepas no recombinantes para la producción de alcohol en un esquema secuencial de

C. shehatae y S. cereviseae o B. bruxellensis. La fermentación secuencial evaluada mostró una

mejor asimilación de azúcar total del 99 %, valores superiores a los obtenidos por las cepas

independientes.

En la figura 49b, se muestra el comportamiento celular en el cultivo secuencial, donde la cepa

LR4 mostró un crecimiento típico durante los primeros 2 días de fermentación, después de la

adición de la cepa T1 la concentración celular total incrementó y por consecuencia el


117

porcentaje celular de cada cepa se vio afectada. Después de 3 días, el porcentaje de

concentración celular para la cepa LR4 disminuyó a 30 % manteniéndose constante entre 20 y

40 % durante el resto de la fermentación. La cepa T1 aumentó su concentración celular a un

70 % y luego se mantuvo constante entre el 60 y 80 % hasta el final de la fermentación.

En el CC1 (tabla 25), la producción máxima de alcohol se obtuvo a los 8 días de fermentación

con 45.2 ± 1.3 g/L, este valor es similar a lo obtenido con la cepa LR4 (medio 200 g/L

azúcares fermentables), pero más alto que el obtenido por la T1 individual, con un rendimiento

(Yp/s) de 0.34 ± 0.01 g/g y la productividad de 5.7 ± 0.16 g/Ld. Los resultados obtenidos son

similares a los reportados por De Bari y col., (2013), quienes observaron más rápida

asimilación de azúcar en co-cultivo de Scheffersomyces stipitis y Saccharomyces cerevisiae

que en los cultivos individuales, no obstante, presentan rendimientos más bajos que los

obtenidos en concentraciones similares (0.28 ± 0.020 g/g).

Tabla 25. Parámetros cinéticos de producción de alcohol y velocidades de producción en el medio con mezcla de azúcar en cultivo mixto

Sistema TAC* (%)

Producción Alcohol

(g/L)

Yp/s (g/g)

µp** (g/L) Producción máxima Etanol Productividad

(g/Ld) t (d) CS*** (%)

CC1**** 73.1 ± 4.7 45.2 ± 1.3 0.34 ± 0.01 0.029 ± 0.004 8 66.4 ± 5.1 5.7 ± 0.16

CC2**** 73.5 ± 5.1 42.4 ± 1.6 0.31 ± 0.01 0.042 ± 0.010 5.5 65.0 ± 1.9 7.7 ± 0.29

CC3**** 85.2 ± 2.0 46.8 ± 2.6 0.30 ± 0.01 0.037 ± 0.007 6 73.7 ± 1.8 7.8 ± 0.44

*TAC: Total consumo de sustrato en 10.5 días de fermentación ** µp: Velocidad de producción de alcohol determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2> 0.95). *** CS: Consumo de sustrato que se obtuvo al día que se obtuvo la máxima producción de alcohol **** CC1: 60 % LR4 - 40 % T1, CC2: 20 % T1 - 80% LR4 y CC3: LR4 100 % 0h - T1 100 % 48h.

En el CC2, se obtuvo una concentración máxima de alcohol de 42.4 ± 1.6 g/L a los 5.5 días, y

mostró una reducción en el tiempo de fermentación para producir alcohol que se refleja en la

velocidad de producción de 0.042 ± 0.010 g/Lh. Se observó también una alta productividad

(7.7 ± 0.29 g/Ld), mayor a lo obtenido en el CC1, En la literatura se reportan valores de

productividad por debajo a los obtenidos por Fu y col., (2009) en un cultivo mixto con

Zymomonas mobilis y Pichia stipitis, y De Bari y col., (2013), en cultivos mixtos de S. stipitis

y S. cerevisiae, en medios mínimos con una mezcla de glucosa y xilosa. El CC3, muestra una

concentración máxima de 46.8 ± 2.6 g/L al día 6, que corresponde con el momento en que

azúcar total muestra su consumo máximo. Más tarde, el metabolito disminuye a alrededor de

35 g/L al día 10.5. La producción de alcohol obtenido con este esquema es el más alto


118

obtenido entre los sistemas probados. Aunque los resultados indican que la inoculación del

microorganismo secuencialmente aumenta el consumo de azúcar y la producción de alcohol,

sólo se observan diferencias significativas con la cepa T1 evaluada individualmente.

La velocidad de producción (0.037 ± 0.007 g/Lh) fue menor que la obtenida con el CC2, sin

embargo, la productividad y el consumo de azúcar al momento en que se tuvo la máxima

producción de alcohol logró ser el más alto en comparación con los sistema CC2 y CC1 (7.8 ±

0.44 g/Ld y 73.7 ± 1.8 %) (tabla 25). De Bari y col., (2013), afirman que el consumo

simultáneo de azúcar garantiza productividades más altas como en los sistemas de cultivo

mixto utilizados. La adición de la cepa LR4 al comienzo de la fermentación favoreció la

asimilación de las hexosas y la producción de alcohol; con la cepa T1 se incrementó el

consumo de pentosas y por consecuencia mejorar la producción de alcohol.

Se realizó un análisis de varianza para conocer si existía diferencia significativa entre los

sistemas de microorganismos utilizados en la cinética de fermentación. En la figura 50, se

presenta el gráfico de medias para los sistemas con respecto a la producción de alcohol y

productividad máxima (Pmáx), los resultados indican que existe una diferencia significativa, ya

que la producción de alcohol en la cepa T1 fue muy diferente a los obtenido en el resto de las

mezclas. En promedio no hay una diferencia entre los cuatro sistemas restantes. Tampoco

existe una diferencia significativa entre los CC2 y CC3 donde se obtuvieron los mejores

resultados, por lo que cualquier sistema podría ser utilizado.

Figura 50. Gráfica de medias para a) producción de alcohol y b) Pmáx en mezcla de azúcares en los cultivos

individuales y mixtos empleados

a) b)


119

También se observo una diferencia significativa en el consumo de la sacarosa al utilizar el

cultivo mixto CC2 y en el consumo de glucosa y fructosa donde el mayor porcentaje de

consumo se da el cultivo mixto CC3. El resto de los azúcares fueron consumidos similarmente

sin una diferencia significativa. El cultivo mixto secuencial (CC3), podría ser utilizado para la

fermentación de hidrolizados de residuos cítricos ya que asimilan en mayor porcentaje glucosa

y fructosa, los principales carbohidratos en los hidrolizados y por haber obtenido una de las

mejores productividades en la producción de alcohol.

7.5 Establecimiento de las condiciones de fermentación con cultivos mixtos en medio

sintético a nivel matraz

Debido a que el sistema de inoculación secuencial (CC3) resultó ser el más adecuado para el

mayor consumo de glucosa y fructosa, principales azúcares en las hidrólisis de los residuos

cítricos, así como del mayor porcentaje total de azúcares consumidos y la mayor producción

de alcohol (tabla 25), se planteó establecer las condiciones de fermentación de cultivos mixtos

variando los días de inoculación de la cepa T1 y la agitación en la mezcla de azúcares antes

mencionada, a 35o C durante 10.5 días.

7.5.1 Cinética de crecimiento utilizando diferentes esquemas de inoculación

En las figuras 51 y 52, se presenta el porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y

producción de alcohol para los tratamientos 5 y 9, respectivamente, como ejemplo de las

cinéticas realizadas en base al diseño factorial 4 x 3 presentado en la tabla 9. En estos dos

tratamientos se obtuvieron los mayores valores de productividad, necesario para la obtención

de la máxima concentración de alcohol en un menor tiempo. En la figura 51a, se observó un

consumo máximo del 89.25 ± 0.38 % del total de azúcar con una contribución de las pentosas

en un 4 %. Después de dos días de fermentación, el consumo del 98, 62 y 56 % de glucosa,

sacarosa y galactosa se logró, que representa el 60 % del total de azúcar presente en el medio,

los resultados con similares a lo obtenido en el sistema CC2 y mayor que los obtenido en las

cepas individuales y CC1.


120

Tiempo (días)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

10

20

30

40a)

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10

Por

cent

aje

de m

ezcl

a de

la c

epa

0

20

40

60

80

100

b)

Figura 51. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para el tratamiento 5.

Sacarosa (círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo inverso verde claro), Galactosa (triángulo verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado azul marino) y Etanol (cuadrado con


Se observó un aumento muy rápido en la asimilación de la glucosa donde del día 1 al 2 se

observa un consumo mayor al 70 % del total de la concentración en el medio. La glucosa

presenta una velocidad de consumo del 0.085 ± 0.011 g/Lh (tabla 26), siendo el azúcar que

más rápido se consume en el tratamiento 5. La fructosa y la galactosa presentan un consumo

del 47 y 59 % al tercer día, con un consumo gradual para llegar a valores de 75.71 ± 0.59 y

83.53 ± 2.94 g/Lh, respectivamente. La sacarosa se consume al 100 % a los 5 días, con una

velocidad de consumo similar a la galactosa (0.033 ± 0.004 g/Lh). La xilosa mostró un

consumo moderado durante 5 días gracias a la presencia de la cepa T1 que se inoculó pasado

un día del inicio de la fermentación, a comparación con el cultivo CC3 que por durante 4.5

días presento un consumo lento del azúcar, que pudo ser debido por la ausencia de la cepa T1

en los primeros dos días de fermentación. Se consumió un total del 94.16 ± 0.29 % del total de

la xilosa con una velocidad de consumo del 0.042 ± 0.003 g/Lh, velocidad que se encuentra

por arriba de las obtenidas en la fructosa, galactosa y sacarosa. La arabinosa presentó un

consumo lento durante los primeros 4 días, estabilizándose a una concentración de alrededor

del 50 % por el resto de la fermentación, tuvo un consumo total del 53.87 ± 6.99 % con una

velocidad de consumo 0.039 ± 0.003 g/Lh (tabla 26).


121

Tabla 26. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en el medio con mezcla de azúcar de los tratamientos 5 y 9.

Azúcar* CAM* (%)

Tratamiento 5 (1 día de inóculo y 100 rpm)

Tratamiento 9 (1 día de inóculo y 200 rpm)

TAC** (%) µs*** (g/Lh) TAC** (%) µs***

(g/Lh) GLU 51 100±0.00 0.085±0.011 100±0.00 0.157±0.025

FRU 30 75.71±0.59 0.024±0.001 82.41±1.59 0.015±0.002

GAL 8 83.53±2.94 0.030±0.003 85.36±0.68 0.025±0.004

SAC 2 100±0.00 0.033±0.004 100±0.00 0.039±0.003

ARA 7 53.87±6.99 0.039±0.003 62.19±0.30 0.027±0.002

XIL 2 94.16±0.29 0.042±0.003 79.35±0.64 0.083±0.017 *GLU: glucosa, SAC: sacarosa, FRU: fructosa, GAL: galactosa, XIL: xilosa, ARA: arabinosa, CAM: concentración de azúcar en los medios. **TAC: total de azúcar consumido en 10.5 días de fermentación ***µ s: Velocidad del consumo de sustrato total determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2> 0.95).

En la figura 51b, se muestra el comportamiento celular en el tratamiento 5, donde la cepa

LR4 mostró un comportamiento típico durante el primer día de fermentación, después de la

adición de la cepa T1, la proporción de la cepa LR4 fue disminuyendo cuando la cepa T1 fue

creciendo, por lo que el porcentaje celular se vio afectado. A los 2 días, el porcentaje de

concentración celular de ambas cepas se mantuvo similar alrededor del 50 %, pero a los 5 días

el porcentaje de la cepa T1 fue mayor manteniéndose en una proporción de 80 % para la cepa

T1 y 20 % LR4 el resto de la fermentación, las proporciones finales fueron similares a lo

observado en el CC3.

En la figura 52a, muestra el comportamiento de consumo de azúcares y producción de alcohol

obtenido en el tratamiento 9 en 10.5 días de fermentación. Se observó un consumo máximo de

91.70 ± 0.26 % con una contribución de las pentosas en un 5 %, por arriba que el tratamiento 5

y por debajo a lo obtenido en el CC3, esto pudo deberse a que la cepa es inoculada cuando

todavía hay una buena cantidad hexosas en el medio. Después de dos días de fermentación un

consumo del 99, 74 y 50 % de glucosa, sacarosa y galactosa se logró, los valores representan

un 60 % del porcentaje de consumo presentes en el medio. Los valores obtenidos a este tiempo

son más altos que los obtenidos en las cepas individuales y en el CC1, y similar al CC3.


122

Tiempo (días)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

10

20

30

40

50

a)

Teimpo (dias)

0 2 4 6 8 10

Por

cent

aje

de m

ezcl

a de

la c

epa

0

20

40

60

80

100

Figura 52. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol para el tratamiento 9.

Sacarosa (círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo inverso verde claro), Galactosa (triángulo verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado azul marino) y Etanol (cuadrado con


Al segundo día de fermentación ya tenía un consumo del 100 % de la glucosa, que pudo ser

usada principalmente para la producción de alcohol ya que este tiempo corresponde al tiempo

en que se obtuvo la concentración máxima del metabolito. La velocidad de consumo de la

glucosa fue de 0.157±0.025 g/Lh (tabla 26), superior a la obtenida en glucosa en el

tratamiento 5. La sacarosa fue consumida con una velocidad moderada (0.039 ± 0.003 g/Lh)

hasta alcanzar el 100 % a los 4 días de fermentación. La galactosa y fructosa tuvieron una

velocidad de consumo lenta hasta alcanzar un consumo total de 85.36 ± 0.68 y 82.41 ± 1.59

g/Lh los 10.5 días de fermentación, éstos azúcares pudieron ser utilizados para el crecimiento

y mantenimiento celular debido a que no se presentó una mayor producción de alcohol.

Con respecto a las pentosas, la xilosa presentó la más alta velocidad de consumo (0.083 ±

0.017 g/Lh) que se ve reflejado en el consumo total de 79.35 ± 0.64 %, obtenido a os 10.5 días

de fermentación, la xilosa fue consumida rápidamente hasta los dos días y se estabilizó

disminuyendo su velocidad de consumo después de los tres días, al contrario la arabinosa

presentó la velocidad de consumo (0.027±0.002 g/Lh) por debajo de la xilosa, pero por encima

de la velocidad de consumo de la galactosa y fructosa. La arabinosa tuvo un consumo total de

62.19 ± 0.30 % a los 6.5 días manteniéndose el resto de la fermentación.


123

En la figura 52b, se observa el comportamiento celular de los microorganismos, los resultados

indicaron que las cepas mantuvieron una proporción similar (50 %) alrededor de solo 12 h

muy por debajo a lo obtenido en el tratamiento 5 donde se mantuvieron en esa proporción por

2 días. La cepa T1 crece más rápido ganándole en proporción a la cepa LR4, desde los días. Se

observó a los 7 días que las proporciones de las cepas fue de 80 % para la cepa T1 y 20 % para

la LR4 manteniéndose así el resto de la fermentación.

En la tabla 27, se muestran los parámetros cinéticos de producción de alcohol y la velocidad

de producción del diseño 4 x 3 donde se variaron los tiempos de inoculación en la mezcla de

azúcares. Se puede observar que las mayores producciones de alcohol se obtienen en el

tratamiento 1 con 43.33 ± 0.74, tratamiento 2 con 45.27 ± 0.18, tratamiento 3 con 45.10 ± 2.81

y tratamiento 4 con 45.52 ± 0.59 g/L, con un consumo de azúcar al tiempo que se obtuvo la

mayor concentración de alcohol de entre el 82 y 89 %, al no existir una agitación en el sistema

se benefició la producción de alcohol. Estos valores de producción de alcohol son muy

similares a los obtenidos en el CC3 (46.8 ± 2.6 g/L).

Tabla 27. Parámetros cinéticos de producción de alcohol y velocidad de producción en el medio con mezcla de azúcar del diseño factorial 4 x 3, en cultivos mixtos.

Trat TAC* (%) Producción

alcohol (g/L)

Yp/s (g/g) µp** (g/Lh)

Producción máxima Etanol Productividad

(g/L.d) t (d) CS*** (%)

1 85.59±0.98 43.33±0.74 0.56±0.01 0.032±0.004 8.0 82.22±1.01 5.41±0.09 2 92.56±1.12 45.27±0.18 0.50±0.01 0.035±0.003 7.0 83.21±0.96 6.46±0.04 3 95.77±0.41 45.10±2.81 0.50±0.02 0.030±0.004 7.0 87.21±0.45 6.44±0.57 4 95.86±0.60 45.52±0.59 0.50±0.01 0.030±0.004 7.5 89.96±1.76 6.04±0.11 5 89.25±0.38 39.93±1.05 0.50±0.01 0.124±0.048 3.0 76.39±0.09 13.31±0.35 6 91.71±0.02 33.49±0.88 0.42±0.02 0.054±0.010 8.5 90.54±0.21 3.94±0.10 7 92.16±0.14 33.74±2.84 0.44±0.01 0.029±0.006 5.5 88.06±1.53 6.13±0.42 8 92.64±0.54 32.80±0.67 0.40±0.01 0.017±0.002 8.0 89.93±0.28 4.10±0.08 9 91.70±0.26 38.04±0.56 0.49±0.01 0.184±0.057 2.0 71.81±1.99 19.02±0.28 10 96.32±0.43 40.85±2.42 0.46±0.02 0.052±0.006 5.0 88.36±1.08 8.17±0.68 11 98.62±0.11 41.20±1.86 0.45±0.02 0.040±0.005 5.0 89.69±2.25 8.24±0.37 12 94.63±0.10 40.48±5.34 0.45±0.02 0.054±0.007 7.0 84.91±1.42 5.78±0.76

*TAC: Total consumo de sustrato en 10.5 días de fermentación ** µp: Velocidad de producción de alcohol determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2> 0.95). *** CS: Consumo de sustrato que se obtuvo al día que se obtuvo la máxima producción de alcohol

Donde se mejoró fue en la productividad máxima, en el tratamiento 9 se obtuvo la

productividad más alta con 19.02 ± 0.28 g/Ld (0.79 g/Lh) a los dos días. De Bari y col.,

(2013), en cultivos mixtos de S. stipitis y S. cerevisiae, en medios mínimos con una mezcla de


124

glucosa y xilosa obtiene una productividad máxima de 17.28 ± 0.03 g/Ld (0.72 g/Lh) al

utilizar 60 g /L total de la mezcla de azúcares, éstos valores son más bajos a los obtenidos por

las cepas LR4 y T1 en cultivo secuencial con una concentración total de 100 g/L de azúcar.

Pero se encuentran por debajo a lo reportado por Fu y col., (2009) donde obtiene una

productividad de 0.830 g/Lh a partir de una mezcla de glucosa y xilosa (100 g/L).

Figura 53. Gráfica de Pareto para a) producción de alcohol, b) Pmáx, c) Yp/s y d) Consumo total de azúcar en

mezcla de azúcares variando el tiempo de inóculo

Los análisis de varianza realizados se resumen con las gráficas de Pareto y de interacción con

respecto a las respuestas cinéticas de producción de alcohol. En la figura 53a, se observa que

con base en las gráficas de Pareto que no hay un efecto por agitación o tiempo de inóculo para

la obtención de la máxima concentración de alcohol, en la figura 53c, se observa que la

agitación y el tiempo de inóculo tienen un efecto significativo sobre el rendimiento (Yp/s).



AB

A:Tiempo de inoculo (d)

B:Agitación (rpm)

+-



B:Agitación (rpm)

AB


+-

Gráfica de Pareto para Yp/s


AB

B:Agitación (rpm)


+-

Gráfica de Pareto para Consumo total de azúcar (%)


AB

B:Agitación (rpm)


+-

a) b)

c) d)


125

Figura 54. Gráfica de interacción para a) producción de alcohol y b) Pmáx en mezcla de azúcares variando el

tiempo de inóculo

En las figuras 53b y 53d, se muestra que el tiempo de inóculo, la agitación y la interacción de

los factores tienen un efecto significativo sobre las respuestas de Pmáx y en el porcentaje del

consumo total de azúcar. En la figura 54, se pueden observar las gráficas de interacción en

base a la producción de alcohol y Pmáx, obtenidas del diseño 4 x 3 donde se varió la agitación y

el tiempo de inóculo. En la figura 54a, se indica que para obtener la mayor producción de

alcohol se podrían usar una inoculación a los 2, 4 y 6 días sin agitación, pero en el caso de la

productividad (figura 54b) las mejores condiciones son utilizando 1 día de inóculo para la

cepa T1 con 200 rpm en promedio, seguido de 1 día de inóculo pero con 100 rpm.

7.6 Evaluar la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado en un hidrolizado

de residuos cítricos a nivel fermentador de 3 L

Se utilizó un bioreactor de 3 L para evaluar la capacidad fermentativa del cultivo mixto

seleccionado, utilizando una mezcla de azúcares y sales con un volumen total de 2 L o de 1.3

L de hidrolizado de residuos de limón persa, esterilizado. Las primeras 24 horas se fermentó

con la cepa LR4 a las condiciones de 35o C y 0 rpm, cuando se inoculó la cepa T1 pasadas las

24 horas, se aplicaron las condiciones especificadas en cada caso.


Tiempo de inoculo (d)1246

Agitación (rpm)

32

35

38

41

44

47

Pro

duc

ció

n de

alc

oho

l (g

/L)

0 100 200


Tiempo de inoculo (d)1246

Agitación (rpm)

0

4

8

12

16

20

Pm

áx

0 100 200

a) b)


126

7.6.1 Condiciones similares a matraz sin ajuste de pH y con ajuste de pH

Se realizó una cinética de fermentación a las condiciones de 35o C y 200 rpm, donde la cepa

T1 se inoculó al día que comenzó la fermentación, buscando obtener valores de productividad

similares en un reactor de 3 L, con un volumen de mezcla de azúcares de 2 L. En la figura

55a, se presenta el porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de alcohol sin

ajuste de pH a las mejores condiciones obtenidas en el diseño anterior (tabla 9).

Se observó un consumo máximo del 80.62 ± 0.43 % del total de azúcar con una contribución

de las pentosas en un 7 % por arriba a lo obtenido en los sistemas anteriores. Después de 2

días de fermentación, el consumo del 71, 58 y 52 % de glucosa, galactosa y fructosa se

obtuvo, éstos valores representan un 70 % del total de azúcar presente en el medio superior a

lo obtenido en los tratamiento 5 y 9 donde se obtuvieron las mejores productividades a nivel

matraz.

Se observó que se asimiló principalmente la glucosa donde a los 1.5 días ya tenía un consumo

del 60 % del total de la concentración en el medio a una velocidad moderada (0.047 ± 0.003

g/Lh) hasta alcanzar un consumo total a los 4 días de fermentación de 93.03 ± 0.01 % (tabla

28). La glucosa y fructosa a los dos días ya presentaban consumos del 71 y 54 %,

respectivamente. La sacarosa se consumió a una velocidad muy lenta (0.021 ± 0.007 g/Lh)

hasta alcanzar un consumo total de 54.16 ± 0.94 %.

La xilosa mostró una velocidad de consumo similar a la sacarosa con 0.025 ± 0.008 g/Lh.

Aunque la arabinosa presentó una velocidad de consumo (0.075 ± 0.007 g/Lh) mayor a las

velocidades del resto de los azúcares solo se obtuvo un consumo total del 48.29 ± 2.70 %


127

Tiempo (días)

0 1 2 3 4

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

10

20

30a)

Teimpo (dias)

0 1 2 3 4

Por

cent

aje

de m

ezcl

a de

la c

epa

0

20

40

60

80

100

b)

pH

0

1

2

3

4

Figura 55. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol a las mejores condiciones obtenidas a nivel matraz sin ajuste de pH. Sacarosa (círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo

inverso verde claro), Galactosa (triángulo verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado azul marino) y Etanol (cuadrado con cruz). b) Porcentaje de mezcla de las levaduras, LR4 (círculo rojo), T1

(círculo naranja) y pH (círculo azul).

En la figura 55b, se muestra el comportamiento celular en la cinética de fermentación sin

ajuste de pH, donde la cepa LR4 mostró un comportamiento típico durante el primer día de

fermentación, después de la adición de la cepa T1, la proporción de la cepa LR4 se ve

superada a los 1.5 días por la cepa T1. Alrededor de los 3 días se obtiene una proporción de 80

% para la cepa T1 y 20 % para la cepa LR4 el resto de la fermentación, en los tratamiento 5 y

9 del diseño en matraz se observa que las concentraciones celulares terminan en las mismas

proporciones al final de la fermentación, aunque en este caso no se observó una estabilidad al

50 % para ambas cepas.

Con respecto al pH, el medio fue ajustado a 4.5, después de esterilizar se detectó un pH de 3.8

este valor no se ajustó debido a que a nivel matraz no se realizó, conformé la cepa LR4 fue

creciendo, se observó una disminución en el pH con el paso del tiempo de la fermentación

hasta estabilizarse a un pH de 2.2 la cepa LR4 podría estar liberando algún tipo de ácido

orgánico al medio disminuyendo el pH, la cepa T1 logró crecer a pesar de la disminución del

pH.


128

Tabla 28. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en el medio con mezcla de azúcar en las cinéticas sin y con ajuste de pH

Azúcar* CAM* (%)

Sin ajuste de pH (1 día de inóculo (T1) y 200 rpm)

Con ajuste de pH (1 día de inóculo (T1), 200 rpm y ajuste de

pH)

TAC** (%) µs*** (g/Lh) TAC** (%) µs***

(g/Lh) GLU 51 93.03±0.01 0.047±0.003 98.93±0.02 0.042±0.005

FRU 30 69.18±1.77 0.047±0.006 84.54±3.79 0.060±0.014

GAL 8 89.03±0.10 0.032±0.008 91.43±4.60 0.052±0.016

SAC 2 54.16±0.94 0.021±0.007 48.93±4.29 0.061±0.022

ARA 7 48.29±2.70 0.075±0.007 79.85±2.42 0.057±0.018

XIL 2 63.43±3.33 0.025±0.008 94.12±2.99 0.055±0.014 *GLU: glucosa, SAC: sacarosa, FRU: fructosa, GAL: galactosa, XIL: xilosa, ARA: arabinosa, CAM: concentración de azúcar en los medios. **TAC: total de azúcar consumido en 10.5 días de fermentación ***µ s: Velocidad del consumo de sustrato total determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2> 0.95).

Debido a que se obtuvo una productividad (7.72 ± 0.02 g/Ld) más baja de lo esperado en la

cinética de fermentación sin ajuste de pH, se repitió la cinética de fermentación a las mismas

condiciones ajustando el pH a 4.5 durante los 4 días de la reacción, para descartar efecto por

este factor.

En la figura 56a, se observó un consumo máximo del 89.48 ± 2.83 % con una diferencia

significativa a lo obtenido sin ajuste de pH, de nuevo la glucosa es el azúcar que se consume

mayoritariamente con 98.93 ± 0.02 %. Se observa en la tabla 28, que los consumo del resto de

los azúcares es mayor que en las cinética sin ajuste de pH, excepto en la sacarosa con un

consumo por debajo del 50 %. Cabe destacar los resultados obtenidos en la asimilación de las

pentosas donde en ambos casos se obtiene un consumo superior al 80 %, que representa una

diferencia significativa a la cinética anterior, por lo que el ajuste de pH benefició la

asimilación de las fuentes de carbono. Pero con respecto a la productividad se obtuvo un valor

muy bajo (7.57 ± 0.04 g/Ld) a lo obtenido a nivel matraz y en la cinética anterior.


129

Tiempo (días)

0 1 2 3 4

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

5

10

15

20

25

30

a)

Tiempo (días)

0 1 2 3 4

Por

cent

aje

de m

ezcl

a de

la c

epa

0

20

40

60

80

100

pH

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

b)

Figura 56. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol a las mejores condiciones obtenidas a nivel matraz y ajuste de pH. Sacarosa (círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo

inverso verde claro), Galactosa (triángulo verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado azul marino) y Etanol (cuadrado con cruz). b) Porcentaje de mezcla de las levaduras, LR4 (círculo rojo), T1

(círculo naranja) y pH (círculo azul).

En la figura 56b, se muestra el comportamiento celular en la cinética de fermentación con

ajuste de pH a las mejores condiciones obtenidas a nivel matraz, donde se observó que durante

el crecimiento de la cepa LR4 se presentó una ligera disminución en el pH pero fue ajustado

con la adición de HCl 0.5 M o NaOH 0.5 M para mantener un pH de 4.5 estable a partir de que

se adicionó la cepa T1. Las proporciones variaron rápidamente donde a los 1.5 días ya se tenía

una proporción del alrededor del 70 % para la cepa T1 y para la cepa LR4 del 30 % , el

porcentaje de la primera cepa aumento ligeramente a los 2 días manteniéndose el resto de la

fermentación.

7.6.2 Cinéticas de crecimiento con diferentes niveles de aireación y agitación

Para tratar de obtener una mayor concentración y una productividad similar a la obtenida a

nivel matraz, se realizó un diseño factorial 22 con 4 tratamientos realizando los ensayos en

orden aleatorio, los factores se presentan en la Tabla 10. Oberoi y col., (2010) que se acelera

la producción de alcohol al incrementar los niveles de aeración, también comenta que los

microorganismos Candida sp generalmente metaboliza mejor las pentosas bajo condiciones

limitadas de oxígeno.


130

En la figura 57a, se obtuvo un consumo máximo del 88.04 ± 0.34 % del total de azúcar.

Después de dos días de fermentación, se obtuvo un consumo del 97, 58 y 57 % de glucosa,

galactosa y fructosa. Que representa un consumo del 80 % del total de los azúcares presentes

en el medio. El porcentaje se encuentra por debajo al porcentaje de consumo al mismo tiempo

en el hidrolizado (98 %). La glucosa y la sacarosa son los primeros azúcares que se consumen

en su totalidad a los 2.25 días. la fructosa presenta la velocidad de consumo más rápida con

0.079 ± 0.015 g/Lh (tabla 29).

Tiempo (días)

0 1 2 3 4

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100E

tano

l (g/

L)

0

10

20

30

40

a)

Tiempo (días)

0 1 2 3 4

Por

cent

aje

de m

ezcl

a de

la c

epa

0

20

40

60

80

100

b)

pH

0

1

2

3

4

5

Figura 57. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol en el tratamiento 1. Sacarosa

(círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo inverso verde claro), Galactosa (triángulo verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado azul marino) y Etanol (cuadrado con cruz). b)

Porcentaje de mezcla de las levaduras, LR4 (círculo rojo), T1 (círculo naranja) y pH (círculo azul).

Con respecto a las pentosas, la xilosa se consume en su totalidad a los 3.25 días con una

velocidad moderada, aunque la arabinosa solo se consume en un 65.97 ± 2.12 %, presenta una

velocidad de consumo mayor (0.051 ± 0.005 g/Lh) que la sacarosa, xilosa y galactosa. A los

dos días que se obtiene la mayor producción (34.34 ± 0.25 g/L) se observa una ligera

disminución en la concentración de alcohol. En la figura 57b, se observa el comportamiento

celular de las cepas en el tratamiento 1, se observa que a partir de los 1.5 días los porcentajes

de población para ambas cepas se mantiene alrededor del 50 %. Con respecto al pH se observa

una disminución constante (2.2) hasta el día y medio manteniéndose constante el resto de la

fermentación. Fromanger y col., (2010) menciona la producción de ácidos orgánicos como el

piruvato, succinato y fumarato utilizando una Candida shehatae, podrían ser los responsables

en la disminución en el pH con limitación de oxígeno. En la figura 58a, se obtuvo un


131

consumo máximo del 89.15 ± 0.22 % ligeramente superior a lo obtenido al tratamiento 1, la

mayor producción de alcohol se obtiene a los dos días (31.73 ± 0.14 g/L) a este tiempo se tiene

un consumo del 100, 74 y 60 % para la glucosa, sacarosa y galactosa. Porcentajes similares en

este tiempo se obtuvieron para fructosa.

Tiempo (días)

0 1 2 3 4

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

5

10

15

20

25

30

a)

Tiempo (días)

0 1 2 3 4

Por

cent

aje

de m

ezcl

a de

la c

epa

0

20

40

60

80

100b)

Y D

ata

0

1

2

3

4




Se obtuvo una velocidad de consumo de glucosa de 0.073±0.011 g/Lh (tabla 29), superior a lo

obtenido en el tratamiento 1, también fue el azúcar que se consumió a mayor velocidad,

seguido por la fructosa. La xilosa no se consumió en su totalidad (78.00 ± 0.14 %), esto difiere

a lo obtenido en el tratamiento 1. La arabinosa tuvo un consumo lento durante los 4 días de

fermentación alcanzando un máximo consumo de 62.64 ± 0.83 %, inferior a lo obtenido en el

tratamiento 1.

Tabla 29. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en el medio con mezcla de azúcar de los tratamientos 1, 2, 3 y 4 con variaciones en la aireación.

*GLU: glucosa, SAC: sacarosa, FRU: fructosa, GAL: galactosa, XIL: xilosa, ARA: arabinosa , CAM: concentración de azúcar en los medios. **TAC: total de azúcar consumido en 10.5 días de fermentación ***µ s: Velocidad del consumo de sustrato total determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2> 0.95).

Azúcar* CAM* (%)

Tratamiento 1 (200 rpm, 0.25 vvm)




TAC** (%)

µs*** (g/Lh)

TAC** (%)

µs*** (g/Lh)

TAC** (%)

µs*** (g/Lh)

TAC** (%)

µs*** (g/Lh)

GLU 51 100±0.00 0.068±0.011 100±0.00 0.073±0.011 100±0.00 0.074±0.011 100±0.00 0.175±0.034

FRU 30 67.42±0.64 0.079±0.015 73.64±1.41 0.055±0.005 85.39±0.30 0.038±0.006 90.47±3.33 0.068±0.013

GAL 8 100±0.00 0.029±0.004 93.56±0.43 0.036±0.007 73.86±0.89 0.061±0.014 96.33±0.23 0.052±0.008

SAC 2 100±0.00 0.034±0.009 100±0.00 0.039±0.010 100±0.00 0.044±0.008 94.71±4.20 0.023±0.005

ARA 7 65.97±2.12 0.051±0.005 62.64±0.83 0.037±0.004 46.05±2.86 0.038±0.006 40.90±2.95 0.183±0.026

XIL 2 100±0.00 0.043±0.006 78.00±0.14 0.047±0.004 77.56±2.85 0.068±0.010 95.94±0.08 0.039±0.007


132

En la figura 58b, se observa el comportamiento celular en el tratamiento 2, donde la cepa LR4

mostró un comportamiento típico el primer día de fermentación, después de la adición de la

cepa T1 se observó un crecimiento constante hasta los 2.5 días donde se observó una

proporción de alrededor del 50 % para ambas cepas. Después de los 3 días la cepa LR4

predominó el resto de la fermentación. Con respecto al pH se observó de nuevo una

disminución constante durante el crecimiento de los microorganismos. Las proporciones

finales fueron de alrededor del 55 % para la cepa LR4 y 45 % para la cepa T1.

En la figura 59a, se muestra el porcentaje de consumo de azúcar en mezcla y la producción de

alcohol para el tratamiento 3, donde se obtuvo un consumo total de azúcar del 88.86 ± 0.65 %,

similar a lo obtenido en en el tratamiento 1. La glucosa y la sacarosa son consumidas en su

totalidad después del segundo día para la glucosa y del tercer día para la sacarosa, velocidad

más alta de consumo de azúcar se obtuvo en un glucosa con 0.074 ± 0.011 g/Lh siendo la

mayor velocidad de consumo obtenido en el tratamiento 3. Martiniano y col., (2013) comenta

que las levaduras prefieren el consumo de glucosa por encima de las pentosas. La xilosa es

consumida en un 78 % con una velocidad de consumo (0.068 ± 0.010 g/Lh) superior al de la

arabinosa. En todos los tratamientos la arabinosa es el azúcar que se consume de último, esto

podría ser debido a que los microorganismos prefieren el consumo de hexosas seguido de

xilosa y arabinosa.

Tiempo (días)

0 1 2 3 4

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

10

20

30a)

Tiempo (días)

0 1 2 3 4

Por

cent

aje

de m

ezcl

a de

la c

epa

0

20

40

60

80

100pH

0

1

2

3

4b)





133

En la figura 59b, se observa el crecimiento celular en porcentaje de las cepas LR4 y T1 en el

tratamiento 3, donde se obtuvo porcentajes similares 0.5 días antes que lo obtenido en el

tratamiento 2, donde también la cepa LR4 se mantuvo en mayor proporción durante los dos

días siguientes de fermentación. Oberoi y col., (2010) observaron la disminución en el pH al

utilizar la cepa Candida tropicalis, en la sacarificación y fermentación de una mezcla de

azúcares.

En la figura 60a, se muestra el porcentaje de consumo en el tratamiento 4, donde obtuvo un

consumo del 92.49 ± 0.97 %, este valor es superior a lo obtenido en los tres tratamientos

anteriores pero por debajo a lo obtenido en el hidrolizado. A los dos días se tenía un consumo

alrededor del 80 % para la glucosa, galactosa y fructosa, donde al final de la fermentación

llegan a un consumo superior al 90 %, la glucosa es el único azúcar que se consume en su

totalidad, éste presenta una velocidad de consumo de 0.175 ± 0.034 g/Lh, el más alto en todos

los sistemas empleados. Cabe destacar que la xilosa se consumió al 95 % con la velocidad más

baja de consumo (0.039 ± 0.007g/Lh) presentado en todos los tratamientos. El xilitol es

producido necesariamente como cofactor regenerativo con la finalidad de mantener el

equilibrio redox celular a partir de xilosa (Martiniano y col., 2013).También Chandel y col.,

(2007) menciona que el xilitol puede ser reabsorbido por la célula para su crecimiento.

Tiempo (días)

0 1 2 3 4

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

10

20

30a)

Tiempo (días)

0 1 2 3 4

Por

cent

aje

de m

ezcl

a de

la c

epa

0

20

40

60

80

100

b)

pH

0

1

2

3

4





134

En la figura 60b, se muestra el comportamiento celular en porcentaje donde a los 1.5 días se

observa que las cepas LR4 y T1 llegan a un porcentaje del 50 %, esta proporción se obtiene

antes que los tres tratamientos anteriores, una alta agitación y aireación beneficiaría un

crecimiento similar para ambos microorganismos.

En la figura 61, se observan las gráficas de Pareto para los parámetros cinéticos de producción

de alcohol, se observó en la figura 61a que los fatores de agitación y la aireación tienen un

efecto significativo en la producción de alcohol. En la figura 61b, se indica que la agitación

tiene un efecto significativo sobre el rendimiento y en la figura 61c, se muestra que la

agitación, la aireación y su interacción tienen un efecto significativo en la productividad

máxima.

Figura 61. Gráficas de Pareto para a) producción de alcohol, b) Yp/s, c) Pmáx y d) gráfica de interacción para producción de alcohol el diseño 22 en mezcla de azúcares

Con la gráfica de interacción (figura 61d) se observa que la mayor producción de alcohol se

obtiene a las condiciones de 200 rpm y 0.25 vvm.

Gráfica de Pareto para la producción de alcohol (g/ L)


AB

B:Aireación

A:Agitación

+-

Gráfica de Pareto para Yp/s


B:Aireación

AB

A:Agitación

+-



AB

B:Aireación

A:Agitación

+-

Agitación (rpm)

Pro

ducc

ión

de a

lcoh

ol (g

/L)

Aireación (vvm)0.250.50


27

29

31

33

35

200 300

a) b)

c) d)


135

7.6.3 Cinética de fermentación de un hidrolizado de limón persa (Citrus latifolia)

Las cepas LR4 y T1 en cultivo secuencial ( 1 día) a las condiciones tratamiento 4 (tabla 10)

que comprende una temperatura de 35o C, 200 rpm y 0.25 vvm resultaron ser los parámetros

más adecuados para fermentar el hidrolizado de limón persa (Citrus latifolia), que contiene un

total de 26.83 ± 0.36 g/L de azúcares fermentables y se enriqueció el medio ajustando la

concentración de fósforo y nitrógeno a 350 mg/L para lograr obtener la mayor producción de

alcohol.

En la figura 62a, se observó un consumo máximo del 98.13 ± 0.4 % del total de azúcares

presentes en el hidrolizado. Donde después de dos días se tenía un consumo del 94, 80 y 78 %

de glucosa, fructosa y sacarosa, respectivamente. Lo que representa un consumo del 90 % del

total de azúcares presentes en el medio, esto es superior a las cinéticas en medios mínimos y

mezcla de azúcares de los diseños anteriores. La baja concentración de azúcares iniciales pudo

haber beneficiado el consumo a alta velocidad de todos los azúcares al no presentarse

represión catabólica por las hexosas.

Tiempo (días)

0 1 2 3 4 5 6 7

Por

cent

aje

de c

onsu

mo

0

20

40

60

80

100

Eta

nol (

g/L)

0

2

4

6

8

10

12

14a)

Tiempo (días)

0 2 4 6

Por

cent

aje

de m

ezcl

a de

la c

epa

0

20

40

60

80

100b)

pH

0

2

4

6

8

10

12

14

Figura 62. a) Porcentaje de consumo de azúcares en mezcla y producción de etanol en el hidrolizado de limón

persa. Sacarosa (círculo rojo), Glucosa (círculo naranja), Xilosa (triángulo inverso verde claro), Galactosa (triángulo verde oscuro), Arabinosa (cuadrado azul turquesa), Fructosa (cuadrado azul marino) y Etanol

(cuadrado con cruz). b) Porcentaje de mezcla de las levaduras, LR4 (círculo rojo), T1 (círculo naranja) y pH (círculo azul).

La glucosa es el principal azúcar consumido, seguido de la fructosa y la xilosa. A los 1.16 días

(tabla 31) que se obtuvo la mayor producción de alcohol, se tenía un consumo total de 75.30 ±

1.49 % donde la glucosa fue el azúcar que ayudó a la obtención de la máxima concentración


136

de alcohol ya que se tenía un consumo del 88 %, el resto de los azúcares tenían un consumo de

alrededor del 50 %. A partir del día y medio se observa una disminución en la concentración

de alcohol, éste fenómeno se presenta en la mayoría de las cinéticas de fermentación. Zhao y

col., (2008) mencionan que el alcohol producido es consumido por los microorganismos. Abbi

y col., (1996) también reportan este fenómeno al utilizar una cepa de Candida shehatae, donde

observó la utilización de alcohol como fuente de carbono, eventualmente consumiéndose en su

totalidad en el reactor. También se reporta un crecimiento regular en la biomasa de una C.

shehatae después del consumo total de xilosa a las 24 h, con la utilización de etanol como

fuente de carbono para el crecimiento metabólico (Chandel y col., 2007).

En la tabla 30, se observa el consumo total de azúcar y las velocidades de consumo en el

hidrolizado de limón persa, se observa un consumo total de la glucosa, fructosa, sacarosa y

xilosa y un consumo del 89.44 ± 0.99 % de arabinosa. La presencia de galactosa no fue

detectada. La velocidad de consumo más alta se obtuvo con glucosa con 0.082 ± 0.011 g/Lh,

similar a lo obtenido en la velocidad de consumo de este azúcar en la cinética de fermentación

sin ajuste de pH. Pero el valor se encuentra por debajo a lo obtenido en la cinética donde se

utilizó una agitación (300 rpm) y aireación (0.5 vvm) superior a las utilizadas en la

fermentación de los residuos cítricos (0.175 ± 0.034 g/Lh).

Tabla 30. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en el hidrolizado de limón persa

Azúcar* CAM* (%)

Hidrolizado (1 día de inóculo (T1), 200 rpm y 0.25 vvm

TAC** (%) µs*** (g/Lh)

GLU 11.98±0.61 100±0.00 0.082±0.011 FRU 6.83±0.34 100±0.00 0.042±0.009 GAL ND ND ND SAC 1.09±0.01 100±0.00 0.051±0.011 ARA 4.74±0.44 89.44±0.99 0.064±0.010 XIL 2.18±0.40 100±0.00 0.078±0.016

*GLU: glucosa, SAC: sacarosa, FRU: fructosa, GAL: galactosa, XIL: xilosa, ARA: arabinosa, CAM: concentración de azúcar en el medio. **TAC: total de azúcar consumido en 10.5 días de fermentación ***µ s: Velocidad del consumo de sustrato total determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2>0.95). ND: no detectado.


137

En la figura 62b, se muestra el comportamiento celular en el hidrolizado de limón persa,

donde a la cepa LR4 le benefició el suministro de aire (0.25 vvm) al reactor debido a que la

población siempre se mantuvo superior al de la cepa T1. Debido a que no se modificó el pH la

fermentación se llevó a cabo a un pH de 4.7, éste se mantuvo durante los primeros dos días de

crecimiento debido al buffer de citrato en el que se contenía el hidrolizado al momento de ser

entregado. A partir de los 2.5 días se tuvo un aumento de pH hasta alcanzar un valor de 8.0.

Liu y col., reportan que la presencia de CO2 y H+ en el medio podría tener a la formación de

carbonatos (CO32-) que podrían alcalinizar los sistemas. También se reporta que

probablemente se deba a la lisis celular (Elmahdi y col., 2003).

La mayor producción de alcohol se obtiene en el tratamiento 1 (tabla 31), la aireación

benefició la productividad donde en el tratamiento 2 se obtienen los mejores resultados,

aunque ambos resultados estuvieron por debajo de la máxima producción obtenida a nivel

matraz. El Yp/s (tabla 31) obtenido en el hidrolizado es similar a lo obtenido por Hickert y

col., (2013) al utilizar un cultivo mixto de S. cerevisiae y C. shehatae en un bioreactor al

utilizar un hidrolizado de cáscara de arroz (0.44 g/g). También es similar al obtenido por

Martin y col., (2010) al utilizar hidrolizados de residuos de árboles de olivo (0.44 g/g).

Martiniano y col., reportan un rendimiento de 0.30 (g/g) a partir de bagazo de caña de azúcar.

Tabla 31. Consumo total de azúcar y velocidades en el consumo de sustrato en las cinéticas en el bioreactor de 3 L con mezcla de azúcares e hidrolizado cítrico

Trat TAC* (%) Producción

alcohol (g/L)

Yp/s (g/g)

µp** (g/Lh)

Producción máxima Etanol Productividad

(g/L.d) t (d) CS*** (%)

Sin control de pH

80.62±0.43 30.88±0.07 0.36±0.01 0.035±0.003 4.00 80.62±0.43 7.72±0.02

Con control de pH

89.48±2.83 30.29±0.14 0.35±0.02 0.033±0.003 4.00 89.48±2.83 7.57±0.04

Trat 1 88.04±0.34 34.34±0.25 0.40±0.01 0.170±0.39 2.25 82.27±1.30 15.26±0.11 Trat 2 89.15±0.22 31.73±0.14 0.40±0.01 0.189±0.052 2.00 79.17±0.73 15.87±0.04 Trat 3 88.86±0.65 31.46±0.18 0.37±0.03 0.153±0.029 3.00 86.73±0.98 10.48±0.06 Trat 4 92.49±0.97 27.50±0.14 0.32±0.01 0.081±0.016 2.00 84.53±2.84 13.75±0.07

Hidrolizado 98.13±0.04 11.71±0.02 0.44±0.01 0.145±0.010 1.16 75.30±1.49 10.09±0.02 *TAC: Total consumo de sustrato en 10.5 días de fermentación ** µp: Velocidad de producción de alcohol determinados por los ajustes al modelo de Gompertz (R2>0.95). *** CS: Consumo de sustrato que se obtuvo al día que se obtuvo la máxima producción de alcohol


138

En la figura 63, se muestra la gráfica de medias para la producción de alcohol y productividad

en todos los sistemas probados en el bioreactor. En la figura 63a, se observa que el

tratamiento 1 (sección 7.6.2) presenta la mayor producción de alcohol con una diferencia

significativa y la más baja es lo obtenido en el hidrolizado, esto se debe a la baja

concentración de azúcares fermentables. En la figura 63b, la mayor productividad se obtienen

en los tratamientos 2 y seguido por el 1 (sección 7.6.2), aunque se encuentran por debajo a lo

obtenido a nivel matraz. El hidrolizado presenta mejores resultados en productividad a los

mostrados por las cinéticas similares al matraz en el reactor con y sin ajuste de pH, el empleo

de aireación benefició en la obtención de mejores resultados de productividad.

Figura 63. Gráfica de medias para a) Producción de alcohol y b) Pmáx de todos los sistemas probados a nivel

bioreactor de 3 L

Las cepas LR4 (Candida tropicalis) y T1 (Candida glabrata) tienen la capacidad de fermentar

hexosas y pentosas por lo que muestran un alto potencial para la fermentación de hidrolizados

de residuos cítricos, por lo que es necesario optimizar las condiciones de fermentación y lograr

escalar estos procesos.

a) b)

CONCLUSIONES

139

8.- CONCLUSIONES

En la evaluación de la capacidad fermentativa de microorganismos silvestres, las cepas

Candida glabrata (LR2, LR5, T1) y Candida tropicalis (LR4) resultaron ser adecuadas para

su uso en la fermentación de los carbohidratos reportados para los residuos cítricos, y de un

hidrolizado de limón persa para la producción de alcohol.

Las condiciones de fermentación variaron para cada microorganismo, ya que con agitación se

propició el aumento de la biomasa celular y sin agitación la producción de alcohol, a pesar de

esta diferencia, todas las cepas probadas presentaron una alta eficiencia en la producción de

alcohol a partir de glucosa, sin una diferencia significativa.

Al fermentar una mezcla de azúcares a las proporciones reportadas presentes en los residuos

cítricos, se obtuvo con la cepa Candida glabrata (T1) los mejores resultados de crecimiento

con base en el peso seco (2.07 ± 0.07 g/l). La cepa Candida glabrata (LR2) tuvo velocidades

de consumo más altas para glucosa, fructosa y xilosa. Con la cepa Candida tropicalis (LR4) se

obtuvo el máximo porcentaje de consumo (90.67 ± 0.17 %) del total de la mezcla de azúcares

(100 g/l), seguido por la cepa Candida glabrata (T1). Asimismo la cepa LR4, obtuvo una

productividad máxima de alcohol de 3.92 ± 0.53 g/Ld, sin una diferencia significativa entre las

cepas; la cepa Candida glabrata (T1) obtuvo la mayor velocidad de producción de alcohol con

0.047 ± 0.007 g/Lh.

Debido a que las cepas Candida tropicalis (LR4) y Candida glabrata (T1) presentaron un

perfil más amplio de asimilación, una mayor producción de alcohol, un mejor consumo de

sustrato y alta velocidad de producción de alcohol en la fermentación de azúcares individuales

y en mezcla, fueron seleccionadas para la formulación de cultivos mixtos, donde, con los

esquemas evaluados, se obtuvo una mejor asimilación de azúcar y una mayor productividad de

alcohol en comparación con las cepas individuales. El esquema de cultivo mixto secuencial

(CC3) mostró una mejor asimilación de azúcares totales del 85.2 ± 2.0 %, teniendo valores

significativamente diferentes entre los esquemas propuestos (P<0.05). La productividad fue

mayor en los cultivos mixtos CC2 y CC3, con 7.7 ± 0.29 y 7.8 ± 0.44 g/ld, respectivamente.

CONCLUSIONES

140

Con el esquema secuencial que consistió en inocular la cepa Candida tropicalis (LR4) al

inicio de la fermentación y 24 h después la cepa Candida glabrata (T1) con agitación se

obtuvieron los mejores resultados de productividad (19.02 ± 0.28 g/ld) y la mayor velocidad

de producción de alcohol (0.184 ± 0.057 g/lh). La complementación metabólica de las cepas

en cultivo mixto mejoraron la conversión de una mezcla de azúcares y como consecuencia el

aumento de la utilización de sustrato y la productividad, por lo que el uso de cultivos mixtos

ha resultado ser una buena estrategia para la fermentación de una mezcla de azúcar similar a la

reportada para los residuos cítricos. Con el esquema secuencial en un bioreactor de 3L, se

obtuvo una disminución en la productividad y en la concentración de alcohol a lo ya obtenido

a nivel matraz. El ajuste del pH benefició una mayor consumo total de azúcar (89.48 ± 2.83

%) pero con resultados en productividad y concentración de alcohol similares a los obtenidos

sin ajuste de pH.

La interacción de la aireación y la agitación tuvieron un efecto significativo sobre la

producción de alcohol y la productividad máxima al fermentar la mezcla de azúcares en el

bioreactor de 3 L, ya que al utilizar las condiciones más altas de aireación y agitación se

observó una mejoría en el consumo de la mezcla de azúcares (92.49 ± 0.97 %) y con los

valores más bajos de agitación y aireación se logró obtener la mayor producción de alcohol

(34.34 ± 0.25 g/L). Por lo que cierta aireación es necesaria para estimular el crecimiento y


Al fermentar un hidrolizado de limón persa, se obtuvo un rendimiento de 0.44 ± 0.01 g/g

similar a lo reportado al fermentar otros residuos lignocelulósicos. La baja cantidad de alcohol

producido (11.71 ± 0.02 g/l) se debió a la concentración de azúcares fermentables presentes en

el hidrolizado de limón persa, muy por debajo a lo reportado, por lo que es necesario seguir

trabajando en la obtención de un método combinado fisicoquímico y enzimático que dé altos

rendimientos de sacarificación ya que los microorganismos de forma individual y en cultivos

mixtos pueden potencialmente ser utilizados para la asimilación de las hexosas y pentosas

presentes. Es necesario seguir evaluando las condiciones más adecuadas para fermentar los

carbohidratos en los hidrolizados de residuos cítricos y lograr una alta productividad de

alcohol.

RECOMENDACIONES

141

9.- RECOMENDACIONES

Para la conservación adecuada de las levaduras empleadas, es indispensable comparar

técnicas, para garantizar que las características fisiológicas no se modifiquen.

Aunque las levaduras denominadas como Candida glabrata presentaron distintas capacidades

fermentativas, es necesario identificar la variedad de cada una de ellas con la finalidad de

obtener información más específica de ellas para posteriormente lograr un mejor desempeño

en los procesos de fermentación.

A partir de las condiciones ya establecidas en los distintos diseños factoriales para la

fermentación de carbohidratos, se sugiere la optimización por superficie de respuesta de las

distintas etapas, así como de las distintas necesidades nutricionales necesarias para el

crecimiento y fermentación de carbohidratos por los microorganismos utilizados.

Es necesario seguir trabajando en la etapa de hidrólisis de los residuos de limón persa para

aumentar el contenido inicial de carbohidratos fermentables, debido a que al utilizar un

método combinado de HCl con una enzima celulolítica (Novozyme) se obtuvo una baja

concentración de carbohidratos fermentables, se recomienda la comparación de diferentes

métodos térmicos junto con un método químico variando la utilización de diferentes ácidos o

bases y posteriormente un consorcio enzimático a diferentes concentraciones.

Se recomienda realizar cultivos mixtos con las cepas no seleccionadas para ello, con la

finalidad de observar los perfiles de consumo en mezclas de carbohidratos, ya que la sinergia

de sus rutas metabólicas podría beneficiar en la obtención de una mayor producción de

alcohol, mejores rendimientos, productividad y el aprovechamiento de un porcentaje más alto

de los carbohidratos presentes.

Para monitorear con mayor exactitud el consumo de azúcar y la producción de alcohol, así

como para la determinación de otros compuestos como el xilitol y ácidos orgánicos que se

RECOMENDACIONES

142

producen durante la fermentación, se sugiere utilizar técnicas como la cromatografía líquida

de alta resolución (HPLC) y la cromatografía de gases (CG) en todas las etapas del proceso.

Puesto que se obtuvieron buenos rendimientos y productividades en la producción de etanol,

se recomienda escalar los procesos de fermentación a escala planta piloto y nivel industrial

tratando de reproducir los resultados obtenidos.

BIBLIOGRAFÍA

143

10.- BIBLIOGRAFÍA

Abate, C., Callieri, D., Rodriguez, E. y Garro, O. (1996). Ethanol production by a mixed culture of flocculent strains of Zymomonas mobilis and Saccharomyces sp. Appl Microbiol Biotechnol 45: 580–583. Abbi, M., Kuhad, R. y Singh, A. (1996). Fermentation of xylose and rice straw hydrolysate to ethanol by Candida shehatae NCL-3501. J. Ind. Microbiol. 17: 20-23. Agbogbo, F., Coward-Kelly, G., Torry-Smith, M. y Wenger, K. (2006). Fermentation of glucose/xylose mixtures using Pichia stipites. Process Biochemistry. 41: 2333-2336. Alberts, E. y Larsson, C. (2009). A comparison of stress tolerance in YPD and industrial lignocellulose-based medium among industrial and laboratory yeast strains. J Ind Microbiol Biotechnol. 36: 1085-1091. Arellano, M., Pelayo, C., Ramírez, J. y Rodríguez, I. (2008) Characterization of kinetic parameters and the formation of volatile compounds during the tequila fermentation by wild yeasts isolated from agave juice. J Ind. Microbiol. Biotechnol . 35: 835–841. Aro, N., Pakula, T. y Penttila, M. (2005) Transcriptional regulation of plant cell wall degradation by filamentous fungi. FEMS Microbiol. Rev. 29: 719–739. Atlas R. M. (2010) Handbook of Microbiological Media. CRC Press. 4a Ed. pp. 1938-1939. ISBN: 978-1-4398-0406-3. Bai, F., Anderson, W. y Moo-Young, M. (2008). Ethanol fermentation technologies from sugar and starch feedstocks. Biotechnology Advances. 26 (1): 89-105. Bai, Y., Luo, L. y Van der Voet, E. (2010). Life-cycle assessment of switchgrass-derived ethanol as transport fuel. International Journal of Life Cycle Assessment. 15:468–77. Baig, V., Baig, M., Baig, M. y Yasmeen, M. (2004) Saccharification of banana agro-waste by cellulolytic enzymes. African J Biotechnol, 3(9): 447-450. Barder, J., Mast-Gerlach, E., Popovic, M., Bajpai, R. y Stahl, U. (2010) Relevance of microbial coculture fermentations in biotechnology. Journal of Applied Microbiology.109: 371-387.

BIBLIOGRAFÍA

144

Bettiga, M., Bengtsson, O., Hahn-Hägerdal, B., Gorwa-Grauslund, M. (2009). Arabinose and xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae expressing a fungal pentose utilization pathway. Microbial Cell Factories. 8(40), 1-12. Boluda-Aguilar, M., García-Vidal, L., González-Castañeda, F. y López-Gómez, A. (2010). Mandarin peel wastes pretreatment with steam explosion for bioethanol production. Bioresource Technology. 101: 3506-3513. Boluda-Aguilar, M., López-Gómez, A., 2013.Production of bioetanol by fermentation of lemon (Citrus limón L.) peel wastes pretreated with steam explosion. Industrial Crops and Products. 41, 188-197. Bohringer, P. y Jacob, L. (1964). The determination of alcohol using chromic acid. Zeitschr. Flussinges Abst. 31: 223. Breznak, J. A. y Brune, A. (1994) Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu Rev Entomol. 39: 453-487. Brune, A. (1998) Termite guts: the world’s smallest bioreactors. Trends Biotechnol 16: 16-21. Cannell, M. (2003) Carbon sequestration and biomass energy offset: theoretical, potential and achievable capacities globally, in Europe and the UK. Biomass Bioenerg. 24: 97-116. Canto, B. (2007) México: Primera, segunda o tercera generación de biocombustibles. Memorias del 1er foro sobre Bioenergía. Fundación Produce Yucatán, A.C. Mérida, Yucatán, México. Cardona, C. y Sánchez, O. (2007) Fuel ethanol production: process design trends and integration opportunities. Bioresource Technology. 98: 2415-2457. Chandel, A., Kapoor, R., Singh, A. y Kuhad R. (2007). Detoxification of sugarcane bagasse hydrolysates improves ethanol production by Candida shehatae NCIM 3501. Bioresour Technol. 98: 1947-1950. Chandraraj, K. y Gunasekaran, P. (2004). Bacterial Alcoholic fermentation. Concise Encyclopedia of Bioresource Technology. Ed. Ashok Pandey. p. 327-333 Czechowski, M. y Bolkan, S. (2011) Glucose conversion to ethanol via yeast cultures and bicarbonate ions. U.S. Pat. No. 0201093.

BIBLIOGRAFÍA

145

Davis, L., Rogers, P., Pearce, J. y Peiris, P. (2006). Evaluation of Zymomonas-based ethanol production from a hydrolysed waste starch stream. Biomass and Bioenergy. 30 (8-9): 809-814. De Bari, I., De Canio, P., Cuna, D., Liuzzi, F., Capece, A., Romano, P. (2013). Bioethanol production from mixed sugars by Scheffersomyces stipitis free and immobilized cells, and co-cultures with Saccharomyces cerevisiae. New Biotechnol. 30(6), 591-597. Deguchi, S., Mukai, S., Tsudome, M. y Horikoshi, K. (2006). Facile generation of fullerene nanoparticles by hand-grinding. Adv Mater. 18:729-732. Demirbas, A., Pehlivan, E. y Altun, T. (2006) Potential evolution of Turkish agricultural residues as bio-gas, bio-char and bio-oil sources. Int J Hydrogen Energy. 31: 613–620. Demirbas, A. (2005) Bioethanol from cellulosic materials: a renewable motor fuel from biomass. Energy Source. 27:327-337. De Oliveira, M., Vaughan, B. y Rykiel, Jr. E. (2005). Ethanol as fuel: energy, carbon dioxide balances, and ecological footprint. BioScience. 55:593–602. Dwivedi, P., Alavalapati, J. y Lal, P. (2009). Cellulosic ethanol production in the United States: Conversion technologies, current production status, economics, and emerging developments. Energy for Sustainable Development. 13: 174-182. Drapcho, C., Nghim, N. y Walker, T. (2008). “Ethanol Production”, Biofuels Engineering Process Technology, Eds. The McGraw-Hill Companies. p. 105-195. Ebringerova, A., Hromadkova, Z. y Heinze, T. (2005). Hemicellulose. Adv. Polym. Sci. 186:1-67. Elmahdi, I., Baganz, F., Dixon, K., Harrop, T., Sugden, D. y Lye, G. (2003). pH control in microwell fermentations of S. erythraea CA340: influence on biomass growth kinetics and erythromycin biosynthesis. Biochemical Engineering Journal. 16: 299-310. Festel, G. (2008). Biofuels-economic aspects. Chemical Engineering and Technology. 31:715–720. Fonseca, G., Barbosa, N. y Gombert, A. (2013). Growth of the yeast Kluyveromyces marxianus CBS 6556 on different sugar combinations as sole carbon and energy source. Applied Microbiology and Biotechnology. 97: 5055-5067.

BIBLIOGRAFÍA

146

Fonseca, C., Spencer-Martins, I. y Hahn-Hägerdal, B. (2007). L-Arabinose metabolism in Candida arabinofermentans PYCC 5603t and Pichia guilliermondii PYCC 3012: influence of sugar and oxygen on product formation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 303-310. Fromanger, R., Guillouet, S., Uribelarrea, J., Molina, C. y Cameleyre, X. (2010) Effect of controlled oxygen limitation on Candida Shehatae physiology for ethanol production from xylose and glucose. J. Ind. Microbiol Biotechnol. 37: 437–445. Fu, N., Peiris, P., Markham, J. y Bavor, J. (2009) A novel co-culture process with Zymomonas mobilis and Pichia stipidis for efficient ethanol production on glucose⁄xylose mixtures. Enz Microb Tech. 45: 210–217. Girio, F., Fonseca, C., Carvalheiro, F., Duarte, L., Marques, S. y Bogel-Lukasic, R. (2010). Hemicellulose. Bioresour. Technol. 101:4775-4800. Goldstein, I. S. (1981) Organics Chemicals from Biomass. CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, USA. González-Molina, E., Domínguez-Perles, R., Moreno, D. y García-Viguera, C. (2010). Natural bioactive compounds of Citrus limon for food and health. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51(2), 327–345. Govindaswamy, S. y Vane, L. (2007) Kinetics of growth and ethanol production on different carbon substrates using genetically engineered xylose-fermenting yeast. Bioresource Technology. 98: 677-685. Grudsky, R. y Arias, J. (1983) Aspectos generales de la microbiología del rumen. Monografía de Medicina Veterinaria. Universidad de Chile. 5: 2. Guan, D., Li, Y., Shiroma, R., Ike, M., Tokuyasu, K. (2013). Sequential incubation of Candida shehatae and ethanol-tolerant yeast cells for efficient ethanol production from a mixture of glucose, xylose and cellobiose. Bioresour. Technol. 132,419-422. Hamelinck, C., Van Hooijdonk, G. y Faaij, A.. (2005). Ethanol from lignocellulosic biomass: techno-economic performance in short-, middle- and long-term. Biomass and Bioenergy. 28:384–410. Hahn-Ha¨gerdal, B., Galbe, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Linde´n, G. y Zacchi, G. (2006) Bio-ethanol: the fuel of tomorrow from the residues of today. Trends Biotechnol 24(12): 549–556.

BIBLIOGRAFÍA

147

Hasunuma, T. y Kondo, A. (2012). Consolidated bioprocessing and simultaneous saccharification and fermentation of lignocellulose to etanol with thermotolerant yeast strain. Process biochem. 47: 1287-1294. Hamelincka, C. N. y Faaij, A. P. C. (2006) Outlook for advanced biofuels. Energy Policy. 34: 3268–3283. Hayashi, T., Furuta, Y. y Furukawa, K. (2011) Respiration-deficient mutants of Zymomonas mobilis show improved growth and ethanol fermentation under aerobic and high temperature condition. Journal of Bioscience and Bioengineering. 111 (4): 414-419. Hickert, L., Cunha-Pereira, F., De Souza-Cruz, P., Rosa, C. y Záchia, M. (2013). Ethanogenic fermentation of co-cultures of Candida shehatae HM 52.2 and Saccharomyces cerevisiae ICV D254 in synthetic medium and rice hull hydrolysate. Biores. Technol. 131: 508-514. Ingram, L., Aldrich, H., Borges, A., Causey, T., Martinez, A., Morales, F., Saleh, A., Underwood, S., Yomano, L., York, S., Zaldivar, J. y Zhou, S. (1999). Enteric bacterial catalysts for fuel ethanol production. Biotechnol. Prog. 15: 855–866 Jamai., L. y Ettayebi, K. (2007). Production of ethanol from starch by free and immobilized Candida tropicalis in the presence of α-amylase. Bioresour Technol. 98 (14): 2765-2770. Jones, R. and Greenfield P. (1984) A review of yeast ionic nutrition. Part I: Growth and fermentation requirements. Process biochemistry. 19(2):48-52 Kádár, Z., Szengyel, Z. y Réczey, K. (2004). Simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of industrial wastes for the production of ethanol. Industrial Crops and Products. 20 (1): 103-110. Karhumaa, K., Fromanger, R., Hahn-Ha¨gerdal, B. y Gorwa-Grauslund, M. F. (2007) High activity of xylose reductase and xylitol dehydrogenase improves xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol 73: 1039–1046. Klinke, H., Ahring, B., Schmidt, A. y Thomsen, A. (2002). Characterization of degradation products from alkaline wet oxidation of wheat straw. Bioresour Technol. 82: 15–26. Kordowska-wiater, M. y Targonski, Z. (2002) Ethanol fermentation on glucose/xylose mixture by co-cultivation of restricted glucose catabolite repressed mutants of Pichia stipitis with respiratory deficient mutants of Saccharomyces cerevisiae. Acta Microbiol Pol. 51: 345–352

BIBLIOGRAFÍA

148

Kosaric, N. y Vardar-Sukan, F. (2001). Microbiology and biochemistry of ethanol formation. The biotechnology of ethanol: Clasical and fuure applications. Eds Wiley-VCH. p 103-105. Krause, K. M. y Oetzel, G. R. (2006) Understanding and preventing subacute ruminal acidosis in dairy herds: A review. Animal Feed Science and Technology 126: 215–236. Kuhad, R., Gupta, R., Khasa, Y., Singh, A. y Zhang, Y. (2011). Bioethanol production from pentose sugars: current status and future prospects. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 15: 4950-4962. Kumar, A., Kumar, R., Singh, A. y Kuhad, R. (2007). Detoxification of sugarcane bagasse hydrolysate improves ethanol production by Candida shehatae NCIM 3501. Bioresour Technol. 98 (10): 1947-1950. Kumar, S., Singh, S., Mishra, I. y Adhikari, D. (2009). Ethanol and xylitol production from glucose and xylose at high temperature by Kluyveromyces sp. IIPE453. J. Ind. Microbiol Biotechnol. 36: 1483-1489. Lal, R. (2005). World crop residues production and implications of its use as a biofuel. Environmental International. 31:575–584. Lang, X., Macdonald, D. G. y Hill, G. (2001) Recycle bioreactor for bioethanol production from wheat starch II, Fermentation and economics. Energy Sources 23: 427-436. Lang, X., Hill, G. y Macdonald, D. (2000) Recycle bioreactor for bioethanol production from wheat starch I, Cold enzyme hydrolysis. Energy Sources 23: 417-425. Lennartsson, P., Ylitervo, P., Larsson, C., Edebo, L. y Taherzadeh M. (2012) Growth tolerance of Zygomycetes Mucor indicus in orange peel hydrolysate without detoxification. Process Biochemistry. 47 (5): 836-842. Lewis, S. M. (1996) Fermentation alcohol. In T. Godfrey, S. West ed. Industrial Enzymology, 2nd Ed., New York: Stockton Press, pp. 12-48. Lin, Y. y Tanaka, S. (2006). Ethanol fermentation from biomass resources: curent state and prospects. Appl Microbiol Biotechnol. 69: 627-642.

BIBLIOGRAFÍA

149

Liu, Q., Zhang, X., Jun, Z., Zhao, A., Chen, S., Liu, F., Tai, J., Liu, J. y Qian, G. (2012). Effect of carbonate on anaerobic acidogenesis and fermentative hydrogen production from glucose using leachate as supplementary culture under alkaline conditions. Bioresour. Technol. 113: 37-43. Liu, Z., Slininger, P., Dien, B., Berhow M., Kurtzman, C. y Gorsich, S. (2004). Adaptive response of yeasts to furfural and 5-hydroxymethylfurfural and new chemical evidence for HMF conversion to 2,5-bis- hydroxymethylfuran. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31: 345–352. Ludovico, P., Sousa, M., Silva, M., Leao, C. y Corte-Real, M. (2001). Saccharomyces cerevisiae commits to a programmed cell death process in response to acetic acid. Microbiology. 147: 2409–2415. Lynd, L., Weimer, P., Van Zyl, W. y Pretorius, I. (2002). Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66(3): 506-577. López-Álvarez, A., Díaz-Pérez, A., Sosa-Aguirre, C., Macías-Rodríguez, L. y Campos-García, J. (2012) Ethanol yield and volatile compound content in fermentation of agave must by Kluyveromyces marxianus UMPe-1 comparing with Saccharomyces cerevisiae baker's yeast used in tequila production. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (5): 614-618. Maki, M., Leung, K.T. y Qin, W. (2009). The prospects of cellulase-producing bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass. Int J Biol Sci 5: 500–516. Mamma, D., Koullas, D., Fountoukidis, G., Kekos, D., Macris, B.J. y Koukios, E. (1996). Bioethanol from sweet sorghum: simultaneous saccharification and fermentation of carbohydrates by a mixed microbial culture. Proc Biochem 31: 377–381. Miller, G. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. 31(3): 426-428. Mussatto, S. y Roberto, I. (2006). Chemical characterization and liberation of pentose sugars from brewer’s spent grain. J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 268–274. Lozano, C. (2008). La utilización de los residuos frutícolas para obtener bioetanol de Segunda Generación, Jornadas Técnicas de Frutas y Hortalizas, Mallorca, España. Leloir, L. (1951). The enzymatic transformation of uridine diphosphate glucose into a galactose derivative. Arch Biochem Biophys. 33:186–190

BIBLIOGRAFÍA

150

Oberoi, H. S., Vadlani, P. V., Brijwani, K., Bhargav, V. K., Patil, R. T. (2010). Enhanced ethanol production via fermentation of rice straw with hydrolysate-adapted Candida tropicalis ATCC 13803. Process Biochemistry. 45, 1299-1306. Oh, D., Kauffman, C., Jensen, P. y Fenical, W. (2007). Induced production of emericellamides A and B from the marine-derived fungus Emericella sp. in competing co-culture. J. Nat. Prod. 70: 515–520. Osorio, V., López, M., Martínez, G. y Fernández, N. (2003) Obtención de una bebida fermentada a partir de la naranja dulce (Citrus sinensis), Universidad Autónoma de Campeche. Pacheco, N., Garnica-González, M., Ramírez-Hernández, J.Y. Flores-Albino, B. Gimeno, M., Barzana, E., Shirai. K. (2009). Effect of temperature on chitin and astaxanthin recoveries from shrimp waste using lactic acid bacteria. Bioresour. Technol. 100, 2849-2854. Phalan, B. (2009). The social and environmental impacts of biofuels in Asia: an overview. Applied Energy. 86:21–29. Patle, S. y Lal B., (2008) Investigation of the potential of agro-industrial material as low cost substrate for etano production by using Candida troicalis and Zymomonas mobilis. Biomass and bioenergy. 32: 596-602. Pereira, N., Schlittler, L., Carlos, L., Gomez, E. y Silva, N. (2011) Method for producing ethanol from residual biomass from the cellulose industry. WO. Pat. No 127545 A1. Petersson, A., Thomsen, M., Hauggaard-Nielsen, H. y Thomsen, A. (2007). Potential bioethanol and biogas production using lignocellulosic biomass from winter rye, oilseed rape and faba bean. Biomass and Bioenergy. 31: 812–819. Peterson, D. y Henriksen, D. (2011) Paenibacillus spp. and methods for fermentation of lignocellulosic materials. U.S. Pat. No .0151532 A1. Ragauskas, A., Williams, C. y Davison, B. (2006). The Path Forward for Biofuels and Biomaterials. Science. 311:484-489. Romo, H., S. (1993). Optimización de nutrientes en los medios de propagación y fermentación para la producción de alcohol a partir de melazas de caña. Tesis de licenciatura. Guadalajara, Jal. Méx.

BIBLIOGRAFÍA

151

Rodrussamee, N., Lertwattanasakul, N., Hirata, K., Suprayogi, Limtong, S., Kosaka, T. y Yamada, M. (2011). Growth and ethanol fermentation ability on hexose and pentose sugars and glucose effect under various conditions in thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90, 1573-1586. Salmon, J., Fornairon, C. y Barke, P. (1998) Determination of oxygen utilization pathways in an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae during enological fermentation, Journal of Fermentation and Bioengineering, 86 (2): 154-163. Sánchez, S., Bravo, V., García, J., Cruz, N. y Cuevas, M. (2008). Fermentation of D -glucose and D -xylose mixtures by Candida tropicalis NBRC 0618 for xylitol production. World J Microbiol Biotechnol. 24:709–16. Sandoval, G. (2010). Biocombustibles avanzados en México: Estado actual y perspectivas. Ed. Red Mexicana de Bioenergía, A.C. pp. 11. Schimer-Michel, A., Flôres, S., Hertz, P., Matos, G., Ayub, M. (2008). Production of ethanol from soybean hull hydrolysate by osmotolerant Candida guilliermondii NRRL Y-2075. Bioresour. Technol. 99, 2898–2904. Schnoor, J. (2011). Cellulosic biofuels disappoint. Environmental Science and Technology 45:70-99. Servicio de información agroalimentaria y pesquera (SIAP) http://www.siap.gob.mx/ Consultado Junio 2012. Siqueira, P., Krap, S., Carvalho, J., Sturm, W., Rodriguez-León, J., Tholozan, J., Singhania, R., Pandey, A. y Soccol, C. (2008). Production of bio-ethanol from soybean molasses by Saccharomyces cerevisiae at laboratory, pilot and industrial scales. Bioresour Technol. 99(17): 8156-8163. Soccol, C., Vandenberghe, L., Medeiros, A., Karp, S., Buckeridge, M. y Ramos, L. (2010). Bioethanol from lignocelluloses: status and perspectives in Brazil. Bioresource Technology. 101: 4820–4825. Sorda, G., Banse, M. y Kemfert, C. (2010). An overview of biofuel policies across the world. Energy Policy. 38:6977–6988.

BIBLIOGRAFÍA

152

Spindler, D., Grohmann, K. y Wyman, C. (1992) Simultaneous saccharification and fermentation (SSF) using celobiose fermenting yeast Brettanomyces custersii. U.S. Pat. No. 5100791. Sridhar, M. y Rao, L. (2004). Thermotolerant and osmotolerant yeast for alcoholic fermentations. Encyclopedia in Bioresource Technology. p. 394-402. Sun, Y. y Cheng, J. (2002) Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresour Technol 83: 1–11. Talebnia, F., Karakashev, D., Angelidaki, L. (2010). Production of bioethanol from wheat straw: an overview on pretreatment, hydrolysis and fermentation. Bioresour Technol. 101: 4744-4753. Ten, L., Im, T., Kim, M., Kang, M. y Lee, S. (2004). Development of a plate technique for screening of polysaccharide-degrading microorganisms by using a mixture of insoluble chromogenic substrates. J Microb Methods. 56: 375-382. Valero, E., Millán, C. y Ortega, J. (2001). Influence of oxygen addition during growth phase on the biosynthesis of lipids in Saccharomyces cerevisiae (M330-9) in enological fermentations. Journal of Bioscience and Bioengineering. 92 (1): 33-38. Van Maris, A. y Abbott, D. (2006). Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 90(4): 391-418. Wang, X., Ike, M., Shiroma, R., Tokuyasu, K. y Sakakibara, Y. (2013). Expression of neutral β-glucosidasa from Scytalidium thermophilum in Candida glabrata for ethanol production from alkaline-pretreated rice straw. Journal of bioscience and Bioengineering. 1; 1-4 Wahlbom, C. y Hahn-Hägerdal, B., (2002). Furfural, 5-hydroxymetyl furfural and acetoin act as external electron acceptors during anaerobic fermentation of xylose in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Bioeng. 78: 172–178. Watanabe, I., Nakamura, T., Shima, J., 2008. A strategy to prevent the occurrence of lactobacillus strains using lactate-tolerant yeast Candida glabrata in bioetanol production. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 35, 1117-1122. Watanabe, I., Nakamura, T. y Shima, J. (2010) Strategy for simultaneous saccharification and fermentation using a respiratory-deficient mutant of Candida glabrata for bioetanol production. Journal of bioscience and Bioengineering. 110 (2): 176-179.

BIBLIOGRAFÍA

153

Widmer, W., Zhou W. y Grohmann K., (2010). Pretreatment effects on orange processing waste for making ethanol by simultaneous saccharification and fermentation. Bioresource Technology, 10: 5242-5249. Wiloso, E., Heijungs, R. y De Snoo, G. (2012). LCA of second generation bioethanol: A review and some issues to be resolved for good LCA practice. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 16: 5295-5308. Wilkins, M., Widmer, W., Camero, R. y Grohmann, K. (2005) Effect of seasonal variation on enzymatic hydrolisis of Valencia orange peel waste. Proc. Fla. State Hort. Soc. 118: 419-422. Wilkins, M. (2009). Effect of orange peel oil on ethanol production by Zymomonas mobilis. Biomass and Bioenergy 33: 538–541. Yan J, Jianping W, Hongmei L, Suliang Y, Zongding H. (2005). The biodegradation of phenol at high initial concentration by the yeast Candida tropicalis. Biochem. Eng. J. 24:243–7. Yokoyama, M. T. y Johnson, K. A. (1988) Microbiología del rumen e intestino. En: El rumiante. Fisiología digestiva y nutrición. C. D. Church Ed.. Editorial Acribia. Zahangir, A. y Nassereldeen, K (2009). Production of bioethanol by direct bioconversion of oil-palm industrial effluent in a stirred-tank bioreactor. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36: 801-808. Zhao, L., Zhang, X. y Tan T. (2008) Influence of various glucose/xylose mixtures on ethanol production by Pachysolen tannophilus. Biomass and Bioenergy. 32: 1156-1161. Zhou, W., Widmer, W. y Grohmann, K. (2008) Developments in ethanol production from citrus peel waste. Proc. Fla. State Hort. Soc. 121: 307-310.

ANEXOS 1- TÉCNICAS ANALÍTICAS

154

11.- ANEXO 1 TÉCNICAS ANALÍTICAS

Método del ácido dinitrosalicílico (DNS)

Para llevar a cabo la determinación de azúcares reductores libres se utilizó el método de ácido

dinitrosalicílico DNS (Miller, 1959).

a) Reactivos utilizados

- 10 g/L Hidróxido de sodio

- 10 g/L Ácido 3, 5 dinitrosalisílico (DNS)

- 200 g/L Tartrato de sodio y potasio

- 2 g/L Fenol

- 0.5 g/L Metabisulfito de sodio

b) Preparación de la solución DNS

Disolver los reactivos en aproximadamente 600 mL de agua destilada, dejando al final el ácido

3, 5 dinitrosalicílico, el cual se debe ir adicionando poco a poco hasta lograr una completa

disolución, posteriormente aforar a un litro con agua destilada.

c) Procedimiento

Adicionar en tubos de ensayo 0.5 mL de muestra, añadirle 1.5 mL de solución de DNS, agitar,

colocar los tubos en baño de agua a punto de ebullición durante 15 min., enfriar a temperatura

ambiente, agregar 8 mL de agua destilada y agitar. Leer absorbancia a 550 nm.


155

d) Curva de calibración

Para hacer la curva de calibración, se utilizó una solución patrón con una concentración de 1

g/L de glucosa anhidra. El rango de concentración a probar fue 0.1 a 1 g/L, se usó también un

blanco, utilizando únicamente agua destilada y se tomó como cero. A cada muestra se le leyó

la absorbancia, a éstos resultados fue necesario someterlos a un análisis de regresión lineal a

fin de predecir la cantidad de azúcares reductores libres presentes en una muestra a partir de

una absorbancia dada. Los resultados deben de multiplicarse por el factor de dilución.

e) Preparación de la muestra

Las muestras tomadas durante las cinéticas en medios líquidos y fermentación, fueron

centrifugadas a 5300 rpm por 20 min. El sobrenadante se vertió en pequeños frascos de vidrio

color ambar y se congelaron a -20 oC hasta su utilización posterior.

y = 0.8022x - 0.0265

R² = 0.9971

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Ab

s 5

50

nm

Concentración

Azúcares reductores libres


156

Determinación de alcohol

La técnica utilizada para la determinación de alcohol, fue por Dicromato de Potasio

(Bohringer, 1964).

a) Reactivos utilizados:

- Dicromato de Potasio (K2Cr2O7) 33.768 g

- Ácido sulfúrico concentrado 323 mL

- Agua destilada 1000 mL

b) Preparación del reactivo

Se diluyó el ácido sulfúrico en aproximadamente 400 mL de agua destilada, se dejó enfriar y

se agregó el dicromato diluído en aproximadamente 200 mL de agua destilada; finalmente, se

aforó con agua destilada a 1000 mL.

c) Procedimiento

A 1 mL de muestra se agregaron 2 mL de solución de dicromato, se agitaron y se dejaron

reposar durante 10 min, después de ese tiempo, se adicionaron 5 mL de agua destilada, se

agitaron nuevamente y por último se determinó la absorbancia a 585 nm.

d) Curva de calibración para la determinación de alcohol

De acuerdo con la densidad y el porcentaje de pureza del etanol, se calcularon los mililitros

necesarios a adicionar a 1 litro de agua destilada para obtener una solución patrón de 20 g/L.

Para realizar la curva de calibración, el rango de análisis de regresión lineal, se obtuvo

entonces, una ecuación, y con ella se cuantificó la cantidad de alcohol presente en las

muestras, a partir de una absorbancia dada.


157

e) Preparación de la muestra

A 5 mL de muestra, se le agregaron 5 mL de agua destilada, esto se destiló en un

Microdestilador de vidrio, cuidando que la temperatura no pasara de los 100 oC a fin de

separar el etanol. Los destilados fueron colocados en frascos color ámbar y congelados a -20 oC hasta su utilización posterior.

y = 0.0503x + 0.0003

R² = 0.9986

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Ab

s 5

85

nm

Concentración (g/L)

Alcohol


158

Determinación de los azúcares totales por medio del método de fenol-sulfúrico

Reactivos utilizados:

� Ácido sulfúrico concentrado � Fenol 5%

Procedimiento:

A 1mL de la solución problema se le adicionó 1 mL de fenol al 5% enseguida se agregaron 5

mL de ácido sulfúrico con el pipetor de forma brusca para conseguir el efecto de la hidrólisis.

Se dejó enfriar durante 5 min a temperatura a temperatura ambiente, se agita y enseguida se

pone a baño de agua fría durante 10 min. Realizar el mismo procedimiento para el blanco.

Leer absorbancia a 490 nm.

Curva de calibración:

Para hacer la curva de calibración, se utilizó una solución patrón con una concentración de 0.1

g/L de sacarosa. El rango de concentraciones a probar fue 0.01 a 0.1 g/L, se utilizó también un

blanco, utilizando únicamente agua destilada y se tomó como cero. A cada muestra se le leyó

la absorbancia, a éstos resultados fue necesario someterlos a un análisis de regresión lineal

para predecir la cantidad de azúcares totales presentes en las muestra a partir de una

concentración dada.

y = 7.3077x + 0.0221

R² = 0.9981

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12

Ab

s 4

90

nm

Concentración

Azúcares totales

ANEXOS 2- ANÁLISIS ESTADÍSTICO

159

12.- ANEXO 2 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Determinación de las condiciones medio ambientales para el crecimiento y fermentación de levaduras silvestres a nivel matraz Crecimiento Análisis de varianza para peso seco de la cepa LR2 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 7.33203 1 7.33203 10.71 0.0056 B:Agitación 2.91067 1 2.91067 4.25 0.0583 AB 7.5272 1 7.5272 10.99 0.0051 Total error 9.58634 14 0.684739 Total (corr.) 27.3563 17 Análisis de varianza para µmáx de la cepa LR2 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 0.1083 1 0.1083 0.82 0.3804 B:Agitación 0.0000333333 1 0.0000333333 0.00 0.9875 AB 0.17405 1 0.17405 1.32 0.2701 Total error 1.84806 14 0.132004 Total (corr.) 2.13044 17 Análisis de varianza para Yx/s de la cepa LR2 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 0.0200083 1 0.0200083 9.97 0.0070 B:Agitación 0.00853333 1 0.00853333 4.25 0.0582 AB 0.02 1 0.02 9.97 0.0070 Total error 0.0280861 14 0.00200615 Total (corr.) 0.0766278 17 Análisis de varianza para peso seco para la cepa LR2 en YPD – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Temperatura 8.91963 2 4.45982 36.76 0.0000 B:Agitación 4.2217 2 2.11085 17.40 0.0008 INTERACTIONS AB 13.1231 4 3.28077 27.04 0.0000 RESIDUAL 1.09185 9 0.121317 TOTAL (CORRECTED) 27.3562 17 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado Análisis de varianza para peso seco de la cepa LR4 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 11.7612 1 11.7612 11.17 0.0048 B:Agitación 6.27853 1 6.27853 5.96 0.0285 AB 5.20031 1 5.20031 4.94 0.0433 Total error 14.7436 14 1.05312 Total (corr.) 37.9837 17 Análisis de varianza para µmáx de la cepa LR4 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 0.3267 1 0.3267 6.28 0.0263 B:Agitación 0.0320333 1 0.0320333 0.62 0.4466 AB 0.0561125 1 0.0561125 1.08 0.3179 blocks 0.03645 1 0.03645 0.70 0.4176 Total error 0.676132 13 0.0520101 Total (corr.) 1.12743 17


160

Análisis de varianza para Yx/s de la cepa LR4 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 0.016875 1 0.016875 8.80 0.0109 B:Agitación 0.006075 1 0.006075 3.17 0.0984 AB 0.0351125 1 0.0351125 18.32 0.0009 blocks 0.0002 1 0.0002 0.10 0.7518 Total error 0.0249153 13 0.00191656 Total (corr.) 0.0831778 17 Análisis de varianza para peso seco de la cepa LR4 en YPD – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Temperatura 11.9081 2 5.95407 58.72 0.0000 B:Agitación 9.53054 2 4.76527 47.00 0.0000 INTERACTIONS AB 15.6325 4 3.90811 38.54 0.0000 RESIDUAL 0.91255 9 0.101394 TOTAL (CORRECTED) 37.9837 17 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado Análisis de varianza para peso seco de la cepa LR5 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 4.21268 1 4.21268 7.21 0.0178 B:Agitación 0.3888 1 0.3888 0.67 0.4284 AB 6.39031 1 6.39031 10.93 0.0052 Total error 8.18432 14 0.584595 Total (corr.) 19.1761 17 Análisis de varianza para µmáx de la cepa LR5 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 0.190008 1 0.190008 7.14 0.0182 B:Agitación 0.258133 1 0.258133 9.70 0.0076 AB 0.00405 1 0.00405 0.15 0.7023 Total error 0.372386 14 0.026599 Total (corr.) 0.824578 17 Análisis de varianza para Yx/s de la cepa LR5 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 0.0108 1 0.0108 6.51 0.0231 B:Agitación 0.00300833 1 0.00300833 1.81 0.1996 AB 0.01805 1 0.01805 10.88 0.0053 Total error 0.0232361 14 0.00165972 Total (corr.) 0.0550944 17 Análisis de varianza para peso seco de la cepa LR5 en YPD – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Temperatura 4.73348 2 2.36674 54.13 0.0000 B:Agitación 2.73991 2 1.36996 31.33 0.0001 INTERACTIONS AB 11.3092 4 2.82731 64.67 0.0000 RESIDUAL 0.3935 9 0.0437222 TOTAL (CORRECTED) 19.1761 17 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado


161

Análisis de varianza para peso seco de la cepa T1 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 4.8387 1 4.8387 8.70 0.0106 B:Agitación 0.350208 1 0.350208 0.63 0.4408 AB 3.96211 1 3.96211 7.12 0.0184 Total error 7.79078 14 0.556484 Total (corr.) 16.9418 17 Análisis de varianza para µmáx de la cepa T1 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 0.000533333 1 0.000533333 0.03 0.8721 B:Agitación 0.0012 1 0.0012 0.06 0.8093 AB 0.01445 1 0.01445 0.73 0.4077 Total error 0.277617 14 0.0198298 Total (corr.) 0.2938 17 Análisis de varianza para Yx/s de la cepa T1 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 0.0075 1 0.0075 5.98 0.0283 B:Agitación 0.00240833 1 0.00240833 1.92 0.1874 AB 0.00845 1 0.00845 6.74 0.0211 Total error 0.0175528 14 0.00125377 Total (corr.) 0.0359111 17 Análisis de varianza para peso seco de la cepa T1 en YPD – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Temperatura 4.9411 2 2.47055 131.57 0.0000 B:Agitación 6.32823 2 3.16412 168.50 0.0000 INTERACTIONS AB 5.50347 4 1.37587 73.27 0.0000 RESIDUAL 0.169 9 0.0187778 TOTAL (CORRECTED) 16.9418 17 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado

Fermentación Análisis de varianza para producción de alcohol de la cepa LR2 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 16.4502 1 16.4502 3.89 0.0686 B:Agitación 17.9585 1 17.9585 4.25 0.0583 AB 34.8612 1 34.8612 8.25 0.0123 Total error 59.1568 14 4.22548 Total (corr.) 128.427 17 Análisis de varianza para eficiencia de la cepa LR2 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 1851.08 1 1851.08 3.93 0.0674 B:Agitación 1849.59 1 1849.59 3.93 0.0675 AB 3473.61 1 3473.61 7.38 0.0167 Total error 6592.61 14 470.9 Total (corr.) 13766.9 17


162

Análisis de varianza para Pmáx de la cepa LR2 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 0.616533 1 0.616533 12.88 0.0030 B:Agitación 0.027075 1 0.027075 0.57 0.4645 AB 0.13005 1 0.13005 2.72 0.1215 Total error 0.670119 14 0.0478657 Total (corr.) 1.44378 17 Análisis de varianza para producción de alcohol de la cepa LR2 en YPD – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Temperatura 27.9536 2 13.9768 35.28 0.0001 B:Agitación 24.142 2 12.071 30.47 0.0001 INTERACTIONS AB 72.7653 4 18.1913 45.91 0.0000 RESIDUAL 3.5658 9 0.3962 TOTAL (CORRECTED) 128.427 17 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado Análsis de varianza para producción de alcohol de la cepa LR4 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 108.12 1 108.12 20.69 0.0005 B:Agitación 0.946408 1 0.946408 0.18 0.6774 AB 0.0300125 1 0.0300125 0.01 0.9407 blocks 0.202672 1 0.202672 0.04 0.8469 Total error 67.9202 13 5.22463 Total (corr.) 177.219 17 Análisis de varianza para eficiencia de la cepa LR4 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 12065.0 1 12065.0 21.80 0.0004 B:Agitación 82.3204 1 82.3204 0.15 0.7055 AB 4.35125 1 4.35125 0.01 0.9306 Total error 7748.89 14 553.492 Total (corr.) 19900.6 17 Análisis de varianza para Pmáx de la cepa LR4 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 1.81741 1 1.81741 51.99 0.0000 B:Agitación 0.00653333 1 0.00653333 0.19 0.6721 AB 0.0006125 1 0.0006125 0.02 0.8966 Total error 0.489407 14 0.0349576 Total (corr.) 2.31396 17 Análisis de varianza para producción de alcohol de la cepa LR4 en YPD – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Temperatura 121.394 2 60.697 62.17 0.0000 B:Agitación 17.2545 2 8.62727 8.84 0.0075 INTERACTIONS AB 29.784 4 7.44599 7.63 0.0058 RESIDUAL 8.78695 9 0.976328 TOTAL (CORRECTED) 177.219 17 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado


163

Análisis de varianza para producción de alcohol de la cepa LR5 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 43.9684 1 43.9684 18.91 0.0007 B:Agitación 23.3523 1 23.3523 10.05 0.0068 AB 27.2322 1 27.2322 11.71 0.0041 Total error 32.5459 14 2.3247 Total (corr.) 127.099 17 Análisis de varianza para eficiencia de la cepa LR5 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 4019.78 1 4019.78 10.93 0.0052 B:Agitación 1705.99 1 1705.99 4.64 0.0492 AB 3232.48 1 3232.48 8.79 0.0102 Total error 5149.58 14 367.827 Total (corr.) 14107.8 17 Análisis de varianza para Pmáx de la cepa LR5 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 0.730133 1 0.730133 3.28 0.0917 B:Agitación 0.0161333 1 0.0161333 0.07 0.7918 AB 0.112812 1 0.112812 0.51 0.4884 Total error 3.11832 14 0.222737 Total (corr.) 3.9774 17 Análisis de varianza para producción de alcohol de la cepa LR5 en YPD – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Temperatura 49.4518 2 24.7259 330.46 0.0000 B:Agitación 28.0902 2 14.0451 187.71 0.0000 INTERACTIONS AB 48.8834 4 12.2208 163.33 0.0000 RESIDUAL 0.6734 9 0.0748222 TOTAL (CORRECTED) 127.099 17 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado Análisis de varianza para producción de alcohol de la cepa T1 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 31.6875 1 31.6875 22.22 0.0003 B:Agitación 21.2534 1 21.2534 14.90 0.0017 AB 19.1271 1 19.1271 13.41 0.0026 Total error 19.9684 14 1.42631 Total (corr.) 92.0364 17 Análisis de varianza para eficiencia de la cepa T1 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 438.504 1 438.504 23.03 0.0003 B:Agitación 487.178 1 487.178 25.58 0.0002 AB 461.624 1 461.624 24.24 0.0002 Total error 266.605 14 19.0432 Total (corr.) 1653.91 17 Análisis de varianza para Pmáx de la cepa T1 en YPD Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Temperatura 0.795675 1 0.795675 51.28 0.0000 B:Agitación 0.00403333 1 0.00403333 0.26 0.6181 AB 0.148512 1 0.148512 9.57 0.0079 Total error 0.217207 14 0.0155148 Total (corr.) 1.16543 17


164

Análisis de varianza para production de alcohol de la cepa T1 en YPD – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Temperatura 33.1355 2 16.5678 318.64 0.0000 B:Agitación 27.7474 2 13.8737 266.83 0.0000 INTERACTIONS AB 30.6856 4 7.67139 147.54 0.0000 RESIDUAL 0.46795 9 0.0519944 TOTAL (CORRECTED) 92.0364 17 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado Obtención del perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados en medio sintético Prueba preliminar de asimilación de carbohidratos Tabla de ANOVA para galactosa según cepa Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 53.4225 3 17.8075 8.75 0.0313 Within groups 8.13885 4 2.03471 Total (Corr.) 61.5614 7 Tabla de ANOVA para fructosa según cepa Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 226.005 3 75.3351 8.22 0.0348 Within groups 36.6724 4 9.1681 Total (Corr.) 262.678 7 Perfil de asimilación de azúcares de los microorganismos aislados Análisis de varianza para peso seco según el diseño 4 x 7 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Cepas 0.157938 1 0.157938 2.02 0.1615 B:Azúcar 7.08583 1 7.08583 90.52 0.0000 AB 0.150429 1 0.150429 1.92 0.1716 Total error 4.07066 52 0.0782819 Total (corr.) 11.4649 55 Análisis de varianza para peso seco según el diseño 4 x 7 – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Cepa 8661.5 3 2887.17 36.65 0.0000 B:Azúcar 87495.4 6 14582.6 185.09 0.0000 INTERACTIONS AB 12552.5 18 697.361 8.85 0.0000 RESIDUAL 2206.0 28 78.7857 TOTAL (CORRECTED) 110915. 55 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado Análisis de varianza para producción de alcohol según el diseño 4 x 7 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Cepas 5.81472 1 5.81472 1.69 0.1998 B:Azúcar 389.084 1 389.084 112.87 0.0000 AB 7.78222 1 7.78222 2.26 0.1390 Total error 179.258 52 3.44727 Total (corr.) 581.939 55


165

Análisis de varianza para producción de alcohol según el diseño 4 x 7 – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Cepa 25.1219 3 8.37398 555.16 0.0000 B:Azúcar 506.298 6 84.383 5594.23 0.0000 INTERACTIONS AB 50.0969 18 2.78316 184.51 0.0000 RESIDUAL 0.42235 28 0.0150839 TOTAL (CORRECTED) 581.939 55 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado Modificación del esquema de propagación Tabla de ANOVA para peso seco en glucosa según cepa Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 3.4317 7 0.490243 225.40 0.0000 Within groups 0.0174 8 0.002175 Total (Corr.) 3.4491 15 Tabla de ANOVA para producción de alcohol en glucosa según cepa Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 153.807 7 21.9725 352.72 0.0000 Within groups 0.49835 8 0.0622937 Total (Corr.) 154.306 15 Tabla de ANOVA para peso seco en galactosa según cepa Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.3263 7 0.0466143 31.60 0.0000 Within groups 0.0118 8 0.001475 Total (Corr.) 0.3381 15 Tabla de anova para producción de alcohol en galactosa según cepa Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.7739 7 0.253414 215.67 0.0000 Within groups 0.0094 8 0.001175 Total (Corr.) 1.7833 15 Evaluación de la capacidad fermentativa de cultivos individuales y mixtos en mezclas de azúcares Comparación de dos medios de fermentación Análisis de varianza para peso seco según la comparación de medios – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:CEPAS 3.67205 1 3.67205 173.01 0.0002 B:MEDIOS 0.1922 1 0.1922 9.06 0.0396 INTERACTIONS AB 0.2592 1 0.2592 12.21 0.0250 RESIDUAL 0.0849 4 0.021225 TOTAL (CORRECTED) 4.20835 7 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado


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Análisis de varianza para producción de alcohol según la comparación de medios – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:CEPAS 10.2604 1 10.2604 169.95 0.0002 B:MEDIOS 43.5244 1 43.5244 720.90 0.0000 INTERACTIONS AB 24.0818 1 24.0818 398.87 0.0000 RESIDUAL 0.2415 4 0.060375 TOTAL (CORRECTED) 78.1082 7 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado

Fermentación con cultivos individuales Tabla de ANOVA para peso seco según cepa en mezcla de azúcares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 3.37414 3 1.12471 317.94 0.0000 Within groups 0.01415 4 0.0035375 Total (Corr.) 3.38829 7 Tabla de ANOVA para µmáx según cepa en mezcla de azúcares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0428375 3 0.0142792 1.90 0.2708 Within groups 0.03005 4 0.0075125 Total (Corr.) 0.0728875 7 Tabla de ANOVA para producción de alcohol según cepa en mezcla de azúcares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 257.663 3 85.8877 10.13 0.0243 Within groups 33.9038 4 8.47596 Total (Corr.) 291.567 7 Tabla de AVOVA para Pmáx según cepa en mezcla de azúcares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.80794 3 0.602646 5.27 0.0712 Within groups 0.45775 4 0.114438 Total (Corr.) 2.26569 7 Fermentación con cultivos mixtos Tabla de ANOVA para producción de alcohol según cultivos mixtos en mezcla de azúcares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 19.4977 2 9.74885 2.64 0.2179 Within groups 11.0673 3 3.6891 Total (Corr.) 30.565 5 Tabla de ANOVA para Pmáx según cultivos mixtos en mezcla de azúcares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 5.8453 2 2.92265 28.04 0.0114 Within groups 0.3127 3 0.104233 Total (Corr.) 6.158 5


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Establecimiento de las condiciones de fermentación con cultivos mixtos en medio sintético a nivel matraz Análisis de varianza para producción de alcohol según el diseño 4 x 3 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Tiempo de inoculo (d) 1.66616 1 1.66616 0.07 0.7981 B:Agitación (rpm) 86.9556 1 86.9556 3.51 0.0758 AB 0.080645 1 0.080645 0.00 0.9551 Total error 495.987 20 24.7994 Total (corr.) 584.69 23 Análisis de varianza para Pmáx según el diseño 4 x 3 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Tiempo de inoculo (d) 133.226 1 133.226 21.79 0.0001 B:Agitación (rpm) 71.0649 1 71.0649 11.62 0.0028 AB 86.1955 1 86.1955 14.10 0.0012 Total error 122.282 20 6.11409 Total (corr.) 412.768 23 Análisis de varianza para Yp/s según el diseño 4 x 3 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Tiempo de inoculo (d) 0.0116033 1 0.0116033 9.25 0.0065 B:Agitación (rpm) 0.011025 1 0.011025 8.79 0.0077 AB 0.000125 1 0.000125 0.10 0.7556 Total error 0.0250967 20 0.00125483 Total (corr.) 0.04785 23 Análisis de varianza para porcentaje de consume según el diseño 4 x 3 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Tiempo de inoculo (d) 103.342 1 103.342 18.38 0.0004 B:Agitación (rpm) 33.005 1 33.005 5.87 0.0250 AB 26.2892 1 26.2892 4.68 0.0429 Total error 112.443 20 5.62213 Total (corr.) 275.079 23 Análisis de varianza para producción de alcohol según el diseño 4 x 3 – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Agitación 385.644 2 192.822 42.42 0.0000 B:Tiempo de inóculo 2.1911 3 0.730367 0.16 0.9207 INTERACTIONS AB 82.0171 6 13.6695 3.01 0.0495 RESIDUAL 54.5479 12 4.54566 TOTAL (CORRECTED) 524.4 23 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado Análisis de varianza para Pmáx según el diseño 4 x 3 – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Agitación 80.0959 2 40.048 314.92 0.0000 B:Tiempo de inóculo 194.102 3 64.7008 508.79 0.0000 INTERACTIONS AB 134.45 6 22.4084 176.21 0.0000 RESIDUAL 1.526 12 0.127167 TOTAL (CORRECTED) 410.174 23 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado


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Evaluar la capacidad fermentativa del cultivo mixto seleccionado en un hidrolizado de residuos cítricos a nivel fermentador de 3 L Cinéticas de crecimiento con diferentes niveles de aireación y agitación Análisis de varianza para producción de alcohol según el diseño 22

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Agitacón 25.2761 1 25.2761 376.97 0.0000 B:Aireación 21.5825 1 21.5825 321.89 0.0001 AB 0.91125 1 0.91125 13.59 0.0211 Total error 0.2682 4 0.06705 Total (corr.) 48.0379 7 Análisis de varianza para Pmáx según el diseño 22

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Agitacón 23.805 1 23.805 2144.59 0.0000 B:Aireación 7.5272 1 7.5272 678.13 0.0000 AB 3.5378 1 3.5378 318.72 0.0001 Total error 0.0444 4 0.0111 Total (corr.) 34.9144 7 Análisis de varianza para Yp/s según el diseño 22

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Agitacón 0.00605 1 0.00605 10.08 0.0337 B:Aireación 0.00125 1 0.00125 2.08 0.2224 AB 0.00125 1 0.00125 2.08 0.2224 Total error 0.0024 4 0.0006 Total (corr.) 0.01095 7 Análisis de varianza para producción de alcohol según el diseño 22 – Suma de cuadrados (Tipo 3) Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Agitacón 25.2761 1 25.2761 376.97 0.0000 B:Aireación 21.5825 1 21.5825 321.89 0.0001 INTERACTIONS AB 0.91125 1 0.91125 13.59 0.0211 RESIDUAL 0.2682 4 0.06705 TOTAL (CORRECTED) 48.038 7 Todos los valores de F están basados en la media del error residual al cuadrado

Producción de alcohol y productividad en todos los sistemas probados en el bioreactor Tabla de ANOVA para la producción de alcohol según todos los sistemas probados en el bioreactor Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 689.423 6 114.904 2529.33 0.0000 Within groups 0.318 7 0.0454286 Total (Corr.) 689.741 13 Tabla de ANOVA para la Pmáx según todos los sistemas probados en el bioreactor Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 142.101 6 23.6835 3369.61 0.0000 Within groups 0.0492 7 0.00702857 Total (Corr.) 142.15 13

ANEXOS 3- PRESENTACIONES EN CONGRESOS

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13.- ANEXO 3 PRESENTACIONES EN CONGRESOS


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centro de investigaciÓn y asistencia en tecnologÍa y ... · se estudió la capacidad fermentativa...

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