Universidad de La Salle Universidad de La Salle

Ciencia Unisalle Ciencia Unisalle

Medicina Veterinaria Facultad de Ciencias Agropecuarias

2006

Cambios patológicos producidos por la inoculación de una cepa Cambios patológicos producidos por la inoculación de una cepa

patógena de Clostridium chauvoei en cobayos Cavia porcellus patógena de Clostridium chauvoei en cobayos Cavia porcellus

Maritza Amparo Cárdenas Figueroa Universidad de La Salle, Bogotá

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Citación recomendada Citación recomendada Cárdenas Figueroa, M. A. (2006). Cambios patológicos producidos por la inoculación de una cepa patógena de Clostridium chauvoei en cobayos Cavia porcellus. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/medicina_veterinaria/342

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CAMBIOS PATOLÓGICOS PRODUCIDOS POR LA INOCULACIÓN DE UNA

CEPA PATÓGENA DE Clostridium chauvoei EN COBAYOS (Cavia porcellus)

MARITZA AMPARO CÁRDENAS FIGUEROA

UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA

Bogotá D.C. 2006

CAMBIOS PATOLÓGICOS PRODUCIDOS POR LA INOCULACIÓN DE UNA

CEPA PATÓGENA DE Clostridium chauvoei EN COBAYOS (Cavia porcellus)

MARITZA AMPARO CÁRDENAS FIGUEROA Código: 14961037

Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el título de MÉDICO VETERINARIO

Director Dr. DIEGO ORTÍZ ORTEGA. MV

Codirector Dr. JORGE HUMBERTO OSSA ARISTIZABAL. MV

UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA

BOGOTÁ 2006

UNIVERSIDAD DE LA SALLE

DIRECTIVOS

RECTOR

Hno. FABIO GALLEGO ARIAS

Vice-Rector Académico

Hno. CARLOS GABRIEL GÓMEZ

RESTREPO

Vice- Rector de Promoción y Desarrollo Humano

Hno. EDGAR FIGUEROA ABRAJIM

Vice –Rector Administrativo

Dr. MAURICIO FERNÁNDEZ FERNÁNDEZ

Decano de la Facultad

Dr. PEDRO PABLO MARTÍNEZ MÉNDEZ

Secretaria Académica

Dra. MARÍA TERESA URIBE MALLARINO

Director Clínica Veterinaria

Dr. HUMBERTO VASQUÉZ ROMERO

APROBACIÓN

DIRECTOR ____________________________________

Dr. DIEGO ORTÍZ ORTEGA

CODIRECTOR _____________________________________

Dr. JORGE HUMBERTO OSSA ARISTIZABAL

JURADO _____________________________________

Dr. CÉSAR AUGUSTO DÍAZ ROJAS

JURADO _____________________________________

Dra. IOVANNA CASTELLANOS LONDOÑO

SECRETARIA ACADÉMICA ____________________________________

Dra. MARÍA TERESA URIBE MALLARINO

COMPROMISO

Los trabajos de grado no deben contener ideas que sean contrarias a la doctrina

de la iglesia católica en asuntos de dogma y moral.

Ni la universidad, ni el asesor, ni el jurado calificador son responsables de las

ideas expuestas por el graduando.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Diego Ortiz Ortega por su apoyo y paciencia incondicional, mil

agradecimientos; al Dr. Jorge Humberto Ossa Aristizabal, quien aporto su

conocimiento durante el desarrollo de este estudio.

Un agradecimiento muy especial a César Díaz quien fue mi bastón durante estos

años en la universidad, a la Dra. Iovanna Castellanos le agradezco el valioso

tiempo que me dedicó durante la realización de esta investigación

A la Universidad de La Salle, Corpoica CEISA y a la Empresa Colombiana de

Productos Veterinarios (VECOL S.A.) por su aporte financiero para la elaboración

de esta investigación.

A todas las personas que me brindaron su apoyo en las diferentes etapas de la

carrera y a todas aquellas personas que directa o indirectamente brindaron su

ayuda para la culminación de este trabajo.

DEDICATORIA

Con todo cariño a mi mami Amparo Figueroa por apoyarme en cada uno de los

pasos que he dado en la vida para lograr cada una de mis metas.

A mi papi Alfredo Cárdenas quien anhelaba estar junto a mi en este momento de

mi vida.

i

TABLA DE CONTENIDO

Pág

GLOSARIO

RESUMEN

ABSTRACT

INTRODUCCIÓN 1

1. REVISIÓN LITERARIA 3

1.1. HISTORIA 3

1.1.1. Uso del cobayo (Cavia porcellus) en el laboratorio 5

1.1.2. Sangre 7

1.1.2.1. Morfología e índices de las células sanguíneas periféricas 7

1.1.2.1.1 Eritrocitos 7

1.1.2.1.2. Trombocitos 9

1.1.2.1.3. Leucocitos 9

1.2. ETIOLOGÍA 11

1.2.1. Tamaño y estructura 11

1.2.2. Estabilidad a la temperatura y pH 11

1.2.3. Relación con el oxígeno 12

1.2.4. Caracterización del Clostridium 12

1.2.5. Toxinas 13

1.2.5.1. Exotoxinas 14

1.3. EPIDEMIOLOGÍA 16

1.4. RESERVORIO 18

1.5. PATOGENIA 19

1.6. SIGNOS CLÍNICOS 21

1.7. LESIONES 22

ii

Pág

1.8. NECROPSIA 23

1.9. DIAGNÓSTICO 24

1.10. TRATAMIENTO 26

1.11. PREVENCIÓN Y CONTROL 26

1.11.1 Estudios realizados con la producción de vacunas 27

2. MATERIALES Y MÉTODOS 29

2.1. POBLACIÓN 29

2.2. DISEÑO EXPERIMENTAL 30

2.3. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 31

2.3.1. Muestras de sangre 31

2.3.1.1. Examen cuantitativo 33

2.3.1.1.1. Recuento de eritrocitos 33

2.3.1.1.2. Índices eritrocitarios 34

2.3.1.1.3. Volumen corpuscular media (VCM) 34

2.3.1.1.4. Hemoglobina corpuscular media (HCM) 34

2.3.1.1.5. Concentración corpuscular media de hemoglobina (CCMH) 34

2.3.1.1.6. Recuento diferencial de leucocitos 35

2.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 35

2.5. EXAMEN MACROSCÓPICO 36

2.6. Inclusión de parafina, coloración hematoxilina y eosina 37

2.7. EXAMEN MICROSCÓPICO 38

2.8. DESECHO DE MATERIAL 38

3. RESULTADOS Y CONCLUSIONES 40

3.1. Muestra de sangre 40

3.1.1. Hematocrito 40

3.1.2. Hemoglobina 42

3.1.3. Hemoglobina corpuscular media 43

3.1.4. Concentración media de hemoglobina 44

iii

Pág

3.1.5. Eritrocitos 45

3.1.6. Proteína plasmática 46

3.1.7. Proteína Sérica 47

3.1.8. Creatinin kinasa 48

3.1.9. Leucocitos 49

3.1.10. Neutrófilos 50

3.1.11. Linfocitos 52

3.1.12. Eosinófilos 54

3.1.13. Monocitos 56

3.1.14. Células Foa – Kurloff 58

3.2. TEMPERATURA 59

3.3. OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE LESIONES 60

3.4. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LESIONES 62

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 68

5. BIBLIOGRAFÍA 71

6. ANEXOS 80

iv

INDICE DE TABLAS

Pág

Tabla 1. Parámetros hematológicos de cobayos (Cavia porcellus). 8

Tabla 2. Muestras tomadas en necropsia de los cobayos (Cavia porcellus).

31

Tabla 3. Escala subjetiva del grado de lesión producida por Clostridium chauvoei en cobayos (Cavia porcellus) inoculados experimentalmente.

39

Tabla 4. Resultados de Hematología, promedio de datos grupos A, B, C, D, E, F y G, de cobayos (Cavia porcellus).

41

Tabla 5. Resultados estadísticos de la calificación de lesiones histopatológicas en tejidos de cobayos (Cavia porcellus) inoculados con cepa patógena de Clostridium chauvoei.

64

v

INDICEDE FIGURAS

Pág

Figura 1. Enrejado del hematocitómetro.

33

Figura 2. Clostridiosis. Lesiones en cavidad toráxica y peritoneal de cobayos (Cavia porcellus).

61

Figura 3. Clostridiosis. 18 horas post inoculación.

61

Figura 4. Clostridiosis. Bacilos de Clostridium chauvoei en músculo estriado esquelético de cobayo (Cavia porcellus).

65

Figura 5. Clostridiosis. Músculo estriado esquelético de cobayo (Cavia porcellus). Infiltración polimorfonucleares y necrosis de coagulación.

65

Figura 6. Clostridiosis. A) Presencia de bacilos de Clostridium chauvoei, leucocitos polimorfonucleares y neutrófilos en músculo estriado esquelético. B) Corte longitudinal de músculo estriado esquelético animal testigo, el cual no presenta cambios patológicos aparentes.

66

vi

INDICE DE GRÁFICAS

Pág

Gráfica 1. Valor promedio del hematocrito por horas post

inoculación.

40

Gráfica 2. Valor promedio de la hemoglobina por horas post inoculación.

42

Gráfica 3. Valor promedio de la hemoglobina corpuscular media por horas post inoculación.

43

Gráfica 4. Valor promedio la concentración media de hemoglobina por horas post inoculación.

44

Gráfica 5. Valor promedio de eritrocitos por horas post inoculación.

45

Gráfica 6. Valor promedio de proteína plasmática por horas post inoculación.

46

Gráfica 7. Valor promedio de proteína sérica por horas post inoculación.

47

Gráfica 8. Valor promedio de creatinin kinasa por horas post inoculación.

48

Gráfica 9. Valor promedio de leucocitos por horas post inoculación.

49

Gráfica 10. Valor promedio de neutrófilos (valor absoluto) por horas post inoculación.

50

Gráfica 11. Valor promedio de neutrófilos (valor relativo) por horas post inoculación.

51

Gráfica 12. Valor promedio de linfocitos (valor absoluto) por horas post inoculación.

52

Gráfica 13. Valor promedio de linfocitos (valor relativo) por horas post inoculación.

53

Gráfica 14. Valor promedio de eosinófilos (valor absoluto) por horas post inoculación.

54

vii

Pág Gráfica 15. Valor promedio de eosinófilos (valor relativo) por horas

post inoculación.

55

Gráfica 16. Valor promedio de monocitos (valor absoluto) por horas post inoculación.

56

Gráfica 17. Valor promedio de monocitos (valor relativo) por horas post inoculación.

57

Gráfica 18. Valor promedio de células Foa – Kurloff (valor absoluto) por horas post inoculación.

58

Gráfica 19. Valor promedio de temperatura por horas post inoculación.

59

viii

INDICE DE ANEXOS

Pág

Anexo 1. Resultados de Hematología, grupo A (3 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).

80

Anexo 2. Resultados de Hematología, grupo B (6 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).

81

Anexo 3. Resultados de Hematología, grupo C (9 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).

82

Anexo 4. Resultados de Hematología, grupo D (12 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).

83

Anexo 5. Resultados de Hematología, grupo E (15 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).

84

Anexo 6. Resultados de Hematología, grupo F (18 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).

85

Anexo 7. Resultados de Hematología, grupo G (Control), cobayos (Cavia porcellus).

86

Anexo 8. Resultados estadísticos de la Temperatura de los cobayos (Cavia porcellus), inoculados con la cepa patógena de Clostridium chauvoei.

87

Anexo 9. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

88

Anexo 10. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

89

ix

Pág

Anexo 11. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

90

Anexo 12. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

91

Anexo 13. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

92

Anexo 14. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

93

Anexo 15. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

94

Anexo 16. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

95

Anexo 17. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

96

Anexo 18. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

97

Anexo 19. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

98

Anexo 20. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

99

Anexo 21. Resultados estadísticos de la calificación de lesiones histopatológicas en tejido de Cavia porcellus inoculados con la cepa patógena de Clostridium chauvoei

100

x

GLOSARIO

AGENTE INFECCIOSO: Organismo capaz de producir una infección o

enfermedad infecciosa.

ANTICUERPOS: Compuesto proteico producido en el organismo, que

pertenece al grupo de las globulinas, se origina por exposición a un antígeno

que se ha introducido en el organismo y que es extraño a él.

BACTERIA: Microorganismo del grupo de los protistas inferiores caracterizado

por presentar organización celular procariótica. Pueden ser inmóviles ó móviles

para lo cual necesitan flagelos.

EDEMA: Aumento anormal de la cantidad de líquido intersticial situado en el

interior de los tejidos y en la acumulación de líquido trasudado en las diversas

cavidades serosas del organismo.

ENZOÓTICO: Peculiar de una localización, o presente constantemente en ella. EPIZOÓTICO: Que ataca a muchos animales en cualquier región al tiempo; de

amplia difusión y rápida extensión. INFECCIÓN: Penetración y desarrollo en un ser vivo de microbios patógenos,

que invaden al organismo por vía sanguínea vertiendo sus toxinas y causando

enfermedad.

INOCULACIÓN: Introducción de microorganismos patógenos, material

infectado, suero u otras sustancias en tejidos de organismos vivos o en medios

xi

de cultivo, introducción de un productor de enfermedad en un animal sano,

para producir una forma suave de la enfermedad, seguida por inmunidad.

TOXINA: Sustancias venenosas de tipo diverso que tienen un efecto activo

sobre el organismo animal y que en cantidades moderadas pueden provocar

su muerte o la presentación de cuadros patológicos mas o menos graves.

TOXOIDE: Toxina que ha perdido sus propiedades deletéreas por un

tratamiento con calor o con un agente químico pero que conserva su

capacidad para estimular la formación de anticuerpos (antitoxinas) y para

unirse a ellos.

xii

RESUMEN

El Clostridium chauvoei causa Pierna Negra ó carbón sintomático, una enfermedad

fatal en bovinos y ovinos. Se presenta en forma esporádica en áreas donde el

microorganismo esta presente en el suelo. Los animales presentan toxemia,

tumefacciones crepitantes en la musculatura y muerte. Los síntomas son confundidos

con edema maligno causado por Clostridium chauvoei, Clostridium septicum,

Clostridium novyi o Clostridium perfringes. Este estudio describe hallazgos

histopatológicos en tejidos de cobayos (Cavia porcellus) inoculados con Clostridium

chauvoei. Los cobayos fueron inoculados vía intramuscular con 0.5 mililitros de una

solución de cloruro de calcio (CaCl2) al 5% conteniendo 100 dosis infectantes de

Clostridium chauvoei; y se sacrificaron cada tres horas. Los tejidos fijados en

formaldehído se procesaron por la técnica de inclusión en parafina, coloreados con

Hematoxilina y Eosina. Los cambios severos se observaron en animales de 18 horas

post inoculación, las lesiones fueron tumefacciones crepitantes en musculatura

estriada esquelética, tejidos color rojo, marrón oscuro, con estrías negras; algunas

áreas aparecieron húmedas, desprendieron exudado oscuro mezclado con gases. Se

encontró marcada infiltración de neutrófilos polimorfonucleares y se observó necrosis

de coagulación. La muerte de los cobayos comienza a presentarse entre las 15 y 18

horas post inoculación. La técnica de inclusión en parafina, coloreado con

Hematoxilina y Eosina permite ver el agente causal y relacionarlo con lesiones

anatomopatológicas, su uso permite un diagnóstico económico para ésta

enfermedad.

Palabras clave: Clostridium chauvoei; Pierna Negra; Carbón sintomático;

Histopatología.

xiii

ABSTRACT

Clostridium chauvoei causes Blackleg, a fatal disease of bovine and ovine species. It

appears in a sporadic form in areas where the microorganism is present in the soil.

The animals present toxemia, crepitant swellings in the muscle and died. The

symptoms are confused with malignant edema caused by Clostridium chauvoei,

Clostridium septicum, Clostridium novyi o Clostridium perfringes. The present study

describes histopathologic findings in Guinea pigs (Cavia porcellus) tissues inoculated

with the bacterium Clostridium chauvoei. The Guinea pigs were inoculated

intramuscular with 0.05 millilitres of solution of calcium Chloride (CaCl2) to 5% content

100 infecting doses of Clostridium chauvoei followed by sacrifice every three hours.

The tissues were fixed in formaldehyde and processed by the paraffin inclusion

technique, colored with Eosin and Hematoxylyn. Severe changes were observed in

animals after 18 hours post inoculation, the lesions were crepitant swellings in skeletal

muscle, coloured spotted tissues from dark red to brown along with black grooves; a

dark exudation mixed with gas was also released in some areas. Neutrophilic

infiltration was marked. And coagulation necrosis was observed. The death of the

Guinea pigs begins to appear between the 15 and 18 hours post inoculation. The

paraffin inclusion technique, colored with Eosin and Hematoxylyn allows to see the

causal agent and to relate it to anatomopathologycs, injuries, its use allows an

economic diagnostic for this one disease.

Keys words: Clostridium chauvoei, black leg, gas gangrene, histopathology.

1

INTRODUCCIÓN

Esta investigación se realizó con el fin de describir los cambios secuénciales

hematológicos, anatomopatológicos e histopatológicos producidos por la

inoculación experimental en cobayos (Cavia porcellus) por la cepa de

Clostridium chauvoei (ATCC), para determinar que tipo de tejido es el más

afectado y relacionar dichos hallazgos con los valores hematológicos

correspondientes, para clasificar que tipos de tejidos se podrían utilizar en otras

técnicas diagnósticas.

En 1865 Feser observó el germen por primera vez en el tejido conjuntivo

subcutáneo de un bóvido enfermo. Lo describió con el nombre Bacillus

sarcophysematos. El carbunco sintomático fue separado por vez primera

etiológicamente por Bollinger (1875) y Feser (1876) del carbunco bacteridiano,

constituyendo una enfermedad independiente. Arloing y col. aclararon la

etiología de manera incontrovertible en los años 1879 – 1884, desarrollando ya

un procedimiento de vacunación preventiva. Roux (1887) cultivó el bacilo sobre

medios nutricios artificiales. Entre el gran número de científicos que estudiaron

el germen y la enfermedad hay que mencionar en especial a Foth, Kitasato, Kilt

y Zeissler1.

El Clostridium chauvoei es una bacteria anaerobia esporulada, que produce

una enfermedad fatal en rumiantes y es conocida como carbunco sintomático o

1 BEER, Joachim. 1981. Enfermedades infecciosas de los animales domésticos. Tomo II. Enfermedades producidas por bacterias y hongos e intoxicaciones. p. 194.

2

“pierna negra2”; es de distribución mundial, ataca con preferencia a bóvidos

jóvenes menores de 3 años y bien alimentados3.

Se considera que esta enfermedad genera un desequilibrio económico al

ganadero y por consiguiente al país4, debido al costo de los tratamientos que

se deben instaurar para su control y finalmente con la pérdida de los animales5,

por esta razón lo que se desea es que el ganadero y las personas que estén

directamente relacionadas con bovinos, ovinos y cerdos conozcan los

síntomas, los cambios macroscópicos y microscópicos que presentan los

animales afectados con esta patología.

2 CHANDLER, H.M. HAMILTON, R.C. 1975. Protective antigenicity of protoplasts and sphaeroplasts of a highly protective strain of Clostridium chauvoei. Journal of General Microbiology. p. 179. 3 BIBERSTEIN, E. 1994. Tratado de microbiología veterinaria. p. 345. 4 CARABALLO, Luis Carlos. 1973. Identificación y clasificación de cepas de Clostridium. p. 46. 5 PORTILLA, Guillermo; FRANCO, Orlando. Carbón sintomático ¡una enfermedad que mata!. ICA Instituto Colombiano Agropecuario. p. 2.

3

1. MARCO TEÓRICO

1.1. HISTORIA

El Clostridium comienza a estudiarse cuando Koch, le demuestra a los amigos

de Davaine, los errores en las experiencias de Jaillard y Leplat, quienes en

realidad habrían inoculado conejos "con otro virus", arremete contra Signol,

asfixiando caballos sanos y recuperando de sus cadáveres ese "otro virus",

largo, translúcido, flexuoso y móvil, era un "vibrión séptico", probablemente el

Clostridium septicum o el Clostridium chauvoei6.

Feser observó en 1865 el germen por primera vez en el tejido conjuntivo

subcutáneo de un bóvido enfermo. Lo describió con el nombre Bacillus

sarcophysematos7. El carbunco sintomático fue diferenciado del bacteridiano

por Charbert a base de síntomas y lesiones. Bollinger (1875), fue el primero en

demostrar que el carbunco bacteridiano y el sintomático tenían agentes

etiológicos distintos. Está conclusión fue confirmada por Feser en 1876.

Arloing, Cornevin y Thomas, en 1887, realizaron aportaciones interesantes

sobre el carbunco sintomático, lo que explica que con frecuencia hayan sido

considerados como los descubridores del germen. Aunque han contribuido

considerablemente al conocimiento de la enfermedad, su causa e inmunidad, el

primero en cultivar el germen en medios artificiales fue Roux, en 1887. Kitasato

aportó nuevos perfeccionamientos a la técnica del cultivo de Clostridium

chauvoei en 18898.

6 BULLOCH, W. 1930. Bacillus anthracis. I: 6 7 BEER, Joachim. Op. cit., p. 194. 8 MERCHANT, I; PACKER, R. 1980. Bacteriología y virología veterinaria. p. 411.

4

A partir de 1885, empiezan las clases del doctor Claude Vericel. Entre los

alumnos que conformarían la primera promoción de egresados con el título de

Maestro en veterinaria, se cuenta a Federico Lleras Acosta, quien fue su

discípulo preferido y a su lado vio los primeros microbios. Lleras Acosta, se

dedicó a la práctica de laboratorio aplicado a la clínica y fundó el primer

laboratorio de diagnóstico privado en Bogotá9.

En 1905, aparece en el país el carbón sintomático. El doctor Claude Vericel

hace el estudio clínico y anatomopatológico y su discípulo Federico Lleras

Acosta aísla el agente causal y prepara la primera vacuna contra la

enfermedad10.

El diagnóstico bacteriológico de los Clostridium se estableció teniendo en

cuenta: forma de crecimiento y aspecto de las colonias según Zeissler,

reacción bioquímica sobre azúcares, acción proteolítica en la leche, inoculación

en curí y observación de lesiones diferenciales. Las especies caracterizadas

fueron los Clostridium chauvoei, septicum, perfringens, novyi, y

haemolyticum11.

Históricamente, la inoculación en animales de laboratorio se ha empleado

como ayuda diagnóstica en muchas enfermedades causadas por Clostridios.

La tipificación de las toxinas que dichas bacterias producen producto de su

metabolismo se realiza mediante neutralización de los efectos letales de la

toxina en cobayos y ratones utilizando antisueros específicos para cada tipo

de clostridio. Este método no es aceptado ya en muchos países por bioética y

9 GARCÍA, Henry; PARRA, Luis Guillermo. 2002. Medicina veterinaria y zootecnia en Colombia. Trayectoria durante el siglo XX y perspectivas para el siglo XXI. p. 256. 10 En: www.veterinaria.unal.edu.co/historia_mv.html 11GARCÍA, Henry; PARRA, Luis Guillermo. Op. cit., p. 255.

5

no todos los laboratorios de diagnóstico están equipados o preparados para

realizar estas pruebas12.

1.1.1. Uso del cobayo (Cavia porcellus) en el laboratorio Los aspectos más importantes de uso que se le da a este animal en el

laboratorio dada su economía, sensibilidad y fácil manejo son:

En la preparación de sueros hiperinmunes.

En la preparación de reactivos para serología.

En el diagnóstico de enfermedades (infecciones virales, infecciones bacteriales

o por protozoarios).

En el control de calidad de productos biológicos de uso humano y veterinario13.

Kerrin (1934) comprobó que el Clostridium chauvoei en condiciones adecuadas

puede producir toxina que, a dosis de 0.025 – 0.5 ml intravenosa, al ratón le

produce síntomas respiratorios y la muerte en unos minutos. La inyección

subcutánea de la toxina a cobayos y ratones no es mortal, pero produce

edema. Es bastante admisible la producción de exotoxina por este germen,

aunque no sea tan potente como la de otras especies del grupo del edema

gaseoso, como Clostridium septicum, Clostridium perfringens y Clostridium

novyi14.

Ryff y Lee observaron que el hámster es más receptivo al Clostridium chauvoei

que el cobayo y muere con la quinta parte de la dosis mortal precisada por

éste. La inoculación de cultivos puros a los animales de laboratorio produce la

12RASDOSTITS, O; et al. 2002. Medicina Veterinaria, Tratado de las enfermedades del Ganado bovino, ovino, porcino, caprino y equino. Vol I. p. 894. 13 PARRA, Danilo; CORREDOR, Hugo. 1970. Estudio del curí (Cavia cobaya). Contribución al estudio del curí como animal de laboratorio en Colombia. p. 16. 14 MERCHANT, I; PACKER, R. Op cit., p. 412.

6

muerte con muchos de los síntomas característicos del carbunco sintomático.

Los cobayos, conejos, ratones blancos y ratas albinas pueden ser infectados,

siendo el cobayo el animal más susceptible, empleándose corrientemente

como animal de experimentación para este germen15.

Entre otros estudios encontramos las observaciones halladas por Ernesto

Sáenz, en el cual realiza inoculaciones para hallar diagnósticos sospechosos

de carbón sintomático; por ejemplo, un curí recibe 1 centímetro cúbico de

cultivo Tarozzi de 24 horas por vía intramuscular, y muere en 24 horas. Al

realizar la necropsia se observa un extenso edema sero-hemorrágico de pierna

y abdomen. Los órganos internos permanecen normales. Los frotis de la

superficie de hígado muestran un bacilo corto y delgado, gram positivo, sin

esporos. El agente se recupera del hígado y de la sangre del corazón,

reproduciendo en la superficie de agar sangre los mismos caracteres culturales

de los cultivos primitivos.

Después otros dos curies, con inoculaciones de 0.5 cc IM y de 1 centímetro

cúbico (la mitad por vía IM y la mitad por vía intraperitoneal) reaccionan de

idéntica manera al anterior, recobrándose de su sangre cardíaca y del hígado

el mismo bacilo16.

Aparte de la diferenciación del Clostridium septicum con las reacciones de los

azúcares, la inoculación del Clostridium chauvoei en el cobayo no muestra

largos filamentos en la superficie del peritoneo o el hígado, que es una prueba

diagnóstica cuando se inocula con Clostridium septicum17. En la superficie del

hígado de cobayas que murieron tras el contagio con Clostridium chauvoei, el

germen aparece por lo regular aislado y en cadenas cortas18.

15 Ibid., p. 413. 16 SÁENZ, Ernesto. 1944. Consideraciones e identificación de los principales anaerobios del género Clostridium patógenos para los animales domésticos. Tesis, Universidad Nacional de Colombia. p. 66. 17 BAKER, F.J.; BREACH, M.R. 1990. Manual de técnicas de microbiología medica. p. 214. 18 BEER, Joachim. Op. cit., p. 195.

7

Aunque en muchos casos la identificación final de los clostridios patógenos no

recae en la inoculación de animales es, sin embargo, imprescindible para otros

tales como el Clostridium botulinum. Se efectúa la inoculación de los cultivos

líquidos en los cobayos uno de los cuales se ha protegido con la antitoxina

específica. Se aconseja la adición de cloruro cálcico al cultivo antes de la

inyección para que actúe como agente necrosante, de esta manera se facilita la

multiplicación de los gérmenes y la subsiguiente producción de toxina. Método:

inocular por vía IM 0.2 ml de un cultivo en caldo glucosado del día anterior en

los cobayos, uno protegido por antitoxina. La muerte del no protegido tiene

lugar en uno o dos días19.

1.1.2. Sangre 1.1.2.1. Morfología e índices de las células sanguíneas periféricas

Los valores hematológicos de cobayos (Cavia porcellus) reportados, se

encuentran en la tabla 1.

1.1.2.1.1. Eritrocitos

Los eritrocitos del Cavia porcellus, tienen una moderada anisocitosis, con un

diámetro entre los 6.6 – 7.9 µm20, algunos microcitos, cuando están presentes

pueden tener un diámetro de 3.5 µm, los eritrocitos de los cobayos son células

sanguíneas rojas largas, comparadas con otras especies comunes de

laboratorio21, los eritrocitos policromáticos pueden estar alrededor del 25% de

19 BAKER, F.J.; BREACH, M.R. Op. cit., p. 214. 20 SCHERMER, S. 1967. The blood morphology of laboratory animals. p. 23 21 JAIN, N.C. 1986. Schalm´s veterinary hematology. 4 ed. Philadelphia: Lea de Febiger. p. 18.

8

los eritrocitos circulantes en neonatos, 4.5% en los jóvenes, y 1.5% en

adultos22. Los índices eritrocitarios en los cobayos (i.e, número de eritrocitos,

hemoglobina y volumen de células empaquetadas. Tabla 1), son relativamente

mas bajas comparados con valores observados en otras especies de roedores

de laboratorio23.

Tabla 1. Parámetros hematológicos de cobayos (Cavia porcellus)

1 2 3

RBC (x 106/mm3) Rango 4,2 - 7,0 4,5 - 7,0 3,2 - 8,0

PCV (%) Rango 37 - 48 37 - 48 32 - 50

Hb (g/dL) Rango 11 - 15 11 - 15 10 - 17,2

MCV (µ3) Rango - - 71 - 96

MCH (µµg) Rango - - 23 - 27

MCHC (%) Rango - - 26 - 39

WBC (x 103/mm3) Rango 7 - 18 7 - 18 5.5 – 17.5

Neutrófilos (%) Rango 28 - 44 28 - 44 22 – 48

Linfocitos (%) Rango 39 - 72 39 - 72 39 - 72

Eosinófilos (%) Rango 1 - 5 1 - 5 0 – 7

Basofilos (%) Rango 0 - 3 0 - 3 0 – 2.7

Monocitos (%) Rango 3 - 12 3 - 12 1 - 10

1 Harkness, J.E.1995. 2 Johnson – Delaney, C.A. 1996. 3 Hillyer, E.V.1996.

22 ALBRITTON, A.B. 1958. Standard values in blood. p. 30. 23 MANNING, P.J; WAGNER, J.E; HARNESS, J.E. 1984. Biology and diseases of guinea pigs. p. 54

9

1.1.2.1.2. Trombocitos

Las plaquetas de los cobayos tienen una forma ovalada irregular (2 – 3 µm de

longitud), y la periferia del citoplasma es pálida en comparación con la

coloración intensa dentro de la célula Los rangos numéricos observados de

plaquetas circulantes reportadas en algunas referencias: 120 – 132 x103 /mm3

24, 161 – 368 x103 /mm3 25 , 530 +/- 149 x103 /mm3 26, 250 – 850 x103 /mm3 27,

250 – 850 x103 /mm3 28, y 260 – 740 x103 /mm3 29.

1.1.2.1.3. Leucocitos Los neutrófilos de los cobayos tienen aproximadamente de 10 – 12 µm de

diámetro, son picnóticos, tienen un núcleo segmentado (con un numero de 5 ó

mas segmentos), los gránulos eosinofilicos dentro del citoplasma, pareciendo

en algunos casos seudoesinofilia un “Drumstick” lóbulo de cromatina sexual

puede estar presente en el núcleo de los neutrófilos de los cobayos hembras,

los eosinófilos son mas largos que los neutrófilos (alrededor de 10 – 15 µm en

diámetro). Los basófilos son raramente encontrados, son del mismo tamaño de

losa neutrófilos o ser más largos, el núcleo tiene una coloración púrpura, y en el

citoplasma se encuentran gránulos violetas de diferentes tamaños30. Los

linfocitos son los leucocitos predominantes (Tabla 1), y los linfocitos pequeños

están presentes en mayor cantidad, tienen forma alargada, no son más largos

24 SCHERMER, S. Op. cit., p. 24. 25 MITRUKA, B.J; RAWNSLEY, H.M. 1977. Clinical biochemical and haematological reference values in normal experimental animals and normal humans. p. 33. 26 BENIRSCHKE, K; GARNER, F.M; JONES, T.C. 1978. pathology of laboratory animals. New York: Springer – Verlag. Nº 1. p. 45. 27 HARKNESS, J.E; WAGNER, J.E. Op. cit., p. 89 28 JOHNSON – DELANEY C.A. 1996. Exotic companion medicine handbook. Lake Worth, FL: Wingers Publishing. P. 43 29 HILLYER, E.V; QUESENBERRY, K.E; DONNELLY, T.M. 1996. Biology, husbandry, and clinical techniques (of guinea pigs and chinchillas). In: Hillyer E.V., Quesenberry K.E, eds. Ferrets, rabbits, and rodents clinical medicine and surgery. Philadelphia: WB Saunders. p. 58 30 SCHERMER, S. Op. cit., p. 25

10

que los eritrocitos. Los linfocitos pequeños de los cobayos son redondos, de

núcleo picnótico, rodeado por una banda en el citoplasma. Los linfocitos

pueden ser dos veces mas largos con menos picnosis, con un núcleo mas

ovalado y brillante y una zona extensa del citoplasma que en algunos casos

puede contener pequeños y largos gránulos azurofílicos, los monocitos de los

cobayos son usualmente mas largos que los linfocitos, tienen un núcleo

ovalado con una pequeña cantidad de cromatina y tiene un citoplasma azul-

grisáceo.

Ocasionalmente las células Foa-Kurloff (KC cells), las cuales son especificas

de los cobayos, pueden ser observadas en la circulación en una proporción

mayor del 3 – 4% del conteo diferencial de los leucocitos31. No hay una

diferencia significativa en el número de KC en machos y hembras después de

los 2 a 3 meses de edad. Las células KC, son leucocitos especializados y

contienen un cuerpo de inclusión intracitoplasmático formado por un

mucopolisacárido, este tipo de células pueden ser encontradas en sangre

periférica y en la glándula del timo, se encuentran en mayor proporción en

pulmón, bazo y placenta bajo estimulación estrogénica y preñez32. El origen

exacto y función de estas células es desconocida, sin embargo se especula

que pueden tener una función de células asesinas en la circulación general o

como protector de antígenos fetales en la placenta33.

31 JAIN, N.C. 1986. Op. cit., p. 1110. 32 IZARD, J; BARRELLIER, M.T; QUILLEC, M. 1976. The Kurloff cell – its differentiation in the blood and lymphatic system. Cell Tissue Res 173: p 237. 33 MARSHALL, A.H.E; SWETTENHAM, K.V; VERNON – ROBERTS, B; REVELL, P.A. 1971. Studies on the function of de Kurloff cell. Int Arch Allergy Appl Immunol. 40: p. 137.

11

1.2. ETIOLOGÍA

El Clostridium chauvoei es una bacteria anaerobia en forma de bacilo, móvil

gram positivo, agente causal del carbón sintomático34.

1.2.1. Tamaño y estructura

Esta bacteria es encapsulada (cápsula de ácido D poliglutámico), tiene un

diámetro de 1 µm y de 3 a 6 µm de largo, se encuentra en forma de esporas en

el suelo, siendo muy resistente. La presentación de la enfermedad, se produce

por la toxina35.

Necesita medios ricos en cisteina y en vitaminas hidrosolubles. Sus colonias

son redondas con contorno liso y en dos días alcanzan un tamaño de incluso

de 4 m. La hemólisis es variable. A diferencia de Clostridium septicum,

fermenta la sacarosa, pero no la salicina y no crece a 44 ºC36.

1.2.2. Estabilidad a la temperatura y pH

Son microorganismos mesófilos su intervalo de crecimiento esta comprendido

entre 15 y 45ºC, aproximadamente, y su temperatura óptima de crecimiento

entre 25 y 40ºC.

34 KOJIMA, A. et al. 2000. Clonación y expresión de un gen que codifica la flagelina de Clostridium chauvoei. Veterinary Microbiology. 76, p. 359. 35 DI GENARO, M. et al. Clostridium chauvoei: Inmunological characterization of antigenic preparations. Anaerobe. 5, 1999. p. 301. 36 BIBERSTEIN, E. Op. cit., p. 345.

12

El pH del medio afecta al crecimiento microbiano; por tanto, cada organismo

tiene un rango de pH que hace posible su crecimiento. Este intervalo, para la

mayoría de las bacterias, está entre 4 y 9, y el pH óptimo alrededor de 737.

1.2.3. Relación con el oxígeno Los microorganismos varían en cuanto a sus necesidades o tolerancia al

oxígeno libre. Entre los microorganismos que no toleran en absoluto el oxígeno

e incluso mueren en su presencia se encuentra el género Clostridium. La razón

de la anaerobiosis estricta es la carencia, por parte de esos microorganismos,

de enzimas como la superóxido dismutasa y catalasa, que están implicadas en

la destrucción de los radicales tóxicos, derivados de la reducción metabólica

del oxígeno (radicales superóxido, hidrófilo y peróxido de hidrogeno)38.

1.2.4. Caracterización del Clostridium

En 1880, Prazmowski agrupó las bacterias anaerobias capaces de producir

fermentación y esporular en el género Clostridium, Actualmente en el género

Clostridium se agrupan más de 100 especies, de las cuales aproximadamente

20 son patógenas y se asocian a infecciones en el hombre y en los animales.

El resto de las especies son inocuas, y algunas presentan aplicaciones de

interés en la industria.

La clasificación de los microorganismos pertenecientes a este género se ha

establecido, tradicionalmente, de acuerdo con las características morfológicas,

culturales y bioquímicas, asociación a determinadas enfermedades, pato-

genicidad, toxigenicidad y propiedades serológicas. En los últimos tiempos esta

clasificación se basa en las homologías existentes en la secuencia del ADN y

37 VADILLO, S; PINZ, S; MATEOS, S. 2002. Manual de microbiología veterinaria. p. 75. 38 Ibid., p. 76.

13

del ARN ribosómico 16 S. La amplia diversidad en el porcentaje de guanina,

citosina (G+C) de las especies del género Clostridium sugiere que éste podría

dividirse al menos en dos géneros: las especies con un contenido en G+C del

22 al 34 %, en un género, y las especies que tienen de un 40 a un 55 %, en

otro. Recientemente, el género Clostridium ha sido incluido en la sección XX,

del volumen 3 (bacterias grampositivas con bajo contenido en G+C), de la 2ª

edición del Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, dentro de la familia

Clostridiaceae39.

Estas secuencias también pueden servir para:

∗ Averiguar condiciones de cultivos de los organismos,

∗ Síntesis de oligonucleótidos para la identificación de su crecimiento en

lugares donde no están aislados o para monitorizar su distribución en la

naturaleza,

∗ Identificar los orígenes de esos genes,

∗ Comprender la diversidad y la filogenia de manera rápida y fácil.

La mayoría de los Clostridium son saprofitos inocuos, pero algunos tienen

carácter patógeno para el hombre y los animales causando patologías muy

graves40.

1.2.5. Toxinas

Las toxinas son quienes invaden e ingieren el tejido41. El Clostridium chauvoei

produce cuatro toxinas:

39 VADILLO, S; PINZ, S; MATEOS, S. Op. cit., p. 467. 40 JOHNSON, J.L; and FRANCIS, B.S. 1974. Taxonomy of the Clostridia: Ribosomal Ribonucleic Acid Homologies among the Species. Journal of General Microbiology. p. 229. 41 GARCIA, Antonio. 2005. MV. Bogotá D.C. Comunicación personal.

14

• α hemolisina necrotoxina

• β desoxirribonucleasa

• γ hialorunidasa

• δ hemolisina

De estas 4 toxinas la más letal es la α y de ahí radica su poder patógeno. Esta

bacteria resiste a los desinfectantes tipo amonio cuaternario pero no es

resistente a la formalina ni al hipoclorito de sodio, es por eso que la vacuna

para "la pierna negra" se inactiva a base de formol42. El peso molecular de

estas toxinas oscila entre 22 y 600 kDA.

Desde el punto de vista médico es importante la determinación de la capacidad

de producir toxinas de un clostridio aislado de una muestra clínica, así como la

caracterización de las toxinas producidas. Las pruebas clásicas que ponen de

manifiesto e identifican las toxinas son la prueba de letalidad en el ratón y la

neutralización con sueros específicos. Actualmente, se han desarrollado

pruebas inmunoenzimáticas (ELISA, látex, etc.) y genéticas (hibridación

ADN/ADN, amplificación de ADN por PCR) que resultan mas rápidas y eficaces

para la identificación de dichas toxinas43.

1.2.5.1 Exotoxinas

Los clostridios invasores producen durante su multiplicación activa exotoxinas

con propiedades necrosantes (histolíticas), hemolíticas o letales. Además,

enzimas tales como la colagenasa, proteinasa, desoxirribonucleasa y

42 VEGA, Marco. Carbunco sintomático. 2000. En: <http//www.portalveterinaria.com/sections.php?op=viewarticle&artid=8>. 43 JOHNSON, J.L; and FRANCIS, B.S. Op cit., p. 243.

15

hialuronidasa, elaboradas por microorganismos en crecimiento, causan una

acumulación de productos de degradación toxica en los tejidos44.

Las exotoxinas son proteínas que se secretan al medio exterior durante el cre-

cimiento del microorganismo o la lisis de la bacteria. En general, las exotoxinas

son producidas tanto por bacterias grampositivas como gramnegativas. Por su

naturaleza proteica, son muy inmunógenas e inducen la formación de

anticuerpos específicos capaces de neutralizar su efecto. La mayoría de las

exotoxinas son muy sensibles al calor, a las condiciones ácidas y a las enzimas

proteolíticas. En algunas ocasiones, la pérdida de su actividad tóxica por acción

del calor, formol, etc; proporciona una proteína que mantiene intactas las

propiedades antigénicas de la toxina, que se denomina toxoide. Este hecho

permite la utilización del toxoide en la inmunización contra las enfermedades

cuya sintomatología se basa en la acción de la exotoxina45.

La acción producida por las exotoxinas es muy específica a nivel celular,

pudiendo actuar, sin embargo, sobre varios tipos de células (citotoxinas), o

producir un efecto en un determinado sistema, órgano o tipo celular, como, por

ejemplo, el sistema nervioso (neurotoxinas), el tracto gastrointestinal

(enterotoxinas), las células hepáticas (hepatotoxinas), etc. Una clasificación

más completa resulta difícil, ya que dentro de las exotoxinas se agrupan un

conjunto muy heterogéneo de proteínas con diferente actividad biológica en

las células. No obstante, en función de su estructura molecular y su

mecanismo de acción, se distinguen varios tipos distintos de exoproteínas,

entre los que destacan: las toxinas A-B, las toxinas que disgregan la

membrana celular, las neurotoxinas y los superantígenos46.

44 DAVIS, Bernard; DULBECCO, Renato; EISEN, Hermar; GINSBERG, Harold. 1984. Tratado de microbiología. p. 584. 45 VADILLO, S. PINZ, S. MATEOS, S. Op. cit., p. 225. 46 Ibid., p. 225.

16

1.3. EPIDEMIOLOGÍA

El carbón sintomático es casi siempre mortal, con 1 a 3 días de duración,

infeccioso pero no contagioso; de presentación enzoótica o epizoótica47, como

en zonas de inundación48.

Todavía se debate la puerta de entrada por la que penetra la bacteria al

organismo. Se supone, sin embargo, que dicha puerta de entrada se encuentra

en la mucosa del aparato digestivo después de la ingestión de alimento

contaminado a partir de heces infectadas y de cadáveres descompuestos de

animales muertos por la enfermedad. Aparece carbunco sintomático verdadero

cuando las esporas que no se alojan en los tejidos proliferan por mecanismos

que no han sido todavía identificados49

En el campo aparece esta enfermedad con más frecuencia en bóvidos que

crecen con rapidez por estar sometidos a un plan intensivo de nutrición. La

mejoría del estado nutricional de las ovejas al aumentar la ingestión de

proteínas en su alimentación incrementa también su susceptibilidad a esta

enfermedad. En ovejas no se observa restricción en cuanto a edad. Se

sospecha que los esfuerzos, magulladuras o las indigestiones agudas

desencadenan los hechos50.

El Clostridium chauvoei habita en el intestino, en el hígado de perros y bóvidos

aparentemente sanos y en otros tejidos normales de las distintas especies en

el animal adulto, tanto sensibles como resistentes. Se encontró Clostridium

47 BLAHA, Thomas. 1995. Epidemiología especial veterinaria. p. 483. 48 VEGA, Marco. Op. cit. 49 Ibid. 50 JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. 1985. Patología de los animales domésticos. Tomo I. p. 223.

17

chauvoei, en el bazo e hígado del 20% de vacunos normales. No se conocen

las vías de infección; se admite la infección endógena y la infección adquirida a

partir del suelo por ingestión o a través de heridas. El microorganismo del

carbunco sintomático vive en el suelo donde puede permanecer viable durante

muchos años, siendo este el reservorio del agente causal, pero no se sabe si

allí se multiplica o sólo vive en la forma esporulada y se multiplica en el tubo

intestinal de los animales51

La eliminación de la bacteria es constante por la vía digestiva de animales

infectados, que por ser un anaerobio estricto esporula para mantenerse vigente

en el medio ambiente, es una infección transmitida por el suelo, pudiendo

infectar el agua de los bebederos y los pastos52. La multiplicación de las

bacterias y la producción de toxinas, provocan la formación de lesiones que se

caracterizan por edema, hemorragia, y necrosis de las miofibrillas musculares.

También puede llegar a la sangre a través de algunas heridas en la mucosa de

los animales y de allí diseminarse por vía hematógena a distintos tejidos del

cuerpo, y causar la muerte rápidamente53.

El carbunco sintomático de los bóvidos tiene incidencia estacional y se registra

el mayor número de casos durante los meses cálidos del año54.

En ovejas, la enfermedad depende casi siempre de la infección de una herida.

En efecto, la infección de las heridas cutáneas durante el esquileo, castración o

amputación del rabo o del ombligo al nacimiento puede propiciar la aparición de

lesiones locales. A veces, es causa de brotes graves, la infección de la vulva y

de la vagina en la oveja durante el parto; la enfermedad puede aparecer en

51 VEGA, Marco. Op.cit. 52 WALTER, Wiliam; McBEE, Richard; TEMPLE, Kenneth. 1980. Introducción a la microbiología. p. 323. 53 VEGA, Marco. Op. cit. 54 JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. Op.cit., p. 223.

18

grupos de corderos y carneros jóvenes hasta de un año de edad, casi siempre

como consecuencia de infección de las heridas cutáneas que se producen

entre ellos al pelear55.

1.4. RESERVORIO Los clostridios patógenos habitualmente están presentes en suelos ricos en

humus y pueden multiplicarse en el suelo en épocas cálidas, después de

períodos de lluvias intensas56. Las esporas pueden vivir en el suelo por mucho

tiempo y se han visto rebrotes de la enfermedad en terrenos donde la tierra fue

removida recientemente57.

También se localizan en el contenido intestinal de animales sanos y solo

causan enfermedad en circunstancias especiales. El carácter ubicuo de estos

microorganismos hace que la erradicación de las enfermedades por clostridios

sea prácticamente imposible y necesite un control mediante medidas

profilácticas58; en el perro se puede ver Clostridium chauvoei en el hígado,

músculos e intestinos de este animal sin causar alteraciones aparentes.

Se han visto casos de Clostridium chauvoei en combinación Clostridium

septicum o Clostridium novyi, pero para que clasifique como pierna negra

propiamente dicha debe estar presente únicamente el Clostridium chauvoei;

sino clasifica como un caso de edema maligno59.

55 OCÁDIZ, J. 1990. Epidemiología en animales domésticos. Control de enfermedades. p. 107. 56 DAVIES, R; WRAY, C. 1996. Clostridium chauvoei. Journal Veterinary Medicine. 43, p. 119. 57 VEGA, Marco. Op. cit. 58 DAVIES, R; WRAY, C. Op.cit., p. 119. 59 VEGA, Marco. Op. cit.

19

1.5. PATOGENIA

Entre los estudios de laboratorio realizados por Antonio García en el

Zooprofiláctico de la ciudad de Bogotá y en el Colegio Mayor de Cundinamarca,

encontramos que utilizaba cobayos (Cavia porcellus) a los cuales inoculaba

con cepas de Clostridium chauvoei para observar los cambios que producía la

bacteria en los diferentes órganos del animal. La dosis del inóculo variaba entre

medio centímetro y un centímetro, debido a la virulencia de la cepa, en estos

estudios no se utilizaba ninguna clase de potencializador. En el proceso se les

tomaba la temperatura, frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria y pulso. Los

cobayos morían entre las 10 a las 18 horas post-inoculación, esto dependía de

la susceptibilidad y edad del animal, como también de la virulencia de la cepa

que se utilizaba60.

Esta enfermedad ataca a los rumiantes, aunque se ha reportado casos en

cerdos61. En los vacunos, la bacteria puede ser endógena y provocar la

enfermedad de esta manera, pero en los ovinos la infección siempre es

exógena y la espora es llevada al organismo por inyección o infección de una

herida previa. La eliminación de la bacteria es constante por la vía digestiva de

animales infectados y esta al salir, por ser un anaerobio estricto esporula para

mantenerse vigente en el medio ambiente, se queda en la tierra y el suelo

pudiendo infectar el agua de los bebederos y los pastos62.

También puede llegar a la sangre a través de algunas heridas predispuestas en

la mucosa de los animales por ejemplo en la época de la dentición de los

60 GARCÍA, Antonio. 2005. MV. Bogotá D.C. Comunicación personal. 61 OCÁDIZ, J. Op. cit., p. 107. 62 JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. Op. cit., p. 221.

20

terneros y de allí diseminarse por vía hematógena a distintos tejidos del

cuerpo63.

Para que se produzca la enfermedad tiene que existir un ambiente propicio

para el desarrollo de la bacteria en el organismo, este ambiente propicio que

desencadena la enfermedad se da por magulladura del músculo, ejercicio

excesivo, indigestión aguda o cualquier proceso que desvitalice al tejido. La

bacteria necesita de un medio rico en glucógeno como fuente de su energía,

esto con una previa glucólisis anaeróbica producida en el músculo. Esto

además tiene que estar acompañado de anaerobiosis y pH alcalino; este

ambiente perfecto para el desarrollo de la bacteria determina primariamente la

forma vegetativa de este germen donde por actuación de toxinas que ya se

están produciendo, propician el desarrollo de la enfermedad y sus

consecuencias64.

Una vez que el ambiente es adecuado para el desarrollo de la bacteria, se

comienzan a producir toxinas y enzimas, cada una con un fin específico, por

ejemplo la β (beta) que atacan exclusivamente al ADN celular y, las γ (gamma)

que se encargan de separar el intersticio celular. Estas toxinas provocan una

reacción tisular y se desencadena una inflamación del músculo comprometido,

hemorragia y edemas gaseosos que es útil para hacer el diagnóstico de esta

enfermedad, el área es crepitante, y finalmente ocasiona necrosis del músculo

comprometido, además de presentar fiebre entre 40ºC por que las toxinas

liberadas por las bacterias son inductoras de liberación de linfoquinas que

elevan la temperatura65.

63 Ibid., p. 222. 64 Ibid., p. 223. 65 VEGA, Marco. Op. cit.

21

Finalmente hay una bacteriemia que se da únicamente en la fase final de la

enfermedad y que conlleva a la muerte del animal por intoxicación sistémica.

La muerte se da 1 a 3 días desde que aparecen los signos clínicos.

En ovinos, la espora ingresa conjuntamente con otros Clostridium en heridas

abiertas, esto lleva a una necrosis del tejido afectado produciendo el cuadro de

gangrena enfisematosa66.

En un estudio realizado se encontraron los valores de las concentraciones de

enzimas plasmáticas (Aldosa, deshidrogenasa láctica (LHD), glutamil

oxalacético transaminasa (GOT), glutamil piruvato transaminasa (GPT))

asociadas con el músculo esquelético incrementadas en el ganado infectado de

Clostridium chauvoei y la concentración de enzimas (LDH y GOT) asociadas al

daño cardiáco también aumentadas. Los valores del potasio del ganado que

murió aumentó, pero el valor de sodio fue normal. Los datos indicaron que el

volumen sanguíneo disminuyó en los animales que murieron. En resumen hubo

cambios en enzimas plasmáticas, valores químicos de sangre y valores

hematológicos67.

1.6. SIGNOS CLÍNICOS

Normalmente la afección comienza súbitamente pudiendo encontrarse algunos

animales muertos sin haberse observado signos clínicos, como cuando las

lesiones ocurren solamente en el miocardio y el diafragma.

66 Ibid. 67 PEMBERTON, J. et al. 1974. Changes in clinical values of cattle infected with Clostridium chauvoei: Clinical relationships during infection. Am. J. Vet. Res, Vol 35, Nº 98. p. 1043.

22

Es común la cojera aguda y la depresión notable, inicialmente hay fiebre (hasta

42ºC) pero cuando los signos clínicos se hacen obvios, la temperatura puede

ser normal o subnormal68.

Aparecen tumefacciones edematosas y crepitantes características en la cadera

hombro, pecho, lomo, cuello o en otros sitios muy musculares del cuerpo.

Inicialmente, la tumefacción es pequeña, caliente y dolorosa. Conforme la

enfermedad progresa rápidamente, la tumefacción crece, hay crepitación a la

palpación y la piel está seca, agrietada, fría e insensible a medida que el

abastecimiento sanguíneo local disminuye. Los signos generales incluyen

postración y temblores. La muerte ocurre en 12 a 48 horas si el animal no ha

sido tratado; llama la atención el olor a ácido butírico69.

En los bóvidos se presenta éxtasis del rumen y de 100 - 120 pulsaciones

minuto. En las ovejas hay una marcha rígida (pierna). No es frecuente el

edema subcutáneo; la lesión es local, donde la infección penetró70.

1.7. LESIONES

Las lesiones se caracterizan por edema, hemorragia y necrosis de las

miofibrillas musculares. La parte central de las lesiones se seca, se oscurece y

se convierte en enfisematosa como consecuencia de la fermentación

bacteriana, mientras que su periferia es edematosa y hemorrágica. Los

animales afectados presentan inflamaciones crepitantes en la musculatura,

68 RASDOSTITS, O. et al. Op. cit., p. 902. 69 Ibid., p. 903. 70 Ibid., p. 903.

23

particularmente en las extremidades, con una extensión rígida característica de

los miembros71.

Dependiendo del momento de la muerte del animal y de la temperatura

ambiental, las tumefacciones pueden estar muy distendidas y con gas. Los

músculos afectados aparecen de marrón o rojo obscuro, con rayas negras. Con

frecuencia se encuentran lesiones similares en el corazón y ocasionalmente en

la lengua. Los tejidos subcutáneos de la zona infectada presentan un exudado

teñido de sangre que contiene grandes depósitos de burbujas de gas72.

1.8. NECROPSIA Al realizar las necropsias de los cobayos (Cavia porcellus) inoculados con cepa

de Clostridium chauvoei por García, presentaban exudado desde el miembro

posterior hasta la zona pectoral, inflamación desde el muslo hasta la parte

anterior del cuerpo (axila), se observaba una sustancia gelatinosa y solo se

hallaba necrosis en el sitio vecino a la inoculación73.

En el cadáver de un bovino se encuentra al animal con el miembro afectado

extendido y rígido, se produce putrefacción y meteorismo post mortem

rápidamente y se puede ver un exudado espumoso que sale del ano y la nariz,

los músculos afectados se ven edematosos y con el centro ennegrecido por la

destrucción, degeneración y necrosis del tejido. En las cavidades se encuentra

siempre abundante líquido que coagula con facilidad por la gran presencia de

fibrina, además se nota un olor rancio como de ácido butírico y se puede notar

la producción de gas en el hígado. Cuando un feto es afectado se puede notar

71 GÁZQUEZ, Antonio. 1991. Patología veterinaria. p. 358. 72 Ibid., p. 359. 73 GARCIA, Antonio. 2005. MV. Bogotá D.C.

24

la distensión del abdomen de la madre posiblemente por la edematización del

feto, el feto puede o no presentar las lesiones típicas de la infección74

Microscópicamente, se encuentran cambios degenerativos en las fibras

musculares se observan rotas por el edema, enfisema y hemorragia. La

infiltración de leucocitos es poco importante75.

1.9. DIAGNÓSTICO

En casos típicos puede formularse un diagnóstico basándose en los signos

clínicos y en los hallazgos de necropsia. Es dudoso por no encontrarse

lesiones típicas en ocasiones76.

En los frotis de tejidos infectados se pueden descubrir bacilos grampositivos,

esporulados e identificarlos con reactivos inmunofluorescentes (wellcome)77.

Cuando se sospecha de muerte por Clostridiosis, se debe confirmar el

diagnóstico por medio de muestras de los tejidos mas afectados para

histopatología, esto debe hacerse en la mayor brevedad, para así evitar una

contaminación con otras bacterias que normalmente están presentes en el

animal78.

74 RASDOSTITS, O. et al. Op. cit., p. 906. 75 BIBERSTEIN, E. Op. cit., p. 345. 76 OCÁDIZ, J. Op. cit., p. 108. 77 BIBERSTEIN, E. Op. cit., p. 346. 78 JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. Op. cit., p. 223.

25

Diagnóstico diferencial: por electrocución por rayo (causa dolor), carbunco

bacteriano (diferencia la lesión esplénica), saturnismo agudo y tetania de la

lactación, este último produce muerte súbita79.

Entre los diferentes trabajos realizados con la bacteria Clostridium chauvoei

encontramos un estudio donde se examinaron 238 muestras de material

patológico de Clostridium, procedente de animales de diferentes especies y por

cada caso se procede a la clasificación del clostridio responsable, por medio

del estudio de sus caracteres morfológicos, culturales, bioquímicos y

biológicos. El Clostridium chauvoei es el tercero mas frecuente después del

Clostridium perfringes y el Clostridium septicum, se encontraron únicamente en

los bóvidos, mostrando su máxima incidencia en los terneros, este clostridio fue

encontrado únicamente en músculo y médula ósea80.

La Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) detectó específicamente

secuencias de DNA de Clostridium chauvoei en muestras de músculo y

exudado obtenidos de ratones luego de 12 horas post-inoculación. En pruebas

usando muestras de músculo e hígado, el límite de detección fue cerca de 200

organismos por reacción. Estos resultados sugieren que el sistema de un paso

de PCR puede ser útil para la detección e identificación directa de Clostridium

chauvoei en especímenes clínicos81.

79 VEGA, Marco. Op. cit. 80 SÁENZ, Ernesto. Op. cit., p. 2. 81 KOJIMA, A. et al. 2001. Op. cit., 78. p. 363.

26

1.10. TRATAMIENTO

La administración de penicilina a los animales afectados se considera la

terapéutica lógica, si el animal no está moribundo, pero los resultados suelen

ser mediocres dada la gran extensión de las lesiones. Deben administrarse

grandes dosis (10.000 unidades/kg de peso corporal), comenzando con

penicilina cristalina por vía intravenosa para administrar después preparados

de acción prolongada, algunos de los cuales se administrarán en los mismos

tejidos afectados, si estos son accesibles. Es probable que el antisuero del

carbunco sintomático no posea gran valor, a menos que se administren dosis

masivas82.

Otras medidas son separar los animales enfermos y movilizar el resto del lote

fuera de los potreros contaminados; enterrar los cadáveres83.

1.11. PREVENCIÓN Y CONTROL

En zonas donde la enfermedad es endémica, debe hacerse vacunaciones

anuales84. Los bóvidos se vacunan de 3 a 6 meses de edad y después cada

año. La vacunación se debe realizar por lo menos dos semanas antes de que

tenga lugar la exposición. Durante un brote de enfermedad, se vacuna a todos

lo bóvidos y se les administra penicilina de acción retardada. Cuando se

presenta la infección, las ovejas preñadas se vacunan tres semanas antes del

parto. Es posible que los corderos tengan que ser vacunados durante su

82 VEGA, Marco. Op. cit. 83 QUIROS, Joaquín; LÓPEZ, Gustavo. 1991. Curso sobre sanidad animal. p. 127. 84 URBINA, Mairo; RODRIGUEZ, Germán. 1978. sistema de vigilancia epidemiológica de enfermedades transmisibles. ICA. p. 53.

27

primer año de vida. Cuando se observan animales enfermos, es aconsejable

cambiarles de pastos85.

1.11.1. Estudios realizados con la producción de vacunas

El flagelo de Clostridium chauvoei presenta un antígeno protectivo86, este

antígeno protector es termolábil, el cual estimula la protección de no

aglutinación de anticuerpos87. Se ha demostrado previamente que la proteína

del flagelo de Clostridium chauvoei es importante para el desarrollo de

inmunidad protectiva en ratón: flagelos purificados provocan un efecto

protectivo, mientras mutantes de la bacteria sin flagelo causan una inmunidad

100 veces menor que la de una cepa madre que sí posee flagelo88.

Una variedad de exámenes de laboratorio diagnóstico y pruebas realizados con

especimenes de ganado vacunado con bacterinas de Clostridium chauvoei y

expuestos luego a inóculos del mismo, muestran que si hubo cambios, Barnes

1974, reporta que hubo algunos pequeños cambios en los valores clínicos, una

parte de la investigación fue experimental y se realizó para evaluar la

inmunidad eficaz en un experimento severo que contuviera la bacteria de

Clostridium chauvoei. El ganado se vacunó con seis diferentes potencias que

fueron determinadas con cobayos. A este ganado se le consideró que tenía

una resistencia variable a la infección con el Clostridium chauvoei, y que

presentaba una respuesta similar a la expuesta por los cobayos. Como mayor

logro se podría decir que la prueba clínica fue determinada cuando el ganado

85 BIBERSTEIN, E. op. cit., p. 347. 86 TAMURA, Y; MINAMOTO, N; TANAKA, S. 1984. Demonstration of protective antigen carried by flagella of Clostridium chauvoei. p. 1325. 87 CHANDLER, H.M. HAMILTON, R.C. 1975. The preparation of inmunogenic cell walls from a highly protective strain of Clostridium chauvoei. Journal of General Microbiology 88. p. 27 88 KOJIMA, A. et al. 2000. Op. cit., 76, p. 359.

28

reacciono a los cambios expuestos y esto se define como interrelaciones y

cambios de varios valores clínicos durante la infección89.

Los anticuerpos monoclonales fueron obtenidos del flagelo del Clostridium

chauvoei por la fusión de células mieloma de roedores y de las células del bazo

de ratones inmunizados con un flagelo purificado parcial que fueron estudiados

y analizados, mostraron que el flagelo de Clostridium chauvoei tiene tres

epitopes. Los tres anticuerpos monoclonales flagelares (1 inmunoglobulina G y

2 M) demostraron los efectos pasivos protectores en ratones. Estos resultados

sugieren que el flagelo de Clostridium chauvoei es importante para la

inmunidad protectora en ratones90.

Se observó una clara relación entre la disminución de inmunogenicidad y la

pérdida total de la capacidad protectora de células en la fase estacionaria

tardía91.

Evidencias sugieren que el flagelo de Clostridium chauvoei es altamente

inmunogénico, la cepa CH3, puede ser importante para estimular la inmunidad

protectiva, fue estudiada preparando una suspensión flagelar pura de un

organismo y comparando su antigenicidad protectiva de la suspensión flagelar

y las células desflageladas. La antigenicidad protectiva de la cepa CH3 no fue

de origen flagelar, pero si debido a la termolabilidad, pH sensitivo, y antígenos

somáticos no aglutinogénicos92.

89 PEMBERTON, John. BATES, Fern. et al. 1974. a. Changes in clinical values of cattle infected with Clostridium chauvoei. p. 1037. 90 TANAKA, M. HIRAYAMA, N. TAMURA, Y. 1987. Production, characterization, and protective effect of monoclonal antibodies to Clostridium chauvoei flagella. Infection ans Inmunity. Aug. Vol. 55, Nº 8. p. 1779 91 MATTAR, M.A. CORTIÑAS, T.I. STEFANINI, A.M. 2002. Inmunogenic protein variations of Clostridium chauvoei cellular antigens associated with the culture growth phase. Vol. 33. Issue 1, 25 march p. 9. 92 CHANDLER, H.M. and GULASEKHARAM, J. 1974. The protective antigen a highly inmunogenic strain of Clostridium chauovoei including an evaluation of its flagella as a protective antigen. Journal of General Microbiology. 84. p. 128.

29

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. POBLACIÓN

Las muestras utilizadas en el presente estudio provienen de tejidos de cobayos

(Cavia porcellus), por ser este animal el modelo biológico mas empleado en el

mundo para trabajar con bacterias del género Clostridium spp93. El criterio de

selección de los animales fue definido como hembras en una edad promedio de

40 días, en buena condición corporal, que no presentó cuadros febriles o

alteraciones clínico patológicas; estos animales provenían del bioterio de la

Empresa Colombiana de Productos Veterinarios (VECOL S.A.)

Para el estudio se seleccionaron 18 cobayos (Cavia porcellus) los cuales se

mantuvieron en observación durante un mes, en las unidades de aislamiento

del Programa de Investigación en Salud Animal de la Corporación Colombiana

de Investigación Agropecuaria Corpoica CEISA de Bogotá, para una mejor

adaptación se dispusieron dos jaulas donde se ubicaron 9 animales en cada

una de ellas, y así minimizar conductas de estrés o tensión, el ambiente se

adecuo para los animales, teniendo en cuenta el control del ruido siendo

considerado como un plan de bienestar para los animales94 asimismo se

manejo la luz95 ya que podía afectar la fisiología96, morfología97, y conducta de

93RAMIREZ, Sergio. 2002. En: http://www.tdx.cesca.es/TESIS_UAB/AVAILABLE/TDX-0613101-121559//mgp4de5.pdf94 PEKRUL, D. 1991. Handbook of Facilities Planning. Laboratory Animal Facilities. p. 166. 95 BRAINARD; VAUGHAN, and REITER. 1986. Effect of light irradiance and wavelength on the Syrian hamster reproductive system. Endocrinol. 119(2):648. 96 ERKERT, and GROBER. 1986. Direct modulation of activity and body temperature of owl monkeys by low light intensities. Folia Primatol. 47(4):171. 97 NEWBOLD; CHAPIN; ZINN, and TUCKER. 1991. Effects of photoperiod on mammary development and concentration of hormones in serum of pregnant dairy heifers. J. Dairy Sci. 74(1):100.

30

varios animales98. Diariamente se le llevaba a cada animal la historia clínica,

donde se monitoreaba frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria, peso y

temperatura corporal.

A la unidad de aislamiento donde se encontraban los animales se le realizaba

dos veces al día, manejo de excrementos, limpieza y desinfección, además, los

animales se beneficiaban de un fácil acceso a la comida y el agua, la

temperatura de la unidad se regulaba con calentadores.

2.2. DISEÑO EXPERIMENTAL

Los 18 cobayos (Cavia porcellus) se distribuyeron al azar en seis grupos de

tres animales. Doce de estos animales se inocularon con la cepa de

Clostridium chauvoei 4408, suministrada por el laboratorio Vecol S.A. los

animales se inocularon vía intramuscular con 0.5 mililitros de una solución de

cloruro de calcio (CaCl2) al 5% conteniendo 100 dosis infectantes de

Clostridium chauvoei, y los 6 animales restantes se inocularon solamente con

CaCl2; En cada grupo habían dos animales inoculados con la cepa de

Clostridium chauvoei, y un animal como testigo el cual fue inoculado solamente

con CaCl2; Cada tres horas se sacrificaba un grupo de animales.

Antes de realizar el sacrificio de cada animal, se les tomó una muestra de

sangre por el método de punción de la vena cava anterior con vacutainer99. La

eutanasia se realizó de acuerdo con los protocolos de bioética vigentes en la

legislación colombiana (LEY 84 de 1989), utilizando anestésicos volátiles para

98 TUCKER; PETITCLERC, and ZINN. 1984. The influence of photoperiod on body weight gain, body composition, nutrient intake and hormone secretion. J. Anim. Sci. 59(6):1610. 99 En: http://www.proclave.com/servet/tomamuestras/agujas.htm

31

evitar el dolor100. Una vez sacrificados los cobayos se realizaban las

necropsias donde se obtenían muestras de diferentes tejidos101 (ver tabla 2)

Tabla 2. Muestras tomadas en necropsia de los cobayos (Cavia porcellus).

MUESTRAS

Bazo

Músculo estriado cardiaco

Músculo estriado esquelético

Duodeno

Hígado

Páncreas

Pulmón

Riñón

Cerebro

Adrenal

2.3. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 2.3.1. Muestras De Sangre

Al realizar la recolección de sangre del Cavia porcellus, se tuvo en cuenta el

volumen de sangre para el análisis, la selección del vaso sanguíneo y el

método requerido para que no afecte el bienestar del animal. Siempre se

obtuvo sangre por punción del corazón102.

100 1986. Report of the AVMA panel de euthanasia. JAVMA, vol 188, Nº 3, February 1, p. 253. 101 ALUJA, Aline; CONSTANTINO, Fernando. 2002. Técnicas de necropsia en animales domésticos. p. 21. 102 DESJARDINS, C. 1986. Indwelling vascular cannulas for remote blood sampling, infusión, and long-term instrumentation of small laboratory animals. p. 32.

32

El volumen de sangre de un cobayo adulto es aproximadamente de 69 – 75

ml/kg de peso corporal103, y aproximadamente el 7 al 10% del volumen de

sangre (0.5 – 0.7 ml por cada 100 gr de peso corporal), pueden ser extraídos

con seguridad, sin provocar anemia104.

A cada cobayo (Cavia porcellus) se le tomó una muestra de sangre obtenida

por el método de punción del corazón con vacutainer, la sangre se recogió en

un tubo de EDTA y en un tubo sin anticoagulante. Las muestras se procesaron

de inmediato y se les realizó un cuadro hemático compuesto por105:

Un examen cuantitativo, que incluye el valor hematocrito, hemoglobina, el

recuento total de eritrocitos, el recuento total de leucocitos, el recuento

diferencial de leucocitos, el recuento de plaquetas, el volumen corpuscular

medio (VCM), la hemoglobina corpuscular media (HCM), la concentración

corpuscular media de hemoglobina (CCMH) y la concentración plasmática de

proteínas totales.

Un examen cualitativo de los frotis sanguíneos para detectar alteraciones en la

morfología celular106.

Luego se realizó la química sanguínea (Creatinin kinasa CK107).

103 HARKNESS, J.E; WAGNER, J.E. 1995. The biology and medicine of rabbits and rodents. p. 68 104 HILLYER, E.V; QUESENBERRY, K.E; DONNELLY, T.M. 1996. Op. cit., p. 102 105 BENJAMIN, Maxine M. 1991. Manual de patología clínica en veterinaria. p. 33. 106 DAVIDSON, Malcom. 2000. Manual patología clínica en pequeños animales p. 46. 107 Auto-Creatinin kinasa liquicolor. Reacción de Jaffé. Prueba fotométrica para mediciones cinéticas de creatinin kinasa. Germany. Human.

2.3.1.1. Examen Cuantitativo

La sangre con anticoagulante se centrifugó en tubos capilares (tubos de

microhematócrito) durante 5 minutos a (12.500 – 15.000 rpm). Los eritrocitos se

concentraron en el fondo del tubo. Los leucocitos forman una capa gris crema

por encima de los eritrocitos. Las plaquetas quedan en la parte alta

distinguiéndose como una capa delgada de color crema, y el plasma aparece

por encima de aquellas. El valor de hematocrito se calculó dividiendo la

longitud de la capa de eritrocitos entre la longitud total, que esta constituida por

la capa de eritrocitos, el buffy coat y el plasma. Un examen superficial del

plasma permite detectar la existencia de ictericia, hemólisis y lipemia108.

2.3.1.1.1. Recuento de eritrocitos. Los recuentos celulares se realizaron

utilizando un hematocitómetro de Neubauer, ver figura 1.

Figura 1. Enrejado del hematocitómetro. Los cuadros marcados con una W se utilizan para estimar el número total de leucocitos; los marcados con una R se usan para los recuentos de eritrocitos.

33108 DAVIDSON, Malcom. Op. cit., p. 47.

34

2.3.1.1.2. Índices eritrocitarios Se determinaron, la hemoglobina corpuscular

media (HCM) y la concentración corpuscular media de hemoglobina (CCMH)

para evaluar si los animales presentaban anemia109.

2.3.1.1.3. Volumen corpuscular medio (VCM) Indicó el tamaño medio de los

glóbulos rojos. Las células normocíticas se determinaron con un VCM normal,

las macrocíticas tenían un VCM elevado, y las microcíticas lo tenían bajo. El

VCM se calculó de la siguiente forma

Hematocrito % VCM = ------------------------------ x 10 = fentolitros Nº de eritrocitos ( ) 2.3.1.1.4. Hemoglobina corpuscular media (HCM) Indicó la cantidad (en

peso) de hemoglobina que había en un eritrocito medio. Dependió del tamaño

de los eritrocitos y de su concentración media de hemoglobina. Una

disminución en la HCM indicó deficiencia de hierro. La HCM se calculó de la

siguiente manera110.

Hemoglobina gr/dl HCM = ------------------------------ x 107 = picogramos Nº de eritrocitos ( )

2.3.1.1.5. Concentración corpuscular media de hemoglobina (CCMH) Indico la concentración media de hemoglobina que había en cada eritrocito. La

hipocromasia nos indicó que la CCMH es baja. Se calculó de la siguiente

manera111

109 DAVIDSON, Malcom. Op. cit., p. 47. 110 Ibid., p. 48. 111 Ibid., p. 49.

35

Hemoglobina gr/dl CCMH = ----------------------------- x 100 = % porcentaje Hematocrito %

2.3.1.1.6. Recuento diferencial de leucocitos Se realizó contando 200

leucocitos en un frotis sanguíneo.

2.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El análisis de la información recolectada en los hemogramas consistió en

categorizar las variables (Hematocrito; recuento total de glóbulos rojos,

glóbulos blancos, recuento absoluto y recuentos relativos entre otros), los

cuales se analizaron por medio de listados, frecuencias y tablas estadísticas.

Los listados se utilizaron para depurar inicialmente la información. Una vez se

obtuvo la base de datos depurada se realizó un análisis de frecuencia en el

cual se contó cada categoría para una variable especificada y se obtuvieron los

resultados absolutos y frecuencias relativas para cada una. Se presenta

también la suma, promedio y desviación estándar. Con los resultados

obtenidos se realizaron las tablas y los gráficos112.

Las variables cuantitativas se evaluaron con la prueba de Barlett para

determinar si las varianzas eran homogéneas. Si esto era cierto, se procedía a

realizar el análisis de varianza paramétrico tradicional (prueba f de Fisher);

utilizando una prueba de t de Student para comparar promedios adyacentes.

En el caso de que no existiera homogeneidad entre las varianzas, se utilizó la

112 DEAN, A.; DEAN, J.; BURTON, A. & DICKER, R. 1992. Epi Info, versión 5. Epidemiología con microordenadores. p. 243.

36

prueba de Kruskal-Wallis (prueba no paramétrica), comparando en este caso

no los promedios, sino las medianas de cada grupo. Posteriormente se utilizó la

prueba de Mann-Whitney/Wilcoxon (prueba de Kruskal-Wallis para dos grupos),

para determinar la diferencia entre medianas adyacentes113.

Se le realizó estadística descriptiva basada en promedio y desviación estándar

a cada una de estas variables hematocrito, hemoglobina, hemoglobina

corpuscular media, concentración media de hemoglobina, eritrocitos, proteína

plasmática, proteína sérica, creatinin kinasa, leucocitos, neutrófilos, linfocitos,

eosinófilos, monocitos, células Foa – Kurloff y de la temperatura de los grupos

experimentales (A, B, C, D, E, F, G). Los tiempos de análisis incluyen, el grupo

A animales sacrificados a las 3 horas post inoculación, el grupo B animales

sacrificados a las 6 horas post inoculación, el grupo C animales sacrificados a

las 9 horas post inoculación, el grupo D animales sacrificados a las 12 horas

post inoculación, el grupo E animales sacrificados a las 15 horas post

inoculación, el grupo F animales sacrificados a las 18 horas post inoculación, y

el grupo G es el grupo de animales control, cada uno de los seis animales que

pertenece a este grupo va a hacer parte de los grupos anteriormente descritos.

2.5. EXAMEN MACROSCÓPICO Primero se revisó la historia clínica de cada cobayo, la cual incluía variables

como especie, edad, grupo, nº de animal, sexo, peso, hora de inoculación,

hora del sacrificio y los síntomas que presentó antes de morir; se continuó con

un examen externo (pelaje, uñas, ojos, orejas, piel, etc)114 luego se prosiguió

con una descripción concisa, ordenada y precisa de la necropsia describiendo

profundamente las lesiones. Se llevó una secuencia sobre los diferentes

113 MARTÍNEZ, R; MARTÍNEZ, N. 1997. Diseño de experimentos. Análisis de datos estándar y no estándar. p. 13. 114ALUJA, Aline; CONSTANTINO, Fernando. 2002. Técnicas de necropsia en animales domésticos. p. 23.

37

sistemas del cuerpo y se hizo la descripción en el sitio correspondiente, las

necropsias se comenzaron realizando una incisión longitudinal ventromedial

desde el extremo anterior de la mandíbula hasta el ano, en el siguiente orden

(se removió la lengua, laringe, traquea, esófago y vísceras, se desprendió el

bazo, se examinó el páncreas, se hizo una incisión en el estómago a lo largo

de la curvatura menor, se desprendió el hígado, los riñones y las glándulas

adrenales, por último se realizó la extracción del sistema nervioso central)115. Los tejidos obtenidos en necropsia se fijaron en solución de formaldehído

(Formaldehyde solución al 37% (CH2O). SIGMA®, Chemical Company, St.

Louis, U.S.A.) tamponado al 3.7% para histopatología116. 2.6. Inclusión de parafina, coloración hematoxilina y eosina

Los tejidos se sometieron al proceso de deshidratación con alcohol etílico

(Alcohol Etílico. SIGMA®, Chemical Company, St. Louis, U.S.A.) en

concentraciones crecientes y se aclararon con xilol (Xylenes. C6H4(CH3)2)

Fischer Scientific Company, New Jersey, U.S.A.) Posteriormente se incluyeron

en parafina a una temperatura de 60ºC. Los cortes se realizaron en micrótomo

de rotación con un espesor de 4 m. Se montaron en láminas portaobjeto y se

desparafinaron se realizó luego el proceso inverso y se coloreó con

hematoxilina (Hematoxylyn (C16H14O6). SIGMA®, Chemical Company, St.

Louis, U.S.A.) y eosina117 (Eosin (C20H6N2O9Br2Na2). SIGMA®, Chemical

Company, St. Louis, U.S.A.). Este proceso se realizó en el laboratorio del

Centro de Investigación en Salud Animal, Corpoica CEISA, de la ciudad de

Bogotá.

115 VILLAFAÑE, Fdo; PEÑA Néstor. 1978. Manual de técnicas del program patología – toxicología. p. 5. 116 LUNA, L. 1968. Manual of histologic stainig methods of the armed forces institute of pathology. p. 258. 117 BANKS, William J. 1996. Histología veterinaria aplicada. p. 6.

38

2.7. EXAMEN MICROSCÓPICO Los tejidos coloreados con hematoxilina y eosina se estudiaron en detalle para

detectar lesiones que pudieran relacionarse con la presencia de Clostridium

chauvoei, para facilitar el análisis de los hallazgos, se diseño una escala

subjetiva del grado de lesión, dependiendo de la severidad de la misma. La

escala incluyó (ver tabla 3).

2.8. DESECHO DE MATERIAL Al terminar el trabajo con los cobayos, se utilizaron bolsas rojas para el

desecho de residuos patológicos, entendiéndose por esto a todo elemento o

material en estado sólido, semisólido, líquido o gaseoso que presente

características de toxicidad y actividad biológica que puedan afectar directa o

indirectamente a los seres vivos. Estas bolsas se incineraron en el horno

crematorio de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria

Corpoica CEISA; donde se realizó el protocolo vigente de las normas de

bioseguridad118.

Tabla 3. Escala subjetiva del grado de lesión producida por Clostridium chauvoei en cobayos (Cavia porcellus) inoculados experimentalmente.

118 http://www.icronline.com/sitio/pacientes/seguridad.asp

39

VALOR CARACTERÍSTICA DE LA LESIÓN

0 Sin Cambios Patológicos Aparentes, No se encontraron cambios patológicos aparentes, el tejido es normal

1 Lesiones Leves, Lesiones ligeras que incluyen cambios congestivos, hemorrágicos, depleción linfoidea, edema ligero

2 Lesiones Moderadas, Incluyen cambios congestivos, hemorrágicos, depleción linfoidea, edema moderado, infiltrados inflamatorios.

3 Lesiones Severas, Incluyen daños tisulares como necrosis de coagulación, infiltrado inflamatorio polimorfonuclear y mononuclear, zonas de hemorragia y congestión con edema abundante.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Muestra de sangre

Los resultados del hemograma se indican a continuación, analizando cada

variable en forma independiente y finalmente correlacionando los valores.

3.1.1. Hematocrito El hematocrito de los grupos experimentales tuvo un promedio de 43.64% (LC

95% 41,40 – 45,88) ver tabla 4. No se encontraron diferencias significativas

entre las horas (p = 0.20). Valores similares son referenciados por Harkness,

1995; quien reporta para esta especie un valor de (37 – 48%119). Todos los

grupos se encontraron entre los parámetros de referencia.

HEMATOCRITO

0102030405060

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

% b

Gráfica 1. Valor promedio del hematocrito por horas post inoculación.

40

119 MOORE, David. 2000. Hematology of the Guinea pig (Cavia porcellus) In: Schalm`s Veterinary hematology. p. 1108.

Tabla 4. Resultados de Hematología, valor promedio por horas 3, 6, 9, 12, 15 y G (grupo control) de cobayos (Cavia porcellus).

n Promedio Desv. estándar Mediana EE LCI 95% LCS 95% P Hto % 18 43,64 4,85 43,75 1,14 41,4 45,88 0,2Hb g/dL 18 13,94 2,41 14,3 0,57 12,83 15,06 0,2HCM Picogramos 18 25,97 11,32 20,73 2,67 20,74 31,2 0,31CCMH % 18 32,04 4,68 33,06 1,1 29,88 34,2 0,65Eritrocitos μL 18 5958611 1722810 6270000 406070 5162713 6754509 0,06Proteína Plasmática 18 5,33 0,62 5,25 0,15 5,05 5,62 0,8Proteína Sérica g/dL 18 4,96 0,45 4,9 0,11 4,75 25,75 0,23CK (UI/L) 18 4014,14 1114,36 4323,52 262,66 3499,33 4528,95 0,12Leucocitos x mm3 18 6985 3775 5425 890 5241 8729 0,15Neutrófilos B. Relativo 18 3,11 4,23 1 1 1,16 5,06 0,02Neutrófilos B. Absoluto 18 264,83 441,98 61,5 104,18 60,65 469,02 0,24Neutrófilos S. Relativo 18 51,06 14,49 51 3,42 44,36 57,75 0,32Neutrófilos S. Absoluto 18 3798,87 3039,87 2512 716,5 2394,52 5203,22 0,33Linfocitos Relativo 18 41,22 14,61 41 3,44 34,47 47,97 0,25Linfocitos Absoluto 18 2667,77 1329,4 2270,5 313,34 2053,62 3281,92 0,02Eosinófilos Relativo 18 1,22 1,22 1 0,29 0,66 1,78 0,36Eosinófilos Absoluto 18 94,2 158,72 48,75 37,41 20,88 167,52 0,07Monocitos Relativo 18 2,94 2,9 2 0,68 1,6 4,28 0,1Monocitos Absoluto 18 222,47 260,82 115,45 61,47 101,98 342,96KC cells Relativo 18 0,33 0,97 0 0,23 -0,11 0,78 0,29KC cells Absoluto 18 21,58 70,57 0 16,63 -11,02 54,18 0,26

41

3.1.2. Hemoglobina La hemoglobina de los grupos experimentales tuvo un promedio de 13.94 g/dL

(LC 95% 13.83 – 15.06) de acuerdo a la tabla 4, no se encontraron diferencias

significativas entre las horas (p = 0.20). Comparativamente estos resultados

son normales, según referencia dada por Wagner, 1995; quien reporta para

esta especie un valor de (11 – 15g/dL120). Todos los grupos se encontraron

entre los parámetros de referencia.

HEMOGLOBINA

17,55

12,9 12,1 12,8715,41513,95

02468

101214161820

3 6 9 12 15 18

Contro

l

HORAS

g/dL

b

Gráfica 2. Valor promedio de la hemoglobina por horas post inoculación.

42120 MOORE, David. 2000. Op. cit., citado por Wagner J.E. p. 1110.

3.1.3. Hemoglobina corpuscular media La hemoglobina corpuscular media de los grupos experimentales tuvo un

promedio de 25.97 µg (LC 95% 20.74 – 31.20) De acuerdo a la tabla 4, no se

encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.31).

Al comparar los resultados con los referenciados por Hillyer, 1996; quien

reporta para esta especie un valor de (23 – 27 µg 121), se encuentran entre los

valores normales. Sin embargo al evaluar las horas individualmente se

encontró que a las 3, 9 y 18 horas se presentaron valores por debajo de los

límites inferiores, a pesar de no existir diferencias significativas entre las horas,

clínicamente el descenso de este valor indica deficiencia de hierro en los

animales ó posiblemente estrés post inoculación.

HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MEDIA

01020304050

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

PIC

OG

RAM

OS

b

Gráfica 3. Valor promedio de la hemoglobina corpuscular media por horas post inoculación.

43121 MOORE, David. 2000. Op. cit., p. 1108.

3.1.4. Concentración media de hemoglobina

La concentración media de hemoglobina de los grupos experimentales tuvo un

promedio de 32.04% (LC 95% 29.88 – 34.20) De acuerdo a la tabla 4 no se

encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.65).

Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por

Hillyer, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (26 – 39% 122). Todos

los grupos se encontraron entre los parámetros de referencia.

CONCENTRACIÓN MEDIA DE HEMOGLOBINA

05

10152025303540

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

%

Gráfica 4. Valor promedio la concentración media de hemoglobina por horas post inoculación.

44122 Ibid., p. 1108.

3.1.5. Eritrocitos

Los eritrocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 5`9 x106/mm3

(LC 95% 5`1 – 6`7) De acuerdo a la tabla 4 no se encontraron diferencias

significativas entre las horas (p = 0.06). Comparativamente estos resultados

son normales, según referencia dada por Quesenberry, 1996; quien reporta

para esta especie un valor de (3`2 – 8`0 x106/mm3 123). Todos los grupos se

encontraron entre los parámetros de referencia.

ERITROCITOS

02000000400000060000008000000

10000000

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

mm

3

b

Gráfica 5. Valor promedio de eritrocitos por horas post inoculación.

45123 MOORE, David. 2000. Op. cit., citado por Quesenberry. p. 1108.

3.1.6. Proteína plasmática La proteína plasmática de los grupos experimentales tuvo un promedio de 5.33

g/dL (LC 95% 5.05 – 5.82) De acuerdo a la tabla 4 no se encontraron

diferencias significativas entre los grupos (p = 0.80). Comparativamente estos

resultados son normales, según referencia dada por Rawnsley, 2004; quien

reporta para esta especie un valor de (4.6 – 6.2 g/dL 124). Todos los grupos se

encontraron entre los parámetros de referencia.

PROTEÍNA PLASMÁTICA

0246

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

g/dL b

Gráfica 6. Valor promedio de proteína plasmática por horas post inoculación.

46

124 RAWNSLEY H.M. En: http://academic.csupomona.edu/research/pdfDocuments/acuHandbook_rev02final.pdf

3.1.7. Proteína Sérica La proteína sérica de los grupos experimentales tuvo un promedio de 4.96 g/dL

(LC 95% 4.75 – 5.17) De acuerdo a la tabla 4 no se encontraron diferencias

significativas entre los grupos (p = 0.23). Comparativamente estos resultados

son normales, según referencia dada por Rawnsley, 2004; quien reporta para

esta especie un valor de (4.6 – 6.2 g/dL 125). Todos los grupos se encontraron

entre los parámetro de referencia.

PROTEÍNA SÉRICA

3,54

4,55

5,5

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

g/dL b

Gráfica 7. Valor promedio de proteína sérica por horas post inoculación.

47

125 Op. cit.., En: http://academic.csupomona.edu/research/pdfDocuments/acuHandbook_rev02final.pdf

3.1.8. Creatinin kinasa En química sanguínea, la creatinin kinasa de los grupos experimentales tuvo un

promedio de 4014.14 UI/L (LC 95% 3499.33 – 4528.95) Al observar la tabla 4.

No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.12).

Comparativamente estos resultados no se encuentran entre los rangos de

referencia dados por Kaspareit, 2004; quien reporta (48 – 340 U/L 126). El

valor de todas las muestras extraídas de CK, presentaron niveles elevados,

debido a la inflamación muscular causada por el trauma de la inoculación.

CREATININ KINASA

010002000300040005000

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

UI/L b

Gráfica 8. Valor promedio de creatinin kinasa por horas post inoculación.

48126 KASPAREIT, J. 2004. En: http://cvm.es/analitica/vetscan/rangos.htm

3.1.9. Leucocitos Los leucocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 6.9 x103/mm3

(LC 95% 5.2 – 8.7) Al estudiar la tabla 4 no se encontraron diferencias

significativas entre los grupos (p = 0.15). Comparativamente estos resultados

no se encuentra entre los parámetros normales, según referencia dada por

Donnelly, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (5.5 – 17.5

x103/mm3 127). Al evaluar los grupos individualmente se encontró que a las 12 y

18 horas se presentaron valores por debajo de los límites inferiores, a pesar de

no existir diferencias significativas entre las horas; clínicamente el descenso de

estos valores indican leucopenia, es decir que uno o la totalidad de los tipos de

células blancas, puede estar afectado, debido a las fases iniciales de

infecciones agudas.

LEUCOCITOS

05000

1000015000

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

mm

3

b

Gráfica 9. Valor promedio de leucocitos por horas post inoculación.

49127 MOORE, David. Op. cit., p. 1109.

3.1.10. Neutrófilos

El valor absoluto de los neutrófilos de los grupos experimentales tuvo un

promedio de 3798.87 (LC 95% 2394.52 – 5203.22) estudiando la tabla 4 no se

encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.33).

Comparativamente estos resultados se encuentran entre los parámetros

normales, según referencia dada por Quesenberry, 1996; quien reporta para

esta especie un valor de (1210 – 8400 128), Al evaluar las horas individualmente

se encontró que a las 3 horas se presenta el valor por encima de los límites

superiores, a pesar de no existir diferencias significativas entre los grupos,

clínicamente el ascenso de estos valores indican que los animales a las 3

primeras horas de inoculación presentaban neutrofilia, debido al estrés.

NEUTRÓFILOS (Valor Absoluto)

02000400060008000

10000

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

mm

3

b

Gráfica 10. Valor promedio de neutrófilos (valor absoluto) por horas post inoculación.

50128 Ibid., p. 1109.

El valor relativo de los neutrófilos de los grupos experimentales tuvo un

promedio de 51.06% (LC 95% 44.36 – 57.75) de acuerdo a la tabla 4 no se

encontraron diferencias significativas entre las horas (p = 0.32).

Comparativamente estos resultados no se encuentran entre los parámetros

normales, según referencia dada por Quesenberry, 1996; quien reporta para

esta especie un valor de (22 – 48% 129), Al evaluar los grupos individualmente

se encontró que a las 3, 6, 12, 15 y 18 horas se presentaron valores por

encima de los límites superiores, a pesar de no existir diferencias significativas

entre los grupos, clínicamente el ascenso de estos valores indican proceso

bacteriano debido al avance progresivo de la infección.

NEUTRÓFILOS (Valor Relativo)

020406080

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

% b

Gráfica 11. Valor promedio de neutrófilos (valor relativo) por horas post inoculación.

51129 Ibid., p. 1109.

3.1.11. Linfocitos

El valor absoluto de los linfocitos de los grupos experimentales tuvo un

promedio de 2667.77 (LC 95% 2053.62 – 3281.92) en la tabla 4 observamos

que se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.02).

Comparando los resultados que se encontraron, frente a la referencia dada por

Johnson, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (2145 – 12600 130).

A las 12, 15 y 18 horas se presentaron valores por debajo de los límites

inferiores, esto indica linfopenia producida por el estrés de los animales.

LINFOCITOS (Valor Absoluto)

0200040006000

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

mm

3

b

Gráfica 12. Valor promedio de linfocitos (valor absoluto) por horas post inoculación.

52130 Ibid., p. 1109.

El valor relativo de los linfocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio

de 41.22% (LC 95% 34.47 – 47.97) de acuerdo a la tabla 4 no presentaron

diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.25).

Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por

Johnson, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (39 – 72% 131). Sin

embargo al evaluar los grupos individualmente se encontró que a las 3, 15 y 18

horas se presentaron valores por debajo de los límites inferiores, a pesar de no

existir diferencias significativas entre los grupos, clínicamente el descenso de

estos valores indican linfopenia, producida a las 3 primeras horas por estrés de

los animales.

LINFOCITOS (Valor Relativo)

0102030405060

3 6 9 12 15 18

Contro

l

HORAS

% b

Gráfica 13. Valor promedio de linfocitos (valor relativo) por horas post inoculación. 3.1.12. Eosinófilos

53131 Ibid., p. 1109.

54

l valor absoluto de los eosinófilos de los grupos experimentales tuvo un E

promedio de 94.20 (LC 95% 20.88 – 167.52) al observar la tabla 4 no se

encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.07).

Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por

Delaney, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (0 – 1225 132).

Todos los grupos se encontraron entre los parámetros de referencia.

EOSINÓFILOS (Valor Absoluto)

0100200300400500

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

mm

3

b

Gráfica 14. Valor promedio de eosinófilos (valor absoluto) por horas post

inoculación.

132 Ibid., p. 1109.

El valor relativo de los eosinófilos de los grupos experimentales tuvo un

promedio de 1.22% (LC 95% 0.66 – 1.78) en la tabla 4 no se encontraron

diferencias significativas entre las horas de exposición (p = 0.36).

Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por

Delaney, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (0 – 7% 133). Todos

los grupos se encontraron entre los parámetros de referencia.

EOSINÓFILOS (Valor Relativo)

00,5

11,5

22,5

33,5

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

% b

Gráfica 15. Valor promedio de eosinófilos (valor relativo) por horas post inoculación.

55133 Ibid., p. 1109.

3.1.13. Monocitos

El valor absoluto de los monocitos de los grupos experimentales tuvo un

promedio de 222.47 (LC 95% 101.98 – 342.96) ver tabla 4. No se encontraron

diferencias significativas entre los grupos (p = 0.10). Comparando los

resultados que se encontraron, frente a la referencia dada por Hillyer, 1996;

quien reporta para esta especie un valor de (55 – 1750134). A las 18 horas post

inoculación se presentaron valores por debajo de los límites inferiores.

MONOCITOS (Valor Absoluto)

0200400600800

1000

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

mm

3

b

Gráfica 16. Valor promedio de monocitos (valor absoluto) por horas post inoculación.

56134 Ibid., p. 1109.

El valor relativo de los monocitos de los grupos experimentales tuvo un

promedio de 2.94% (LC 95% 1.60 – 4.28) ver tabla 4. No se encontraron

diferencias significativas entre los grupos (p = 0.10). Comparativamente estos

resultados son normales, según referencia dada por Hillyer, 1996; quien reporta

para esta especie un valor de (1 – 10% 135). Todos los grupos se encontraron

entre los parámetros de referencia.

MONOCITOS (Valor Relativo)

02468

10

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

% b

Gráfica 17. Valor promedio de monocitos (valor relativo) por horas post inoculación.

57135 Ibid., p. 1109.

3.1.14. Células Foa – Kurloff

El valor absoluto de las células Foa – Kurloff (KC cells) de los grupos

experimentales tuvo un promedio de 21.58 (LC 95% -11.02 – 54.18) ver tabla 4.

No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.26).

El valor relativo de las células Foa – Kurloff (KC cells) de los grupos

experimentales tuvo un promedio de 0,33% (LC 95%- 0,11 – 0,78) ver tabla 4.

No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0,29).

Comparativamente estos resultados son normales, según referencia dada por

Jain, 1986; quien reporta para esta especie un valor de (3 – 4% 136), en

animales con una edad aproximada hasta de 4 meses.

Células Foa - Kurloff (Valor Absoluto)

050

100150200

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

mm

3

b

Gráfica 18. Valor promedio de células Foa – Kurloff (valor absoluto) por horas post inoculación.

58136 Ibid., p. 1109.

59

Correlacionando los valores hematológicos de los cobayos (Cavia porcellus)

inoculados con una cepa de Clostridium chauvoei podemos observar que la

mayoría de los cambios hematológicos se hicieron evidentes a partir de las 9

horas post inoculación, el hematocrito indica un leve aumento de las tres

primeras horas a las 12 horas, observándose un descenso de este entre las 15

y 18 horas, igualmente la hemoglobina comienza un ascenso de las 3 a las 12

horas para disminuir de las 15 a las 18 horas, estos cambios encontrados están

entre los parámetros de referencia.

Al evaluar por horas la hemoglobina corpuscular media se encuentra que a las

3, 9 y 18 horas post inoculación los valores disminuyeron, a causa del estrés

que presentaban los animales al ser manipulados.

La concentración media de hemoglobina, los eritrocitos, la proteína plasmática

y la proteína sérica se mantuvieron estables durante las horas de exposición a

la cepa patógena.

Aunque no se encontraron diferencias significativas en los resultados de

creatinin kinasa, se observó que los niveles son elevados obviamente a causa

del trauma de la inoculación. Los leucocitos presentaron a las 12 y 18 horas un descenso en los valores,

esto indica leucopenia, queriendo decir que una clase de células blancas esta

afectada debido a la fase inicial de una infección aguda.

El valor de las células Foa – Kurloff se encontró bajo en comparación con lo

referenciado por Jain, 1986 quien reporta un parámetro de (3 – 4%) del conteo

diferencial de leucocitos y en el estudio nos dio un promedio de (0.33%), claro

que estas células son especificas de los cobayos menores de 2 a 3 meses de

edad.

3.2. TEMPERATURA

La temperatura de los grupos experimentales tuvo un promedio de 35,54ºC (LC

95% 32,42 – 38,66) Al evaluar la temperatura de los cobayos en el anexo 8 se

encontraron diferencias significativas entre las horas de exposición (p =

0,0008). Al comparar los resultados con los referenciados por Rawnsley, 2004;

quien reporta para esta especie una temperatura de (37.2 – 39.5ºC 137), los

grupos se encontraron fuera de los parámetros de referencia.

Al observar los tiempos individualmente vemos que a las 3, 6 y 9 horas post

inoculación los cobayos encontraban entre el rango normal de temperatura, a

las 12 horas tuvo un valor superior, debido al proceso bacteriano que

presentaron los animales; a las 15 y 18 horas mostraron valores por debajo de

los limites inferiores.

TEMPERATURA

01020304050

3 6 9 12 15 18

Control

HORAS

ºC b

Gráfica 19. Valor promedio de temperatura por horas post inoculación.

60

137 RAWNSLEY H.M. Op. cit., En: http://academic.csupomona.edu/research/pdfDocuments/acuHandbook_rev02final.pdf

61

3.3. OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE LESIONES

Los cobayos presentaron lesiones aparentes a partir de las 6 horas post-

inoculación; se observó ligera tumefacción del área inoculada, lesión que no se

presentó en los animales testigos. Después de las 9 horas se acentúa la

tumefacción del miembro posterior con crepitación a la palpación e hinchazón

moderada, que produce en los animales cojera inicial y después de las 15

horas por la severidad, postración; uno de los animales inoculados murió entre

las 15 y 18 horas con lesiones anteriormente descritas pero más severas en el

músculo afectado y en la región inguinal.

Los hallazgos de necropsia permitieron observar cambios discretos en las

primeras horas, donde se observó ligero edema en la zona de inoculación;

después de las 6 horas esta lesión comenzó a ser mas notoria, con presencia

de áreas oscuras (rojo – negruzco) y de un líquido sanguinolento que paso de

ligero a severo después de las 15 horas y continuó hasta las 18 horas post-

inoculación, presentándose en estos últimos casos un aspecto mucoide, que se

distribuía por todo el miembro y el tejido subcutáneo del abdomen en su región

inguinal.

A nivel general se observó congestión ligera desde las 3 horas de inoculación

en órganos como pulmón, cerebro, bazo, hígado y riñón, pasando a moderada

después de las 6 horas y severa a partir de las 15 horas, cuando el animal

presentaba las lesiones vasculares más severas. La crepitación y la presencia

de gas fueron notorias a partir de las 12 horas (Figura 2) en todos los animales

inoculados.

Las lesiones principales en los animales de 18 horas fueron tumefacciones

crepitantes en la musculatura estriada esquelética, tejidos de color rojo o

marrón oscuro con estrías negras; algunas áreas aparecían húmedas y

desprendían exudado oscuro mezclado con gases que le daban un particular

olor dulzón (Figura 2 y 3).

a

Figura 2. Clostridiosis. Lesiones en cavidad toráxica y peritoneal de cobayos (Cavia porcellus) a. Abundante producción de gases en intestino, cuadro congestivo y hemorrágico, 15 horas post inoculación.

b

a

Figura 3. Clostridiosis. 18 horas post inoculación. a. Tumefacciones crepitantes en la musculatura estriada esquelética, tejidos de color rojo o marrón oscuro con estrías negras; b. Algunas áreas aparecen húmedas y desprenden exudado oscuro mezclado con gases.

62

63

3.4. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LESIONES

En la tabla 4, se muestra que las lesiones más importantes ocurrieron en el

músculo estriado esquelético (MEE), única variable que resultó significativa (p =

0,0005) demostrando que si hay diferencia entre los grupos experimentales. En

los grupos control se inyectó únicamente con cloruro de calcio (CaCl2). Estos

animales presentaron un ligero edema, el cual se evidenció por la separación

de las fibras musculares, las lesiones se valoraron entre 0 y 1(Tabla 3); A este

grupo se le inyectó solamente cloruro de calcio presentando ligero edema, el

cual se evidenció por la separación de las fibras musculares.

Los cobayos después de 3 a 15 horas de la inoculación con Clostridium

chauvoei y luego sacrificados mostraron lesiones leves a moderadas como

sigue:

A partir de las 3 horas se encontró una ligera necrosis coagulativa, infiltrado de

neutrófilos polimorfonucleares y ligero edema; después de las 6 horas se hizo

notoria la separación de fibras musculares, congestión con hemorragias ligeras

y se observa infiltración polimorfonuclear, se presentó una variación moderada;

a las 9 y 12 horas se observó necrosis de coagulación. La necrosis y el

infiltrado polimorfonuclear fueron más severos a las 18 horas, al igual que la

presencia de formas bacilares en cantidades abundantes (Figura 4). El grupo

que demostró los cambios severos fue el grupo experimental de 18 horas de

inoculadas y no fue necesario sacrificar algunos cobayos, sino que murieron

por sí solos. Las lesiones principales fueron gangrena gaseosa con marcada

necrosis de coagulación y de licuefacción con olor fétido. Se encontró una

marcada infiltración polimorfonuclear de tipo neutrófilo (Figura 5 y 6).

En órganos como el bazo se observó deplesión linfoide desde las primeras 3

horas de inoculación en todos los cobayos, al igual que congestión desde las 9

horas sin tener una tendencia específica, sin embargo en el cobayo que murió

repentinamente, fue severa la congestión con hemorragias.

64

Se observaron cambios vasculares como congestión en: pulmón, hígado,

músculo estriado, músculo cardiaco y riñón (corteza y médula), desde las 3

horas de inoculación con Clostridium chauvoei.

En el cobayo que murió entre las 15 y 18 horas post inoculación, se observó

hemorragia muy severa.

Las láminas de tejidos coloreadas con hematoxilina y eosina permiten observar

lesiones anatomopatológicas generales que hacen pensar en una clostridiosis.

65

Tabla 5. Resultados estadísticos de la calificación de lesiones histopatológicas en tejidos de cobayos (Cavia porcellus) inoculados con cepa patógena de Clostridium chauvoei.

No. Hora sacrificio BAZO M E C M E E DUODENO HIGADO PANCREAS PULMON RIÑON CEREBRO ADRENAL

01/01/2004 3 1 0 1ab 0 0 0 2 1 1 0 01/02/2004 3 1 0 1ab 0 0 0 2 0 0 0 01/03/2004© 3 1 0 1a 0 0 0 1 0 0 0 02/01/2004 6 1 1 1abc 2 1 0 2 2 2 0 02/02/2004 6 0 1 2abc 2 1 0 1 1 1 0 02/03/2004 © 6 1 1 1a 0 2 0 1 1 1 0 03/01/2004 9 3 1 2abc 2 2 0 3 1 1 0 03/02/2004 9 1 1 2abc 0 1 0 2 1 1 0 03/03/2004 © 9 1 2 1a 1 1 0 3 2 0 0 04/01/2004 12 1 1 2bc 1 1 0 3 1 1 0 04/02/2004 12 0 1 3bc 1 2 0 2 3 1 0 04/03/2004 © 12 1 1 1a 1 1 0 3 0 1 0 05/01/2004 15 1 2 2abc 1 2 0 2 2 1 0 05/02/2004 15 1 1 2abc 1 1 0 2 1 1 2 05/03/2004 © 15 1 0 0a 1 1 0 2 1 1 0 06/01/2004 18 2 2 3c 2 1 0 2 2 1 0 06/02/2004 18 2 2 3c 1 1 0 2 1 1 0 06/03/2004 © 18 1 0 1a 0 1 0 1 1 | 0 p 0,059 0,0945 0,0005 0,0769 0,1876 0,8084 0,4803 0,4038 0,2284

MEC: Músculo estriado cardiaco; MEE: Músculo estriado esquelético ©= Grupos control inoculados con Cloruro de Calcio p= nivel de significancia

A B

a

Figura 4. Clostridiosis. a. Bacilos de Clostridium chauvoei en músculo estriado esquelético de cobayo (Cavia porcellus) después de 18 horas de inoculación. H.E. 100X (A) y 400X (B).

A B

Figura 5. Clostridiosis. Músculo estriado esquelético de cobayo (Cavia porcellus), 18 horas post inoculación. Se observa infiltración polimorfonucleares y necrosis de coagulación. H.E. 100X (A) 400X (B).

66

A B

Figura 6. Clostridiosis. A) Presencia de bacilos de Clostridium chauvoei y leucocitos polimorfonucleares neutrófilos en músculo estriado esquelético, 18 horas post inoculación. H.E. 1000X). B) Corte longitudinal de músculo estriado esquelético de cobayo (Cavia porcellus) testigo, el cual no presenta cambios patológicos aparentes. H.E. 400X).

Los cambios patológicos mas importantes se observaron en el músculo

estriado esquelético, y se encontraron alteraciones a partir de 3 horas post

inoculación que incluyen desde ligero edema hasta gangrena gaseosa severa

que se produce después de las 15 horas, por la acción de las toxinas alfa y

gamma, necrotizante e hidrolizante respectivamente que destruyen la matriz

del tejido conectivo, resultados que concuerdan con lo encontrado por

Hateway, 1990 y Titball et al. 2003. esto indica que el músculo estriado

esquelético resulta ser el adecuado para el diagnostico de carbón sintomático.

67

68

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

La temperatura se incrementó levemente a las 12 horas post inoculación con

Clostridium chauvoei, a las 15 horas disminuyó a 28.8ºC, para continuar

bajando a las 18 horas a 21ºC, como lo referencia Pemberton, 1974.

La proteína sérica y plasmática se encontró entre los valores normales, en el

animal que murió no se encontraron diferencias significativas.

No se encontró cambios hematológicos significativos en los cobayos, tan solo

algunos grupos presentaron en las primeras horas post inoculación una

leucopenia, debido a las fases iniciales de infección aguda.

La neutrofilia se observó en todos los grupos inoculados con Clostridium

chauvoei, su valor nunca retorno al normal, debido a la agudeza de la infección.

No se hallaron diferencias significativas en sangre debido a la rapidez con la

cual se desarrolla la enfermedad.

La enzima asociada con el daño de músculo esquelético Creatinin Kinasa,

incrementó su valor por encima de los límites superiores, debido a la

inflamación muscular causada por el trauma de la inoculación. La actividad de

Gamma glutamil transferasa GGT; Alanina aminotransferasa ALAT - GPT;

Aspartato aminotransferasa AST – GOT, no se determinó ya que los datos

fueron insuficientes para dar conclusiones validas.

Los cambios patológicos mas importantes se observaron en el músculo

estriado esquelético y se encontraron alteraciones leves a partir de las 3 horas

post - inoculación

69

El músculo esquelético estriado es el único tejido que presento cambios

significativos en esta investigación, debido a que la bacteria de Clostridium

chauvoei afecta específicamente a este tejido.

El tejido muscular estriado esquelético resulta ser el adecuado para el

diagnóstico de carbón sintomático, este resultado concuerda con Assis et al.

(2005).

Los cobayos inoculados con Clostridium chauvoei mueren entre las 15 y 18

horas post inoculación, presentando las lesiones mas severas.

Importante tomar muestras del animal recién muerto, teniendo en cuenta el

protocolo de recolección de tejidos para histopatología y así evitar que estos

tejidos sean contaminados con otras bacterias que normalmente están

presentes en el animal y no poder hallar un diagnóstico certero.

La fijación del tejido en formaldehído permitió su uso posterior a la toma de la

muestra, sin presentar cambios que alteren el diagnóstico.

La utilización de tejidos fijados en formol bufferado al 10%, es una buena

opción ya que se pueden enviar muestras desde áreas remotas del país y

también estas muestras pueden ser almacenadas por el tiempo necesario sin

alterar los resultados de la técnica.

De acuerdo con los resultados obtenidos, la técnica de hematoxilina y eosina

permite observar lesiones anatomopatológicas generales que nos hacen

pensar en una clostridiosis, pero no permiten confirmar el tipo de Clostridium

involucrado tal como lo indicaron Ortiz y Benavides (2002)

70

Evitar enterrar animales presuntamente muertos por Clostridiosis, para evitar

que las esporas del Clostridium después salgan al medio ambiente y contamine

agua, pienso ó a otros animales.

Darle a conocer al ganadero la importancia de enviar muestras de los animales

muertos para tener un diagnóstico real del agente causal de la enfermedad.

Este trabajo es importante como soporte para nuevos estudios en el área de

bacterias anaerobias en Colombia

71

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6. ANEXOS

Anexo 1. Resultados de Hematología, grupo A (3 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).

n Promedio des. estándar Mediana EE LCI 95% LCS 95% Hto % 2 40,5 3,54 40,5 2,5 35,6 45,4Hb g/dL 2 13,95 1,91 13,95 1,35 11,3 16,6HCM Picogramos 2 18,75 0,94 18,75 0,66 17,45 20,05CCMH % 2 34,37 1,71 34,37 1,21 31,99 36,74Eritrocitos μL 2 7475000 1393000 7475000 985000 5544400 9405600Proteína Plasmática 2 5,45 0,35 5,45 0,25 4,96 5,94Proteína Sérica g/dL 2 5,1 0,57 5,1 0,4 4,32 5,88CK (UI/L) 2 4293,31 880,25 4293,31 622,43 3073,35 5513,27Leucocitos x mm3 2 12975 5692 12975 4025 5086 20864Neutrófilos B. Relativo 2 1 1,41 1 1 -0,96 2,96Neutrófilos B. Absoluto 2 895 1265,72 895 895 -859,2 2649,2Neutrófilos S. Relativo 2 64,5 14,85 64,5 10,5 43,92 85,08Neutrófilos S. Absoluto 2 8791,5 5598,16 8791,5 3958,5 1032,84 16550,16Linfocitos Relativo 2 29 16,97 29 12 5,48 52,52Linfocitos Absoluto 2 3279,75 551,19 3279,75 389,75 2515,84 4043,66Eosinófilos Relativo 2 3 1,41 3 1 1,04 4,96Eosinófilos Absoluto 2 429,5 354,26 429,5 250,5 -61,48 920,48Monocitos Relativo 2 2,5 2,12 2,5 1,5 -0,44 5,44Monocitos Absoluto 2 384,75 417,55 384,75 295,25 -193,94 963,44KC cells Relativo 2 0 0 0 0 0 0 KC cells Absoluto 2 0 0 0 0 0 0

80

Anexo 2. Resultados de Hematología, grupo B (6 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).

n Promedio des. estándar Mediana EE LCI 95% LCS 95% Hto % 2 45,25 5,3 45,25 3,75 37,9 52,6Hb g/dL 2 15 1,13 15 0,8 13,43 16,57HCM Picogramos 2 25,9 8,89 25,9 6,28 13,58 38,21CCMH % 2 33,23 1,39 33,23 0,99 31,3 35,16Eritrocitos μL 2 6075000 1647559 6075000 1165000 3791600 8358400Proteína Plasmática 2 5,65 1,2 5,65 0,85 3,98 7,32Proteína Sérica g/dL 2 4,65 0,21 4,65 0,15 4,36 4,94CK (UI/L) 2 4727,29 500,41 4727,29 353,84 4033,76 5420,82Leucocitos x mm3 2 5900 1061 5900 750 4430 7370Neutrófilos B. Relativo 2 2 1,41 2 1 0,04 3,96Neutrófilos B. Absoluto 2 110,5 62,23 110,5 44 24,26 196,74Neutrófilos S. Relativo 2 55,5 10,61 55,5 7,5 40,8 70,2Neutrófilos S. Absoluto 2 3330,75 1214,46 3330,75 858,75 1647,6 2897,61Linfocitos Relativo 2 39 7,07 39 5 29,2 58,47Linfocitos Absoluto 2 2263,5 3,54 2263,5 2,5 2258,6 2268,4Eosinófilos Relativo 2 0,5 0,71 0,5 0,5 -0,48 1,48Eosinófilos Absoluto 2 33,25 47,02 33,25 33,25 -31,92 98,42Monocitos Relativo 2 3 2,83 3 2 -0,92 6,92Monocitos Absoluto 2 162 135,06 162 95,5 -25,18 349,18KC cells Relativo 2 0 0 0 0 0 0 KC cells Absoluto 2 0 0 0 0 0 0

81

Anexo 3. Resultados de Hematología, grupo C (9 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).

n Promedio des. estándar Mediana EE LCI 95% LCS 95% Hto % 2 46 1,41 46 1 44,04 47,96Hb g/dL 2 15,4 1,41 15,4 1 13,44 17,36HCM Picogramos 2 19,29 2,45 19,29 1,73 15,9 22,69CCMH % 2 33,45 2,05 33,45 1,45 30,61 36,28Eritrocitos μL 2 8000000 282843 8000000 200000 7608000 8392000Proteína Plasmática 2 5,55 0,21 5,55 0,15 5,26 5,84Proteína Sérica g/dL 2 5,05 0,07 5,05 0,05 4,95 5,15CK (UI/L) 2 4139,05 366,84 4139,05 259,39 3630,63 4647,46Leucocitos x mm3 2 9750 212,13 9750 150 9456 10044Neutrófilos B. Relativo 2 1 1,41 1 1 -0,96 2,96Neutrófilos B. Absoluto 2 96 135,76 96 96 -92,16 284,16Neutrófilos S. Relativo 2 33,5 14,85 33,5 10,5 12,92 54,08Neutrófilos S. Absoluto 2 3282 1518,87 3282 1074 1176,96 5387,04Linfocitos Relativo 2 55,5 12,02 55,5 8,5 38,84 72,16Linfocitos Absoluto 2 5398,5 1054,3 5398,5 745,5 3937,32 6859,68Eosinófilos Relativo 2 0,5 0,71 0,5 0,5 -0,48 1,48Eosinófilos Absoluto 2 49,5 70 49,5 49,5 -47,52 146,52Monocitos Relativo 2 8 0 8 0 8 8 Monocitos Absoluto 2 780 16,97 780 12 756,48 803,52KC cells Relativo 2 1,50 2,12 1,50 KC cells Absoluto 2 144 203,65 144 144 -138,24 426,24

82

Anexo 4. Resultados de Hematología, grupo D (12 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).

n Promedio des. estándar Mediana EE LCI 95% LCS 95% Hto % 2 50,5 4,95 50,5 3,5 43,64 57,36Hb g/dL 2 17,55 0,78 17,55 0,55 16,47 18,63HCM Picogramos 2 35,89 3,27 35,89 2,31 31,36 40,42CCMH % 2 34,84 1,88 34,84 1,33 32,25 37,44Eritrocitos μL 2 4920000 664680 4920000 470000 3998800 5841200Proteína Plasmática 2 5 0,28 5 0,2 4,61 5,39Proteína Sérica g/dL 2 4,4 0,14 4,4 0,1 4,2 4,6CK (UI/L) 2 4003,9 1767,15 4003,9 1249,57 1554,75 6453,04Leucocitos x mm3 2 3875 742 3875 525 2846 4904Neutrófilos B. Relativo 2 1 0 1 0 1 1 Neutrófilos B. Absoluto 2 38,75 7,42 38,75 5,25 28,46 49,04Neutrófilos S. Relativo 2 54,5 4,95 54,5 3,5 47,64 61,36Neutrófilos S. Absoluto 2 2130,25 596,44 2130,25 421,75 1303,62 2956,88Linfocitos Relativo 2 42 4,24 42 3 36,12 47,88Linfocitos Absoluto 2 1611,75 147,43 1611,75 104,25 1407,42 1816,08Eosinófilos Relativo 2 0,5 0,71 0,5 0,5 -0,48 1,48Eosinófilos Absoluto 2 22 31,11 22 22 -21,12 65,12Monocitos Relativo 2 0,5 0,71 0,5 0,5 -0,48 1,48Monocitos Absoluto 2 22 31,11 22 22 -21,12 65,12KC cells Relativo 2 1,50 2,12 1,50 1,5 -1,44 4,44KC cells Absoluto 2 50,25 71,06 50,25 50,25 -48,24 148,74

83

Anexo 5. Resultados de Hematología, grupo E (15 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).

n Promedio des. estándar Mediana EE LCI 95% LCS 95% Hto % 2 42,25 1,06 42,25 0,75 40,78 43,72Hb g/dL 2 12,90 4,67 12,9 3,30 6,43 19,37HCM Picogramos 2 39,67 27,21 39,67 19,24 1,95 77,38CCMH % 2 30,68 11,82 30,68 8,36 14,30 47,06Eritrocitos μL 2 3725000 1378858 3725000 975000 1814000 5636000Proteína Plasmática 2 4,70 0,42 4,7 0,30 4,11 5,29Proteína Sérica g/dL 2 4,75 0,21 4,75 0,15 4,46 5,04CK (UI/L) 2 4473,55 1293,67 4473,55 914,76 2680,62 6266,48Leucocitos x mm3 2 7850 3677 7850 2600 2754 15057Neutrófilos B. Relativo 2 8,50 7,78 8,5 5,50 -2,28 19,28Neutrófilos B. Absoluto 2 524,25 298,05 524,25 210,75 111,18 937,32Neutrófilos S. Relativo 2 62,00 8,49 62 6,00 50,24 73,76Neutrófilos S. Absoluto 2 5023,00 2945,81 5023 2083 940,32 9105,68Linfocitos Relativo 2 25,00 1,41 25 1,00 23,04 26,96Linfocitos Absoluto 2 1988,50 1030,25 1988,5 728,50 560,64 3416,36Eosinófilos Relativo 2 1,00 1,41 1 1,00 -0,96 2,96Eosinófilos Absoluto 2 52,50 74,25 52,5 52,50 -50,40 155,40Monocitos Relativo 2 3,50 0,71 3,5 0,5 2,52 4,48Monocitos Absoluto 2 261,75 73,19 261,75 51,75 160,32 363,18KC cells Relativo 2 0 0 0 0 0 0 KC cells Absoluto 2 0 0 0 0 0 0

84

Anexo 6. Resultados de Hematología, grupo F (18 horas post inoculación con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).

n Promedio des. estándar Mediana EE LCI 95% LCS 95% Hto % 2 46 0 46 460 46Hb g/dL 2 12,10 1,84 12,1 1,30 9,55 14,65HCM Picogramos 2 16,84 4,98 16,84 3,52 9,93 23,75CCMH % 2 26,30 4,00 26,30 2,83 20,77 31,84Eritrocitos μL 2 7345000 1081873 7345000 765000 5845600 8844400Proteína Plasmática 2 5,45 1,34 5,45 0,95 3,59 7,31Proteína Sérica g/dL 2 4,85 0,49 4,85 0,35 4,16 5,54CK (UI/L) 2 1821,28 87,43 1821,28 61,82 1700,10 1942,45Leucocitos x mm3 2 5075 742 5075 525 4046 6104Neutrófilos B. Relativo 2 10,50 2,12 10,5 1,50 7,56 13,44Neutrófilos B. Absoluto 2 540,75 185,62 540,75 131,25 283,5 798Neutrófilos S. Relativo 2 54,00 19,80 54 14,00 26,56 81,44Neutrófilos S. Absoluto 2 2814,00 1405,73 2814 994 865,76 4762,24Linfocitos Relativo 2 34,50 21,92 34,5 15,50 4,12 64,88Linfocitos Absoluto 2 1669,50 856,31 1669,5 605,50 482,72 2856,28Eosinófilos Relativo 2 1 0 1 0 1 1Eosinófilos Absoluto 2 50,75 7,42 50,75 5,25 40,46 61,04Monocitos Relativo 2 0 0 0 0 0 0 Monocitos Absoluto 2 0 0 0 0 0 0 KC cells Relativo 2 0 0 0 0 0 0 KC cells Absoluto 2 0 0 0 0 0 0

85

Anexo 7. Resultados de Hematología, grupo G (Control), cobayos (Cavia porcellus).

n Promedio des. estándar Mediana EE LCI 95% LCS 95% Hto % 6 40,75 5,21 42,75 2,13 36,58 44,92Hb g/dL 6 12,87 1,89 13,05 0,77 11,36 14,38HCM Picogramos 6 25,80 8,75 22,11 3,57 18,80 32,81CCMH % 6 31,82 4,50 32,80 1,84 28,22 35,43Eritrocitos μL 6 5362500 1492427 5710000 609281 4168310 6556690Proteína Plasmática 6 5,40 0,55 5,35 0,23 4,96 5,84Proteína Sérica g/dL 6 5,28 0,48 5,3 0,20 4,90 5,67CK (UI/L) 6 4222,97 853,35 4469,86 348,38 3540,15 4905,79Leucocitos mm3 6 5813 3695 4750 1509 2857 8770Neutrófilos B. Relativo 6 1,33 1,86 1 0,76 -0,16 2,82Neutrófilos B. Absoluto 6 59,42 80,04 42,5 32,67 -4,62 123,46Neutrófilos S. Relativo 6 45,17 14,30 42 5,84 33,72 56,61Neutrófilos S. Absoluto 6 2939,45 3006,67 1816,25 1227,47 533,61 5345,29Linfocitos Relativo 6 48,67 13,98 51 5,71 37,48 59,85Linfocitos Absoluto 6 2599,47 1062,86 2601,65 433,91 1749,00 3449,93Eosinófilos Relativo 6 1,50 1,38 1 0,56 0,40 2,60Eosinófilos Absoluto 6 70,10 79,59 47,5 32,49 6,42 133,78Monocitos Relativo 6 3,00 3,10 2 1,26 0,52 5,48Monocitos Absoluto 6 130,57 92,13 115,45 37,61 56,85 204,29KC cells Relativo 6 0 0 0 0 0 0 KC cells Absoluto 6 0 0 0 0 0 0

86

Anexo 8. Resultados estadísticos de la Temperatura de los cobayos (Cavia porcellus), inoculados con la cepa

patógena de Clostridium chauvoei.

Temperatura

ºC A B C D E F G

Control

n 18 2 2 2 2 2 2 6

Promedio 35,54 38 38,85 38,45 39,85 28,8 21 38,3

Des. estándar 6,75 0 0,35 0,78 0,21 11,03 1,41 0,58

Mediana 38,2 38 38,85 38,45 39,85 28,8 21 38,3

EE 1,59 0 0,25 0,55 0,15 7,8 1 0,24

LCI 95% 32,42 38 38,36 37,37 39,56 13,51 19,04 37,84

LCS 95% 38,66 38 39,34 39,53 40,14 44,09 22,96 38,76

p 0,0008

87

Anexo 9. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004 Hora inóculo:

8:00 a.m.

Clostridium

chauvoei

DENTIFICACIÓN HORA DE

SACRIFICIO GRUPO BAZO DUODENO HÍGADO PÁNCREAS PULMÓN

MÚSCULO ESTRIADO CARDIACO

01/01/2004 3 A Deplesión

linfoide

Infiltrado

mononuclear SCPA SCPA

Congestión, área de

consolidación con

engrosamiento de septos

alveolares. Neumonía

intersticial

Infiltrado mononuclear

perivascular

01/02/2004 3 A Deplesión

linfoide

Infiltrado

mononuclear

Infiltrado

mononuclear

periportal,

degeneración

centrolobulillar

SCPA

Engrosamiento septos

alveolares, infiltrado

mononuclear, congestión,

neumonía intersticial.

Infiltrado mononuclear

perivascular

01/03/2004 © 3 G

Congestión,

deplesión

linfoidea

Infiltrado

mononuclear SCPA SCPA

Congestión,

engrosamiento septos

alveolares

SCPA

88

Anexo 10. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004 Hora inóculo:

8:00 a.m.

Clostridium

chauvoei

IDENTIFICACIÓN HORA DE

SACRIFICIO GRUPO MÚSCULO ESTRIADO ESQUELÉTICO RIÑÓN CEREBRO ADRENAL

01/01/2004 3 A

Necrosis, congestión, infiltrado

polimorfonuclear, separación fibras,

edema

Congestión cortical y

medular

Congestión, edema

perivascular SCPA

01/02/2004 3 A

Necrosis de coagulación, infiltrado

polimorfonuclear, separación fibras,

edema, hemorragia

SCPA SCPA SCPA

01/03/2004 © 3 G Separación de fibras por edema SCPA SCPA SCPA

89

Anexo 11. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004 Hora inóculo:

8:00 a.m.

Clostridium

chauvoei

IDENTIFICACIÓN HORA DE

SACRIFICIO GRUPO BAZO DUODENO HÍGADO PÁNCREAS PULMÓN

MÚSCULO ESTRIADO CARDIACO

02/01/2004 6 B

Deplesión

linfoide,

congestión

Infiltrado

mononuclear

Congestión,

infiltrado

mononuclear

periportal

SCPA

Engrosamiento

septos

alveolares,

congestión,

hemorragia

Congestión,

infiltrado

mononuclear

perivascular

02/02/2004 6 B SCPA Infiltrado

eosinófilos

Congestión,

infiltrado

mononuclear

periportal

SCPA

Focos,

Engrosamiento

de septos

alveolares

Infiltrado

mononuclear

perivascular

02/03/2004 © 6 G

Congestión,

deplesión

linfoidea ligera

SCPA Congestión

moderada SCPA

Focos,

Engrosamiento

de septos

alveolares, ligera

Congestión

moderada

90

Anexo 12. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004 Hora inóculo:

8:00 a.m.

Clostridium

chauvoei

IDENTIFICACIÓN HORA DE

SACRIFICIO GRUPO MÚSCULO ESTRIADO ESQUELÉTICO RIÑÓN CEREBRO ADRENAL

02/01/2004 6 B

Hemorragia, separación de fibras por

edema, necrosis de coagulación,

infiltrado polimorfonuclear

Congestión,

degeneración vacuolar

tubular

Edema perivascular,

infiltrado de

mononucleares en

meninges, congestión

SCPA

02/02/2004 6 B

Congestión, separación de fibras por

edema, necrosis de coagulación,

hemorragia, infiltrado polimorfonuclear,

precipitación de calcio

Congestión

corticomedular

Congestión, edema

perivascular SCPA

02/03/2004 © 6 G

Separación de fibras por edema,

infiltrado polimorfonuclear ligero,

precipitación de calcio

Congestión

corticomedular ligera Congestión ligera SCPA

91

Anexo 13. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004 Hora inóculo:

8:00 a.m.

Clostridium

chauvoei

IDENTIFICACIÓN HORA DE

SACRIFICIO GRUPO BAZO DUODENO HÍGADO PÁNCREAS PULMÓN

MÚSCULO ESTRIADO CARDIACO

03/01/2004 9 C Congestión

leve

Infiltrado

mononucleares,

leve

Congestión

moderada SCPA

Engrosamiento septos

alveolares con infiltración

mononucleares,

congestión

Infiltrado mononuclear

perivascular leve

03/02/2004 9 C Deplesión

linfoidea leve

Infiltrado

mononuclear Congestión leve SCPA

Engrosamiento septos

alveolares moderado con

infiltrado mononuclear y

congestión moderada

Congestión, infiltrado

mononuclear

perivascular, leve

03/03/2004 © 9 G

Congestión,

deplesión

linfoidea ligera

Infiltrado

mononuclear

ligero

Congestión ligera,

infiltrado

mononuclear

periportal ligero

SCPA

Engrosamiento

generalizado de septos

alveolares con focos de

infiltrado mononuclear

Congestión moderada e

infiltrado perivascular

mononuclear ligero

92

Anexo 14. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004 Hora inóculo:

8:00 a.m.

Clostridium

chauvoei

IDENTIFICACIÓN HORA DE

SACRIFICIO GRUPO

MÚSCULO ESTRIADO ESQUELÉTICO

RIÑÓN CEREBRO ADRENAL

03/01/2004 9 C

Separación de fibras por edema,

necrosis coagulativa moderada,

hemorragia leve, infiltrado

polimorfonuclear moderado

Congestión cortical y

medular leve

Edema perivascular,

congestión SCPA

03/02/2004 9 C

Hemorragia, separación de fibras por

edema, necrosis de coagulación,

infiltrado polimorfonuclear, presencia

de bacterias bacilares basófilas

Congestión corticomedular,

foco de infiltrado

mononuclear en médula

Congestión, edema

perivascular ligero SCPA

03/03/2004 © 9 G

Necrosis, congestión, infiltrado

polimorfonuclear, separación fibras,

edema, ligero

Congestión cortical y

medular moderada SCPA SCPA

93

Anexo 15. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004 Hora inóculo:

8:00 a.m.

Clostridium

chauvoei

IDENTIFICACIÓN HORA DE

SACRIFICIO GRUPO BAZO DUODENO HÍGADO PÁNCREAS PULMÓN

MÚSCULO ESTRIADO CARDIACO

04/01/2004 12 D Deplesión

linfoidea ligera

Infiltrado

mononucleares,

leve

Congestión ligera,

infiltrado

mononuclear

periportal ligero

SCPA

Congestión, área de

consolidación con

engrosamiento de septos

alveolares. Neumonía

intersticial

Congestión leve

04/02/2004 12 D SCPA

Infiltrado

mononuclear

ligero

Congestión

moderada SCPA

Focos de consolidación ,

engrosamiento de septos

alveolares

Congestión ligera

04/03/2004 © 12 G

Deplesión

linfoidea,

congestión

Infiltrado

mononuclear

ligero

Congestión leve SCPA

Engrosamiento

generalizado de septos

alveolares con focos de

infiltrado mononuclear,

congestión moderada

Congestión leve

94

Anexo 16. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004 Hora inóculo:

8:00 a.m.

Clostridium

chauvoei

IDENTIFICACIÓN HORA DE

SACRIFICIO GRUPO

MÚSCULO ESTRIADO ESQUELÉTICO

RIÑÓN CEREBRO ADRENAL

04/01/2004 12 D

Separación de fibras por edema,

necrosis coagulativa moderada,

congestión moderada, infiltrado

polimorfonuclear severo con

presencia de abundantes bacterias y

áreas de precipitados de calcio

Congestión cortical y

medular leve, infiltrado

mononuclear subepitelial en

pelvis

Congestión ligera SCPA

04/02/2004 12 D

Congestión moderad y hemorragia

ligera. Infiltrado polimorfonucleares

con presencia de bacterias,

separación de fibras y necrosis

coagulativa

Congestión corticomedular,

severa

Congestión moderada

con edema

perivascular ligero

SCPA

04/03/2004 © 12 G

Necrosis, congestión, infiltrado

polimorfonuclear, separación fibras,

edema, ligero

SCPA Congestión ligera SCPA

95

Anexo 17. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004 Hora inóculo:

8:00 a.m.

Clostridium

chauvoei

IDENTIFICACIÓN HORA DE

SACRIFICIO GRUPO BAZO DUODENO HÍGADO PÁNCREAS PULMÓN

MÚSCULO ESTRIADO CARDIACO

05/01/2004 15 E

Congestión ligera

y presencia de

hemosiderófagos

Infiltrado

mononuclear

Congestión

moderada SCPA

Congestión, área de

consolidación con

engrosamiento de

septos alveolares.

Neumonía intersticial,

moderado

Congestión moderada

e infiltrado

perivascular

mononuclear ligero

05/02/2004 15 E

Congestión ligera

y presencia de

hemosiderófagos

Infiltrado

mononuclear

ligero

Infiltrado

periportal

mononuclear

ligero y

Congestión

ligera

SCPA engrosamiento de

septos alveolares

Congestión ligera

infiltrados

mononucleares

perivasculares ligeros

05/03/2004 © 15 G Deplesión

linfoidea

Infiltrado

mononuclear

en submucosa

ligero

Infiltrado

mononuclear

periportal, ligero

SCPA

Engrosamiento

generalizado de

septos alveolares con

focos de infiltrado

mononuclear,

congestión moderada

SCPA

96

Anexo 18. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004 Hora inóculo:

8:00 a.m.

Clostridium

chauvoei

IDENTIFICACIÓN HORA DE

SACRIFICIO GRUPO

MÚSCULO ESTRIADO ESQUELÉTICO

RIÑÓN CEREBRO ADRENAL

05/01/2004 15 E

Separación de fibras por edema,

necrosis de coagulación, infiltrado

polimorfonuclear, mononucleares

Congestión cortical y

medular moderada,

infiltrado mononuclear

perivascular

Edema perivascular

ligero, área gliosis SCPA

05/02/2004 15 E

Congestión modera, Infiltrado

polimorfonucleares con presencia

de bacterias, separación de fibras y

necrosis coagulativa

Congestión corticomedular,

ligera

Congestión ligera,

edema perivascular

ligero

Hemorragia

severa

05/03/2004 © 15 G Necrosis coagulación Congestión ligera Congestión ligera SCPA

97

Anexo 19. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004 Hora inóculo:

8:00 a.m.

Clostridium

chauvoei

IDENTIFICACIÓN HORA DE

SACRIFICIO GRUPO BAZO DUODENO HÍGADO PÁNCREAS PULMÓN

MÚSCULO ESTRIADO CARDIACO

06/01/2004 18 F

Congestión

moderada,

deplesión

linfoide severa

Infiltrado

mononuclear

Infiltrado

mononuclear

periportal ligero y

congestión ligera

SCPA

Congestión, área de

consolidación con

engrosamiento de septos

alveolares. Edema ligero

Congestión ligera e

infiltrado

perivascular

mononuclear ligero

06/02/2004 18 F

Congestión

moderada,

deplesión

linfoide

moderada

Infiltrado

mononuclear y

polimorfonuclear

Congestión,

infiltrado

mononuclear

periportal

SCPA

Congestión, área de

consolidación con

engrosamiento de septos

alveolares. Edema ligero

Congestión

moderada e

infiltrado

perivascular

mononuclear ligero

06/03/2004 © 18 G

Deplesión

linfoidea ligera,

congestión

ligera

Infiltrado

mononuclear en

submucosa

ligero

Infiltrado

mononuclear

periportal,

congestión ligera

SCPA

Engrosamiento

generalizado de septos

alveolares con focos de

infiltrado mononuclear,

congestión moderada

SCPA

98

Anexo 20. Resultados de histopatología de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004 Hora inóculo:

8:00 a.m.

Clostridium

chauvoei

IDENTIFICACIÓN HORA DE

SACRIFICIO GRUPO

MÚSCULO ESTRIADO ESQUELÉTICO

RIÑÓN CEREBRO ADRENAL

06/01/2004 18 F

Separación de fibras por edema,

necrosis de coagulación, infiltrado

polimorfonuclear, mononucleares,

bacterias bacilares basófilas, severo

Congestión cortical y

medular moderada,

degeneración vacuolar de

túbulos ligera

Congestión SCPA

06/02/2004 18 F

Separación de fibras por edema,

necrosis de coagulación, infiltrado

polimorfonuclear, mononucleares,

bacterias bacilares basófilas, severo

Congestión cortical y

medular ligera

Congestión ligera,

infiltrado mononuclear

en meninges

SCPA

06/03/2004 © 18 G Ligero infiltrado polimorfonuclear Congestión corticomedular

ligera Congestión ligera SCPA

99

Anexo 21. Resultados estadísticos de la calificación de lesiones histopatológicas en tejido de Cavia porcellus inoculados

con la cepa patógena de Clostridium chauvoei

Tejido Mean Std. dev. Min Max p

Bazo 1,11 0,68 0 3 0,06

Duodeno 0,89 0,76 0 2 0,08

Hígado 1,06 0,64 0 2 0,19

Páncreas 0,00 0,00

Pulmón 2,00 0,69 1 3 0,81

MEC 0,94 0,73 0 2 0,09

MEE 1,61 0,85 0 3 0,00

Riñón 1,17 0,79 0 3 0,48

Cerebro 0,89 0,47 0 2 0,40

Adrenal 0,11 0,47 0 2 0,23

P = Nivel de significancía; MEC: Músculo estriado cardiaco; MEE: Músculo estriado esquelético; © = Grupos testigo

inoculados con Cloruro de Calcio.

100