UNIVERSIDAD DE COLIMA

Facultad de Ciencias Químicas

Químico Farmacéutico Biólogo

Bioquímica ll

“Identificación de catalasa hepática en tejidos animales y vegetales; aislamiento y medición de la actividad enzimática

en eritrocito humanos”

Practica No.2

Quinto Semestre

Doctora Nélida Araceli Medina Pineda

Integrantes:

Jonathan Eduardo González Anguiano

Juan Manuel Herrera Zamora

Fernando Osuna López

Coquimatlán, Colima 10 de Septiembre del 2015

Introducción

Las especies de oxígeno reactivas como el radical superóxido, el radical hidroxilo y el peróxido de hidrógeno (H2O2) se forman durante la reducción del dioxígeno en agua. Estas especies pueden dañar las proteínas, los lípidos y los ácidos nucleicos, por lo que se requieren sistemas antioxidantes eficientes, entre los que se incluyen ciertas enzimas. El peróxido de hidrógeno se forma por la dismutación del radical superóxido y también en la reacción de algunas oxidasas. Hay varias enzimas capaces de degradar el peróxido de hidrógeno: las catalasas, las peroxidasas y las peroxirredoxinas (1, 2). Las peroxidasas eliminan el H2O2 usándolo para oxidar otros sustratos. A diferencia de las otras enzimas, que requieren de un sustrato reducido, las catalasas dismutan el peróxido de hidrógeno. Se han identificado tres grupos de catalasas:

i) Las catalasas mono funcionales, que contienen hemo y están presentes tanto en los organismos procariotas como en los eucariotas.

ii) Las Mn-catalasas, que son enzimas hexaméricas que no tienen hemo, tienen Mn en el sitio activo y sólo están presentes en algunos organismos procariontes aerobios.

iii) Las catalasas-peroxidasas, que tienen actividad de catalasa y de peroxidasa, contienen hemo y sólo están presentes en las bacterias y los hongos.

La mayoría de los organismos aerobios tienen catalasas mono funcionales. Las catalasas catalizan la dismutación del peróxido de hidrógeno en agua y dioxígeno evitando así que se forme el radical hidroxilo y el oxígeno singulete, especies de oxígeno que son muy reactivas. En el hombre, la catalasa protege la hemoglobina del peróxido de hidrógeno que se genera en los eritrocitos. También tiene un papel de protección en la inflamación, en la prevención de mutaciones, evita el envejecimiento y cierto tipo de cáncer. Las mutaciones en el gen de la catalasa pueden resultar en la enfermedad hereditaria denominada acatalasemia que entre otros síntomas se reconoce por un incremento en la incidencia de ulceraciones bucales.

El mecanismo de reacción

En la reacción de la catalasa ocurre la transferencia de dos electrones entre dos moléculas de peróxido de hidrógeno en la cual una funciona como donador y otra como aceptor de electrones. El mecanismo de reacción se lleva a cabo en dos pasos. En el primero la catalasa se oxida por una molécula de peróxido formando un intermediario llamado compuesto I. El compuesto I se caracteriza por tener un grupo ferroxilo con Fe IV y un radical catiónico de porfirina. En esta reacción se

produce una molécula de agua (Reacción 1). En el segundo paso de la reacción, el compuesto I es reducido por otra molécula de peróxido regresando la catalasa a su estado inicial y produciendo agua y dioxígeno (Reacción 2). En ciertas condiciones el compuesto I puede captar un electrón originando el compuesto II. El compuesto II tiene un estado de oxidación intermedio a los observados en el compuesto I y la catalasa en reposo. Al reaccionar con una molécula de H2O2 forma el compuesto III, que tiene un estado de oxidación Fe IV. El compuesto II y el compuesto III son inactivos catalíticamente. La catalasa también puede catalizar ciertas reacciones como peroxidasa. En la reacción de peroxidasa de la catalasa, el compuesto I puede oxidar el metanol, el etanol, el formato o el nitrato utilizando una molécula de H2O2 como oxidante. En el cerebro, la reacción de la catalasa con el etanol forma acetaldehído (Reacción 3), que explica algunos de los efectos neurológicos del alcohol en humanos.

Enz (Por-FeIII) + H2O2 → Compuesto I (Por+•-FeIV-O) + H2O ❶

Compuesto I (Por+•-FeIV-O) + H2O2 → Enz (Por-FeIII) + H2O + O2 ❷

Compuesto I (Por+•-FeIV-O) + CH3CH2OH → Enz (Por-FeIII) + CH3CHO + H2O ❸

Antecedentes

Las catalasas mono funcionales son de dos tipos: las catalasas con subunidades pequeñas (masa molecular ≈ 60 kDa) y las catalasas con subunidades grandes (masa molecular > 80 kDa). Las primeras (Fig. 1A) se encuentran en los mamíferos, las plantas, los hongos y la mayoría de las bacterias y tienen la característica de unir NADPH y de ser inhibidas e inactivadas por sustrato. La unión del NADPH es para prevenir la acumulación del compuesto II y III.

Las catalasas grandes sólo están presentes en los hongos y en las bacterias, no unen NADPH, tienen un dominio en el C-terminal semejante a la flavodoxina y son resistentes al H2O2.

Un estudio cinético muestra que la catalasa de hígado de bovino (BLC: “bovine liver catalase”), que es una catalasa pequeña, se inhibe reversiblemente y se inactiva irreversiblemente a partir de 200 mM de H2O2, mientras que la catalasa R de Aspergillus niger, que es una catalasa grande, no muestra inhibición reversible e inactivación irreversible con 2 M de sustrato. La inhibición reversible de la BLC se debe a la acumulación del compuesto III (5). Otra catalasa grande que no se inhibe reversiblemente y no se inactiva irreversiblemente con altas concentraciones de H2O2 (3 M) es la Catalasa-1 de Neurospora crassa (CAT-1). Además de su resistencia al H2O2, la CAT-1 presenta cooperatividad en altas concentraciones de sustrato (> 200 mM) (Díaz A, Muñoz-Clares R A y Hansberg W. Manuscrito en preparación).

Para poder entender estas diferencias funcionales es importante conocer la estructura tridimensional de las distintas catalasas. Estableciendo correlaciones estructura-función se podrá desentrañar el mecanismo íntimo de la reacción.

DESCRIPCIÓN DE LA ORGANIZACIÓN DE LAS CATALASAS

Las catalasas mono funcionales están formadas por los siguientes dominios: 1) el amino terminal, 2) un barril β con ocho hebras antiparalelas, 3) el asa envolvente, 4) un dominio de hélices (Fig. 1A) (4) y, en el caso de las catalasas grandes, el dominio tipo flavodoxina del carboxilo terminal.

El amino terminal comprende desde el primer aminoácido hasta el residuo de histidina esencial catalítico. Esta región de aproximadamente 60 aminoácidos

tiene poca similitud entre las secuencias de las catalasas y se observa como un brazo torcido que se entierra en las subunidades vecinas. Contiene a la hélice α2 que es el primer elemento de estructura secundaria común en las catalasas. La HPII tiene el amino terminal más largo, con 90 aminoácidos. En tres estructuras de catalasa los primeros aminoácidos del amino terminal están desordenados, en la SCCA son los primeros 14 aminoácidos, en la HPII de E. coli son los primeros 26 aminoácidos y en la CAT-1 de N. crassa son los primeros 17 aminoácidos (Díaz A, Rudiño-Piñera E, Arreola R, Horjales E y Hansberg W. Manuscrito en preparación), por lo que no se observan en los mapas de densidad electrónica y no se incluyen en los modelos moleculares.

El barril β con ocho hebras antiparalelas es el dominio más conservado de las catalasas; se clasifica como estructura α+β y abarca aproximadamente 260 aminoácidos. Las primeras cuatro hebras (β1-4) son consecutivas y están separadas por tres hélices (α3-5) del segundo grupo de cuatro hebras (β5-8). La primera mitad del barril β contiene la histidina y la asparagina esenciales del sitio activo. La continuidad de los puentes de hidrógeno entre las hebras del barril β se pierde entre las hebras β4 y β5 dónde hay sólo dos puentes de hidrógeno con la asparagina esencial. La hebra β5 es irregular porque tiene tres aminoácidos (Ser196, His197 y Thr198 en PMC) que no participan en la hoja β. Lo anterior permite que el amino terminal de la hebra β5 se una a las hebras β4 y β6 para cerrar el barril β. Entre las hebras β6 y β7 hay dos hélices (α6 y α7). La segunda mitad del barril funciona para unir el NADPH en las catalasas BLC, PMC, MLC, SCCA y HEC. La última hélice (α8) es una hélice tipo π en BLC, PVC, CAT-1 y posiblemente en todas las otras estructuras de catalasa.

La principal diferencia estructural entre las catalasas pequeñas y las grandes es la presencia, en estas últimas de un dominio extra en el carboxilo terminal de aproximadamente 150 aminoácidos. Éste es un dominio del tipo α/β formado por cuatro hélices alfa (α15-18) y ocho hebras β (β9-16) cuya topología es semejante a la flavodoxina.

EL GRUPO HEMO Y SU FUNCIÓN

La localización del hemo y su ambiente están muy conservados en las catalasas. El hemo no está unido covalentemente y se encuentra enterrado entre el barril β y dos hélices (α4 y α12). La distancia del hemo a la superficie del tetrámero es de aproximadamente 20 Å. Los grupos propionato del hemo están enterrados y estabilizados por puentes salinos con tres argininas conservadas. (Departamento de Bioquímica, Instituto de Fisiología Celular, UNAM. México, D. F. C. P. 04510. Teléfono: 5622 5655, Fax: 5622 5630. Correo E: adiaz@ifisiol.unam.mx. : http://www.uacj.mx/ICB/redcib/Documents/REB_DOC/2003/06/20032_LA%20ESTRUC_.pdf)

(1. Maté MJ, Zamocky M, Nyquirí LM, Herzog C, Alzari PM, Betzel C, Koller F y Fita I (1999) Structure of catalase-A from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol 286:135-149).

(2. Lledías F, Rangel P y Hansberg W (1998) Oxidation of catalase by singlet oxygen. J Biol Chem 273:10630-10637).

OBJETIVO GENERAL:

Aislar e identificar la presencia de la enzima catalasa y comprobar algunas de sus propiedades específicas.

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

1.- Aislar y comprobar experimentalmente la presencia de la catalasa en diversos tejidos animales y vegetales. 2.- Demostrar la desnaturalización proteica de la enzima catalasa por medio de calor3.- Realizar la medición de la actividad enzimática de la catalasa en eritrocitos humanos.

MATERIAL:

8Tubos de ensayo de 13 x 150 1 Gradilla para tubos de ensayo 3 Pinza para tubos de ensayo 1 Mechero Bunsen 1 Mortero con pistilo 2 Vasos de precipitado de 100 ml 1 Vaso de precipitado de 250 ml 5 Matraces Erlenmeyer de 50 ml.

1 Matraz aforado de 100 ml. 1 Pipetas serológicas de 0.1 ml 2 Pipetas serológicas de 1 ml 2 Pipeta graduada de 5ml 1 Pipeta graduada de 10 ml. 1 Bureta de 50 ml 1 Soporte universal 1 Pinzas para bureta. 1 Tubos de ensayo de13 x 100 con tapón esmerilado 1 Baño de temperatura constante (100 C) o incubadora (para todo el

grupo) 1 Recipiente para baño de hielo (por equipo)

REACTIVOS:

Agua oxigenada comercial (traer un frasco pequeño el alumno) AGUA DESTILADA FRÍA Acido sulfúrico 6 N (250 (ml) Amortiguador de fosfatos 0.02 M (pH= 7.0) (500 ml) Permanganato de potasio, 0.005M (500 ml) Peróxido de Hidrógeno 0.05M (250 ml) Sal di sódica de EDTA al 1% (50 ml) o en su caso tubo Vacutainer con

heparina

MATERIAL BIOLÓGICO Y ADICIONAL

- Fuentes animales: Hígado (res, cerdo),

- Vegetales: papa, cebolla, col, zanahoria, pepinos.

- Frutas: manzana, piña, plátanos.

- Sangre humana completa obtenida en el momento de realizar la práctica

- Hielo

Desarrollo Experimental:

Para comenzar cada equipo se encargo de hacer un macerado de su fruta o verdura que les tocó (plátano, zanahoria, papa, cebolla, col, pepinos, piña, manzana) con agua destilada, utilizando un mortero con pistilo y se depositaron

los macerados en vasos de precipitados. De igual manera se hizo con el hígado de res, para obtener su macerado. Y también se realizo la extracción de sangre con vacutainer, la cual se coloco con en un tubo con heparina y este se coloco en hielo inmediatamente.

Para la primera prueba se colocaron 2.5 ml. de macerado de cada fruta, cada verdura, del hígado y de sangre en un tubo de ensayo diferente cada uno, se rotularon y después a cada uno se le agregaron 10 gotas de agua oxigenada y se observó lo que sucedió al colocar las gotas (generación de espuma).

Para la siguiente prueba se realizó de igual manera el primer paso, (colocar 2.5 ml. de cada macerado en un tubo de ensayo diferente), luego de tener los macerados en los tubos estos se rotularon y después se procedió a tomar un tubo de ensayo y colocarlo al mechero hasta ebullición y después de alcanzar el punto de ebullición se colocaron 10 gotas de agua oxigenada y se observo lo que sucedió (espuma), se hizo el mismo procedimiento con cada uno de los tubos con macerado.

En la siguiente prueba en un matraz aforado de 100 ml se colocaron 25 ml de agua destilada fría, se pipeteo exactamente 0.1 ml de la sangre extraída y se coloco en el matraz aforado con agua destilada fría y se pipeteo varias veces hasta corroborar que toda la sangre quedo en el matraz, se procedió a agitar el matraz durante 1 minuto para homogeneizar la mezcla y una vez homogeneizada la mezcla se aforo a 100 ml con agua destilada fría. Después de esto se procedió a colocarla en agua fría para evitar desnaturalización de la enzima.

Después se procedió a preparar cinco matraces de 50 ml según indica la siguiente tabla. Todos los matraces deben estar en agua fría pues la reacción se lleva a cabo a esa temperatura. Después de añadir cada reactivo mezclar con movimientos de rotación.

Una vez que se tiene todo listo se procedió a titular el H2O2 restante en cada uno de los matraces con KMNO4 0.005.

Observaciones:

En la primera prueba que realizamos sobre presencia de catalasa en tejidos logramos observar como dio positiva esta prueba para: papa, zanahoria, pepino, plátano, manzana, hígado, sangre. Dio positiva debido a que la prueba positiva consistía en observar la creación de espuma al agregar agua oxigenada. De igual manera observamos como en cebolla, piña, y col no creo espuma lo que nos indicó que no hay presencia de catalasa en estas pruebas.

Para la siguiente parte de la primera prueba la cual consistió en el mismo método que la primera parte a excepción de que antes de agregar el agua oxigenada se calentó cada uno de los tubos de ensayo a punto de ebullición logramos observar que todas las pruebas dieron negativo ya que no creo espumar al agregar el agua oxigenada, esto se debió a que al calentar el tubo el tejido que contenía la enzima se desnaturalizo y perdió la actividad catalítica.

Para la segunda y última prueba al momento de titular logramos observar que el primer matraz necesito 2 ml para virar a color rosa, en cambio los matraces 3 y 4 solo necesitaron 3 gotas para virar a rosa, mientras que el segundo matraz necesito solo 2 gotas para virar a rosa y el ultimo matraz necesito 4 gotas para virar a color rosa. Observamos como todos cambiaron a color rosa, y también como al primer matraz se le tuvo que agregar más gotas para que virara a color rosa esto debido a que antes de añadir la enzima y titular se añadieron 2ml de H2S04.

Resultados:

tejidos papa

Cebolla

zanahoria

pepino

plátano

manzana

piña

hígado

Sangre completa

Tejidos mas H2O2 a T ambiente

Si no si si si si no si si

Tejido mas calor, mas H2O2

no no no no no no no no no

reactivos 1(ml) 2(ml) 3(ml) 4(ml) 5(ml)Amortiguador de fosfatos 0.02 M (pH)

10 10 10 10 10

H202 0.005M (S)

2 2 2 2 2

catalasa0 centígrados (inactiva)

.5 .5 .5 .5

catalasa desnaturalizada por calor

.5

H2SO4 6N 2 ml antesde añadir la enzima

2

6 minutos

2

después de

2

añadir la

2

catalasa

Discusiones:

Al analizar los resultados discutimos que la enzima catalasa se encuentra tanto en tejidos animal como vegetal, ya que ambos producen a causa del metabolismo peróxido que es toxico, y como ya lo aviamos mencionado esta enzima lo descompone en agua y oxigeno, pero al realizar la practica nos dimos cuenta que la catalasa esta presente principalmente en los tejidos animales, en este caso fue el hígado y la sangre ya que al agregar el agua oxigenada comercial mostraba mayor efervescencia que todos los tejidos vegetales que utilizamos, en los cuales

algunos de estos no presentaron actividad a simple vista tal es el caso de la cebolla y la piña.

En la prueba de medición de la actividad enzimática en el tubo numero uno o blanco se necesitaron dos mililitros, el cual teóricamente nos muestra que es la actividad máxima de la enzima, en el matraz dos se necesitaron 2 gotas (cada gota equivale de 0.0648524 ml), en el matraz 3 que también lo utilizamos como blanco para la determinación de otras sustancias externas a la reacción utilizamos tres gotas, en el matraz numero 4 utilizamos tres gotas y finalmente en el matraz numero 5 utilizamos 4 gotas. Todos los matraces viraron a un color rosa, lo cual nos dice que es positivo a la prueba.

Cálculos:

Fomula.

mol de H2O2 = ml de KMNO4 x 2.5 x 1000

1

μmol de H2O2 iniciales = ml matraz 1 x 2.5 x 1000 =

2ml x 2.5 x 1000 = 5000

μmol de H2O2 restantes = ml matraz 2 x 2.5 x 1000 =

(.06 x 2) =0.12 x 2.5 x 1000 = 300 ml matraz 3 x 2.5 x 1000 =

(.06 x 3) = 0.18 x 2.5 x 1000 = 450 ml en el matraz 4 x 2.5 x 1000 =

(.06 x 3) = 0.18 x 2.5 x 1000 = 450 ml en el matraz 5 x 2.5 x 1000 =

(.06 x 4) = .24 x 2.5 x 1000 = 600-sumatoria (300+450+450+600)=1800

2

μmol de H2O2 descompuesto = μmol de H2O2 iniciales - μmol de H2O2 restantes. = 5000 – 1800 = 3200

Actividad enzimático =mol de H2O2 descompuesto/4x102 = 3200/4x102 = 1280000

Conclusiones:

Con respecto a la tabla uno (superior), concluimos que la actividad catalítica de los tejidos que presentaron la enzima catalasa al agregar el H2O2 a temperatura ambiente, ya no mostraban o se perdía la actividad catalítica al someter a calor la enzima por que ocurría un proceso de desnaturalización permanente (al enfriar no regresaban a su actividad enzimática) y por ende no reaccionaba con el H2O2.

En la tabla dos (inferior) concluimos que la catalasa no cambiaba o no variaba a pesar que la sometimos o la utilizamos, tanto desnaturalizada por calor, como inactiva a cero grados centígrados y esto se debe a que a pesar de los cambios físicos primarios en ambos casos se dejo agitando la enzima durante unos segundos lo cual permite que la enzima que no estuviera activa se active y la q estaba desnaturalizada se re naturalice, y así produce su actividad catalítica.

Bibliografía:

http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/enzima-catalasa

http://www.uacj.mx/ICB/redcib/Documents/REB_DOC/2003/06/20032_LA%20ESTRUC_.pdf

https://es.wikipedia.org/wiki/Catalasa

http://tesisdeinvestigadores.blogspot.mx/2011/05/la-catalasa-enzima.html

Cuestionario:

1.- De acuerdo al tipo de reacción que cataliza ¿A que grupo de enzimas pertenece la catalasa?

Peroxidasas

2.- ¿Por qué burbujeaba el hígado al agregarse el agua oxigenada?

Presencia de niveles altos de catalasa

3.- ¿Por qué se usaba (o se usa) el agua oxigenada como desinfectante?

La existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como muchas de las bacterias patógenas son anaerobias (no pueden vivir con oxígeno),

mueren con el desprendimiento de oxígeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos actúa sobre el agua oxigenada.

4.- ¿Qué tipo de organismos producen la enzima catalasa?

La mayoría de los organismos vivos.

5.- ¿Qué podría suceder si el agua oxigenada se le agrega a una colonia de bacterias?

Las bacterias anaerobias, mueren al estar en contacto con oxígeno, es por esta razón que el oxígeno producido por esta enzima tiene efecto bactericida sobre estos microorganismos. Al agregar agua oxigenada a la colonia estas morirían.

6.- ¿Por qué se obtuvieron resultados diferentes en el ensayo 1.1 y 1.2?

Esto se debe a que en el ensayo 1.2 se desnaturalizo la enzima, esto hizo que los resultados fueran todos negativos en este punto y ninguno diera espuma como presencia de catalasa.

7.- Investigar en bibliografía las características químicas, el nombre sistemático y el número asignado por la comisión de enzimas para la catalasa.

Catalasa (peróxido de hidrogeno peroxidasa). La catalasa es una enzima perteneciente a la categoría de las oxidorreductasas que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno (H202) en oxígeno y agua. Esta enzima utiliza como cofactor al grupo hemo y al manganeso.

8.- Escribir dos reacciones donde haya formación de peróxido de hidrógeno.

H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E

H2O2 + O=Fe(IV)-E → H2O + Fe(III)-E + O2

9.- Escriba la reacción catalizada por la catalasa.

2 H2O2 2 H2O + O2

10.- Escribir en la siguiente tabla los datos y resultados que se indican.

MATRAZ NÚMERO

1 2 3 4 5

ml de KMNO4 0.005 M utilizado

mol de H2SO4 iniciales

mol de H2O2

descompuestos (en 5 min./5x10-4 ml de sangre)

Actividad Enzimática

11.- Investigue en bibliografía la actividad enzimática de la catalasa

El peróxido de hidrógeno es un residuo del metabolismo celular de muchos organismos vivos y tiene como función protectora contra microorganismos patógenos, principalmente anaerobios, pero dada su toxicidad debe transformarse rápidamente en compuestos menos peligrosos. Esta función la efectúa esta enzima que cataliza su descomposición en agua y oxígeno.