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Biología

(Tema 5)

Carmen Fagoaga carmen.fagoaga@ucv.es

1er Curso 2015-2016

PREGUNTAS CON RESPUESTAS

Biología

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Tema 5. Tecnología del DNA recombinante

A) Lo que vamos a ver…

5.1. Primeros experimentos

5.2 Clonación. Esquema general

5.3 Elementos básicos

5.4 Métodos de clonación

5.5 Clonación en bacterias

5.5.1. Tipos de vectores

5.5.2. Métodos de transformación

5.6 Aplicaciones

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5.1. Primeros experimentos

Veamos esquemáticamente algunos eventos esenciales para entender el surgimiento de la tecnología del ADN recombinante:

· A partir de 1865, Mendel establece las bases de la genética. En sus famosos experimentos con el guisante, descubrió el modo de transmisión de ciertos caracteres desde una generación a las siguientes, y su "mezcla" en el aporte materno y paterno.

· Los hallazgos de Mendel permanecieron en el olvido hasta 1900. En 1909 se acuña el término "gen" (o gene) para referirse a la entidad hipotética responsable de los rasgos observables.

· Pero la naturaleza del material genético fue objeto de polémicas durante mucho tiempo, hasta que entre los años 40 y primeros 50 una serie de autores (Avery y colaboradores, Hershey y Chase, etc.) establecen firmemente que el material de la herencia reside en el ácido desoxirribonucleico.

· En los 40 y 50 se produce, en efecto, un "desembarco" de físicos y cristalógrafos en el abordaje de cuestiones biológicas. Es la época del florecimiento de técnicas como la difracción de rayos X, la ultracentrifugación y la cromatografía.

· En 1951 un joven biólogo estadounidense, James Watson, llega al laboratorio Cavendish de la Universidad de Cambridge, para pasar una estadía postdoctoral. Allí se une al inglés Francis Crick, y 18 meses más tarde (primavera de 1953) publican en la revista Nature su modelo tridimensional de la doble hélice del ADN. Con ello se abría en principio una nueva manera de estudiar la base genética de los seres vivos: de dentro (genotipo) a fuera (fenotipo), al revés de lo que se venía haciendo desde Mendel.

A continuación se abre un decenio llamado a menudo la "Edad de Oro de la Biología Molecular", que pone las bases de la comprensión de los procesos básicos de la herencia y de la expresión genética:

· El "Dogma Central" de la Biología Molecular: la información fluye unidireccionalmente en sentido ADN -> ARN -> proteína.

· El desciframiento del código genético: el lenguaje del ADN consta de "palabras" de tres letras (nucleótidos), llamadas codones. Cada codón tiene un equivalente en el lenguaje de la proteína, significando uno de los 20 aminoácidos. Existen 64 codones, de los cuales tres carecen de sentido: no tienen equivalente aminoácido, y sirven como señales de parada de la traducción del mensajero.

Pero aparte de estos avances básicos, a finales de los años 60, seguía pendiente de plasmación una de las expectativas abiertas por el descubrimiento de la estructura del ADN: ¿cómo llegar a "tocar" el ADN?, ¿cómo estudiar cada gen por separado, aislándolo físicamente de los demás?, ¿cómo determinar su secuencia de bases?

Cuando los científicos comprendieron la estructura de los genes y cómo la información que portaban se traducía en funciones o características, comenzaron a buscar la forma de

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aislarlos, analizarlos, modificarlos y hasta de transferirlos de un organismo a otro para conferirle una nueva característica. Justamente, de eso trata la Ingeniería Genética, que se podría definir como:

Un conjunto de metodologías que permite transferir genes de un organismo a otro y expresarlos (producir las proteínas para las cuales estos genes codifican) en organismos diferentes al de origen. El ADN que combina fragmentos de organismos diferentes se denomina ADN recombinante. En consecuencia, las técnicas que emplea la ingeniería genética se denominan técnicas de ADN recombinante. Los primeros experimentos de este tipo que se llevaron a cabo fueron:

1. Fusión de dos plásmidos diferentes de E. coli Primeras moléculas de DNA recombinante. Experiencias de Stanley Cohen y Herbert Boyer en la Universidad de California. (Cohen et al., 1972.)

2. Fusión de dos plásmidos de especies bacterianas distintas (E. coli y Staphilococus aureus).

3. Introducción de un DNA eucariótico en un plásmido ( plásmido de E. coli + DNA de Xenopus)

Se vió que era factible hacer toda clase de experimentos en los que se recombina ADN de organismos totalmente diferentes (bacterias, plantas, animales). Con el fin de poner restricciones a la clonación de ADN, en 1975 se celebró una reunión de más de cien biólogos moleculares internacionalmente reconocidos en Asilomar (California) y se llegó al acuerdo de que sólo se debía clonar ADN en organismos que hubieran sido dañados genéticamente de forma que no pudieran vivir bien fuera del tubo de ensayo.

Esto nos lleva ya a la idea de lo que es la Ingeniería Genética: la formación in vitro de nuevas combinaciones de material genético, por medio de la inserción de un ADN de interés en un vehículo genético (vector), de modo que tras su introducción en un organismo que hospeda el ADN híbrido (recombinante) se pueda multiplicar, propagar, y eventualmente expresarse.

Los experimentos de DNA recombinante se definen como aquellos que implican moléculas que consisten en diferentes segmentos de DNA unidos en sistemas libres de células, y que tienen capacidad para infectar y replicarse en algunas células hospedadoras, ya sea autónomamente o como parte integrada del genoma del hospedador.

Dentro del ámbito de la Ingeniería genética, ¿qué es un clon?

Clon: son células o colonias bacterianas descendientes e idénticas a una célula original y por lo tanto tienen la misma composición genética. El concepto de clon puede ir ligado, o no a las técnicas del DNA recombinante.

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5.2. Clonación. Esquema general ¿Qué es la clonación?

La clonación (del griego κλών, "retoño, rama") puede definirse como el proceso por el que se consiguen, de forma asexual copias idénticas de un organismo, célula o molécula ya desarrollado.

Si nos referimos al ámbito de la Ingeniería Genética, clonar es aislar y multiplicar en un tubo de ensayo un determinado gen o, en general, un trozo de ADN. Es decir llamamos clonación génica al procedimiento por el cual se introduce un gen o un fragmento de DNA en una célula “hospedadora” donde se multiplicará cuando la célula se divide.

5.3. Elementos básicos

Para estudiar los genes los biólogos tenían que ser capaces de aislarlos uno a uno a partir del cromosoma, que es demasiado grande para su manipulación inmediata. Pero ¡cómo hacerlo?. Todavía no se habían descubierto nucleasas específicas capaces de cortar en puntos determinados del ADN para generar fragmentos discretos y homogéneos. Fue precisamente el descubrimiento diversas enzimas en bacterias y virus el que abrió definitivamente el camino hacia la manipulación del ADN. A comienzos de los años 70 cuando se descubrieron las siguientes enzimas:

· Endonucleasas de restricción: enzimas bacterianas que reconocen secuencias

específicas del ADN, y cortan la cadena cada vez que esta secuencia aparece. Existen endonucleasas de restricción que cortan el ADN en diferentes puntos · ADN ligasas: enzimas que “pegan” fragmentos de ADN.

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Las enzimas de restricción, conocidas también como endonucleasas, sólo cortan el ADN si reconocen en su interior una secuencia específica de nucleótidos. Estas enzimas fueron descubiertas en microorganismos. De hecho, se encuentran sólo en organismos procariotas (bacterias). Por esto, se les dio una nomenclatura asociada al organismo de donde provienen. Por ejemplo, las enzimas de restricción que se descubrieron en la bacteria Escherichia coli se denominan Eco. Existen diferentes tipos de enzimas Eco que se diferencian en la secuencia que reconocen y cortan. Para diferenciarlas se les agregan letras y números romanos, por ejemplo: Eco RI (Eco “erre” “uno”). Así, el sitio de restricción para EcoRI es la secuencia GAATTC, como muestra la ilustración anterior. Una vez que la enzima encontró ese sitio en el ADN, se acerca a la hebra de ADN y realiza el corte entre la G y la A. Al investigar otras especies de bacterias se descubrieron cientos de enzimas de restricción distintas y cada una reconoce una región específica.

Se cree que la función natural de estas enzimas en las bacterias es protegerlas contra ADN de virus que podrían ingresar en sus células. De esta manera, la bacteria utiliza estas “tijeras moleculares” para cortar en pedacitos el ADN viral que la infecta. El ADN propio de la bacteria no se corta, pues lo tiene “protegido” contra sus propias enzimas de restricción.

Las enzimas son proteínas que cumplen una función esencial en el metabolismo celular: son catalizadores biológicos (aceleradores de reacciones químicas) que hacen posible que las reacciones se lleven a cabo en un tiempo adaptado a las necesidades vitales del organismo. Entre sus características fundamentales se encuentra la de ser específicas, es decir que cada tipo de enzima actúa sobre un sustrato particular o una secuencia particular de una molécula, y no sobre otra. Esta especificidad enzimática resulta fundamental en la actividad de las enzimas de restricción que cortan secuencias particulares y determinadas del ADN.

Resumiendo, las enzimas de restricción son proteínas cuya función es cortar las hebras de ADN. Esa secuencia específica para cada enzima se denomina “sitio de restricción”. Una vez que la enzima reconoce estos sitios, se posiciona sobre la molécula de ADN y corta dentro o en torno de esa secuencia.

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Vamos a ilustrar el concepto de la ingeniería genética con el caso bastante fácil de lograr bacterias que hospeden nuevas combinaciones de ADN: · Partimos de ADN que queremos aislar y estudiar. · Por otro lado, necesitamos un vehículo genético para transportar y replicar ese

ADN: lo llamamos vector. Los vectores son igualmente moléculas de ADN con capacidad de replicarse por sí mismos o de insertarse una vez que se introducen en el organismo adecuado.

He aquí una lista de lo que debe poseer idealmente un vector genético: - capacidad de replicación autónoma, o de integración en el genoma del

hospedador. - Marcadores seleccionables: se trata de genes que confieren algún rasgo

que se puede rastrear o seleccionar fácilmente en el laboratorio. Unos de los más usados son los genes que confieren resistencia a algún antibiótico.

· Finalmente, contamos con el organismo anfitrión o huésped. Así, pues, el "retrato robot" de un experimento de Ingeniería Genética podría ser como sigue:

1. Se corta por separado el ADN del organismo a estudiar y el ADN del vector con la misma restrictasa, de modo que se generan extremos compatibles entre sí (mutuamente cohesivos).

2. Se juntan ambos ADNs y se les añade ADN-ligasa: de esta forma, las uniones entre ADN a clonar y ADN del vector se sellan covalentemente, generándose moléculas híbridas (quiméricas o recombinantes).

3. Ahora hay que introducir las moléculas generadas en el organismos huésped. En el caso de bacterias se recurre a una técnica sencilla denominada transformación, que permite la entrada del ADN a través de las envueltas del microorganismo.

4. Finalmente, hay

que localizar las bacterias que han captado y han

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establecido establemente las moléculas híbridas. A menudo este es el paso más laborioso, pero el hecho de que el vector posea uno o varios genes de resistencia favorece al menos la eliminación de las bacterias que no han recibido ADN del vector: basta añadir al medio de cultivo el antibiótico para el que el vector confiere resistencia. Para localizar los transformantes recombinantes, muchos vectores incorporan un gen marcador que produce alguna sustancia coloreada. Si insertamos el gen a aislar dentro de ese marcador, lo rompemos, por lo que las colonias bacterianas no producirán la sustancia coloreada, sino que permanecen incoloras o blancas.

5. El resultado del experimento es la obtención de al menos una colonia (clon) de bacterias que portan la combinación buscada de vector con el inserto de ADN pasajero. Se dice entonces que hemos clonado (=aislado) dicho ADN.

5.4. Métodos de clonación Acorde a como las endonucleasas de restricción realizan el corte de las cadenas del DNA, la clonación se puede llevar a cabo de dos formas:

· Clonación en romo: empleando enzimas que generan “extremos romos” (blunt ends).

· Clonación en cohesivo: empleando enzimas que generan “extremos cohesivos” (sticky ends). Estos extremos “colgantes” de simple cadena pueden pegarse con otros extremos de cadena simple que tengan la secuencia complementaria.

Como se ha comentado anteriormente las enzimas encargadas de unir los extremos de ambas cadenas de DNA se denominan ligasas. Por ejemplo, la ligasa de ADN del fago T4: permite la unión covalente de ADNs de orígenes diferentes previamente cortados con la misma enzima de restricción o con enzimas que generan el mismo tipo de extremos. El siguiente esquema resume los tipos de clonaje más frecuentes y sus interconexiones:

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Tipos de clonaje

5.5. Clonación en bacterias 5.5.1. Tipos de vectores

Un vector de clonación es una molécula de DNA estable que se replica y a la que puede unirse un fragmento de DNA extraño para ser introducido en una célula. Dicho vector puede manipularse e introducirse fácilmente en una bacteria, fago o célula eucariota donde puede replicarse y generar un gran número de copias. Los Vectores de clonación en bacterias pueden ser de varios tipos:

· Vectores plasmídicos Son los más empleados y existe un gran número de ellos. El tamaño máximo del

inserto (fragmento de DNA que se quiere clonar) es de entre 10-15 kilobases (Kb). El tamaño del DNA se mide en “pares de bases” (1Kb=1000 pares de bases). Se caracterizan por ser de pequeño tamaño, y por contener genes de resistencia a antibióticos (que son los marcadores de selección) lo que permite seleccionar la células que contienen el vector plasmídico. Además tienen sitios de clonación únicos donde se inserta el fragmento de DNA a clonar. Su origen de replicación asegura que se multipliquen dentro de la célula produciéndose un alto número de copias por bacteria.

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Algunos ejemplos más comunes son: pBR322: con dos genes de resistencia a antibióticos con dianas únicas para algunas

enzimas de restricción. La inserción de un ADN foráneo se evalúa viendo la sensibilidad a uno de los antibióticos.

pUC19: con un gen de resistencia a ampicilina para seleccionar eventos de transformación. Dispone de un polilinker (secuencia con múltiples dianas únicas de enzimas de restricción).

· Vectores derivados del bacteriofagos lambda (λ)

Los bacteriófagos (virus de bacterias) pueden actuar como vehículos naturales en la transducción (transferencia de DNA mediada por virus) de DNA bacteriano. Los vectores más conocidos derivan del fago λ de Escherichia coli. Estos fagos se insertan en el cromosoma bacteriano de E. coli por recombinación. Se caracterizan por una elevada eficiencia de transferencia y porque pueden albergar insertos de unas 20 kb. Contiene genes que no son esenciales para su supervivencia, los cuales pueden ser sustituidos por el DNA foráneo a clonar. Hay vectores λ de dos tipos: de inserción y de reemplazamiento o sustitución.

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· Vectores de expresión

Como su nombre indica permiten sintetizar el producto proteico del gen clonado. Es decir producen la proteína en la célula hospedadora.

5.5.2. Métodos de transformación

Los métodos más comunes para introducir el ADN en bacterias son:

a)Transformación Por método del “choque térmico” por calor tras incubación en Cl2Ca Por el método de Electroporación: aplicando una descarga eléctrica

b) Infección

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5.6. Aplicaciones

El ámbito de aplicación de la tecnología del DNA recombinante es muy amplio. Sus aplicaciones responden a fines muy variados (investigación básica, fines médico-forenses, comerciales…etc, entre otros).

En este tema estudiaremos con más detalle dos de las aplicaciones más importantes actualmente destinadas a la salud humana, como son la obtención de proteínas recombinantes con fines terapéuticos y la obtención de vacunas recombinantes.

Proteínas recombinantes En ingeniería genética o tecnología del ADN recombinante, se utilizan diferentes

enzimas (ya estudiadas, ver apartados anteriores) para cortar y aislar un gen determinado -que tiene información para fabricar una proteína particular- e introducirlo en las células de un organismo distinto del inicial. En consecuencia, este organismo tendrá ADN recombinante a partir del cual fabricará una nueva proteína. A la proteína producida a partir de ADN recombinante se la denomina proteína recombinante.

La recombinación de genes humanos en el ADN de bacterias es una de las posibilidades que ofrece la ingeniería genética, y que posibilita obtener proteínas humanas con fines medicinales. Por ejemplo, la insulina humana obtenida a partir de la bacteria Escherichia coli. Esta técnica es de gran valor porque las bacterias se reproducen rápidamente y pueden duplicar su número cada 20 minutos. De esta forma se pueden obtener en poco tiempo muchas copias del gen humano inserto en el ADN bacteriano y producir grandes cantidades de proteínas recombinantes.

A escala industrial, la producción de proteínas recombinantes involucra las siguientes etapas:

· Fermentación: las bacterias son cultivadas en tanques sellados (fermentadores) que contienen un medio de cultivo nutritivo.

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· Extracción: las células son centrifugadas para recuperar las proteínas de su interior. · Purificación: se separa la proteína recombinante de las otras proteínas bacterianas. · Formulación: la proteína recombinante es modificada para conseguir una forma estable

y estéril que puede administrarse terapéuticamente. Cada una de las fases de la elaboración implica un manejo muy cuidadoso de los

materiales y un estricto control de calidad para optimizar la extracción, la pureza, la actividad y la estabilidad del fármaco. Dependiendo del producto y del tipo de célula utilizada, la producción de proteínas recombinantes puede ser un proceso simple o más complejo. Aunque la complejidad del proceso aumentaría el costo final del producto, el valor nunca sobrepasará al gasto de aislar el compuesto desde su fuente original (por ejemplo, obtención de insulina a partir de páncreas de porcinos o bovinos) para llegar a cantidades medicinales.

El caso de la insulina humana La insulina es una hormona producida por el páncreas. Tiene una estructura proteica y

su función consiste en regular la concentración de glucosa en la sangre. Sin la insulina, la glucosa se acumula en la sangre hasta que alcanza niveles elevados y puede causar diferentes complicaciones en el funcionamiento del organismo. Esta es la enfermedad conocida como diabetes. Cuando la diabetes es causada por una escasa o nula producción de insulina, se puede regular el nivel de glucosa en la sangre (glucemia) mediante la administración exógena de insulina.

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En 1921, los fisiólogos canadienses Frederick G. Banting y Charles H. Best extrajeron por primera vez la insulina del tejido pancreático de perros, y en 1923 la insulina estaba comercialmente disponible en los Estados Unidos. Luego, la insulina para diabéticos se obtuvo a partir de páncreas de cerdos o vacas, que aunque es biológicamente activa en humanos, no es idéntica a la humana, de modo que se pueden producir algunos problemas de reacciones inmunes adversas.

La insulina es el primer caso de proteína producida por ingeniería genética aprobada para uso en humanos, desde 1982. La insulina humana biosintética, es idéntica en todos los aspectos a la insulina purificada del páncreas humano. En la actualidad, varios laboratorios farmacéuticos producen insulina humana, tanto a partir de bacterias como de levaduras, y sin ningún riesgo para la salud.

En la figura anterior, se muestra un esquema general de la obtención de insulina a partir de páncreas de vacas o cerdos, y mediante ingeniería genética.

Vacunas recombinantes Desde que en 1796, el médico inglés Edward Jenner descubriera la primera vacuna

contra la viruela, un número considerable de vacunas han sido utilizados con gran éxito para el control de muchas enfermedades. Sin embargo, este tipo de vacunas, denominadas vacunas clásicas, pueden presentar algunas limitaciones tales como la aparición de efectos secundarios y complicaciones posteriores a la vacunación.

Aunque las vacunas clásicas se consideran seguras, y por tal motivo se siguen aplicando a la población de todo el mundo, la ingeniería genética ha permitido avanzar en este campo de la medicina mediante la creación de una nueva generación de vacunas que reducen o eliminan los inconvenientes que presentan las vacunas clásicas.

Las vacunas activan el sistema inmunológico. La respuesta inmune protege al cuerpo contra los agentes extraños, entre ellos algunos causantes de enfermedades. Pero existen algunas enfermedades de riesgo contra las cuales el organismo no tiene una respuesta efectiva. Contra estas enfermedades se han desarrollado vacunas. Las vacunas constituyen un método preventivo, mediante el cual el individuo adquiere inmunidad permanente contra algún agente patógeno específico.

Las vacunas son preparadas a base del agente que causa la enfermedad, pero en un estado no patogénico. Éstas pueden estar constituidas por el agente causante de la enfermedad vivo pero atenuado (disminuido en su capacidad de desencadenar la enfermedad), por el agente patógeno muerto, o por sus fracciones (antígenos). Con la administración de la vacuna se desarrolla la respuesta inmune, un mecanismo complejo en el que intervienen células especializadas de la sangre (linfocitos B y T) que son capaces de reconocer el agente extraño y responder a su presencia. Una vez eliminado el agente suministrado con la vacuna, el organismo conserva células activadas (linfocitos “memoria”) que reaccionan rápida y eficientemente ante la exposición futura al mismo tipo de germen o toxina (en su estado natural) antes de que puedan causar daño. Es decir que las vacunas obligan al sistema inmune a construir una defensa, y de esta

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forma evitan la enfermedad.

Dentro de las vacunas tradicionales, se encuentran:

· Vacunas de Virus vivos atenuados (debilitados): emplean microorganismos vivos cuya virulencia es disminuida o atenuada por sucesivos pasajes en animales de experimentación. De esta manera, los microorganismos son seleccionados por crecer preferentemente en células animales y muy lentamente en células humanas. Por eso, no provocan la enfermedad en los individuos vacunados aunque son capaces de inducir una fuerte y duradera inmunización. En el grupo de las vacunas atenuadas se incluyen las de la viruela, sarampión, paperas, rubéola, varicela ..etc.

· Vacunas de Virus o bacterias muertos (inactivados): la inactivación de los microorganismos patógenos se realiza mediante el tratamiento con calor o sustancias químicas como formaldehído. De esta manera, estas vacunas son más seguras y más estables frente a los cambios de temperatura que las anteriores. En este grupo se encuentran las vacunas contra la rabia, polio…etc.

Si bien son muy eficaces, las vacunas tradicionales presentan algunas dificultades ya

que no todos los microorganismos se pueden cultivar en el laboratorio, la producción a menudo es cara, se requieren medidas muy estrictas para asegurar la completa inactivación o la atenuación adecuada de la cepa.

En todo el mundo, desde principios de la década de 1980, laboratorios y científicos investigan el desarrollo de nuevas vacunas que, se espera reemplazarán en un futuro a las vacunas tradicionales. Estas nuevas vacunas son producidas por ingeniería genética, basadas en la molécula de ADN y en las secuencias de aminoácidos que contienen la información genética con la cual el organismo patógeno produce la enfermedad, y su primer exponente fue la vacuna contra la hepatitis B. Las investigaciones se centran en mejorar las vacunas ya existentes para lograr respuestas inmunitarias más eficaces, nuevas vías de administración, y en la aplicación de vacunas combinadas (varias vacunas en una sola dosis) para reducir el número de inyecciones.

El descubrimiento y decodificación de los genomas de bacterias y virus patógenos llevados a cabo en los últimos años, ha abierto una enorme esperanza en el desarrollo de estas nuevas vacunas.

Éstas pueden clasificarse de la siguiente manera: · Vacunas atenuadas: mediante técnicas de ingeniería genética, se pueden eliminar

los genes de virulencia de un agente infeccioso manteniendo la habilidad de provocar una respuesta inmune. En este caso, el organismo modificado genéticamente puede usarse como una vacuna viva sin riesgo a que revierta al tipo virulento. En el caso de Salmonella se ha ensayado quitarle ciertos genes que aunque no están relacionados con la virulencia, al desaparecer convierten a la cepa en atenuada (disminución de su virulencia en un millón de veces). Se ha demostrado su efectividad en ovejas, bovinos, pollos y, más recientemente en humanos. · Vacunas vectores o de organismos recombinantes vivos: utilizan microorganismos no patógenos (virus o bacterias) a los cuales se les incorporaron, mediante ingeniería genética, genes de agentes patógenos que codifican para los antígenos que

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desencadenan la respuesta inmune. El virus vacunal es uno de los vectores recombinantes más utilizados en este tipo de vacunas, ya que tiene un genoma amplio, totalmente secuenciado, y que permite acomodar varios genes foráneos en su interior. De esta manera, se ha desarrollado una vacuna contra la rabia al insertar en el genoma de este virus, un gen del virus rábico, la cual provoca la respuesta inmune en el organismo hospedador. También se han ensayado las expresiones de genes que codifican para antígenos de virus de la hepatitis B, de la gripe y del herpes simple.

El paramyxovirus es una familia de virus que incluye agentes de enfermedad comunes como sarampión, paperas y parainfluenza. La estructura genómica de estos virus es tal que se le podrían insertar genes adicionales (coloreado en rojo en la figura) que codificase una amplia variedad de proteínas de fuentes diferentes. Así el virus del sarampión ofrece varias ventajas como portador de genes que provoquen respuesta inmune contra otras enfermedades al mismo tiempo. Con tecnologías recombinantes se hace posible extender el rango de enfermedades contra las que una sola cepa atenuada del virus puede conferir inmunidad.

· Vacunas de subunidades: para aquellos agentes infecciosos que no se pueden mantener en cultivo, se pueden aislar los genes que codifican para las proteínas que provocan la respuesta inmune (por ejemplo, las proteínas de las cápsulas de los virus). Mediante técnicas de ingeniería genética, esos genes se pueden clonar y expresar en un huésped alternativo tales como bacterias (Escherichia coli), levaduras (Saccharomyces Cerevisiae) o líneas celulares de mamíferos. Luego de insertado el gen de interés, la bacteria o levadura recombinante comienza a producir subunidades de proteínas en grandes cantidades, las cuales son recolectadas y purificadas para utilizarlas como vacunas. La vacuna contra la hepatitis B fue la primera vacuna puesta en el mercado producida por este método. Esta vacuna se desarrolló aislando el gen del virus que codifica para la proteína (antígeno) llamada HBsAg que provoca respuesta inmune. El gen que produce esta proteína se introdujo por ingeniería genética en levaduras (Saccharomyces Cerevisiae). El antígeno se produce a altos niveles en grandes fermentadores, de modo seguro. En la actualidad, se está avanzando en vacunas de subunidades frente al virus del herpes simple (HSV) y la fiebre aftosa.

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· Vacuna de ADN desnudo

En este tipo de vacunas se utiliza directamente una porción del ADN purificado que contenga el gen de la proteína que produce la respuesta inmune. Esta fracción de ADN (coloreado en rojo) se inserta en un plásmido. Las células del paciente vacunado captan ese plásmido y lo incorporan en su núcleo, permitiendo la expresión del gen foráneo y produciendo la proteína recombinante. Esta proteína es secretada al exterior de la célula, por lo cual el sistema inmune puede reconocerla de la misma manera que durante una infección natural, induciendo una respuesta inmune. Son las vacunas en experimentación que suscitan más expectativa Actualmente, se están realizando ensayos de varias vacunas de este tipo -para la malaria y el SIDA.

Muchas de estas investigaciones se encuentran en fase de desarrollo en el laboratorio y, aunque se estima que la mayor parte comenzará a dar sus frutos dentro de 10 años, el impacto de estas nuevas tecnologías evitará, según datos de UNICEF, la muerte de 8 millones de niños por año en todo el mundo.

[Texto plano. Negrita, Candara 12. especial en primera línea 0,5 9]

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B) Practicamos lo visto

1. El DNA puede ser fragmentado por enzimas conocidas como:

a) polimerasas b) enzimas de restricción c) anticuerpos d) enzimas de fragmentación

2. Las pequeñas cadenas simples de DNA que sobresalen en ambos lados de un

fragmento de restricción se denominan:

a) extremos isosquizómeros b) extremos romos c) extremos cohesivos d) extremos de ligación

3. El híbrido formado por DNAs de distintos organismos se denomina:

a) DNA secuencial b) DNA clónico c) DNA recombinante d) ninguna de los anteriores

4. La electroporación es un método para introducir DNA en células mediante la

utilización de corriente eléctrica

a) Verdadero b) Falso

5. Sitúa en el esquema (usando las letras) los siguientes elementos, reactivos o técnicas:

a) DNA cromosómico b) DNA recombinante c) inserto d) vector (plásmido) e) enzima de restricción f) ligasa g) electroporación

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6. Determinar si cada una de las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas:

a) La ingeniería genética se denomina también "Tecnología de ADN recombinante”.

b) La ingeniería genética incluye técnicas que permiten la obtención de un gran número de copias de genes de interés.

c) Las endonucleasas de restricción son proteínas.

d) Las endonucleasas son enzimas exclusivas de los virus.

e) Las ligasas se utilizan para cortar el ADN en regiones específicas.

f) La insulina es una proteína.

g) La insulina es una hormona.

h) La insulina recombinante se puede producir en bacterias

i) Actualmente, la insulina recombinante se produce a partir del gen de la insulina de cerdo introducido en bacterias.

j) Actualmente, la insulina recombinante se produce a partir del gen de la insulina humana introducido en bacterias.

k) La ventaja de producir proteínas recombinantes consiste en que se producen en mayor cantidad y a menor costo que si se extrajeran directamente desde su fuente de origen.

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7. Completa los espacios en blanco del texto utilizando los siguientes términos:

Insulina recombinante humana Diabéticos Escherichia coli Plásmido bacteriano Insulina humana Insulina ADN ADN humano Cerdos

En 1972 se llevó a cabo el primer clonaje de un gen. Para realizarlo, los científicos utilizaron tres componentes: la bacteria ______________, un plásmido, que es un fragmento de ADN circular ubicado dentro de la bacteria, y el _____de un humano. ¿Qué realizaron con esto? Los científicos lograron tomar un fragmento del ______________ e insertarlo dentro del ___________________. Luego, introdujeron esta construcción dentro de E. coli para que ésta, al multiplicar su material genético, produjera millones de veces la copia del gen insertado.

Esto fue la gran revolución de la biotecnología en los años ochentas. Años más tarde, se aplicó esta nueva técnica al gen de la ___________________, obteniendo la proteína que ese gen codificaba. Y no sólo los científicos estaban contentos con su descubrimiento. Los más favorecidos fueron los ____________, porque a ellos les falta ___________ y hasta ese momento tenían que aplicarse la insulina que se extraía del páncreas de los __________. El problema era que un porcentaje de personas era sensible a este medicamento y presentaban reacciones de rechazo. La _________________________no presenta ese problema y la calidad de vida mejoró para esos enfermos.

8. Las vacunas recombinantes están constituidas por:

a) Plásmidos en los que se introduce la pequeña fracción del material genético del patógeno contra el que se pretende inmunizar

b) Subunidades de proteínas del patógeno producidas en bacterias o levaduras

c) Las 2 respuestas anteriores son correctas

9. Al final de la técnica del DNA recombinante, es necesario proceder a la detección o la selección de los clones recombinantes. Para ello, se hace uso de la presencia de un gen especial en el plásmido que permite dicha detección o selección. ¿Qué puedes comentar al respecto?

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C) Debes recordar

o El descubrimiento de las enzimas (endonucleasas de restricción) que cortan el

DNA por lugares específicos, junto con las enzimas que unen segmentos de DNA,

(ligasas) dio a los biólogos la posibilidad de trasladar genes de un lugar a otro.

o La ingeniería genética se basa en insertar genes de un organismo en otro. Las

manipulaciones génicas suelen producir combinaciones nuevas de genes en los

cromosomas, o recombinación genética. Por este motivo, a las técnicas utilizadas

en ingeniería genética a menudo se las denomina tecnología del DNA

recombinante.

o Para analizar un gen, los biólogos tienen que conseguir muchas copias idénticas

de este. Esto se puede hacer insertando el gen en una célula bacteriana que copia

el gen a medida que crece o realizando una reacción en cadena de la polimerasa.

o Clonar un gen significa que dicho gen ha sido aislado y que se han producido

muchas copias idénticas del mismo.

o Los elementos básicos en la ingeniería genética bacteriana son: las endonucleasas

de restricción (para fragmentar y modificar el DNA); las DNA ligasas (para unir los

extremos romos o cohesivos del DNA fragmentado); los vectores de clonación

(moléculas de DNA adecuadas para la transferencia y propagación del DNA

recombinante) y células bacterianas hospedadoras del DNA recombinante (en las

cuales se multiplicará dicho DNA).

o El ámbito de aplicación de la tecnología del DNA recombinante en bacterias es

muy amplio.

o Dos de las aplicaciones actuales más importantes son la obtención de proteínas

recombinantes con fines terapéuticos y la obtención de vacunas recombinantes.

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o La ventaja de producir proteínas recombinantes para uso terapéutico consiste en

que se producen en mayor cantidad y a menor costo que si se extrajeran

directamente desde su fuente de origen.

o La insulina recombinante es el primer caso de proteína producida por ingeniería

genética, aprobada para su uso en humanos desde 1982. Actualmente se produce

y se comercializa insulina humana mediante ingeniería genética, a partir tanto de

bacterias como de levaduras y sin ningún riesgo para la salud.

o Los actuales diseños de diversos tipos de nuevas vacunas recombinantes

permiten inactivar selectivamente los genes del patógeno no deseados

implicados en la virulencia lo que garantiza su seguridad y estabilidad, eliminando

los posibles riesgos de introducir microorganismos vivos atenuados.

Biología

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D) Para saber más

Cohen, S., Chang, A., Boyer, Hof., Helling, R. (1973): Construction of biologically functional bacterial plasmids In Vitro. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 70, pg. 3240-3244.

Cohen, S. (1975): The manipulation of genes. Scientific American, pg. 25-33 (Traducido en: Bases Moleculares de la vida. Capítulo 43. pg. 470-479)

Covarrubias, L., Cervantes, L., Covarrubias, A., Soberon, X., Vichido, I., Blanco, A., Kupersztoch-Portnoy, Y.M. and Bolivar, F. (1981): Construction and characterization of new cloning vehicles. V. Mobilization and coding properties of pBR322 and several deletion derivatives including pBR327 and pBR328. Gene 13, pg. 25-35

Curtis H., Barnes N.S., Schnek A., and Flores G. (2006): Invitación a la Biología. Sexta edición. Editorial Panamericana, Buenos Aires

Freeman, S. (2010): Fundamentos de Biología. Tercera edición. Pearson Education S.A., Madrid

Izquierdo M. (1999): Ingeniería genética y transferencia génica. Editorial Pirámide, Madrid

Morcillo, G. y Portela I. (2010): Biología básica. Editorial Sanz y Torres, Madrid Nathans, D. (1979): Restriction Endonucleases, Simian Virus 40, and the new genetics.

Science 206, pg. 903-909. Nathans, D., and Smith, H.O. (1975). Restriction endonucleases in the analysis and

restructuring of DNA molecules. Annual Review of Biochemistry 44, pg. 273-293 Perera, J. Tormo, A. y García J.L. (2010). Ingeniería genética, Preparación, análisis,

manipulación y clonaje de DNA. Volumen I. Capítulos 5, 9, 10, 11 y 12. Editorial Síntesis, Madrid

Smith, H.O. (1979). Nucleotide sequence specificity of restriction endonucleases. Science 205, pg. 455-462

Watson, J.D., Tooze, J. and Kurtz, D.T. (1988): ADN recombinante, Introducción a la ingeniería genética. Primera edición. Editorial Labor S.A., Barcelona

Wong, D.W.S. (1997): The ABCs of gene cloning. International Thomson Publishing, New York

Biología

24

E) Glosario

antibiótico

Sustancias que evitan o retrasan el crecimiento de los microorganismos. Se los

emplea en el tratamiento de las enfermedades infecciosas y como agentes de

selección en procesos de transformación genética.

fármaco

Droga, medicamento.

glucosa

Monosacárido (azúcar) de seis carbonos que constituye la principal fuente de

carbono de las células. Los polímeros de glucosa, como el almidón y el

glucógeno, son usados para almacenar energía en las células vegetales y

animales, respectivamente.

Kilobases (Kb)

Unidad empleada para medir la longitud, en número de bases nitrogenadas,

que tiene un fragmento de ácido nucleico. Cuando se trata de un fragmento de

ADN de cadena doble, se habla de Kpb o kilopares de bases. 1 Kb = 1.000 bases.

hospedador/a

En ingeniería genética, célula u organismo que se emplea para la expresión de

uno o más genes heterólogos (de otro origen). En parasitología, organismo

sobre (o dentro de) el cual vive un parásito.

in vitro

Del latín literalmente "en el vidrio", se usa para indicar experimentos (una

reacción o proceso) realizados fuera de un organismo vivo o fuera del organismo

de origen. Lo contrario de “in vivo”.

Biología

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marcador genético (o gen marcador)

Segmento de ADN cuya herencia se puede rastrear. Puede ser un gen o un

segmento sin función conocida. Dado que las secuencias de ADN que se

encuentran contiguas en un cromosoma tienden a heredarse juntas, los

marcadores se usan como herramientas para rastrear el patrón hereditario de

genes que aún no han sido identificados, pero cuyas ubicaciones aproximadas se

conocen.

nucleasa

Enzima capaz de cortar o degradar ácidos nucleicos.

pares de bases

Dos bases nitrogenadas (timina y adenina o citosina y guanina) que se unen

por puentes de hidrógeno en la molécula de ADN.

patógeno

Organismo que causa una enfermedad.

plásmido

Porción de ADN circular que puede mantenerse como elemento

extracromosomal en bacterias u otras células. Lleva pocos genes y no es

indispensable para el crecimiento y sobrevida de la célula hospedadora. Los

plásmidos pueden transferirse de un organismo a otro, por eso se usan en

ingeniería genética como vectores de clonado y expresión.

respuesta inmune

Conjunto de mecanismos que se inducen en un organismo como respuesta a

la presencia de un antígeno.

transducción

Transferencia de genes desde un organismo a otro mediante un virus.

transfección

Introducción de ADN foráneo en células animales.

Biología

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transformación

Modificación permanente y heredable de una célula como resultado de la

incorporación de ADN foráneo (cuando se trata de células animales, se emplea el

término "transfección" en lugar de transformación).

Biología

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F) Autoevaluación

1. Cuáles de los siguientes se utilizan como vectores de clonación?

a. bacteriófagos

b. virus

c. plásmidos

d. todos los anteriores

2. La enzima que cataliza la unión de las cadenas azúcar-fosfato en un DNA recombinante es:

a. ligasa

b. enzima de restricción

c. vector

d. todos los anteriores

3. Las pequeñas moléculas de DNA circular con capacidad autoreplicativa se conocen como:

a. cromosomas

b. lípidos

c. genes

d. plásmidos

4. La transferencia de DNA al interior de las células de plantas se denomina:

a. transvección

b. transmigración

c. clonación

d. transformación

Biología

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5. En presencia de un antibiótico es menos probable que crezcan células bacterianas que contienen un plásmido con un gen que confiere resistencia a dicho antibiótico que las bacterias sin el plásmido.

a. Verdadero

b. Falso

6. Se denominan vacunas tradicionales a las obtenidas mediante:

a. el empleo de organismos genéticamente modificados

b. el empleo de microorganismos patógenos causantes de la enfermedad

muertos o debilitados

c. la administración de células infectadas de pacientes enfermos

7. Algunas desventajas que presentan las vacunas tradicionales son:

a. aplicación del microorganismo vivo, y sus posibles efectos secundarios (como

por ejemplo el revetir a una cepa virulenta)

b. se necesita conocer el genoma del organismo patógeno causante de la

enfermedad

c. a pesar de ser más seguras, las vacunas de microorganismos muertos poseen

una efectividad inferior respecto a las de organismos vivos atenuadas

8. Las vacunas recombinantes atenuadas están constituidas por:

a. Microorganismos patógenos cuya virulencia ha sido atenuada al eliminar los

genes de virulencia de un agente infeccioso manteniendo la habilidad de

provocar una respuesta inmune

b. Subunidades de proteínas del patógeno producidas en bacterias o levaduras

Biología

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Respuestas correctas del test de autoevaluación:

Pregunta Respuesta correcta

1 d)

2 a)

3 d)

4 d)

5 b)

6 b)

7 a) y c)

8 a)