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. BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Capítulo 11. Expresión génica: de la transcripción a la traducción BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Capítulo 1. Introducción al estudio de la biología celular y molecular

Expresión génica: de la transcripción a la traducción

Capítulo 11

11.1 Relación entre genes, proteínas y RNA 11.2 Sinopsis de la transcripción en células procariotas y

eucariotas 11.3 Síntesis y procesamiento de los RNA ribosómicos y

de transferencia en organismos eucariotas 11.4 Síntesis y procesamiento de RNA mensajeros en

organismos eucariotas 11.5 RNA reguladores pequeños y vías de desactivación

de RNA 11.6 Codificación de la información genética 11.7 Decodificación de los codones: función de los RNA

de transferencia 11.8 Traducción de la información genética PERSPECTIVA HUMANA: Aplicaciones clínicas de la interferencia del RNA VÍAS EXPERIMENTALES: Función del RNA como catalizador

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. BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Capítulo 11. Expresión génica: de la transcripción a la traducción

Figura 11.1 Experimento de Beadle-Tatum para la separación de mutantes genéticos en Neurospora. Las esporas se radiaron para inducir mutaciones (paso 1) y se permitió que las colonias crecieran en tubos con medios complementados (paso 2). En las esporas genéticamente idénticas producidas por las colonias se valoró su capacidad de proliferar en medio complementado o mínimo (fase 3). Las que no proliferaron en medio mínimo fueron mutantes y se emprendió la tarea de identificar el gen alterado. En el ejemplo del paso 4 se encontró que una muestra de células mutantes crecía en el medio mínimo complementado con vitaminas, pero no en el medio enriquecido con aminoácidos. Esta observación señala una deficiencia en una enzima que ayuda a la formación de una vitamina. En el paso 5, el crecimiento de estas mismas células en un medio mínimo complementado con una u otra de las vitaminas indica que la deficiencia reside en un gen que participa en la formación del ácido pantoténico (parte de la coenzima A).

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Figura 11.2 Sinopsis del flujo de información en una célula eucariota. El DNA de los cromosomas localizados dentro del núcleo contiene toda la información genética almacenada. Los sitios seleccionados del DNA se transcriben en pre-mRNA (paso 1) y se procesan para formar mRNA (paso 2). Éstos se desplazan fuera del núcleo (paso 3) hacia el citoplasma, donde los ribosomas que se mueven a lo largo de ellos (paso 4) los traducen en polipéptidos. Después de la traducción, la proteína se pliega para adquirir su conformación nativa (paso 5).

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Figura 11.3 Estructura bidimensional de un RNA ribosómico bacteriano que muestra la extensa complementariedad de bases entre regiones diferentes de la cadena sencilla. La sección amplificada evidencia la secuencia de bases de un tallo y un asa, incluidos un apareamiento de bases no convencional (G-U) y un nucleótido modificado, la metiladenosina. Una de las hélices aparece con un sombreado diferente porque tiene una participación esencial en la función del ribosoma, como se revisa en la página 470. En la figura 11.43b se muestra un ejemplo de la estructura tridimensional de un RNA.

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Figura 11.4 Alargamiento de la cadena durante la transcripción. (a) Modelo esquemático del alargamiento de una molécula de RNA recién sintetizada, durante la transcripción. La polimerasa cubre alrededor de 35 pares de bases del DNA, la burbuja de transcripción compuesta de DNA de cadena sencilla contiene cerca de 15 pares de bases y el segmento presente en un híbrido DNA-RNA incluye más o menos nueve. La enzima crea un superenrollamiento (positivo) del DNA por delante de éste y un desenrollamiento (negativo) del DNA por detrás (pág. 397). Estas condiciones se anulan por la acción de las topoisomerasas (pág. 398). (b) Modelo esquemático de una RNA polimerasa en el momento de la elongación de un transcrito. El DNA localizado en dirección 3’ permanece en un surco dentro de la polimerasa, sujeto por un par de mandíbulas formadas por las dos subunidades principales de la enzima. El DNA traza una vuelta pronunciada en la región del sitio activo, por lo que la secuencia en dirección 5’ se extiende hacia la parte superior de este dibujo. El RNA naciente sale del sitio activo de la enzima a través de un conducto separado.

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Figura 11.4 Alargamiento de la cadena durante la transcripción. (Continuación) (c) El alargamiento de la cadena ocurre como resultado de un ataque del grupo 3’OH del nucleótido en el extremo de la cadena en crecimiento sobre el fosfato α 5’ del nucleósido trifosfatado entrante. El pirofosfato liberado después se corta y ello induce la polimerización. La geometría del apareamiento de bases entre el nucleótido de la cadena plantilla y el nucleótido que se integra determina cuál de los cuatro posibles nucleósidos trifosfatados se incorporará en la cadena creciente de RNA en cada sitio.

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Figura 11.4 Alargamiento de la cadena durante la transcripción. (Continuación) (d) Micrografía electrónica de varias moléculas de RNA polimerasa unidas a una plantilla de DNA de un fago. (d: cortesía de Robley C. Williams.)

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Figura 11.5 Ejemplos de técnicas experimentales para rastrear la actividad de una sola molécula de RNA polimerasa. (a) En este protocolo, la molécula de RNA polimerasa está unida con firmeza al portaobjetos y se le permite transcribir una molécula de DNA que contiene una esfera fluorescente en el extremo 5’. Las flechas indican el movimiento del DNA a través de la polimerasa. La velocidad del desplazamiento y el progreso de la polimerasa pueden rastrearse al observar la posición de la esfera en un lapso de tiempo, para lo cual se emplea un microscopio fluorescente. (b) En este protocolo, la polimerasa unida transcribe una molécula de DNA con una esfera en su extremo 3’. Como en el apartado a, las flechas indican la dirección del movimiento del DNA. La esfera queda atrapada en una trampa óptica (rayo láser), la cual ejerce una fuerza conocida que puede regularse al ajustar el haz de luz. Este tipo de aparato puede medir las fuerzas generadas por una polimerasa en transcripción activa. (Imagen reimpresa de J. Gelles y R. Landick, Cell 93:15, 1998, © 1998, con autorización de Elsevier Science.)

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Figura 11.6 Representación esquemática del inicio de la transcripción en bacterias. (a) En ausencia del factor σ, la enzima central no interactúa con el DNA en los sitios de iniciación específicos. (b-d) Cuando la enzima central se relaciona con el factor σ, la enzima completa (u holoenzima) es capaz de reconocer y unirse a regiones promotoras del DNA, separar las cadenas de la doble hélice de DNA e iniciar la transcripción en los sitios de inicio adecuados (fig. 11.7). En el modelo tradicional mostrado aquí, el factor σ se disocia de la enzima central, la cual es capaz de alargar a un transcrito. Estudios recientes sugieren que al menos en algunos casos, σ puede permanecer con la polimerasa.

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Figura 11.7 Elementos básicos de una región promotora en el DNA de la bacteria E. coli. Las secuencias clave de regulación necesarias para el inicio de la transcripción se encuentran en las regiones localizadas a -35 y -10 pares de bases del sitio en el cual comienza la transcripción. El sitio de inicio marca el límite entre los lados + y - del gen.

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Figura 11.8 Comparación de la estructura de la RNA polimerasa procariota y eucariota. (a) RNA polimerasas de los tres dominios de la vida. Cada subunidad de una enzima está indicada por un color diferente y está etiquetada de acuerdo con la nomenclatura convencional para esa enzima. Las subunidades homólogas tienen el mismo color. Puede verse que las polimerasas de las arquebacterias y las de las eucariotas tienen una estructura más parecida entre sí que las enzimas bacterianas y las eucariotas. La RNA polimerasa II (mostrada aquí) es una de las tres principales RNA polimerasas nucleares eucariotas. (b) Diagrama de listones de la estructura central de la RNA polimerasa II de una levadura. Las regiones de la polimerasa bacteriana que tienen homología estructural con la enzima de la levadura se presentan en color verde. Es evidente el conducto grande que sujeta al DNA en dirección 3’. El ion Mg2+ situado en el extremo del conducto y dentro del sitio activo se ve como una esfera roja. RNAP = RNA polimerasa. (a: imagen tomada de Akira Hirata, Brianna J. Klein y Katsuhiko S. Murakami. Nature 451:852, 2008. Reimpresa con autorización de Macmillan Magazines Ltd. b: imagen tomada de fig 12b. Patrick Cramer et al., Science 292:1874, 2001; © copyright 2001, reimpresa con autorización de American Association for the Advancement of Science. Cortesía de Roger Kornberg, Stanford University School of Medicine.)

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Figura 11.9 Composición macromolecular del ribosoma de un mamífero. Este esquema muestra los componentes presentes en cada una de las subunidades de un ribosoma de mamífero. La síntesis y el procesamiento de los rRNA y el ensamblaje de las subunidades ribosómicas se revisan en las páginas siguientes. (Imagen tomada de D. P. Snustad et al., Principles of Genetics. © 1997, John Wiley & Sons, Inc. Reimpresa con autorización de John Wiley & Sons, Inc.)

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Figura 11.10 Nucléolo. (a) Micrografía óptica de dos células humanas de la cepa HeLa, transfectadas con un gen que codifica a una proteína ribosómica fusionada a la proteína fluorescente verde (GFP, green fluorescent protein). Ésta puede observarse en el citoplasma, donde se sintetiza y realiza su función, y en el nucléolo (flechas blancas), donde se ensambla para formar los ribosomas. (b) Micrografía electrónica de un corte que muestra parte de un núcleo con su nucléolo. En este último se distinguen tres regiones morfológicas. La parte principal del nucléolo consiste en un componente granular (gc, granular component). Embebidos dentro de los gránulos se hallan los centros fibrilares (fc, fibrillar centers) que están rodeados por un componente fibrilar más denso (dfc, dense f ibrillar component). El recuadro muestra un dibujo esquemático de estas partes del nucléolo. De acuerdo con un modelo, el fc contiene el DNA que codifica al RNA ribosómico y el dfc los transcritos de pre-rRNA nacientes y proteínas relacionadas. Según este modelo, la transcripción del precursor del pre-rRNA ocurre en la frontera entre el fc y el dfc. (Nota: los nucléolos tienen otras funciones no relacionadas con la biogénesis de los ribosomas que no se consideran en este texto.) La barra mide 1 µm. (a: imagen tomada de C.E. Lyon y A. I. Lamond, Curr. Biol. 10:R323, 2000, fig b, con permiso de Elsevier; b: imagen tomada de Pavel Hozak et al., J. Cell Science 107:641, 1994; con autorización de the Company of Biologists, Ltd. http://jcs.biologists.org/content/107/2/639.full. pdf+html?sid=8e44240f-0860-4bea-bef4-b79b866c0261)

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Figura 11.11 Síntesis del RNA ribosómico. (a) Micrografía óptica de un núcleo teñido de un ovocito de Xenopus, que revela cientos de nucléolos. (b) Micrografía electrónica de un segmento de DNA aislado de un nucléolo de ovocito de Xenopus. El DNA (llamado rDNA) contiene los genes que codifican a los dos RNA ribosómicos grandes, los cuales se forman a partir de un solo transcrito primario. Numerosos genes se muestran aquí, cada uno en el proceso de la transcripción. Ésta se reconoce por la estructura fibrilar unida al DNA. Dichas fibras consisten en RNA nacientes y proteínas relacionadas. Los segmentos de DNA entre los genes que se someten a transcripción son fragmentos que no se transcriben. Las flechas indican los sitios donde se inicia la transcripción. . (a: imagen tomada de Donald D. Brown e Igor B. Dawid, Science 160:272, 1968; © 1968: reimpresa con autorización de la American Association for the Advancement of Science. c: cortesía de Oscar L. Miller, Jr., y Barbara R. Beatty.)

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Figura 11.11 Síntesis del RNA ribosómico. (Continuación) (c) Vista cercana de dos genes nucleolares sujetos a transcripción. La longitud del transcrito primario del rRNA emergente se incrementa conforme la distancia aumenta desde el punto de inicio. Las moléculas de RNA polimerasa de la base de cada fibrilla pueden observarse como puntos. (c: cortesía de Oscar L. Miller, Jr., y Barbara R. Beatty.)

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Figura 11.12 Unidad de transcripción del rRNA. El dibujo de la parte superior muestra la apariencia de una porción del DNA de un nucléolo mientras se transcribe para formar rRNA. La representación de abajo ilustra una de las unidades de transcripción que codifica al rRNA en Xenopus y en ratones. Estas partes del DNA que codifican a los productos de rRNA maduros aparecen en verde. Las regiones del espaciador transcrito, es decir, las áreas del DNA que se transcriben pero cuyos RNA correspondientes se degradan durante el procesamiento, se muestran en amarillo. El espaciador no transcrito, que permanece entre las unidades de transcripción, contiene la región promotora en el lado 5’ del gen. (Según B. Sollner-Webb y E. B. Mougey, Trends Biochem. Sci. 16:59, 1991.)

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Figura 11.13 Análisis cinético de la síntesis y el procesamiento del rRNA. Un cultivo de células de mamífero se incubó durante 10 min en [14C]metionina y luego se monitorearon en un medio no marcado en diferentes momentos, como se indica en cada panel. Después del rastreo, las células se lavaron para dejarlas libres del isótopo, se homogeneizaron y se prepararon fracciones citoplásmicas y nucleolares. El RNA de cada fracción se extrajo y se analizó por medio de sedimentación en gradiente de densidad en sacarosa. Como se revisa en la sección 18.9, esta técnica separa a los RNA de acuerdo con su tamaño (los grandes son los más próximos a la parte inferior del tubo, que corresponde a la fracción 1). La línea continua representa la absorbancia ultravioleta de cada fracción celular, la cual provee una medida de la cantidad de RNA de cada clase de acuerdo con su tamaño. Este perfil de absorbancia no cambia con el tiempo. La línea roja representa la radiactividad en diferentes momentos durante el rastreo. Las gráficas del RNA nucleolar (perfiles superiores) muestran la síntesis de los precursores de rRNA 45S y su conversión subsecuente a la molécula 32S, que es un precursor de los rRNA 28S y 5.8S. Los otros productos principales del precursor 45S dejan el núcleo con rapidez y de esta forma no aparecen de manera importante en el RNA nucleolar. Los perfiles inferiores señalan el tiempo de la aparición de las moléculas de rRNA maduro en el citoplasma. Los rRNA 18S aparecen en el citosol antes que las especies más grandes 28S, que se correlacionan con el rápido éxodo de estas últimas desde el nucléolo. (Imagen tomada de H. Greenberg y S. Penman, J. Mol. Biol. 21:531, 1966; © 1966, con autorización de the Publishers Academic Press.)

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Figura 11.14 Esquema propuesto para el procesamiento del RNA ribosómico de mamíferos. El transcrito primario de los rRNA es una molécula 45S de unas 13 000 bases. Los cortes principales durante el procesamiento de este pre-rRNA se indican por medio de los números encerrados en cuadros. El corte del transcrito primario en los sitios 1 y 5 elimina las secuencias transcritas externas 5’ y 3’ y produce un intermediario 41S. El segundo corte puede ocurrir en los sitios 2 o 3 según sea el tipo de célula. El corte en el sitio 3 genera el intermediario 32S, visto en las curvas de la figura anterior. Durante los pasos finales del procesamiento, las secciones 28S y 5.8S se separan y los extremos de diferentes intermediarios se procesan a su tamaño maduro final. (Imagen tomada de R. P. Perry, J. Cell Biol. 91:29S, 1981; con autorización de la Rockefeller University Press.)

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Figura 11.15 Modificación del pre-rRNA. (a) Las modificaciones más frecuentes de los nucleótidos en un pre-rRNA son la conversión de una uridina a una seudouridina y la metilación de una ribosa en el sitio 2’ del azúcar. Para convertir uridina en seudouridina se rompe el enlace N1—C1’ y el anillo de uracilo se rota 120º, lo cual coloca al C5 del anillo en posición para formar un nuevo enlace con el C1’ de la ribosa. Se piensa que componentes de una proteína de la snoRNP catalizan estas modificaciones químicas, pero las enzimas aún no se identifican. (b) Formación de un dúplex RNA-RNA entre el snoRNA U20 y una porción del pre-rRNA que genera la metilación de la ribosa en la posición 2’. En cada caso, el nucleótido metilado en el rRNA se une mediante un puente de hidrógeno a un nucleótido del snoRNA localizado a cinco pares de bases de la caja D. Esta última, que contiene la secuencia invariable CUGA, está presente en todos los snoRNA que guían la metilación de la ribosa. (c) Formación de un dúplex RNA-RNA entre el snoRNA U68 y una porción del pre-rRNA que lleva a la conversión de una uridina en seudouridina (). La seudouridilación tiene lugar en un sitio relativamente fijo para un plegamiento en forma de asa en el snoRNA. Los snoRNA que controlan la seudouridilación poseen una secuencia ACA 3’ común. (b: según J. P. Bachellerie y J. Cavaillé, Trends in Bioch. Sci. 22:258, 1997; © 1997, con autorización de Elsevier Science; c: según P. Ganot et al., Cell 89:802, 1997.)

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Figura 11.16 Ordenamiento de los genes que codifican a los RNA de transferencia en Xenopus. El fragmento de DNA de 3.18 kilobases muestra el ordenamiento de diferentes genes de tRNA y sus espaciadores. (Imagen tomada de S. G. Clarkson et al., en D. D. Brown, ed., Developmental Biology Using Purified Genes, Academic Press, 1981.)

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Figura 11.17 Formación del RNA nuclear heterogéneo (hnRNA) y su conversión a mRNA más pequeños. (a) Las curvas muestran el patrón de sedimentación del RNA total extraído de células sanguíneas de pato después de la exposición a [32P]fosfato durante 30 min. Los RNA más grandes viajan mucho más durante la centrifugación y se aproximan más a la región inferior del tubo donde yacen. La absorbancia (línea azul) indica la cantidad total de RNA en diferentes regiones del tubo de centrifugación, mientras que las líneas rojas señalan la radiactividad correspondiente. Es evidente que la mayor parte de los RNA sintetizados de novo es muy grande, más que los rRNA estables 18S y 28S. Estos son los hnRNA. (b) La absorbancia y los perfiles de radiactividad del RNA se extrajeron de células marcadas por pulsos durante 30 min como en el apartado a, pero después se rastrearon durante 3 h en presencia de actinomicina D, que previene la síntesis de RNA adicional. Es evidente que los hnRNA grandes se han procesado en productos de RNA más pequeños. (Imagen tomada de G. Attardi et al., J. Mol. Biol. 20:160, 1966. © 1966, con autorización de the Publishers Academic Press.)

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Figura 11.18 Inicio de la transcripción a partir de un promotor para la polimerasa II eucariota. (a) Secuencia nucleotídica de la región en dirección 5’ del sitio donde se inicia la transcripción en tres genes eucariotas diferentes. La caja TATA se indica por el cuadro sombreado en azul. Muchos promotores eucariotas contienen un segundo elemento promotor conservado llamado iniciador (Inr), que incluye el sitio donde comienza la transcripción (que se muestra en naranja). Otros elementos promotores se exponen en la figura 12.40. Hay que señalar que (1) la mayoría de los promotores eucariotas carecen de una caja TATA reconocible y (2) se han identificado muchos otros elementos promotores, como el DPE mostrado en el apartado b, que se encuentran en dirección 3’ del sitio de inicio de la transcripción. Diferentes genes contienen combinaciones distintas de elementos promotores, por lo que sólo se necesita un subgrupo para la nucleación del ensamble PIC. (b) Un modelo muy esquemático de los pasos del ensamblaje del complejo de pre-iniciación de la RNA polimerasa II. Ésta se refiere como RNAPII; los otros componentes son los factores de transcripción generales necesarios en el ensamblaje del complejo en su totalidad. El TFIID incluye la subunidad TBP, que se une de manera específica a la caja TATA, y otras subunidades diferentes, que en su conjunto se conocen como factores relacionados con la TBP (TAF, TBP-associated factors). Al parecer, el TFIIB provee un sitio de unión para la RNA polimerasa. El TFIIF, que contiene una subunidad homóloga al factor bacteriano σ, se une a la polimerasa entrante. El TFIIH contiene nueve subunidades, tres de las cuales poseen actividades enzimáticas.

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Figura 11.19 Modelos estructurales de la formación del complejo de preiniciación. (a) Modelo del complejo formado por el DNA y tres de los GTF, la TBP de TFIID, TFIIA y TFIIB. La interacción entre la caja TATA y la TBP dobla al DNA cerca de 80º y permite que el TFIIB se una al DNA en direcciones 5’ y 3’ de la caja TATA. (b) Vistas superior e inferior de un modelo del complejo de preiniciación. A diferencia del modelo esquemático de la figura 11.18b, el DNA (que se muestra en blanco) se enrolla al parecer alrededor del complejo de preiniciación, de tal forma que los GTF pueden tener contacto con el DNA en ambos lados del sitio donde inicia la transcripción. (a: imagen tomada de Gourisankar Ghosh y Gregory D. Van Duyne, Structure 4:893, 1996, fig 2, con autorización de Elsevier; b: imagen tomada de M. Douziech et al., Mol. Cell Biol. 20:8175, 2000, fig 7a. cortesía de Benoit Coulombe. Reproducida con autorización de la American Society for Microbiology.)

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Figura 11.20 La iniciación de la transcripción por parte de la RNA polimerasa II se acompaña de la fosforilación del dominio terminal C (CTD). La iniciación de la transcripción se relaciona con la fosforilación, catalizada por el TFIIH, de los residuos de serina en la posición 5 de cada repetición de siete elementos del CTD. Se cree que la fosforilación desencadena la separación de la maquinaria de transcripción de los factores generales y/o del DNA promotor. TFIIS, ELL y P-TEFb son tres de varios factores de elongación que pueden relacionarse con la polimerasa conforme se desplaza por el DNA. El TFIIS ayuda a la polimerasa a moverse de nuevo después de una pausa, mientras que la molécula P-TEFb es una cinasa que fosforila los residuos Ser2 del CTD después que comienza la elongación. Se cree que la fosforilación de los residuos Ser2 fomenta el reclutamiento de factores para el corte y empalme del RNA y factores de poliadenilación, cuyas actividades se describen en las secciones siguientes (fig. 11.34).

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Figura 11.21 Estructura del mRNA de la globina β humana. El mRNA contiene un casquete de metilguanosina 5’, regiones 5’ y 3’ no codificadoras que flanquean al segmento codificante y una cola de poli(A) 3’. La longitud de cada segmento se expresa en número de nucleótidos. La longitud de la cola de poli(A) es variable. Casi siempre comienza con una extensión cercana a 250 nucleótidos y se acorta en forma gradual, como se explica en la figura 12.62. Se muestra la estructura del capuchón 5’.

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Figura 11.22 Diferencia de tamaño entre los hnRNA y los mRNA. (a,b) Micrografías electrónicas de preparaciones sombreadas con metales, que muestran moléculas de poli(A)-mRNA (a) y poli(A)-hnRNA (b). Aquí se muestran los tamaños representativos de cada tipo. La molécula de referencia es un DNA vírico de ϕX- 174. (c) Distribución del tamaño de hnRNA y mRNA de células L de ratón, determinada por sedimentación en gradiente de densidad. La línea roja representa el hnRNA, que se marca con suma rapidez, mientras que la línea púrpura representa el mRNA aislado de poliribosomas después de un periodo de 4 h de marcaje. La abscisa se ha convertido de un número fraccionario (indicado por los puntos) al tamaño molecular por calibración de los gradientes. (Imagen tomada de John A. Bantle y William E. Hahn, Cell 8:145, 1976; reproducida con autorización de Elsevier.)

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Figura 11.23 Descubrimiento de las secuencias interpuestas (intrones). Una porción del genoma del adenovirus se muestra en la parte superior. Las secuencias discontinuas de los bloques marcados con las letras x, y y z aparecen en un ordenamiento continuo en el mRNA maduro que codifica a diferentes polipéptidos como la proteína hexón. Como se revisa más adelante, la conversión del transcrito primario en un mRNA supone la eliminación (escisión) de las secuencias interpuestas o intrones (I1 a I3) y la unión de las porciones remanentes para producir una molécula continua de RNA (parte inferior). En la figura 11.32 se muestran los pasos por medio de los cuales ocurre este fenómeno.

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Figura 11.24 Descubrimiento de los intrones en un gen eucariota. Como se analiza en el capítulo 18, las bacterias tienen enzimas de restricción que reconocen y cortan las moléculas de DNA en ciertas secuencias nucleotídicas. El dibujo muestra un mapa de sitios de corte para las enzimas de restricción en la región del gen de la globina β de conejo (parte superior) y el mapa correspondiente de un cDNA preparado a partir del mRNA de la globina β (inferior). (Un cDNA es un DNA formado in vitro a través de la enzima transcriptasa inversa, utilizando un mRNA como plantilla. Para este experimento se utilizó cDNA porque las enzimas de restricción no cortan los RNA.) Las letras indican los sitios en los cuales diferentes enzimas de restricción cortan los dos DNA. El mapa superior muestra que el gen de la globina contiene un sitio de restricción para la enzima BamH1 (B) localizado a unos 700 pares de bases de un sitio de restricción para la enzima EcoR1 (E). Cuando el cDNA de la globina se trató con estas mismas moléculas (mapa inferior), los sitios correspondientes B y E estuvieron separados sólo por 67 nucleótidos. Es evidente que el DNA preparado a partir del genoma tiene una región que está ausente en el cDNA correspondiente (y que por lo tanto no se encuentra en el mRNA a partir del cual se generó el DNA complementario). La secuencia completa del gen de la globina mostró después que éste contiene un segundo intrón más pequeño. (Imagen tomada de A. J. Jeffreys y R. A. Flavell, Cell 12:1103, 1977; con autorización de Cell Press.)

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Figura 11.25 Visualización de un intrón en el gen de la globina. Micrografía electrónica de híbridos formados entre (a) el RNA precursor de la globina 15S y el DNA del gen que la codifica, y (b) el mRNA de la globina 10S y el mismo DNA del apartado a. Las líneas rojas punteadas en los recuadros indican las posiciones de las moléculas de RNA. El precursor de RNA es equivalente en longitud y secuencia al DNA del gen de la globina, pero al mRNA 10S le falta una porción. Estos resultados sugieren que el RNA 15S se procesa para eliminar una secuencia interna de RNA y unir las regiones flanqueadoras. (Tomada de Shirley M. Tilghman et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. Usa 75:1312, 1978.)

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Figura 11.26 Visualización de los intrones en el gen de la ovoalbúmina. Micrografía electrónica de un híbrido formado entre el mRNA de la ovoalbúmina y un fragmento del DNA genómico de pollo que contiene el gen de la ovoalbúmina. El híbrido que se muestra en esta micrografía es similar en naturaleza al de la figura 11.25b. En ambos casos, el DNA contiene la secuencia entera del gen porque se aisló directamente del genoma. En cambio, el RNA se ha procesado por completo y las porciones que se transcribieron de los intrones se removieron. Cuando el DNA genómico y el mRNA se hibridan, las porciones del DNA que no están representadas en el mRNA forman asas. En esta figura se pueden observar las asas de siete intrones (A-G). (Cortesía de Pierre Chambon.)

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Figura 11.27 Los transcritos de premRNA se procesan al ser sintetizados (p. ej., de manera cotranscripcional). (a) Micrografía electrónica de una unidad de transcripción no ribosómica que muestra la presencia de partículas de ribonucleoproteínas unidas a los transcritos de RNA nacientes. (b) Dibujo interpretativo de la micrografía que se muestra en el apartado a. La línea punteada representa la hebra de cromatina (DNA), las líneas sólidas las fibrillas de ribonucleoproteína (RNP) y los círculos sólidos las partículas de RNP relacionadas con las fibrillas. Para numerar los transcritos individuales, se empieza con el más cercano al punto de inicio. Las partículas de RNP no se distribuyen de modo aleatorio a lo largo del transcrito emergente, sino que se unen a sitios específicos donde se realiza el procesamiento del RNA. (Tomada de Ann L. Beyer, Oscar L. Miller, Jr., y Steven L. Mcknight, Cell 20:78, 1980; con autorización de Elsevier.)

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Figura 11.28 Sinopsis de los pasos de la adición de un capuchón de metilguanosina 5’ y una cola de poli(A) en el extremo 3’ de un pre-mRNA. El extremo 5’ del pre-mRNA naciente se une a una enzima formadora del capuchón, la cual en los mamíferos tiene dos sitios activos que catalizan reacciones diferentes: una trifosfatasa que remueve al grupo fosfato terminal (paso 1) y una transferasa de guanililo que adiciona un residuo de guanina en orientación inversa, por medio de un enlace 5’-a-5’ (paso 2). En el paso 3, diferentes transferasas de metilo agregan un grupo CH3 al capuchón de guanosina terminal y a la ribosa del nucleótido colocado en el extremo del RNA emergente. Un complejo proteínico (llamado CBC) se une al casquete (no se muestra). Una serie de sucesos muy diferentes ocurre en el extremo 3’ del pre-mRNA, donde un complejo grande de proteínas se ensambla. Primero, una endonucleasa divide el transcrito de RNA primario, lo que genera un nuevo extremo 3’ en dirección 5’ del extremo 3’ original. En los pasos a-c, una polimerasa de poli(A) añade residuos de adenosina al extremo 3’ sin intervención de una plantilla de DNA. Un mRNA típico de mamífero contiene 200 a 250 residuos de adenosina en su cola de poli(A) completa; el número es mucho menor en eucariotas inferiores. (Según D. A. Micklos y G. A. Freyer, DNA Science, Carolina Biological Supply Co.)

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Figura 11.29 Sinopsis de los pasos durante el procesamiento del mRNA de la globina. Los intrones se muestran en púrpura, mientras que las porciones azul oscuro del gen aluden a las posiciones de los exones, que son las secuencias de DNA representadas en el mRNA maduro.

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Figura 11.30 Secuencias nucleotídicas en los sitios de corte y empalme del pre-mRNA. Además de codificar la información para construir un polipéptido, un pre-mRNA también debe ser capaz de dirigir la maquinaria encargada del corte y empalme del RNA. Las secuencias nucleotídicas mostradas en las regiones de los sitios de corte y empalme están basadas en el análisis de un gran número de pre-mRNA y por lo tanto, se refieren como secuencias de consenso. Las bases que se muestran en naranja virtualmente no varían y las que aparecen en negro representan las bases preferidas en dichas posiciones. N representa cualquiera de los cuatro nucleótidos mientras que la Y es una pirimidina. La secuencia de polipirimidina cercana al sitio de corte y empalme 3’ casi siempre contiene entre 10 y 20 pirimidinas. La secuencia del punto de ramificación que se muestra se observa en pre-mRNA humanos y por lo general está unas 30 bases en dirección 5’ del extremo 3’ del intrón.

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Figura 11.31 Estructura y vía de corte y empalme autónomos de los intrones del grupo II. (a) Estructura bidimensional de un intrón del grupo II (mostrado en rojo). Éste se pliega en seis dominios característicos que irradian de una estructura central. Los asteriscos indican los nucleótidos de adenosina que se abultan fuera del dominio VI y forman una estructura semejante a un lazo, descrita en el texto. Los dos extremos del intrón llegan a estar muy cercanos entre sí, como lo indica la proximidad de los dos enlaces intrón-exón.

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Figura 11.31 Estructura y vía de corte y empalme autónomos de los intrones del grupo II. (Continuación) (b) Pasos en el corte y empalme autónomos de los intrones del grupo II. En el paso 1, el OH 2’ de una adenosina dentro del intrón (asterisco en el dominio VI del apartado “a”) realiza un ataque nucleofílico al sitio de corte y empalme 5’, que corta el RNA y forma un enlace fosfodiéster 2’-5’ raro con el primer nucleótido del intrón. Esta estructura ramificada se describe como lazo. En el paso 2, el grupo OH 3’ libre del exón desplazado ataca al sitio de corte y empalme 3’, el cual corta el RNA en el otro extremo del intrón. Como resultado de esta reacción, el intrón se libera en la forma de un asa y los extremos 3’ y 5’ de los dos exones flanqueadores se ligan (paso 3). Una vía similar se sigue en el corte y empalme de los pre-mRNA, pero en lugar de suceder de manera autónoma, estos pasos requieren la ayuda de distintos factores adicionales.

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Figura 11.32 Modelo esquemático del ensamble de la maquinaria de corte y empalme y algunos de los pasos que ocurren durante este proceso. El paso 1 muestra la porción del pre-mRNA que se somete a corte y empalme. En el paso 2, el primero de los componentes, snRNP U1, se ha unido al sitio 5’ del corte y empalme del intrón. La secuencia nucleotídica del snRNA U1 es complementaria del sitio de corte y empalme 5’ del premRNA y hay evidencias que indican que dicha ribonucleoproteína se une de manera inicial al extremo 5’ del intrón por la formación de pares de bases específicas entre el sitio de corte y empalme y el snRNA U1 (véase el recuadro A). La snRNP U2 es la siguiente en entrar al complejo de corte y empalme y se une al premRNA (como se muestra en el recuadro A), lo cual ocasiona que un residuo de adenosina específico (resaltado) se exponga hacia afuera de la hélice (paso 3). Éste es el sitio que más tarde será el punto de bifurcación del lazo. Se piensa que a la U2 la recluta la proteína U2AF, que se une a la secuencia de polipirimidina cerca del sitio de corte y empalme 3’. U2AF también interacciona con las proteínas SR que se unen a los potenciadores del corte y empalme exónico (ESE). Estas interacciones tienen una función importante en el reconocimiento de los extremos intrón/exón. El próximo paso es la unión de las snRNP U4/U6 y U5 al pre-mRNA con el desplazamiento de U1. (Continúa)

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Figura 11.32 Modelo esquemático del ensamble de la maquinaria de corte y empalme y algunos de los pasos que ocurren durante este proceso. (Continuación) (paso 4 ) El ensamble de un empalmosoma implica una serie de interacciones dinámicas entre el pre-mRNA y los snRNA específicos y entre los snRNA mismos. A medida que entran en el complejo con el pre-mRNA, ls snRNA U4 y U6 se parean de manera extensa el uno con el otro (recuadro B). Después, el snRNA U4 se separa del dúplex y las regiones de U6 que estaban apareadas con U4 forman pares con una porción de los snRNA U2 (recuadro C). Otra porción del snRNA U6 se halla en el sitio de corte y empalme 5’ (recuadro C), una vez que ha desplazado al snRNA U1 que antes residía ahí (recuadro A). Se cree que U6 es una ribozima y que U4 es un inhibidor de su actividad catalítica. Según esta hipótesis, una vez que los snRNA U1 y U4 se desplazan, el snRNA U6 está en posición para catalizar las dos reacciones químicas necesarias para retirar el intrón. Según una visión alternativa, las reacciones son catalizadas por la actividad combinada del snRNA U6 y una proteína de la snRNP U5. Cualquiera que sea el mecanismo, la primera reacción (indicada con la flecha en el recuadro C) conduce a la separación del sitio de corte y empalme 5’, lo que forma un exón 5’ libre y un intermediario lazo de intrón-exón 3’ (paso 5). Se piensa que la porción 5’ libre del exón se mantiene en su lugar por su relación con el snRNA U5 del empalmosoma, que también interactúa con el exón 3’ (paso 5). A la primera reacción de corte en el sitio de corte y empalme 5’ le sigue una segunda reacción de corte en el sitio de corte y empalme 3’, lo cual elimina el intrón en forma de lazo y de manera simultánea une los extremos de los dos exones vecinos (paso 6). Después del corte y empalme, deben liberarse las snRNP del pre-mRNA, reiniciarse las relaciones originales entre los snRNA y reensamblarse las snRNP en los sitios de otros intrones.

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Figura 11.33 Estructura de una snRNP. (a) Modelo de una partícula snRNP U1 basada en datos bioquímicos e información estructural obtenida a partir de microscopia crioelectrónica. En el núcleo de la partícula se halla un complejo proteínico en forma de anillo compuesto de siete proteínas Sm diferentes que son comunes en todas las snRNP U. Otras tres proteínas son únicas de las snRNP U1 (llamadas 70K, U1-A y U1-C). Los tallos I, II y IV son partes de los snRNA U1 de 165 bases. El snRNA se ensambla en el citoplasma y se importa al núcleo, donde realiza su función. (b) Modelo de un snRNA U1 casi en la misma orientación que en el apartado a. (Imagen tomada de Holger Stark et al., Nature 409:541, 2001; reproducida con autorización de Macmillan Publishers Limited.)

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Figura 11.34 Representación esquemática de un mecanismo para la coordinación de la transcripción, la colocación de capuchón, la poliadenilación y el corte y empalme. En este modelo simplificado, el dominio C-terminal (CTD) de la subunidad grande de la RNA polimerasa (pág. 443) sirve como andamiaje flexible para la organización de los factores participantes en el procesamiento de pre-mRNA, incluidos los de la colocación del casquete, la poliadenilación y la eliminación de intrones. Además de las proteínas mostradas aquí, es probable que la polimerasa se relacione con muchos factores de transcripción, así como enzimas que modifican la plantilla de cromatina. Las proteínas unidas a la polimerasa en cualquier momento podrían depender de los residuos de serina del CTD que estén fosforilados. El patrón de residuos de serina fosforilados cambia conforme la polimerasa avanza del principio al final del gen que se transcribe (comparar con la fig. 11.20). Los grupos fosfato unidos a los residuos #5 se pierden casi por completo cuando la polimerasa ya transcribió el extremo 3’ del RNA. (Según E. J. Steinmetz, Cell 89:493, 1997, con autorización de Cell Press.)

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Figura 11.35 Procesamiento de pre-mRNA ovomucoide. La fotografía muestra los resultados de un método conocido como Northern blot, en el cual el RNA extraído (en este caso de núcleos de células de oviducto de gallina) se fracciona por electroforesis en gel y se transfiere a una membrana. El RNA inmovilizado en ésta se incuba con un cDNA marcado con radiactividad (en este caso un cDNA elaborado a partir de mRNA ovomucoide) para producir bandas que identifiquen la posición de los RNA que contienen la secuencia complementaria. El mRNA maduro que codifica a la proteína ovomucoide posee una longitud de 1 100 nucleótidos y se muestra en la parte inferior de la membrana. Es evidente que el núcleo contiene varios RNA más largos que también tienen la secuencia nucleotídica del mRNA ovomucoide. El RNA más grande en el ensayo posee una longitud de 5 450 nucleótidos y corresponde al tamaño de la unidad de transcripción ovomucoide; se presume que este RNA es el transcrito primario del cual se deriva el mRNA. Otras bandas prominentes contienen RNA con longitudes de 3 100 nucleótidos (que corresponden a un transcrito que perdió los intrones 5 y 6), 2 300 nt (un transcrito que perdió los intrones 4, 5, 6 y 7) y 1 700 nt (un transcrito que perdió todos los intrones excepto el 3). (Cortesía de Bert O’Malley.)

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Figura 11.36 Interferencia del RNA. (a) Las petunias por lo general producen flores de color púrpura. Las de esta planta son blancas porque las células contienen un gen extra (un transgén) que codifica una enzima necesaria para la producción de color. El gen agregado ocasiona una interferencia del RNA que causa la destrucción específica de mRNA transcritos tanto del transgén como de los genes de la propia planta, lo cual hace que las flores carezcan de pigmento. (b) Un nematodo con un gen que codifica una proteína de fusión GFP (pág. 273) expresado de manera específica en la faringe del animal. (c) Este gusano se desarrolló de un progenitor con el mismo genotipo que el mostrado en el apartado b, cuyas gónadas se habían inyectado con una solución del dsRNA complementario del mRNA de la proteína bajo estudio. La ausencia de tinción refleja la destrucción del mRNA por una interferencia del RNA. (a: imagen tomada de David Baulcombe, Curr. Biol. 12:R82, 2002; con autorización de Elsevier. Cortesía de David Baulcombe, Sainsbury Laboratory, Norwich, UK.; b, c: imagen reimpresa de www.neb.com(2012) con autorización de New England BioLabs.)

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Figura 11.37 Formación y mecanismo de acción de siRNA y miRNA. (a) En el paso 1, la endonucleasa Dicer corta ambas cadenas de un RNA bicatenario para formar un siRNA pequeño (de 21 a 23 nucleótidos) que tiene extremos salientes (paso 2). En el paso 3, el siRNA se relaciona con un complejo proteínico, un pre-RISC, que contiene una proteína Argonauta (casi siempre Ago2) capaz de cortar y retirar la cadena pasajera del siRNA bicatenario. En el paso 4, el siRNA guía de cadena sencilla, junto con proteínas del complejo RISC, se une a un RNA blanco que tiene una secuencia complementaria. El RNA diana podría ser un RNA vírico, un transcrito de un transposón o un mRNA, según las circunstancias. En el paso 5, el RNA blanco se divide en un sitio específico por efecto de la proteína Argonauta y luego se degrada. (b) Los microRNA provienen de RNA precursores monocatenarios con secuencias complementarias, lo que les permite plegarse sobre sí mismos para formar un RNA bicatenario con un tallo y un asa en un extremo (paso a). Este seudodsRNA (o pri-miRNA) se divide en un sitio específico localizado cerca de su asa terminal, por acción de un complejo proteínico que contiene una endonucleasa llamada Drosha, para generar un premiRNA con un extremo 3’ colgante. El pre-miRNA se exporta al citoplasma, donde es dividido por acción de la enzima Dicer y se forma un miRNA doble pequeño (paso 2) que tiene un colgajo 3’ en ambos extremos.

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Figura 11.37 Formación y mecanismo de acción de siRNA y miRNA. (Continuación) En el paso 3, el RNA bicatenario se relaciona con un complejo proteínico que contiene una proteína Argonauta (casi siempre Ago1), lo que conduce a la separación de la cadenas y el retiro de la cadena pasajera (llamada miRNA*). Luego, el miRNA de cadena sencilla se une a una región complementaria localizada en un mRNA (paso 4) e inhibe la traducción del mensaje, como se muestra en el paso 5 (o como alternativa, conduce a la desestabilización y la degradación del mRNA, como se explica en la sección 12.6). A diferencia de los siRNA, los miRNA que inhiben la traducción sólo son parcialmente complementarios con el mRNA blanco, de ahí el abultamiento. La mayoría de los miRNA vegetales y unos cuantos miRNA animales tienen una secuencia completamente complementaria a la del mRNA, o se aproxima a serlo; en estos casos, el resultado de la interacción tiende a ser la división del mRNA por parte de Ago2 de la misma manera que se muestra en el apartado a. (Cierta clase de miRNA provenientes de intrones no produce largos pri-miRNA en forma de horquilla y no requiere de la enzima Drosha para su procesamiento.)

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Perspectiva Humana Figura 1 Efectos de siRNA en el epitelio intestinal de ratones con enfermedad inflamatoria inducida. (a) Apariencia histológica de un corte del intestino de un ratón normal. (b) Apariencia del intestino de un ratón con colitis inflamatoria, pero sin tratamiento con siRNA dirigido contra β7. (c) Apariencia del intestino de un ratón tratado con un siRNA dirigido contra β7 y diseñado contra un mRNA que codifica la ciclina D1. El siRNA se enfocó en los leucocitos promotores de la inflamación y produjo una reducción drástica en el daño al tejido intestinal. (Imagen tomada de Dan Peer et al., por cortesía de Motomu Shimaoka, Science 319:630, 2008; fig. 4c © copyright 2008, reimpresa con autorización de la American Association for the Advancement of Science.)

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Figura 11.38 Los microRNA se sintetizan en tejidos específicos durante el desarrollo embrionario. Estas micrografías de embriones de pez cebra muestran la expresión específica de tres miRNA diferentes, cuya localización está indicada por la tinción azul. El miR-124a se expresa de manera específica en el sistema nervioso (a), el miR-206 en el músculo esquelético (b) y el miR-122 en el hígado (c). (Imagen tomada de Erno Wienholds, Wigard Kloosterman, et al., Science 309:311, 2005, cortesía de Ronald H. A. Plasterk; © copyright 2005, reimpresa con autorización de la American Association for the Advancement of Science.)

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Figura 11.39 Diferencias entre un código genético superpuesto y uno no superpuesto. El efecto en el contenido de la información de un mRNA por una sola sustitución de bases depende de si el código está superpuesto o no. Los codones afectados están subrayados en rojo.

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Figura 11.40 El código genético. Esta carta universal de codificación enlista cada uno de los 64 codones de mRNA posibles y sus aminoácidos correspondientes. Para usar la carta para traducir el codón UGC, por ejemplo, se debe encontrar la primera letra (U) en la fila indicada a la izquierda, se sigue la fila de la derecha hasta encontrar la segunda letra (G) señalada en la parte superior y después se encuentra el aminoácido que coincide con la tercera letra (C) en la fila a la derecha. El triplete UGC codifica la inserción de cisteína. Cada aminoácido (excepto dos) posee dos o más codones que ordenan su inserción, lo cual hace al código genético degenerado. Un aminoácido particular tiende a ser codificado por codones relacionados. (Continúa)

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Figura 11.40 El código genético..(Continuación) Esta característica reduce la probabilidad de que las sustituciones de bases resulten en cambios de la secuencia aminoacídica de una proteína. Los aminoácidos con propiedades similares también tienden a estar agrupados. Los aminoácidos con cadenas laterales ácidas se muestran en rojo, aquellos con cadenas laterales básicas en azul, los que tienen cadenas laterales polares sin carga en verde y aquellos con cadenas laterales hidrófobas en café. Como se revisa en la siguiente sección, la decodificación en la célula la llevan a cabo los tRNA, algunos de los cuales se ilustran de forma esquemática en el lado derecho de la figura. Los codones UAA, UAG y UGA indican el cese de la traducción.

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Figura 11.41 Los genes pueden experimentar varios tipos de mutaciones. Las líneas rojas señalan a los codones. (a) Las mutaciones sinónimas (en este caso el cambio de AUC a AUA) no afectan la asignación del código de aminoácidos, pero aún pueden tener un efecto fenotípico al alterar el corte y empalme del pre-mRNA, la eficiencia de la traducción, la estabilidad del mRNA, etc. (b) Las mutaciones no sinónimas (con cambio de sentido) (en este caso la transformación de AUC a AUG) cambian un solo aminoácido en la secuencia del polipéptido. (c) Las mutaciones finalizadoras (en este caso la sustitución del triplete UGU por el codón UGA) hacen que el ribosoma interrumpa la traducción del mRNA en el sitio de la mutación y con ello termina de manera prematura la síntesis proteínica. (d) Las mutaciones con cambio del marco de lectura, que pueden ser causadas por la inserción o la deleción de una o dos bases, desplazan el ribosoma a un marco de lectura incorrecto, causando que haya una secuencia anormal de aminoácidos a partir de la mutación.

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Figura 11.42 Estructura bidimensional de los RNA de transferencia. (a) Secuencia nucleotídica de un tRNAAla de levadura en forma de trébol. El aminoácido se une al extremo 3’ del tRNA, mientras que el lado opuesto porta el anticodón, en este caso IGC, cuya función se revisa más tarde. Además de las cuatro bases, A, U, G, y C, este tRNA contiene:ψ, seudouridina; T, ribotimidina; mI, metilinosina; I, inosina; me2G, dimetilguanosina; D, dihidrouridina; y meG, metilguanosina. Los sitios de las 10 bases modificadas en este tRNA se indican con sombras de diferentes colores. (b) Representación general del tRNA en forma de trébol. Las bases comunes a todos los tRNA (en procariotas y eucariotas) se indican con las siguientes letras: R es una purina, Y una pirimidina y ψ una seudouridina, todas invariables. La variabilidad mayor entre los tRNA, que oscila entre cuatro y 21 nucleótidos, ocurre en el brazo V (variable). Hay dos sitios de menor variabilidad a lo largo del brazo D.

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Figura 11.43 Estructura de un tRNA. (a) Estructura bidimensional de un fenilalanil-tRNA de levadura, con las diferentes regiones de la molécula en código de color para correlacionarlas con las del modelo del apartado b. (b) Estructura tridimensional de un tRNAPhe obtenida mediante cristalografía por rayos X. El brazo aceptor de aminoácidos (AA) y el brazo TC (T) forman una doble hélice continua. El brazo del anticodón (AC) y el brazo D crean una doble hélice de manera intermitente. Estas dos columnas de hélices forman una molécula semejante a una L. (b: cortesía de Mike Carson, University of Alabama, Birmingham.)

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Figura 11.44 Bamboleo en la interacción entre codones y anticodones. En algunos casos, el nucleótido en el extremo 5’ del anticodón del tRNA es capaz de aparearse con más de un nucleótido en el extremo 3’ (tercera posición) del codón de mRNA. En consecuencia, más de un codón puede usar el mismo tRNA. Las reglas para el apareamiento en el esquema del bamboleo se indican en la figura y en el texto.

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Figura 11.45 Imagen tridimensional de la interacción entre un tRNA y su aminoacil-tRNA sintetasa. La estructura cristalina de la glutaminil-tRNA sintetasa de E. coli (en azul) forma un complejo con el tRNAGln (que se indica en rojo y amarillo). La enzima reconoce este tRNA específico y discrimina otros a través de interacciones con el brazo aceptor y el anticodón del tRNA. (Imagen tomada de Thomas A. Steitz, Science Vol. 246, portada del tomo publicado el 12 de enero de 1989; ©1989, reimpresa con autorización de la American Association for the Advancement of Science.)

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Figura 11.46 Iniciación de la síntesis de proteínas en bacterias. En el paso 1, la iniciación de la traducción comienza al adherirse la subunidad ribosómica 30S al mRNA en el codón de inicio AUG, un paso que requiere de los factores IF1 e IF3. Dicha unión es resultado de una interacción entre una secuencia nucleotídica complementaria en el rRNA y el mRNA, como se revisa en el texto. En el paso 2, el formilmetionil-tRNAfMet se vincula al mRNA y al complejo de la subunidad ribosómica 30S mediante la unión al complejo IF2-GTP. En el paso 3, la subunidad 50S se une al complejo, el GTP se hidroliza y se libera IF2-GDP. El tRNA iniciador entra al sitio P del ribosoma, mientras que todos los tRNA subsecuentes ingresan al sitio A (fig. 11.49).

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Figura 11.47 Iniciación de la síntesis de proteínas en organismos eucariotas. Como se señala en el texto, la iniciación comienza con la unión de dos complejos, uno (llamado 43S) contiene la subunidad ribosómica 40S unida a varios factores de iniciación (eIF) y el tRNA iniciador, mientras que el otro posee el mRNA unido a un grupo separado de factores de iniciación. Esta unión es mediada por una interacción entre el eIF3 en el complejo 43S y el eIF4G en el complejo del mRNA. Se cree que los factores eIF1 y eIF1A inducen un cambio de conformación en la subunidad ribosómica pequeña que abre un “cerrojo” para acomodar la entrada de mRNA. Una vez que el complejo 43S se ha unido al extremo 5’ del mRNA, recorre el mensaje hasta alcanzar el codón de iniciación AUG apropiado.

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Figura 11.48 Modelo de un ribosoma bacteriano, basado en datos de cristalografía por rayos X, que muestra los tRNA unidos a los sitios A, P y E de las dos subunidades ribosómicas. (a-b) Vista de las subunidades 30S y 50S, en dicho orden, con los tres tRNA unidos mostrados en la interfase entre las subunidades. (a’-b’) Representaciones que corresponden a las estructuras que aparecen en los apartados a y b. El dibujo en a’ de la subunidad 30S ilustra las localizaciones aproximadas de los anticodones de los tres tRNA y sus interacciones con los codones complementarios del mRNA. El dibujo en b’ de la subunidad 50S muestra los sitios del tRNA en dirección inversa. Los extremos aceptores de aminoácidos de los tRNA que se encuentran en los sitios A y P están muy cerca entre sí dentro del sitio de transferencia del peptidilo de la subunidad, en donde ocurre la formación del enlace peptídico. Los sitios de unión para los factores de elongación EF-Tu y EF-G se hallan en la protuberancia del lado derecho de la subunidad. (a y b: imágenes tomadas de Jamie H. Cate et al., cortesía de Harry F. Noller, Science 285:2100, 1999; a’, b’ y c: imágenes tomadas de A. Liljas, Science 285:2078, 1999; todas reimpresas con autorización de la American Association for the Advancement of Science.)

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Figura 11.48 Modelo de un ribosoma bacteriano, basado en datos de cristalografía por rayos X, que muestra los tRNA unidos a los sitios A, P y E de las dos subunidades ribosómicas. (Continuación) (c) Dibujo del ribosoma procariota 70S que señala el espacio entre las dos subunidades ocupado por cada molécula de tRNA y el conducto dentro de la subunidad 50S a través del cual el polipéptido recién formado sale del ribosoma. (a y b: imágenes tomadas de Jamie H. Cate et al., cortesía de Harry F. Noller, Science 285:2100, 1999; a’, b’ y c: imágenes tomadas de A. Liljas, Science 285:2078, 1999; todas reimpresas con autorización de la American Association for the Advancement of Science.)

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Figura 11.49 Representación esquemática de los pasos de la elongación durante la traducción en bacterias. (a) En el paso 1, un aminoacil-tRNA cuyo anticodón es complementario del segundo codón del mRNA entra al espacio vacío A del ribosoma. La unión del tRNA se acompaña de la liberación del complejo EF-Tu-GDP. En el paso 2, la formación del enlace peptídico se acompaña de la transferencia de la cadena polipeptídica naciente desde el tRNA en el sitio P hasta el aminoacil-tRNA en el sitio A, con lo cual se forma un dipeptidil-tRNA en el sitio A y un tRNA desacilado en el sitio P. La reacción la cataliza en parte el rRNA que actúa como ribozima. En el paso 3, la unión de EF-G y la hidrólisis de su GTP adjunto resultan en la translocación del ribosoma sobre el mRNA. La translocación opera junto con el movimiento del tRNA desacilado y del peptidil-tRNA en los sitios E y P, respectivamente. En el paso 4, el tRNA desacilado deja el ribosoma y un nuevo aminoacil-tRNA entra al sitio A. (b) Formación del enlace peptídico y desplazamiento posterior del tRNA desacilado. Un ribosoma puede catalizar la incorporación de 10 a 20 aminoácidos a un polipéptido en crecimiento cada segundo, una tasa que es casi 10 millones de veces mayor que la observada en la reacción no catalizada que emplea sustratos modelo en solución.

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Figura 11.50 Modelo estructural de las etapas de translocación durante la elongación traduccional en bacterias. (a) Esquema de la transición del estado clásico al estado de “avance por trinquete” del ribosoma procariota, que comprende la rotación de 6º de las subunidades en relación mutua. (Dicha rotación se expone de manera detallada en Ann. Rev. Biophys. 39:227, 2010.) (b) Los pasos que ocurren durante la translocación se describen en el texto. (Imagen tomada de T. Martini Schmeing y V. Ramakrishnan, Nature 461:1238, 2009. Reimpresa con autorización de Macmillan Publishers Ltd. Cortesía de Venki Ramakrishnan.)

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Figura 11.51 Modelo estructural del primer paso de la terminación de la traducción en bacterias. Cuando el ribosoma llega a un codón de terminación, UAA o UAG, un RF de clase I entra al sitio A y se alinea en forma semejante a como lo hace un aa-tRNA entrante. Un dominio del RF que reside en el centro de transferasa de peptidilo del ribosoma induce la hidrólisis del enlace éster que une al polipéptido con el peptidil-tRNA en el sitio P y así se libera el polipéptido completo. (Imagen tomada de H. S. Zaher y R. Green, Cell 136:747, 2009, con autorización de Elsevier. Cortesía de Rachel Green, Johns Hopkins School of Medicine.)

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Figura 11.52 Polirribosomas. (a) Dibujo esquemático de un poliribosoma (polisoma). (b) Este modelo tridimensional se generó a partir de tomografías crioelectrónicas de polisomas bacterianos en proceso de traducción in vitro. Para obtener las imágenes, las preparaciones se vitrificaron (se congelaron para obtener hielo parecido al vidrio, sin la formación de cristales de hielo) en etano líquido a -196ºC. Luego se tomaron micrografías electrónicas con el espécimen colocado en varios ángulos de inclinación, lo que aportó datos para generar una reconstrucción tridimensional. (c) Micrografía electrónica de un corte por raspadura del borde externo de una cisterna del ER rugoso. Los ribosomas están alineados en asas y espirales, lo que indica su unión con moléculas de mRNA para formar polisomas. (b: imagen tomada de Florian Brandt et al., por cortesía de Wolfgang Baumeister, Cell 136:267, 2009, con autorización de Elsevier. d: Don W. Fawcett/Photo Researchers/ Getty Images, Inc.)

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Figura 11.53 Visualización de la transcripción y la traducción. (a) Micrografía electrónica de partes de un cromosoma de E. coli en proceso de transcripción. El DNA se observa en la forma de líneas muy tenues que discurren a lo largo de la fotografía, en tanto que las cadenas de mRNA nacientes se observan fijadas a uno de sus extremos, al parecer por una molécula de RNA polimerasa. Las partículas relacionadas con los RNA nacientes son ribosomas en el momento de la traducción; en bacterias, la transcripción y la traducción ocurren de manera simultánea. Las moléculas de RNA aumentan de longitud conforme crece la distancia al sitio de inicio. (b) Micrografía electrónica de un polirribosoma aislado de células de glándula de gusano de seda que producen gran cantidad del polipéptido fibroína. Esta proteína es lo suficientemente grande para ser visible en la micrografía (las flechas apuntan a las cadenas de los polipéptidos emergentes). (a: imagen tomada de Oscar L. Miller Jr., Barbara A. Hamkalo y C. A. Thomas, Science 169:392, 1970; ©1970, reimpresa con autorización de la American Association for the Advancement of Science; b: cortesía de Steven L. Mcknight y Oscar L. Miller Jr.)

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Vías Experimentales Figura 1 RNA ribosómico purificado de Tetrahymena marcado con 32P, transcrito en concentraciones diferentes de (NH4)2SO4 y analizado por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida. Los números en la parte superior indican la concentración de sulfato de amonio. Se presentan dos grupos de muestras, “la forma nativa” y la variante desnaturalizada por calor. Las muestras del último grupo se sometieron a ebullición durante 5 min en amortiguador y se incubaron en hielo para disociar cualquier molécula que se mantuviera unida por puentes de hidrógeno entre las bases complementarias. Las dos columnas de la derecha contienen los rRNA bacterianos 16S y 23S, que proveen los marcadores de tamaño de referencia con los cuales se pueden comparar las otras bandas en el gel. Puede observarse a partir de las posiciones de las bandas que a medida que la concentración de sulfato de amonio aumenta, aparece un RNA pequeño cuyo tamaño es igual al del intrón aislado (IVS, secuencia interpuesta). Estos datos suministran la primera indicación de que el rRNA es capaz de escindir el intrón sin la ayuda de otros factores adicionales. (Imagen tomada de T. R. Cech et al., Cell 27:488, 1981; con autorización de Elsevier.)

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Vías Experimentales Figura 2 Resultados de la electroforesis en gel de poliacrilamida de las mezclas de reacción que contenían los precursores del tirosiniltRNA (pTyr) y del RNA 4.5S (p4.5). Se describe sólo el pTyr, que se procesa por lo general mediante la ribonucleasa P para formar dos moléculas de RNA, Tyr y 5’-Tyr (que es el extremo 5’ del precursor). Las posiciones en las cuales estos tres RNA (pTyr, Tyr y 5’- Tyr) migran durante la electroforesis se indican en el lado izquierdo del gel. El carril 1 muestra los RNA que aparecen en la mezcla de reacción cuando pTyr y p4.5 se incuban con la ribonucleasa P completa. Muy poco del pTyr permanece en la mezcla y se transforma en dos productos (Tyr y 5’-Tyr). El carril 5 señala los RNA que aparecen en la mezcla de reacción cuando pTyr se incuba con el componente proteínico purificado de la ribonucleasa P. La proteína no es capaz de cortar al precursor del tRNA, como es evidente por la ausencia de bandas en las que los dos productos deberían migrar. En cambio, cuando pTyr se incuba con el componente del RNA purificado de la ribonucleasa P (carril 7), el pTyr se procesa de manera eficiente, como ocurriría al utilizar la ribonucleoproteína intacta. (Imagen tomada de Cecilia Guerrier-Tokada et al. Cell 35:850, 1983; con autorización de Elsevier.)

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Figura 3 Modelo molecular de una porción de la subunidad de RNA catalítica de la ribonucleasa P bacteriana (en blanco) y su sustrato unido, el tRNA precursor (en rojo). El sitio del tRNA precursor, donde lo corta la ribozima, se indica con una esfera amarilla. Es interesante destacar que la RNasa P de las mitocondrias humanas es una enzima proteínica y no necesita un componente de RNA para tener actividad catalítica. Se cree que dicha enzima ejemplifica cómo una proteína adquiere durante la evolución una actividad catalítica a partir de un RNA antiguo. (Cortesía de Michael E. Harris y Norman R. Pace.).

biologÍa celular y molecular capítulo 11 -...

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