biocatálisis en medios no acuosos: una historia de veinte años, desde los fundamentos a las...
TRANSCRIPT
j$p 2I
Biocatálisis en medios no acuosos: una historia de 20
años, desde los fundamentos a las aplicaciones
industriales
Dr. Eduardo Bárzana García
Facultad de Química
Universidad Nacional Autónoma de México
Trabajo de ingreso presentado a la
Academia de Ingeniería
México D.F. 23 de Enero de 2003.
"Biocatálisis en medios no acuosos: una historia de 20 años,
desde los fundamentos a las aplicaciones industriales"
Eduardo Bárzana García
Facultad de Química, UNAM
México D.F. 04510
.g!Y1P.! JJflm. mx
INTRODUCCIÓN
La catálisis biológica aplicada en procesos industriales es conocida desde
principios del siglo XX, como en el caso de la licuefacción de productos
almidonáceos, la clarificación de cerveza o la producción de hidrolizados de
proteina vegetal. Sin embargo, por más de 50 años, las transformaciones
resultantes eran muy simples desde el punto de vista químico, pues consistían en
reacciones hidrolíticas de polímeros biológicos (proteínas y polisacáridos). Este
lento crecimiento se debió fundamentalmente a dos razones, 1) la frágil estructura
proteica de las enzimas que al resultaba en una propensión a perder su poder
catalítico a condiciones normales de operación, y 2) a un relativo alto costo de
obtención, en comparación con los catalizadores inorgánicos, a partir de fuentes
naturales como plantas, animales o microorganismos.
El posible impacto de los procesos enzimáticos en la industria cambió
favorablemente durante el último cuarto del siglo, cuando se consolidó la biología
molecular a través de las metodologías conocidas como "ingeniería genética"
Estas técnicas permitían manipular y transferir información genética, inclusive
entre especies, lo que llevó a mejorar sustancialmente la capacidad catalítica y la
tasa de producción de una gran gama de enzimas, como en el caso de la renina
gástrica para la producción de quesos (Tucker y Woods, 1991). A partir de
mediados de los 80's los avances surgidos de este tipo de manipulaciones
genéticas han sido, y siguen siendo, múltiples y de gran trascendencia,
impactando no solo los sectores farmacéutico y alimentario, sitios tradicionales
1'
2
donde se aplicaba la catálisis enzimática, sino otras áreas como la química o la
ambiental. Un ejemplo notable es el caso de la acrilamida producida en Japón
por la via biocatalítica que se presenta en la Figura 1 y a una escala de más de
10,000 tan/año. Seguramente esta aplicación representa el ejemplo más
impactante donde un producto masivo (commodity) de la química orgánica clásica
es ahora producida por vía enzimática (Wandrey et al., 2000).
Nbika 21Mt2
¡lo
= Figura 1. Ruta enzimática para la producción industrial de acrilamida
En forma complementaria a la diversidad de capacidades enzimáticas que
resultaron de la nueva biotecnología, la Ingeniería Bioquímica llevó a cabo
innovadoras aportaciones que expandieron el espectro de aplicaciones de la
biocatálisis. Es el caso de las técnicas mejoradas de inmovilización de enzimas
que permitían su rehúso, o el descubrimientos de formas de vida en ambientes
extremos, y por ende fuentes de enzimas muy resistentes, entre las que destacan
los microorganismos hipertermófilos (v.gr. capaces de crecer a temperaturas
superiores a los 100 °C). Sin embargo, el descubrimiento hecho por Alexander
Klibanov del MIT en 1984 en el sentido de que las enzimas son capaces de
desplegar su poder catalítico en un medio orgánico libre de agua, evolucionó
rápidamente para incidir de manera destacada en el sector productivo y en un
corto plazo. Cómo surge esta aproximación catalítica denominada enzimología no
acuosa, porque trasciende y hacia donde se dirige son los temas que se discuten
el presente trabajo.
3
Para fines de definición, la biocatálisis no acuosa implica el llevar a cabo
una transformación química por mediación de una (o varias) enzima y en un medio
monofásico, ya sea sin agua o en cantidades tales que el agua esté presente en
forma discontinua y totalmente dispersa en el sistema. Los solventes orgánicos,
tanto solubles como insolubles en agua, han sido empleados mayoritariamente
para este fin (Le. fase orgánica). Como extensión del concepto, también se han
desarrollado métodos biocatalíticos en fluidos supercríticos y para sustratos
presentes como vapores o gases (i.e. en fase gas).
ANTECEDENTES HISTORICOS
Las enzimas fueron conocidas desde finales del Siglo XIX y las primeras
patentes sobre su uso fueron otorgadas en 1894 y 1906, ambas basadas en los
trabajos pioneros de Takamine con preparaciones diastásicas (amilolíticas). Con el
tiempo, el uso industrial de enzimas se consolidó lentamente, pero siempre
alrededor de aquellas que presentaban una actividad hidrolítica despolimerizante
(amilasas, proteasas) o desesterificante (lipasas). Como se indico previamente, la
funcionalidad química era de alta sencillez. En contraste, otras enzimas conocidas
o nuevas y con otras funcionalidades (e.g. oxidoreductasas, liasas, isomerasas)
eran vistos meramente como componentes de interés en estudios bioquímicos o
médicos. Esto a pesar de las propiedades únicas ofrecidas por las enzimas en
comparación con otros catalizadores químicos, como una superior regio y estéreo
selectividad, capacidad de catálisis a condiciones ambientales tenues, nula
toxicidad y baja permanencia en el ambiente por su total biodegradabilidad.
Un cambio importante ocurrió en las 1960's cuando fueron desarrollados
los procesos enzimáticos para la isomerización de aminoácidos (aminoacilasa) y
de producción de jarabes fructosados de maíz (glucosa-isomerasa), vigentes aún
hoy en día con un muy alto valor comercial. Por otra parte, es claro que todas las
aplicaciones mencionadas se llevaban a cabo en un medio acuoso. Sin embargo,
y más allá de las grasas u aceites, existen una gran cantidad de compuestos de
naturaleza hidrofóbica con una baja solubilidad en agua (ácidos grasos, alcoholes,
4
aromáticos, esteroides, etc) que quedaban fuera de la posibilidad de
transformación enzimática. El razonamiento fundamental era que las enzimas
debían, por su naturaleza protéica, funcionar solamente en agua o interfases
agua-solvente orgánico. Aún más, la presencia obligada de agua no permitía la
inhibición de reacciones indeseables como hidrólisis y adición nucleofílica del ion
hidroxilo en muchos procesos de síntesis.
El camino lógico para transformar (sin hidrólisis) los sustratos insolubles en
agua se derivó de la peculiar habilidad de las lipasas para trabajar en la interfase
de sistemas bifásicos. Para ello, muchos estudios optimizaron la cantidad mínima
de agua en mezclas bifásicas obteniendo en algunos casos rendimientos
aceptables. Sin embargo, debajo del 5% de agua la reacción decaía rápidamente.
Era entonces claro que, a pesar de que las hidrolasas son capaces en teoría de
catalizar reacciones opuestas de hidrólisis y síntesis, en un medio acuoso el
equilibrio termodinámico favorece la hidrólisis puesto que el agua no sólo es un
reactivo sino que está presente a una concentración de 55M. Obviamente, otro
requisito esencial era que la enzima mantuviera su capacidad catalítica en lo que
se consideraban condiciones "no fisiológicas". En consecuencia, el límite de un
medio anhídro era considerado inviable.
En 1984 fue publicado un artículo que rompió el paradigma de la
imposibilidad de llevar a cabo una transformación enzimática en un medio
orgánico sin agua (Zaks y Klibanov, 1984). Aún más, presentaba el atractivo de
que una reacción de transesterificación con lipasa pancreática porcina podía
realizarse a 100°C, temperatura considerada como desnaturizante en ese
entonces. La reacción estudiada fue la transesterificación de tributirina con n-
heptanol. Adicionalmente, la enzima se agregaba en forma de un sólido y el
reactivo tributirina funcionaba simultáneamente como reactivo y medio continuo.
Este primer artículo de Zaks y Klibanov (1984) es considerado hoy en día como
un clásico y el punto inicial de partida de la enzimología no acuosa, tanto en sus
aspectos científicos como tecnológicos. El descubrimiento fue inmediatamente
5
reconocido como un parte aguas de la enzimología aplicada (Dagani, 1984)
habiendo sido citado a la fecha en más de 5,000 ocasiones en la literatura
científica. Asimismo, este trabajo dio impulso a la formación de grupos de
investigación en todo el mundo y a una expansión notable de trabajos de
científicos en el área. El hecho se refleja en el número de publicaciones que
surgieron durante la década posterior al artículo de Zaks y Klibanov, según se
aprecia en la Figura 2.
nq 1
180
160
140
12(
8c
Z 60
40
20
0
68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92
Pub1iction year
Figura 2. Número de publicaciones relacionadas con reacciones enzimáticas en
medios orgánicos (Sih et al., 1996)
El punto toral de este descubrimiento fue establecer que la ventana de
humedad mínima necesaria para la catálisis era mucho menor a la previamente
concebida. La reacción de síntesis ocurría en un estrecho margen de 0.6% a 1 .2%
de agua en el sistema, niveles que se encuentran dentro de los límites de
saturación de agua en solvente (tributirina en este caso). Debajo de estos límites
la reacción no se presentaba, mientras que a valores superiores se favorecía la
reacción de hidrólisis del sustrato tributirina. La hipótesis, comprobada
rei
posteriormente, era que en ausencia total de agua la enzima presenta una
estructura rigidizada que no le permite efectuar los cambios conformacionales
indispensables para la catálisis. Así, el agua funciona como el "lubricante" que da
soltura a la molécula enzimática. Por ende, a mayor contenido de agua mayor
libertad de movimiento para catalizar pero también para desnaturizarse. Como se
mencionó anteriormente, el valor relativo de la reacción de transesterificación vs.
hidrólisis depende exclusivamente de la dirección termodinámica que dicte la
cantidad de agua presente, y no de la actividad catalítica "per se".
A partir de esta publicación, el grupo de Klibanov reportó del orden de 15
artículos en los siguientes 3 años en los que confirmaron y generalizaron estos
sistemas enzimáticos para una diversidad de condiciones. Por ejemplo, se
emplearon diversos solventes, tanto hidrofílicos como hidrofóbicos, diferentes
enzimas, preparaciones libres o inmovilizadas, y una diversidad de reacciones. Se
logró con ello llevar a cabo una variedad de reacciones relevantes prácticamente
imposibles en agua como oxidoreducciones, epoxidaciones, isomerizaciones y
formación de péptidos y ésteres diversos. Estos aspectos son ilustrados en el
resumen de reacciones y solventes presentados en la Tabla 1.
Tabla 1. Reacciones catalizadas por lipasa porcina pancreática en diferentes solventes orgánicos. (Zaks y Klibanov, 1985)
Velocidad inicial de reacción (pmol/hr-mg)
So'vente
Transeste-
rificación Esterificación Aminólisis
Intercambio
de acilo
Tio-
esterificación Oximólisis
Hexano 5.2 2.4 0.60 2.0 3.0 3.0
Acetona 1.2 0.30 0.60 0.54 1.1 1.5
THF 2.0 0.36 0.54 0.54 1.8 2.1
Eteretílico 5.1 0.90 0.24 0.72 1.9 2.1
Piridina 1.3 0.06 0.60 0.12 1.1 1.1
Tolueno 2.1 2.4 0.18 1.1 1.7 2.3
7
Dentro de las aplicaciones subsecuentes, las resoluciones enantioméricas
con enzimas en medio orgánico son de particular relevancia. Su aportación a la
síntesis de productos farmacéuticos es contundente. Baste recordar que es
sumamente difícil obtener producciones enantioméricas puras con los
catalizadores tradicionales de la química orgánica, mientras que esta funcionalidad
es intrínseca a las enzimas.
En menos de 5 años un número cada vez más creciente de otros grupos en
el mundo reportaron investigaciones originales que le dieron diversidad a la
metodología y atrajeron la atención del sector productivo. Asimismo y casi de
inmediato, los principios dieron origen a otras ideas innovadoras dentro del mismo
grupo del Profesor Klibanov. Primero se dio a conocer que el dióxido de carbono
en estado supercrítico (CO2SC), con un poder solvatante similar al hexano,
permitía también la expresión enzimática y en condiciones de baja humedad,
situación que despertó enorme interés porque implicaba que la estructura activa
no se veía afectada por las altas presiones operadas. Este notable descubrimiento
se dio a conocer casi simultáneamente por el grupo de Prausnitz en la Universidad
de California en Berkeley (Randolph y col, 1985) y el de Klibanov en MIT
(Hammond y col, 1985).
Finalmente, la idea de eliminar totalmente la presencia de una fase continua
se logró al demostrar que preparados enzimáticos secos con muy baja humedad
podían catalizar la conversión de sustratos gaseosos (Bárzana y col., 1986 y
1989a), abriendo así el abanico de posibilidades para la enzimología no acuosa.
Al igual que para los solventes orgánicos, estos reportes para fluidos supercríticos
y fase gas dieron origen en poco tiempo a otras publicaciones con diferentes
enzimas y sistemas de reacción.
APLICACIONES Y AREAS DE INTERÉS
La aplicación más publicitada de las lipasas en medio orgánico
correspondió a la empresa Unilever de Holanda que logró sintetizar un análogo de
8
manteca de cacao con lipasas a partir de aceite de palma, proceso de alto valor
agregado gracias a los trabajos pioneros de McRae (1983). Hoy en día, el proceso
es también empleado en Japón por Fuji Oil (Sheldon, 1996).
Otros productos de interés producidos industrialmente son los
alquilpoliglucósidos empleados como detergentes biodegradables y obtenidos a
partir de sacáridos simples por intermediación de glicosidasas. Asimismo, se logró
obtener compuestos de alta demanda como los aromas y las fragancias
empleados en alimentos, destacando los ésteres sintetizados con lipasas.
También son relevantes las resoluciones enantioméricas de compuestos
hidrofóbicos de importancia en fármacos y con mercados mundiales de millones
de dólares (Sheldon, 1996), así como la biotransformación de esteroides.
Revisiones completas para los interesados pueden encontrarse en fuentes
diversas (Klibanov, 1990; Kanerva, 1996, Roberts, 1997).
Actualmente existen alrededor de 100 diferentes biotransformación que se
llevan a cabo en la industria, la mayoría para la producción de precursores
farmacéuticos o agroquímicos (Wandrey et al., 2000). En la Figura 3 se presentan
los volúmenes de producción de 18 compuestos obtenidos por biocatálisis,
cubriendo un espectro de producción desde las 10 toneladas hasta el millón de
toneladas por año (Powell et al., 2001) . De éstos, 3 procesos corresponden a
lipasas en medio orgánico reflejando la incidencia de la enzimología en fase
orgánica (manteca de cacao, L-Dopa, butirato de glicidilo).
9
Tonnes per Year - o
- o o o o o
O O O O O O
Glucose isomerase - Fructose Nitrile hydratase - acrylamide
Lipase - cocoa butter Penicillin amidase - 6-APA
Asparlase - L-aspartate Thermolysin - aspartame
Hydantoinase - D-phenylglycine Hydantoinase/carbamoylase n-hydroxyphenylglycirie
Aldonolactoriase - D-pantothenic acid Fumarase - L-malic acid
Aminoacylase - [-methionine Aminoacylase - L-valine
Beta-tyrosinase - L-phenylalanine Upase - t. -DOPA
Hydroxylase - L - Carnitine Lipase - Glycidylbutyrate
Trans-glucosidase/Iipase - Butylgiucoside Dextransucrase - gluco-oligosaccharides
Figura 2. Productos comerciales actualmente producidos por vía biocatalítica (Powell et al., 2001)
Una prometedora área de aplicación de la enzimología en medios orgánicos
recae de manera natural en la industria petrolera, estrategia que se ha centrado en
la búsqueda de enzimas activas para la eliminación del indeseable azufre presente
en diesel proveniente de crudos pesados (Ayala et al., 1998, Vázquez Duhalt, et
al., 2002a), si bien otras aplicaciones en potencia para la industria de refinación
han sido descritos (Vazquez Duhalt et al., 2002b).
Un enfoque complementario ha sido explorado por nuestro grupo de trabajo
que se basa en la adsorción selectiva de organoazufrados sobre soportes que
mimetizan el comportamiento de una enzima y que son capaces de remover
preferencialmente los azufrados en mezclas orgánicas (Castro el al., 2001). Esta
metodología es conocida como el estampado molecular y permite construir
receptores activos en estructuras poliméricas muy estables y resistentes a
condiciones drásticas de operación, mejora notable respecto a los catalizadores
biológicos. El uso industrial de estas partículas impresas de polímero y fabricadas
con las características físicas de los catalizadores típicos de la industria se ¡lustran
en el esquema siguiente:
o c 3 (t
ID]
Disel oxidado
IP *
COLUMNA
Estampado EMPACADA O
molecular FLUIDIZADA
Bioadsorción
Diesel con DBT DBT
o
------------ ---- -------
escalamiento
/
diesel sin-DBT
Figura 3. Esquema hipotético de desulfuración de combustible con polímeros estampados molecularmente.
En relación al sector agroalimentario, nuestro grupo de investigación ha
estado trabajando en proyectos de biocatálisis no acuosa durante la última década
con la mira de alcanzar la aplicación industrial en el mediano plazo. En particular
hemos tenido interés en mejorar el proceso comercial usado para la extracción de
colorantes del tipo carotenos que en México se producen a partir de la flor de
cempasuchil (Tagetes erecta) y que son demandados por la industria avícola para
colorear la yema de huevos y los tejidos grasos de pollos para consumo humano
(Alain et al., 1968). Dentro de esta línea se ha logrado demostrar que un
ir
preparado comercial multienzimático de hidrolasas diversas mejora los
rendimientos de extracción del pigmento luteína (ver Figura 4), lo que simplifica el
proceso industrial al eliminar, o minimizar, las etapas de maceración y secado
previos a la extracción con solventes. Estas modificaciones fueron patentadas en
México (Rubio et al., 1994). Asimismo, los resultados fueron probados
exitosamente hasta una escala piloto de 80 litros (Bárzana et al., 2002).
Otra parte importante del proceso comercial de extracción de luteína
consiste en la hidrólisis del diéster obtenido por extracción con hexano y que
regularmente se lleva a cabo con una solución de potasa alcohólica. El objeto de
esta etapa es llegar a un producto que se asimila de manera más eficiente en el
tracto digestivo de las aves. Aprovechando la operación de extracción con hexano,
hemos visualizado que sería de alto beneficio el poder llevar a cabo la hidrólisis
simultáneamente al proceso de extracción hexánica, y no como un paso posterior.
Para ello, hemos trabajado con muestras comerciales de enzima lipasa
inmovilizada de la levadura Candida antarctica (Novozyme 435), proporcionadas
por la compañía Roche de México y en un esquema de dos pasos indicados en la
Figura 4, que llevan secuencialmente del diester al monoester y finalmente a la
luteína libre.
Para la reacción anterior, hemos logrado alcanzar conversiones cercanas al
60% del diéster inicial, si bien en tiempos aún muy largos de 180 horas. Por otra
parte, resulta interesante notar que a pesar de tratarse de una reacción de
hidrólisis, la velocidad de reacción aumenta al disminuirse la actvidad acuosa (Aw)
del preparado enzimático, alcanzando un máximo de 0.6 h( 1 para una Aw de tan
solo 0.1 (Mora-Pale, et al, 2001). Actualmente estamos llevando a cabo estudios
tendientes a ¡dentificar las causas de este comportamiento que incrementa las
posibilides de adaptarse a la práctica industrial al no requerir la inclusión de agua
en la fase hexánica en la unidad de extracción.
R-C-O 11
4 OH
kq
Figura 4. Esquema de la reacción de hidrólisis del diéster de luteína catalizada por una lipasa.
-L
o ca c a) o o o
• Luteína Diéster
A Monoéster
A A A
A A A
f .
I l III
II l. • I U I,
tiempo (horas)
Figura 5. Perfil de concentración de la reacción de desesterificación de los diésteres de luteína catalizada por las lipasas de (A) Candida antarctica.
13
Aprovechando la probada habilidad de las enzimas de actuar en un medio
continuo constituido por una fase supercrítica, al momento estamos estudiando el
desempeño de la reacción de desesterificación de luteína en CO2 en estado
su percríti co.
REACCIONES ENZIMÁTICAS EN FLUIDOS SUPERCRITICOS
Los fluidos supercríticos, y en particular el CO2 en estado supercrítico
(CO2SC), representan una alternativa prometedora al uso de los solventes
orgánicos en procesos industriales. Entre sus ventajas destacan su poder de
solvatación de liposolubles, la facilidad de ajustar la densidad del solvente por
variaciones simples de presión y temperatura, así como su recuperación facilitada
por despresurización y recompresión. Adicionalmente, el CO 2 es un gas no tóxico
ni flamable, propiedades que lo favorecen al compararlo con los solventes
orgánicos. Por sus ventajas, la tendencia hacia un mayor uso industrial del CO2SC
es clara (McCoy, 1999). Sin embargo, su implementación práctica en forma
extendida dependerá en gran medida de los avances en nuevos materiales de
bajo costo capaces de resistir altas presiones.
El CO2 supercrítico ha sido probado exitosamente como medio de reacción
en sistemas enzimáticos a partir de los primeros reportes de principios de los
80's,. Éste como una extensión dentro del campo de la enzimología en medios
orgánicos con bajo contenido de agua. Interesantemente se ha identificado que los
controles fisicoquímicos son similares para todos los medios no acuosos,
destacando el papel jugado por el parámetro termodinámico denominado actividad
acuosa (Mori et al., 1998).
Al igual que para las reacciones en medio orgánico, las enzimas de la familia
de las lipasas han sido las más estudiadas en fluidos supercríticos. Extender el
conocimiento de la actividad de lipasas en fluidos supercríticos para llevar a cabo
bioconversiones de interés en productos naturales representa el primer paso en el
desarrollo de procesos futuros respetuosos del medio ambiente.
14
Los primeros reportes que demostraron la factibilidad de llevar a cabo
reacciones catalizadas por enzimas en fluidos supercríticos datan de 1985
(Randolph et al, 1985; Hammond et al., 1985). Sin embargo, al igual que las
reacciones en medios orgánicos, las lipasas han sido utilizadas en forma
predominante en CO2SC, y fundamentalmente en reacciones de esterificación y
transesterificaciones ((Nakamura et al., 1990, Kamat et al, 1992, , Mesiano, et al.,
1999). Las ventajas de los fluídos supercríticos como medios de reacción se
resumen a continuación (Mesiano et al., 1999):
Su densidad es similar a la de los líquidos, mientras que su viscosidad y su
difusividad son comparables a las de los gases. Las consecuencias son una
buena solvatación de solutos aunado a una excelente transferencia de masa y
un buen mezclado.
La densidad puede ajustarse con relativa facilidad por simples cambios en la
presión y temperatura del sistema (por enzima de las propiedades críticas).
Esto permite la extracción selectiva de compuestos presentes en una matriz
compleja.
Los compuestos solubilizados pueden recuperarse con facilidad por
condensación o precipitación al despresurizar el sistema y liberar el solvente
en forma de gas.
Para el caso del CO2 , su baja temperatura crítica (304 °K) permite operar a
condiciones que evitan la descomposición térmica de compuestos
termosensibles y la generación de subproductos indeseables.
Como fue señalado previamente, continuamos con nuestra línea de
investigación de extracción de colorantes estableciendo la capacidad de solubilizar
los diester de luteína en CO2 a diferentes condiciones supercríticas. Al variar la
presión se estableció que la máxima recuperación ocurre después de 30 minutos
de contacto y a una densidad del fluido de 0.9 g/mL. Asimismo, hemos
demostrado que la solubilidad de diesteres de luteina en CO2SC se ve mejorada al
15
agregar cosolventes al sistema, dependencia que puede apreciarse en la Figura 6
y de acuerdo con los mezclas cosolvente/CO2SC presentadas en la Tabla 2
(Naranjo-Modad et al., 2000, Naranjo 2000).
Los alcoholes se muestran como barras oscuras o a 80
: 70
. 60 1 - = CO2puro
1: TI
10
-0.76 -0.33 -0.24 -0.23 0.20 0.60 0.66 0.80 2.00 2.80 Iog P
Figura 6. Solubilidad de diesteres de luteína en función del log P de mezclas CO2/cosolvente en condiciones supercríticas. Densidad del fluido 0.9 g/mL, 40°C (Naranjo-Modad et al., 2000).
Table 2: Supercritical CO 2 with modifiers. Percentage composition and log P.
Modificador % vol % mol log P Metanol 5 5.8 -0.76 Acetonitrilo 6 5.4 -0.33 Etanol 7 5.7 -0.24 Acetona 9 5.9 -0.23 Isopropanol 9 5.7 0.20 Cloruro de metileno 7 5.2 0.60 Acetato butilo 11 5.6 0.66 n-Butanol 11 5.9 0.80 Cloroformo 9 5.5 2.0 Tetracloruro carbono 11 5.1 2.8 Hexano 14 5.5 3.5
*l og P is the logarithm of the partition coefficient of the solvent in the two-phase system octanol-water. (Naranjo-Modad et al., 2000)
16
REACCIONES ENZIMÁTICAS CON SUSTRATOS EN FASE GAS
En aquellas situaciones donde el sustrato de una enzima es un gas o vapor,
el llevar a cabo su transformación en fase gas puede presentar diversas ventajas
sobre su contraparte en fase líquida (i.e. acuosa u orgánica), entre las que
destacan un alto coeficiente de difusión y la recuperación facilitada de productos
por simple condensación fraccionada.
Los antecedentes del comportamiento enzimático en medios libres de agua
llevaron al grupo de Klibanov a estudiar en detalle el papel del agua también en
reacciones en fase gaseosa (Bárzana, 1987) y en 1989 se publicó un estudio
sistemático sobre la oxidación de vapores de etanol mediante la enzima alcohol
oxidasa (Bárzana, 1989). Por primera vez, en este artículo un sistema gaseoso fue
analizado con el parámetro termodinámico actividad acuosa (a) y fue fundamento
para estudios posteriores (Lamare y Legoy, 1995, Russell y Yang., Hwang, y
Park, 1996, Pulvin et al., 1986). Estudios subsecuentes permitieron conocer los
niveles de hidratación (g H 20/g enzima) y su influencia en la actividad catalítica
(Yang y Russell, 1996b). De igual manera, el grupo de Russell publicó estudios
sobre la deshalogenación en fase gas de haloalcanos con potencial de uso a gran
escala para la descontaminación de corrientes gaseosas (Dravis et al.,. 2000), lo
que abre nuevos horizontes.
Finalmente, otra línea que ha sido explorada es el diseño de biosensores
basados en enzimas para la detección de compuestos en fase gas (Bárzana et al.,
1989b). Una revisión ha sido publicada previamente (Bárzana, 1995). El principio
explotado parte de un acoplamiento de la transformación enzimática a una señal
electroquímica o colorimétrica que puede ser amplificado por métodos
instrumentales. Esto es relevante dentro del área de los biosensores donde existe
un enorme campo de aplicación para las enzimas como medio para el análisis de
gases y vapores (Guilbault, 1991, Dennison, 1995).
POTENCIAL DE LAS ENZIMAS HIPERTERMOFÍLICAS
La existencia de seres vivos que no solo sobreviven sino que llevan a cabo
una serie de complejas reacciones metabólicas a temperaturas superiores a los
100°C es un descubrimiento relativamente reciente de la biología que data de
principios de los 1980's. Estos descubrimientos y posteriores investigaciones
llevaron a contar hoy en día con enzimas comerciales denominadas
"hipertermofílicas" por su actividad y alta resistencia a la termoinactivación a altas
temperaturas. Las compañías más destacadas que ofrecen un amplio espectro de
tales enzimas son Diversa de California y Thermogen de Chicago.
En esta dirección, nuestro grupo estudió reacciones de glicosidación de
carbohidratos con alcoholes superiores como vía de síntesis de tensoactivos de
interés industrial (García Garibay et al., 2000a). Para ello se empleó una enzima
Il-glucosidasa de Diversa con un optimo de actividad a 90 °C dispersa en heptanol
(reactivo y medio de reacción) y en presencia de glucosa o lactosa como agente
nucleofílico. El punto clave del estudio fue encontrar que los carbohidratos
aumentan más de 6 veces su solubilidad en el heptanol saturado con agua al
elevar la temperatura de 37°C a 90°C. En consecuencia, el carbohidrato se vuelve
más disponible para la enzima favoreciendo la reacción. Estudios posteriores
(Montiel, et al., 2002) han demostrado que el agua dispersa representa un sistema
meta-estable con una dinámica compleja de agregación.
La figura 4 muestra que la enzima a 90 °C es capaz de transglicosidar
lactosa (García Garibay et al., 2000b, Montiel, et al., 2002). Adicionalmente dicha
enzima es capaz de llevar a cabo la hidrólisis inversa de los monosacáridos
glucosa y galactosa, si bien con diferentes velocidades de reacción. Esto resulta
en una mezcla de glucósidos con propiedades surfactantes similares (heptil-
galactósido y heptil-glucósido).
18
3
3(
10
E
o
o AJ
3- 1 Illeptil-glicósido 3- 41 Lactosa
G1ucosa
u u U j A A
A A A
u £
0 1 2 3 4
tiempo (horas)
Figure 7. Perfil de concentración de la reacción de transglicosidación de lactosa 90°C catalizada por 13-glicosidasa hipertermófila.
CONCLUSIONES
La enzimología en fases no acuosas ha despertado un enorme interés a
partir de su descubrimiento en 1984 por Alexander Klibanov. El elemento
fundamental fue determinar que la actividad enzimática se expresaba dentro de
una ventana muy estrecha de humedad (normalmente menor al 5%), en la cual no
se forma una fase acuosa distinguible. Este comportamiento resultó general para
una gran variedad de enzimas y por ende de reacciones y compuestos
hidrofóbicos. En pocos años, los medios orgánicos fueron inclusive sustituidos por
CO2 en condiciones supercríticas e inclusive en sistemas sin medio de reacción
en que los reactivos están presentes en fase gas. Al igual que en muchos otros
laboratorios en el mundo, en México se han constituido grupos maduros de
investigación que trabajan en métodos de la enzimología no acuosa con éxito.
Dicho trabajo ha resultado en un número importante de publicaciones en revistas
de prestigio, se han obtenido patentes nacionales e internacionales y se ha llevado
trabajo en colaboración con el sector productivo. Se espera una consolidación en
México a lo largo de la próxima década y a través de propuestas prácticas de
interés para los sectores farmacéutico, agropecuario, alimentario, químico y
ambiental.
19
REFERENCIAS
Alain, A.U., Creger, C.R., Couch, J.R. 1968. Petals of aztec marigold, Tagetes erecta, as a source of pigment for avian species. J. Food Sci. 55: 61 2-617.
Ayala, M., Tinoco, R., Hernández, V., Bremauntz, P. y Vazquez-Duhalt. 1998. Biocatalytjc oxidation of fuel as an alternative to biodesulfurization. Fuel Process Technol. 57:101-111.
Bárzana, E. 1995. Gas phase biosensors. Adv Biochem. Eng. Biotechnol., 53:1-15.
Bárzana, E., Karel, M. y Klibanov, A.M. 1987. Enzyme catalyzed gas phase reactions". Appl. Biochem. Biotechnol. 15:25-34.
Bárzana, E., Karel, M. Y Klibanov, A.M. 1989. Enzymatic oxidation of ethanol in the gaseous phase. Biotechnol. Bioeng. 34:1178-1185.
Bárzana, E., Klibanov, A.M. E.y Karel, M. 1989a. A colorimetric method for the enzymatic analysis of gases: the determination of ethanol and formaldehyde vapors using solid alcohol oxidase. Anal. Biochem. 182:109-115.
Bárzana, E., Rubio, D., Santamaría, R.I., García-Correa, O., García, F., Ridaura Sanz, V.E. y López-Munguía, A. 2002. J. Enzyme-mediated solvent extraction of carotenoids from marigoid fiower (Tagetes erecta). J. Agric. Food Chem. 50: 4491-4496.
Castro, B., Whitcombe, M.J., Vulfson, E.N., Vazquez-Duhalt, R. and Barzana, E. (2001). Molecular imprinting for the selective adsorption of organosulfur compounds present in fuels. Anal Chimica Acta. 435(1): 83-90.
Dagani, R. 1984. Enzyme active in hot organic media. Chem. Eng. News, Julio 2:23.
Dennison, M.J., Hall, J.M., y Turner, A.P.F. 1995. Gas phase microbiosensor for monitoring phenol vapor at ppb levels. Anal. Chem. 67:3922-3927.
Dravis, B.C., LeJeune, K.E., Hetro, A.D. y Russell, A.J. 2000. Enzymatic dehalogenation of gas phase substrates with haloalkane dehalogenase. Biotechnol. Bioeng. 69(3):235-241.
García Garibay, M., López Munguía, galactosidase hydration on alcoholysis Biotechnol Bioeng. 70(6):647-653.
A. and Bárzana, E. 2000a. Effect í-reaction in organic one-phase system.
20
García-Garibay, M., López-Munguía, A. y Bárzana, E. 2000b. Alcoholysis and reverse hydrolysis reactions in organic one-phase system with a hyperthermophilic 3-glycosidase. Biotechnol. Bioeng. 69(6): 627-632.
Guilbault, G.C. 1991. Biosensors. Curr. Op. Biotechnol. 2:3-8.
Hammond. D.A., Karel, M., Klibanov, A.M. y Krukonis, V.J. 1985. Enzymatic reactions in supercritical gases . AppI. Biochem. Biotechnol. 11: 393-400.
Hwang, S.O. y Park, Y.H. 1997. Gas phase ethyl acetate production in a batch bioreactor. Bioprocess Eng. 17: 51-54.
Kamat, S., Barrera, J., Beckman, E.J., Russel, A.J. Bíotechnol. Bioeng. 40:158.
Kanerva, L.T. 1996. Hydrolase-catalyzed asymmetric and other transformations o synthetic interest. En "Enzymatic Reactions in Organic Media". A.M.P Koskinen y A.M. Klibanov, Ed. Blackie, Glasgow.
Klibanov, A.M. 1990. Asymetric transformations catalyzed by enzymes in organic solvents. Acc. Chem. Res. 23: 114-120.
Lamare, 5., y Legoy, M.D. Solid/gas biocatalysis: how to fully define the system?. Biotechnol. Techniques. 9(2): 127-132.
MaCrae, A.R., 1983. Lipase-catalyzed interesterification of oils and fats. JAOCS. 60(2):243a-246a.
McCoy, M., 1999. Chem. & Eng. News, June 14: 11.
Mesiano, A.J., Beckman, E.J. and Russell, A.J. 1999. Chem. Rey., 99, 623.
Montiel, C., Pérez-Munguía, S. y Bárzana, E. 2002. Caracterización del sistema enzimático para la producción de alquilglicósidos a alta temperatura. Memorias del XXV Congreso Latinoamericano de Química, Septiembre 22-26, 2002. Cancún, México.
Mora Pale, M., Pérez-Munguía, S. y Bárzana, E. 2002. Efecto del Aw sobre la hidrólisis del diéster de luteína catalizada por la lipasa b de Candida antarctica en medio orgánico. Memorias del XXV Congreso Latinoamericano de Química, Septiembre 22-26, 2002. Cancún, México.
Mori, T., Kobayashi, A. Y Okahata, Y. 1998. Biocatalytic esterification in supercritical carbon dioxide using a lipid-coated upase. Chemistry Lett. 1998:921-922.
Nakamura, K., Fujii, H., Chi, Y., Yano, T. 1990. Ann N.Y. Acad. Sci. 319.
21
Naranjo, S. 2000. Extracción de carotenoides y otros compuestos por medio de CO2 en estado supercrítico a partir de Tagetes erecta. Tesis de Doctorado en Ciencias Químicas. UNAM.
Naranjo-Modad, S., López Munguía, A, Gaset, A., Villarem, G.. y Bárzana, E., 2000. Solubility of Purified Lutein Diesters Obtained from Tagetes erecta in Supercritical CO2 and the Effect of Solvent Modifiers. J. Agric. Food Chem. 48: 5640-5642.
Powell, K.A., Ramer, S.W., del Cardayré, B., Stemmer, W.P.C., Tobin, M.B., Longchamp, P.F. y Huisman, G.W. 2001. Directed evolution and biocatalysis. Angew. Chem. mt. Ed. 40: 3948-3959.
Pulvin, S., Legoy, M.D., Lortie, R., Pensa, M. Y Thomas, D. 1986. Enzyme technology and gas phase catalysis: alcohol dehydrogenase example. Biotechnol. Lett. 8(1 1):783-784.
Randolph, T.W., Clark, D.S., Blanch, H.W. y Prausnitz, J.M. 1985. Enzymatic catalysis in a supercritical fluid. Biotecnol. Lett. 7:325-328.
Roberts, S.M., 1997. Preparative biotransformations: whole cell and isolated enzymes in organic synthesis. Wiley, New York.
Rubio, D. 1999. Desarrollo de un proceso enzimático para la extracción de aceites vegetales. Tesis de Maestría, Facultad de Química, UNAM.
Rubio H. D., Bárzana E. y López-Munguía A. 1994. Procedimiento para la obtención de pigmentos liposolubles a partir de productos vegetales. Patente MEX 176018. Propietaria: UNAM.
Russell, A.J. y Yang, F.X. 1996. Catalyze gas-phase reactions with enzymes. CHEMTEC. October:24-27.
Sheldon R.A., 1996. Large-scale enzymatic conversions in non-aqueous media. Capítulo 10, en "Enzymatic Reactions in Organic Media". A.M.P Koskinen y A.M. Klibanov, Ed. Blackie, Glasgow.
Sih, C.J., Girdaukas, G., Chen, C.S. y Sih, J.C. 1996. Enzymatic resolutions of alcohois, esters and nitrogen-containing compounds. Capítulo 10, en Enzymatic Reactions in Organic Media. A.M.P Koskinen y A.M. Klibanov, Ed. Blackie, Glasgow.
Tucker, G.A., y Woods, L.F.J. 1991. Enzymes in food processing. Ed. Blakie, London.
OX
Vazquez-Duhalt, Bremauntz, M.P., Bárzana, E., y Tinoco, R. 2002a. Enzymatic oxidation process for desulfurization of fósil fuels. United States Patent US 6,461,859, asignada al IMP y la UNAM.
Vazquez-Duhalt, R., Torres, E., Valderrama, B. y Le Borgne, S. 2002b. Will biochemical catalisis impact the petroleum refining industry? Energy & Fuels, 1 6(5):1 239-1250.
Wandrey, Ch, Liese, A. y Kihumbu, D. 2000. Industrial biocatalyst: past, present and future. Organic. Proc. Res. Develop. 4: 286-290.
Yang, F. Y Russell, A.J. 1996a. "The role of hydration in enzyme activity and stability: 1. Water adsorption by alcohol dehydrogenase in a continuous gas phase reactor". Biotechnol. Bioeng. 49(6): 700-708.
Yang, F. Y Russell, A.J. 1996b. "The role of hydration in enzyme activity and stability: 2: Alcohol dehydrogenase activity and stability in a continuous gas phase reactor". Biotechnol. Bioeng. 49(6): 709-716.
Zaks, A. y A.M. Klibanov. 1984. Enzymatic catalysis in organic media at 100°C. Science, 224:1249-1251.
Zaks, A. y A.M. Klibanov. 1985. Enzymatic-catalyzed processes in organic solvents. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:3192-3196.
23