bio034 201210 clase 13 cromosomas, regulacion de la expresion genica y tecnologia del dna
TRANSCRIPT
Sitios de unión de RNA en el ribosoma
Aminoacil-tRNA
Peptidil-tRNA
Salida (Exit)
Lugar de uniónal RNAm
Subunidadribosomal
grande
Subunidadribosomalpequeña
La subunidad pequeña une el tRNA al codón correspondiente en el mRNA y la subunidad grande cataliza la formación de los enlaces peptídicos. Ambas
subunidades se unen en el mRNA y se separan cuando se termina de sintetizar la proteína.
Inicio de la traducción
Subunidad pequeña del ribosoma con factores de iniciación unidos (no mostrados)
Unión al RNAm (reconocimeinto de CAP 5’)
El RNAt de iniciación se desplaza a lo largo del RNAm buscando el primer AUG
tRNA de iniciación
Los factores de iniciación se disocian y se une la subunidad ribosomal grande
Unión del aminoacil-tRNA al
sitio A (paso 1)Formación del primer enlace peptídico (paso 2)
Los codones del mRNA (codón de inicio y codones de término) indican dónde comenzar y dónde finalizar la traducción
El tRNA de inicio lleva metionina y es diferente al que normalmente une metionina. Es el único tRNA que se une al ribosoma en el sitio P
Traducción de un mRNA
1. Unión de un nuevo aminoacil-tRNA en el sitio A
2. Formación de un nuevo enlace peptídico (peptidil transferasa)
3. La subunidad grande avanza quedando el tRNA vacío en el sitio E y el péptido en el sitio P
4. La subunidad pequeña avanza, el sitio A queda vacío y el tRNA vacío sale
El ciclo vuelve a comenzar con la unión de un nuevo tRNA al sitio A
La traducción ocurre de 5’ a 3’ y la proteína se sintetiza desde el extremo amino al carboxilo terminal
Término de la traducción
Término
Unión de un factor de liberación al sitio A
Codones de término UAA, UAG o UGA señalan el fin de la síntesis proteica. A ellos se une un factor de liberación (sitio A).
Finalmente el polipéptido terminado es liberado y las dos subunidades del ribosoma se disocian
RNA procarionte es policistrónico
En bacterias un mRNA puede codificar varias proteínas (policistrónico)
La unión del ribosoma al mRNA se produce en secuencias específicas que señalan los sitios de unión al ribosoma y se encuentran antes del
codón de inicio AUG
Polirribosomas en procariontes y eucariontes
Una molécula de mRNA es traducida simultáneamente por varios ribosomas
Síntesis de una proteína eucarionte
Degradación de proteínas regulada en el citosol de los eucariontes
El proteosoma es un complejo de enzimas proteolíticas. Al interior del cilindro las proteasas presentan los sitios activos
Proteínas mal plegadas, con aa oxidados o alterados, proteínas de vida media corta son degradadas por este sistema
La proteína que vaa ser degradada es marcada
covalentemente con ubiquitina
La maquinaria importadora reconoce
ubiquitina
Cromosomas y regulación de la expresión génica
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICASDEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
BIO034
Dra. Ximena Ortega A.Dr. Enrique Vinés V.
Estructura del núcleo
Retículo endoplásmico
Heterocromatinaperiférica
EucromatinaRNA y proteínas
Nucleolo
Centrosoma
Microtúbulos
Lámina nuclear
Membrana externaMembrana interna
Envolturanuclear
Poro nuclear
Nucleoplasma
En el núcleo el DNA se distribuye en diferentes cromosomas
Cromosomas humanos
Las células humanas poseen dos copias de cada cromosoma, uno heredado del padre y otro de la madre. Este par de cromosomas se llaman cromosomas homólogos. La disposición ordenada de los cromosomas se
llama cariotipo
Cromosomashomólogos
Cromosomas humanos
La posición del centrómero y el tamaño varían en los diferentes cromosomas
Colorantes que se unen a regiones ricas en AT (colorante de Giemsa) producen bandas oscuras que permiten distinguir los 23 pares de cromosomas
El estado de condensación de los cromosomas varía durante el ciclo celular
Interfase Fase M Interfase
Tres elementos de secuencias de DNA básicas para la replicación y repartición
Aseguran que la replicación ocurra en forma eficiente
Telomerasa
Los telómeros son secuencias nucleotídicas repetidas que permiten la replicación de los extremos de los cromosomas y dan protección contra degradación por acción de nucleasas. Son agregados por la telomerasa
La telomerasa agrega los telómeros usando un templado de RNA que ella posee
Regulación génica
La diferenciación celular es producto de la regulación de la expresión génica
Las diferentes células de un organismo tienen el mismo DNA, sin embargo no expresan de igual forma sus genes y
tienen diferentes proteínas
Neurotransmisores Anticuerpos Hemoglobina
La diferenciación es producto de la regulación en la expresión de los genes
La información contenida en el núcleo de una célula diferenciada posee todas las instrucciones para controlar la expresión génica
La transcripción de un gen generalmente ocurre sólo en el tipo celular en el cual se expresa, por lo tanto
células diferentes tienen proteínas diferentes
Hígado
Riñón
Cerebro
RNA Proteínas
La expresión de un gen depende del tipo celular, medio ambiente, edad y señales extracelulares
Las células no difieren entre si porque tengan distintos genes, sino porque los expresan de distinta forma
Puntos de control de la expresión génica
Control de la síntesis proteica
1. Regulando el momento y la frecuencia de la transcripción de genes concretos (control transcripcional)
2. Controlando el modo de maduración o procesamiento de los transcritos primarios de RNA (control del procesamiento de RNA)
3. Seleccionando los mRNA maduros que van a ser exportados al citoplasma (control del transporte de RNA)
4. Seleccionando los mRNA citoplasmáticos que van a ser traducidos por ribosomas (control traduccional)
5. Desestabilizando selectivamente algunas moléculas de mRNA citoplasmático (control de la degradación de los mRNA)
6. Activando, inactivando o ubicando de modo selectivo las proteínas ya sintetizadas (control de actividad proteica)
La transcripción se controla con proteínas reguladoras que se unen al DNA en secuencias regulatorias
Las regiones regulatorias se encuentran en cada gen y son el lugar donde se unen las proteínas reguladoras tanto en procariontes como en eucariontes.
Pueden ser cortas (unos 10 nucleotidos) o muy largas (10.000 nucleotidos).
Diferentes proteínas reguladoras reconocen y se unen a diferentes secuencias de DNA.
Las proteínas reguladoras se unen al DNA en pares (dímeros) a través de estructuras específicas dentro de cada proteína llamadas motivos de unión al DNA
Interacción proteína - DNA
La proteína establece interacciones como puentes de hidrógeno, enlaces iónicos e interacciones hidrofóbicas con las bases del DNA
en el surco mayor (sin desenrollarlo)
Surcomenor
Surcomayor
Ejemplo de algunos motivos de unión al DNA presentes en proteínas reguladoras eucariontes
Homeodominio
Dedos de Zinc Cremallera o cierrede Leucina
Hélice-vuelta-hélice
Control Transcripcional en procariontesLas secuencias reguladoras son reconocidas por proteínas reguladoras
y están involucradas en la activación e inactivación de un gen
promotor
operadormolécula
de RNAm
Cromosoma de E. coli
Enzimas para la biosíntesis de triptofano
En procariontes
-El promotor es el lugar donde se une la RNA polimerasa
-El operador es el lugar donde se unen las proteínas reguladoras que pueden ser activadoras o represoras
-Proteínas represoras impiden el inicio de la transcripción
-Proteínas activadoras ayudan a la unión de la RNA polimerasa y promueven la transcripción
Los genes que se transcriben en un mismo RNAm constituyen un operón
Los operones represibles son habitualmente expresados (expresión constitutiva), pero cuando no son necesarios,
son reprimidos
En ausencia de triptofano el represor está inactivo, la RNA polimerasa se une al DNA, transcribe normalmente y se producen las enzimas necesarias para la síntesis de triptofano
En presencia de triptofano el represor está activo, la RNA polimerasa NO se une al DNA, no hay transcripción y NO se producen las enzimas necesarias para la síntesis de triptofano
Activación y desactivación de genes mediante una proteína activadora
Proteína activadora unida RNA polimerasa
Sitio de unión para la proteína
activadora
mRNA
Proteína
Funcionan en promotores que normalmente no son muy activos ya que la RNAS polimersas se une débilmente a ellos uniéndose a la enzima y ayudándola a iniciar la transcripción optimizando su funcionamiento
Operon lactosa (Jacob y Monod, 1961)
CAP (catabolite activator protein) inicia la transcripción de genes que permiten usar otras moléculas como combustible cuando la glucosa no está presente. Si los niveles de glucosa son altos los niveles de AMPc son bajos (represión por catabolito). En presencia de AMPc (producido en ausencia de glucosa) CAP se une al DNA, lo dobla y favorece la unión de la RNA polimerasa.
En ausencia de lactosa hay una proteína represora unida al operador.
Operón controlado por un activador y un represor
Los operones inducibles son expresados sólo cuando los genes que contienen son necesarios
• Existen tres RNA polimerasas
• Participan factores de transcripcióngenerales
• Proteínas represoras o activadoras pueden influir en la transcripción
• Las regiones reguladoras están a distancias grandes del promotor
• Tomar en cuenta el empaquetamiento del DNA
Transcripción en células Eucarointes
Genes transcritosTipo de RNA Polimerasa
RNA pol I Mayoría de los genes de RNA ribosomales (RNAr)
RNA pol II Todos los genes que codifican proteínas y algunos de RNA pequeños
RNA pol III Genes de RNAt (de transferencia), RNAr 50S (ribosomal) genes de algunos de RNAestructurales
pequeños
Las tres RNA polimerasa de las células eucariontes
Los factores de transcripción ubican a la RNA polimerasa correctamente en el promotor
En eucariontes la transcripción también requiere de proteínas reguladoras
Proteína activadora eucarionte
Incrementador (enhancer) sitio de unión para la proteína activadora
Inicio de la transcripción
Caja TATA
Unión de factores de transcripción generales, mediador y RNA polimerasa
Proteína activadora
Mediador
RNA polimerasa II
Se inicia la transcripción
Factores de transcripción
generales
Los genes eucariontes son regulados porcombinaciones de proteínas
La expresión de distintos genes puede estar coordinada por una sola proteína
* En procariontes existen los operones
Procariontes
Proteína activadora unida RNA polimerasa
Sitio de unión para la proteína activadora
mRNA
Proteína
Proteína activadora
Mediador
RNA polimerasa II
Se inicia la transcripción
Factores de transcripción
generales Eucariontes
El control combinatorio puede generar distintos tipos celulares
Los patrones estables de expresión génica son heredados a las células hijas
Un ciclo de retroalimentación positiva puede producir memoria celular
La proteína A es una proteína reguladora de genes que activa su propia transcripción. Todos los descendientes de la célula original “recordarán” que la célula progenitora recibió una señal temporal que inició la producción de la proteína
La proteína A no se produce porque es necesaria para
estimular su propia transcripción
Señal temporal activa la expresión de la proteína A
El efecto de la señal temporal es “recordado” por las células hijas
(decendientes de la célula original)
Propagación exacta de la estructura condensada de la cromatina
La expresión de una sola proteína reguladora puede inducir la formación de un órgano completo
Expresión del gen Ey en células precursoras de la pata de D. melanogaster
En resumen
Las células regulan la expresión génica
En las células eucariontes el inicio de la transcripción es un proceso complejo
La transcripción está controlada por proteínas que se unen a regiones reguladoras del DNA
Las RNA polimerasas eucariontes requieren factores de transcripción generales
Existen proteínas moduladoras (activadoras o represoras) que regulan la expresión de los genes
Las proteínas reguladoras de las células eucariontes controlan la expresión de los genes a distancia
El empaquetamiento del DNA promotor en los nucleosomas puede afectar el inicio de la transcripción
Los genes eucariontes son regulados por combinaciones de proteínas
La expresión de diferentes genes puede estar coordinada por una sola proteína
El control combinatorio puede dar origen a diferentes tipos celulares
Una sola proteína reguladora puede inducir la formación de un órgano completo
Tecnología del DNA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICASDEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
BIO034
Dra. Ximena Ortega A.
Endonucleasas de restricción
Extremos romos
Extremos escalonados
Son enzimas de origen bacteriano que cortan el DNA en secuencias específicas (palíndromes)
Los fragmentos generados con endonucleasas de restricción se pueden volver a unir usando la ligasa
Unión de extremos escalonados complementarios
Unión de extremos romos
Electroforesis en gel de Agarosa
Permite determinar el tamaño de los fragmentos de DNA obtenidos de la digestión con una enzima de restricción
Hibridación
Doble hélices de DNA Denaturación a hebras simples por ruptura de
puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas
AltaTemp
AltopH
Enfriar lento
Bajar el pH
Renaturación o hibridación, se reestablecen las doble
hélices de DNA, (se vuelven a formar los
puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas)
Detección de anemia falciforme por hibridación
Una sonda es un DNA corto de cadena sencilla que se utiliza en una reacción de hibridación para detectar moléculas de DNA que tienen una secuencia complementaria. Están marcados y se pueden detectar
El individuo 1 tiene dos genes deβ-globina normales
El individuo 2 tiene dos genes de β-globina falciforme
El individuo 3 tiene un gen normal y el otro falciforme
Southern blot
La hibridación in situ permite determinar la localización de los genes en los distintos cromosomas
PCR, Polymerase Chain Reaction
Secuencia conocida
DNA dedoble hebra
Separar la doble hebra
por calor
Hibridación con
partidores
DNApolimerasa+dATP+dGTP+dCTP+dTTP
Síntesis de DNA a partir de los partidores
Separar las hebras de DNA y unir los
partidores
Separar las hebras de DNA y unir los
partidores
Separar las hebras de DNA y unir los
partidores
Síntesisde DNA
Síntesisde DNA
Síntesisde DNA
Región de DNA de doble hebra a
amplificar
Partidores de DNA
Primer ciclo2 moléculas de DNA de
doble hebra
Segundo ciclo4 moléculas de DNA de
doble hebra
Tercer ciclo8 moléculas de DNA de
doble hebra
Detección de RNA viral por PCR
Clonamiento de DNASe usan plasmidios bacterianos (moléculas circulares pequeñas de DNA de hebra doble) para clonar genes de interés. Se necesita un origen de replicación, un sitio de corte para una endonucleasa y una propiedad seleccionable, por ejemplo, resistencia a un antibiótico
Permite obtener muchas copias idénticas y aislar un gen en particular