BANDEO CROMOSÓMICO

¿PARA QUE? En algunas especies los pares

cromosómicos no pueden diferenciarse claramente considerando sólo sus componentes distintivos en sentido longitudinal;

se debe recurrir a técnicas citológicas especiales para la tinción de los cromosomas,

Se evidencian "bandas" transversales (oscuras y claras) que corresponden a los distintos tipos de cromatina.

TECNICAS MAS USADAS

Bandeo G

Bandeo Q

Bandeo R

Bandeo C

Bandeo NOR

BANDEO G Se utiliza tratamiento con tripsina previo a la

utilizacion de Giemsa ya que la tripsina degrada la proteinas y da lugar a bandas claras y oscuras.

Bandas Oscuras: Regiones de ADN ricas en A-T y pobres en genes constitutivos.

Bandas Claras: Regiones de ADN con G-C Y en genes constitutivos

Regiones A-T son resistentes a la tripsina lo cual genera una coloración oscura en el bandeamiento.

Mayor nivel de bandas = Mayor calidad del estudio

BANDEO Q

Se basa en el uso de colorantes fluorescentes como la quinqcrina. Dando a lugar bandas brillantes y oscuras. Técnica similar al bandeo G

Bandas Brillantes: Contienen regiones ricas en A-T.

Bandas oscuras: G-C

Regiones con G-C reprimen la fluorescencia y por eso no se tiñen, al contrario que las regiones con A-T

No es muy frecuentemente utilizada

BANDEO R

Técnica opuesta al bandeamiento y se utiliza el calor como desnaturalizante o BrdU

Bandas oscuras: G-C

Bandas claras: A-T

El calor desnaturaliza las regiones ricas en A-T por eso se visualizan mas las regiones con G-C

BANDEO C Marcan las regiones Centromericas y

pericentromericas.

Permite la tinción de la heterocromatina constitutiva.

Se utiliza hidroxido de sodio e hidroxido de bario para desnaturalizar el ADN.

Se usa principalmente para los cromosmas 1, 9 y 16

BANDEO NOR

Marcan las regiones de los organizadores nucleolares acrocentricos.( regiones cromosómicas que forman y mantienen el nucléolo)

BASES MOLECULARES DEL BANDEO CROMOSOMICO.

CLASIFICACIÓN

BANDEOS CROMOSOMICOS

MORFOLOGICOS

QFQ

GTG

RFA

RHG

THG

CBG

DINAMICOS

GBG

RBA

RBG

GB-AAu

RB-AAu

BANDEOS MORFOLOGICOS

Se basan en técnicas inherentes a la heterogeneidad de la cromatina.

Importante la relación con proteínas(histónicas y no histónicas) e interacciones ADN.

Se subclasifican en:

1. Técnicas de tinción diferencial

2. Métodos de tinción selectiva

3. Coloraciones con fluoroeromos específicos aislados o combinados con colorantes no fluorecentes

4. Tinciones con anticuerpos fluorecentes.

Nomenclatura Bandeos Morfologicos QFQ: Bandas Q por fluorecencia usando

quinacrina. GTG: Bandas G por tratamiento enzimático

con tripsina utilizando Giemsa. RFA: Bandas R por fluorecencia usando

naranja de acridina. RHG: Bandas R mediante desnaturalización

térmica utilizando Giemesa. THG: Bandas T por desnaturalización térmica

empleando Giemesa. CBG: Bandas C por hidróxido de bario

utilizando Giemesa.

1) tipo de bandeo 2) técnica de detección empleada 3) tipo de tinción.

BANDEOS DINAMICOS Incorporación de una base analoga, (BrdU), en el ADN durante la

fase S del ciclo celular. Se denomina también bandeo de replicación debido a la relación existente entre el tiempo de incorporación del BrdU y el patrón de replicación.

Si se incorpora BrdU durante la fase de replicación temprana se obtiene un patrón de bandeo R destacándose las regiones ricas en G-C.

Si se incorpora la base análoga durante la fase tardía de replicación se obtiene un patrón de bandas G, destacándose las zonas de predominio de secuencias A-T.

Los cromosomas pueden visualizarce utilizando distintos métodos de tinción como Giemesa o el naranja de acridina o utilizando anticuerpos específicos

Nomenclatura Bandeos Dinamicos GBG: Bandas G por incorporación de BrdU

utilizando Giemesa. RBA: Bandas R por incorporación de BrdU

empleando naranja de acridina. RBG: Bandas R por incorporación de BrdU

utilizando Giemesa. GB-AAu: Bandas G por incorporación de

BrdU empleando anticuerpos específicos unidos a partículas deoro coloidal.

RB-AAu: Bandas R por incorporación de BrdU usando anticuerpos específicos unidos a partículas deoro coloidal.

Bromo desexiuridina (BrdU) Análogo mutagénicamente activo de la timina, en que el

grupo -CH3 en posición 5' se reemplaza por Br. Tratamiento e investigación del cancer debido a que aumenta

la susceptibilidad de las células a la radioterapia porque inhibe la reparación de roturas causadas por la radiación en la doble cadena de ADN

Agente mutagenico: altera los patrones de transcripción Aumenta la afinidad de las proteinas cromosomales por las

zonas de la cadena que contengan BrdU, Altera la unión de proteínas reguladoras a la cadena de ADN, Inhibe la expresión de algunas funciones de diferenciacion

celular Provoca alteraciones en la membrana plasmatica.

PROCEDIMIENTO BANDAS G

1. Envejecer las preparaciones en estufa a 65°C / 14h o 3 dias a temperatura ambiente

Bandeo GTG

Tripsina desnaturaliza proteinas de cromosomas

Tincion Giemsa o Leishman

Bandeo G con colorante Wright

Protocolo mas usado.

Se introduce la preparacion en solucion salina de 2SSC (Citrato trisodico disuelto en NaCl 0,3M) durante 1 minuto a 65°C. Esto permite que se abra la hebra de ADN

Lavar la preparacion con agua destilada y secar al aire.

Teñir con colorante Wright al 0.25% y tampon Sorensen en proporcion 1 a 3 duraten 3 minutos

PROCEDIMIENTO BANDA C

CBG bandas C obtenidas con hidroxido Barico usando Giemsa

1. Introducir la preparacion en una cubeta con HCL 0.02N a temperatura ambiente por 10 minutos, lavar con agua y dejar secar al aire

2. Introducir la preparacion en una cubeta a 60°C con Ba(OH)2 saturado durante 1 minuto. Esto despuriniza y desnaturaliza el ADN.

3. Lavar con agua destilada y metanol para eliminar restos de bario dos veces

4. Dejar secar e incubar en 2xSSC a 65°C / 15 min

5. Lavar la preparacion y dejar secar

6. Teñir con colorante Leishman al 20% o Giemsa durate 5 a 10 minutos

Esta tecnica degrada un 50% del material cromosomico lo que dificulta la aplicación posterior de otras tecnicas.

El unico material que queda teñido es la heterocromatina constitutiva porque resiste a la degradacion

Procedimiento bandas NOR1. Añadir 0.2uL de solucion de nitrato de

plata al 50% filtrada a la preparacion

2. Adicionar 6 a 8 gotas de formaldehido al 0.3% (acelera la tincion)

3. Incubar a 37°C durante 24h protegido de la luz

BIBLIOGRAFIA http://www.oocities.org/researchtriangle/lab/251

3/bandeos.htm Cristina Hernando Davalillo, Caracterizacion de

Anomalias cromosomicas en diagnostico prenatal y postnatal mediante tecnicas de citogenetica molecular, Tesis Doctoral 2005.

http://docentes.cs.urjc.es/~odeluis/Docencia/Genetmed/Bloque_1_2p.pdf

http://geneticahumana.tripod.com/libros/page201.html

http://www.fmed.uba.ar/depto/histo1a/genetica/adm/sg2.pdf