AVANCES EN EL CONTROL BIOLÓGICO DE LA

FUSARIOSIS DEL MAÍZ EN SINALOA

Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza

imaldona@ipn.mx

Superficie total de cultivos

1, 400, 000 Ha Producción de maíz:

• 500-600,000 Ha • 13, 000 MDP

29, 000 Ha en pérdidas (costo ~780 MDP)

Importancia del maíz en Sinaloa

Fusariosis del maíz en Sinaloa (2009)

Pudrición del tallo y raíz

Pudrición en nodos e internodos de la raíz Macroconidio

Microconidio

Figueroa-López

Fusarium verticillioides

Fusariosis del maíz en Sinaloa (2013)

Rizósfera

• ~4,000 especies de bacterias por gr de suelo

• Solo podemos cultivar 1-5% de los microorganismos (MOs)

• La planta afecta distribución y abundancia de los MOs del suelo

• Entender las interacciones MOs-planta nos ayudaría a desarrollar estrategias de control biológico

La salud de la raíz de una planta se debe, en parte, a la capacidad de asociarse con los microorganismos adecuados en el suelo

(Munkvold y Desjardins, 1997)

Residuos infestados

(micelio o conidiosporas)

Acarreo por

viento o lluvia

Daño

por insectos

Semilla

contaminada

9

Uso de Bacterias Promotoras del Crecimiento

Vegetal (BPCV) como antagonistas a Fusarium

Las BPCV son usadas en biocontrol de patógenos

Alternativa amigable para el ambiente

Pueden tener muchos efectos benéficos en plantas

Bacillus spp. ha sido ampliamente estudiado

•Potente antagonista diversos patógenos

•Capaz de producir compuestos antifúngicos

(Pereira et al., 2007; Singh et al., 2008; Mendes et al., 2011)

10

Mejora

nutricional

Producción de

Fitohormonas

Biocontrol de

patógenos

Sideróforos

Fosfatos

Fijación de

nitrógeno

Citocininas

Auxinas

Giberelinas

Antibióticos

Enzimas

hidrolíticas

Ácido

cianhídrico

Promoción del crecimiento

vegetal

Efecto de las BPCVs sobre las plantas 10

Objetivo general del trabajo

Desarrollar un producto agrobiológico en base a microorganismos de la

rizósfera del maíz nativos de Sinaloa para el biocontrol de Fusarium

verticillioides

Estrategia General del Proyecto Colección de 11,520 bacterias nativas de

Sinaloa mantenida a -70°C

Pruebas en medio sólido (42 antagonistas) y

hemólisis (14 antagonistas)

Ensayos en planta para seleccionar los 3

mejores antagonistas para pruebas de campo

Ensayos masivos en líquido para seleccionar

622 potenciales antagonistas a Fv

Pruebas de validación en campo con las tres

bacterias antagonistas

Muestreo dirigido de plantas enfermas vs. sanas en el mismo surco

Caldo Dextrosa y Papa

Aislados bacterianos Toma del aislado bacteriano

Inoculación con el aislado bacteriano

Inoculación con Fusarium verticillioides

Bioensayo Incubar en agitación

Pruebas de antagonismo en medio líquido

Cuantificación de biomasa fúngica

Tres lavados con buffer PBS

Agregar WGA Tres lavados con buffer PBS

Incubar 4ºC toda la noche

Pruebas de antagonismo en medio líquido

Placa óptica 96 pozos Incubar en agitación

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A B C D E F G H

Formato 12 x 8 = 96 pozos

Celda con probable antagonista

WGA ALEXA FLUOR 488nm (Wheat Germ Agglutinin Alexa Flúor 488 nm)

Fuente:Maldonado-Mendoza

Pruebas de antagonismo en medio líquido

Cuantificación de biomasa fúngica

Fusarium

Posible antagonista

Fusarium

Posible antagonista

A. Antagonista controlando el crecimiento de Fusarium

B. Fusarium crece ya que no hay efecto antagonista

Celda de 2 ml del formato de 96 pozos con 500 µL de caldo Papa Dextrosa con Fusarium y los aislados

Se incubó 25°C, 250 rpm 30 h

Fusarium

Posible antagonista

236

FORL

236 FORL

Fuente: Maldonado-Mendoza

Pruebas de antagonismo en medio líquido

Cuantificación de biomasa fúngica

Figueroa-López et al., en prensa (Journal of Basic Microbiology)

622 aislados seleccionados Prueba en líquido

42 aislados seleccionados Prueba en sólido

20

α-hemólisis = Parcial β-hemólisis = Total γ-hemólisis = No hemólisis

Tipo de hemólisis

Pruebas de hemólisis

Pruebas de hemólisis como factor de selección

50 µL sobrenadante

β

β γ

γ

37ºC – 24hr

Aislados Identificados Molecularmente

% INHIBICIÓN LIQUIDO % INHIBICIÓN SOLIDO HEMÓLISIS

2 Bacillus megaterium 88 66 α

3 Pseudomonas putida 84 67 α

4 Bacillus megaterium 89 71 γ

5 Bacillus megaterium 91 66 α

7 Bacillus megaterium 74 71 α

8 Paenibacillus polymyxa 62 85 γ

9 Bacillus cereus 62 70 γ

12 Bacillus megaterium 84 56 α

13 Bacillus subtilis 86 63 α

22 Bacillus sp. 74 68 γ

23 Bacillus megaterium 64 63 γ

24 Bacillus cereus 72 73 γ

25 Bacillus cereus 93 52 γ

35 Bacillus subtilis 76 73 γ

Características de los 14 mejores antagonistas seleccionados para evaluar en planta

A B

C D

b

b

abab ab

ab

bb

ab

a

abab

ab

ab

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

CTL B2 Ps3 B4 B5 B7 Pa8 B9 B12 B13 B23 B24 B25 B35

Ro

ot

volu

me

(cm

3)

a a

ab ab

b

ab

ab ab

ab

bab ab

b

ab

0

20

40

60

80

100

120

CTL B2 Ps3 B4 B5 B7 Pa8 B9 B12 B13 B23 B24 B25 B35

Seve

rity

(%

)

a

ab ab ab

b

abab

ab ab abab

abab

bb

0

20

40

60

80

100

120

CTL B2 Ps3 B4 B5 B7 Pa8 B9 B12 B13 B22 B23 B24 B25 B35

Seve

rity

(%

)

cc

b

c

a

bc

d

d

bc

c

bc bcbc

b

a

0

0,5

1

1,5

2

2,5

CTL B2 Ps3 B4 B5 B7 Pa8 B9 B12 B13 B22 B23 B24 B25 B35

Ro

ot

volu

me

(cm

3)

Tres antagonistas seleccionados para pruebas en campo por disminuir la severidad de la fusariosis en plántulas de maíz

Híbrido Cebú

Híbrido Garañón

Características de antagonismo y de promoción del crecimiento vegetal de los aislados

No. Aislado Fosfato Auxina Quitinasa Sideróforos Proteasa Glucanasa

B2 Bacillus megaterium - - - - - +

Ps3 Pseudomonas putida - - - + - +

B4 Bacillus sp. + - - + + +

B5 Bacillus sp. + - - + + +

B7 Bacillus megaterium - - - + + +

Pa8 Paenibacillus polymyxa + + - - - +

B9 Bacillus cereus - - - - - +

B12 Bacillus subtilis + - - + + -

B13 Bacillus aquimaris + - + + - +

B22 Bacillus megaterium - - - + + +

B23 Bacillus sp. + - + - - -

B24 Bacillus cereus - - + + + +

B25 Bacillus cereus - - + + + +

B35 Bacillus sp. - - - - - +

Compatibilidad entre aislados

4 5 8 9 22 23 24 25 35

4

5

8

9

22

23

24

25

35

COMPATIBLES

NO COMPATIBLES

24

Fecha de siembra: Primer experimento: ciclo Otoño-Invierno 2011-2012 Segundo experimento: ciclo Otoño-Invierno 2012-2013 Diseño Experimental: Bloques completamente al azar con tres repeticiones. Anova, Tukey P<0.05

TRATAMIENTOS

1 AISLADO A

2 AISLADO B

3 AISLADO C

4 A+B

5 A+C

6 B+C

7 A+B+C

8 CONTROL ABSOLUTO

9 CONTROL DE PATOGENICIDAD ( + Fusarium)

10 CONTROL INOCULANTE BIOLÓGICO COMERCIAL

11 CONTROL CON LB

Establecimiento del experimento en campo

2 11 3 6 9 5 10 7 1 4 8

1 5 8 7 10 11 3 4 9 2 6

11 4 9 2 1 7 6 8 5 10 3

BLOQUES

Variables a medir:

Altura Grosor de tallo Altura de la primera mazorca Incidencia y severidad de pudrición de tallo Incidencia y severidad de pudrición de mazorca

Rendimiento de grano Humedad de grano Comprobación de

esterilidad de semillas de maíz con identificación morfológica y molecular de hongos asociados a granos de maíz

Evaluación de fumonisinas presentes en granos de maíz

26

Establecimiento del experimento en campo

Propagación del inóculo de Fv en maíz picado

Toma de muestras y marca del terreno experimental

Pruebas en campo (Febrero 2012)

Pruebas en campo (FPS El Realito. 07/05/2012)

B CTL

Las bacterias antagonistas afectan la incidencia

y severidad de pudrición en mazorca

Tratamiento Variables

% Incidencia de

pudrición en

mazorca

% de Severidad

de pudrición en

mazorca

1 AISLADO A 6.0c 4.5c

2 AISLADO B 4.7c 3.8c

3 AISLADO C 44.6b 15.2b

4 A+B 44.6b 3.8c

5 A+C 44.6b 3.6c

6 B+C 69.2ª 13.8b

7 A+B+C 8.6c 3.8c

8 CONTROL ABSOLUTO 77.0a 15.4b

9 CONTROL (+ Fusarium) 80.2a 34.7ª

10 CONTROL CON LB 58.6a 18.3b

11 CONTROL COMERCIAL 72.9a 18.3b

TRATAMIENTOS Rendimiento de grano

(t ha-1)

1 AISLADO A 11.00a

2 AISLADO B 11.22a

3 AISLADO C 9.66ab

4 A+B 10.51a

5 A+C 9.59ab

6 B+C 9.59ab

7 A+B+C 11.34a

8 CONTROL ABSOLUTO 9.45ab

9 CONTROL DE PATOGENICIDAD (+ Fv) 7.10b

10 CONTROL CON LB 9.04ab

11 CONTROL COMERCIAL 9.54ab

Los antagonistas mejoran el rendimiento del grano (159 dds)

Ciclo O-I de 2012. Letras iguales en las columnas no presentan diferencias

significativas (Tukey, α= 0.05).

Segundo experimento en campo El Realito resultados parciales (2012-2013)

Tratamiento Variables

% Incidencia de pudrición en tallo Nivel de severidad

de pudrición en

tallo a 159 DDS

(escala de 0 a 5) 41 dds 98 dds

1 Control absoluto híbrido Garañón 85.0c 85.0c 2.5c

2 Control de patogenicidad híbrido

Garañón

85.0c 55.0b 2.5c

3 Híbrido Garañón + Aislado (aplicado a

semilla)

10.0a 0.0a 0.0a

4 Híbrido Garañón + Aislado (aplicado a

semilla y tallo)

20.0b 10.0a 1.0b

5 Control absoluto híbrido Dekalb 2038 70.0c 60.0bc 2.5c

6 Control de patogenicidad híbrido

Dekalb 2038

85.0c 70.0c 2.5c

7 Híbrido Dekalb 2038 + Aislado (aplicado

a semilla)

25.0bc 10.0a 1.0b

8 Híbrido Dekalb 2038 + Aislado (aplicado

a semilla y tallo)

10.0a 10.0a 1.0b

Letras iguales en las columnas no presentan diferencias significativas (Tukey, α= 0.05)

Segundo Experimento en campo NO infestado de Fusarium ciclo 2012-2013

•Cosecha realizada en junio 2013 • Helada en enero 2013 •No incidencia, no severidad en raíz y tallo •Daño por cogollero •Probable incidencia en mazorca (Campo La Esmeralda. Productor: Reynaldo Valencia)

Bacillus cereus disminuye la incidencia y severidad de pudrición en mazorca (187 dds)

Tratamiento

Variables

% incidencia en

pudrición de

mazorca

% severidad en

pudrición de

mazorca

1 Control absoluto híbrido Cebú 87.1ab 76.2a

2 Híbrido Cebú + aislado bacteriano (aplicado a semilla) 69.2c 34.1c

3 Híbrido Cebú + aislado bacteriano (aplicado a semilla y tallo) 74.3b 28.3d

4 Control absoluto híbrido Garañón 94.4a 62.7bc

5 Híbrido Garañón + aislado bacteriano (aplicado a semilla) 88.3a 34.2c

6 Híbrido Garañón + aislado bacteriano (aplicado a semilla y

tallo)

71.1bc 37.5c

7 Control absoluto híbrido Gorila 92.3a 68.2b

8 Híbrido Gorila + aislado bacteriano (aplicado a semilla) 74.5b 33.0c

9 Híbrido Gorila + aislado bacteriano (aplicado a semilla y

tallo)

78.4b 31.2c

Bacillus cereus aumenta el rendimiento de grano (187 dds)

Estandarización de la producción del inóculo en fermentadores de 3 L

Laboratorio de Bioenergéticos

Dra. Claudia Castro Martínez M.C. Juan Carlos Martínez Álvarez

Formulación en polvo a base de esporas de Bacillus

spp. nativos de Sinaloa para el control de Fv en maíz

Establecer y optimizar la producción de esporas de Bacillus sp.

Generar una formulación en polvo a base de esporas de Bacillus sp.

Evaluar in vitro el efecto de la formulación en:

a) control F. verticillioides b) eficiencia en el recubrimiento de las semillas de maíz c) viabilidad y vida de anaquel de las esporas de Bacillus spp. d) germinación de las semillas de maíz

Evaluar el efecto de la formulación en el control de F. verticillioides en maíz

Tesis doctoral MC Juan Carlos Martínez Álvarez

Factores con efectos principales

Diseño Plackett-Burman

Zona de optimización

(ascenso más pronunciado)

Optimización DCC

Selección y optimización de nutrientes del

medio de cultivo por MSR

Estandarización de la

concentración

del inóculo

Producción de esporas (UFC/mL) de

aislados de Bacillus

MEDIO DO 24h DO 48h DO 72h UFC/mL 24h UFC/ml 72h

1X107 1X108

DSM 0.786 0.859 0.867 1.2± 0.16 1.2± 0.14

Medio 1 DSM+ AM 0.656 0.694 0.453 1.1± 0.12 3.3± 0.21

Medio 2 DSM+ AP 1.117 1.31 1.401 2.8± 0.1 2.1± 0.24

Medio 3 DSM+ CSL 1.926 1.658 1.465 3.5± 0.8 2.1± 0.08

Medio 4 DSM+ EC 1.278 1.829 1.546 -- --

Medio 5 DSM+ GLUC 0.993 0.971 0.928 0.1± 0 1.9± 0.04

Medio 6 DSM+ MAL 1.048 0.954 0.878 1.3± 0.16 2.3± 0.37

Medio 7 DSM+ SAC 0.756 0.983 0.916 8.2± 0.2 0.8± 0.12

MEDIO A B C D E F G

1 1 1 1 -1 1 -1 -1

2 -1 1 1 1 -1 1 -1

3 -1 -1 1 1 1 -1 1

4 1 -1 -1 1 1 1 -1

5 -1 1 -1 -1 1 1 1

6 1 -1 1 -1 -1 1 1

7 1 1 -1 1 -1 -1 1

8 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1

Letra Componente -1 1

A PEPTONA (g/L) 2.5 7.5

B EXTRACTO DE LEVADURA (g/L) 1.5 4.5

C KCl 10% (mL/L) 5 15

D MgSO4 1.2% (mL/L) 5 15

E MnCl2 10 mM (mL/L) 0.5 1.5

F FeSO4 1 mM (mL/L) 0.5 1.5

G Ca(NO3)2 0.5M (mL/L) 1 3

Diseño factorial fraccionado (Plackett-Burman) para evaluar los 7

componentes del medio de cultivo DSM y poder identificar aquellos con

mayor influencia en la producción de esporas.

MEDIO DO 24h DO 48h DO 72h UFC/ml 72h (1X109)

1 1.410 2.025 1.816 1.33

2 (EL) 1.683 1.459 1.426 5.13

3 1.171 0.982 0.881 1.10

4 (Mg) 1.557 1.710 1.562 5.60

5 1.778 1.585 1.501 0.30

6 1.975 1.663 1.727 0.43

7 1.755 1.944 1.861 2.00

8 1.068 1.058 0.906 2.90

Después de aplicar el método Plackett-Burman se obtiene producción de esporas hasta de 5.6 x 10 9 UFC/ml

El estudio de la diversidad de las bacterias cultivables en la rizósfera del maíz nos ayuda a entender porque una planta se enferma

• Se secuenciaron 10,000 aislados y se seleccionaron 7,000 secuencias para agruparlas por similitud en 185 OTUs

• El análisis de rarefacción nos indicó que el esfuerzo de muestreo para entender la diversidad total de la muestra debe ser mayor

Composición de las poblaciones de bacterias cultivables de la rizósfera

del maíz

Phyla

Firmicutes

Proteobacteria

Location Infection

1 B. subtilis 0.0001 0.0031 all five SYM

2 B. cereus 0.0001 0.0001 all five SYM

5 B. megaterium 0.0001 all five

6 Bacillus sp. 0.0001 all five

7 B. cereus 0.0001 0.0002 all five SYM

8 B. subtilis 0.0001 all five

12 B. subtilis 0.0001 all five

13 B. endophyticus 0.0001 all five

17 B. thuringiensis 0.0001 0.02 all five ASY

18 B. subtilus 0.0001 all five

19 B. firmus 0.0001 all five

21 B. megaterium 0.0001 all five

22 E. cloacae 0.0001 0.001 I, II, III SYM

36 P.putida 0.0049 0.0038 all five ASY

82 Pantoea sp. 0.0001 0.0001 I, V SYM

94 L. sphaericus 0.0001 0.0001 all five SYM

95 B. megaterium 0.0001 all five

114 Arthrobacter sp. 0.0001 II, IV, V

117 B. niacini 0.0001 all five

128 B. megaterium 0.0001 I, II, IV, V

169 Acinetobacter sp. 0.0016 I, V

179 B. luciferensis 0.0439 all five

239 S. maltophila 0.0015 I, II, III

375 L. sphaericus 0.0039 I, V

383 P. fluorescens 0.0001 0.0001 III, IV, V ASY

388 B. aquimaris 0.027 III, IV, V

422 Paenibacillus sp. 0.0237 I, II, III, IV

Related to infectionOTU OTUs present at sitesOrganismPr > Chisq

SANA ENFERMA

Poblaciones específicas de Bacillus y Pseudomonas de la rizósfera del maíz son modificadas con la aparición de síntomas de fusariosis

OTUs associated only with asymptomatic

plant rhizospheres OTU number Putative species Sample point

34 B. cereus I

37 P. putida I

39 P. putida I

46 P. putida I

50 P. putida I

52 Bacillus sp. I

54 B. subtilis I

75 P. putida I

79 B. subtilis I

84 B. pumilus I

313 Enterobacter sp. I

321 B. pumilus I

325 B. pumilus I

331 B. pumilus I

335 Enterobacter sp. I

453 Paenibacillus sp. I

495 B. thuringiensis I

505 B. megaterium I

251 B. pumilus II

600 Pseudomonas sp. III

607 B. cereus III

195 B. cereus IV

167 A. calcoaceticus V

381 B. thuringiensis V

151 Bacillus sp. III / V

162 B. cereus II / III / V

197 B. catenulatus I /IV

254 Bacillus sp. I / II

260 B. cereus I / II

324 B. pumilus I / III

336 B. pumilus I / III

372 B. subtilis I / V

423 B. aquimaris II / IV

464 B. subtilis II / III

494 Bacillus sp. I / II

510 B. megaterium I / II

OTUs associated only with symptomatic plant

rhizospheres OTU number Putative species Sample point

104 C. sakazakii I

577 B. megaterium I

282 P. mendocina II

642 B. amyloliquefaciens III

650 Aeromonas media III

661 P. fluorescens III

662 B. megaterium III

433 B. subtilis IV

568 B. aquimaris IV

575 B. aquimaris IV

392 L. sphaericus V

393 L. sphaericus V

409 B. subtilis V

123 B. subtilis II / III

124 B. subtilis I / II

127 B. subtilis I / II

168 P. putida II / V

175 Bacillus sp. I / V

183 B. cereus I / V

190 B. cereus I / V

216 Enterobacter sp. I / II

220 B. subtilis II / IV

224 B. cereus II / IV

240 S. maltophila I / III

243 S. canadense II / III

274 Brevibacillus sp. II / IV

281 Paenibacillus sp. II / III / IV

288 Bacillus sp. II / IV

289 Rhizobium sp. II / III

398 Bacillus sp. I / V

401 B. thuringiensis IV / V

411 Bacillus sp. IV / V

441 Terribacillus sp. I / IV

469 B. thuringiensis I / III

490 B. subtilis I / III

592 Bacillus sp. III / IV

593 B. megaterium III / IV

523 Bacillus sp. I / V

Existen poblaciones principalmente de Bacillus y Pseudomonas que están asociadas exclusivamente con la condición sintomática o asintomática en presencia de Fv

¡GRACIAS POR SU ATENCIÓN! imaldona@ipn.mx

Alejandro Figueroa

Damián Cordero

Glenda Lizárraga Karla Leyva

Dr. Nacho