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REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA - 2011
Sistema de Revisiones en Investigación Veterinaria de San Marcos
Autor: Mercy G. Ramírez Velásquez Universidad Nacional Mayor de San MarcosFacultad de Medicina Veterinaria
USO DE LAS VARIANTES DEL PCR EN EL ESTUDIO DEL
VIRUS DEL SÍNDROME RESPIRATORIO Y
REPRODUCTIVO PORCINO
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�Postgrado – Autor: Mercy G. Ramírez Velásquez
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TABLA DE CONTENIDO
1.� PRESENTACIÓN .................................................................................................... 2�2.� CARACTERISTICAS VIRALES ............................................................................ 2�2.1.� Taxonomía ................................................................................................................ 2�2.2.� Genotipos .................................................................................................................. 3�2.3.� Organización genómica .......................................................................................... 3�3.� EL PCR Y SUS VARIANTES................................................................................. 3�4.� CONCLUSIONES .................................................................................................... 5�5.� BIBLIOGRAFÍA CITADA: ....................................................................................... 5�
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�Postgrado – Autor: Mercy G. Ramírez Velásquez
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1. PRESENTACIÓN
En los últimos años, el uso de las
técnicas convencionales como el
ensayo inmunoabsorvente ligada a
enzimas (ELISA) y la inmunoperoxidasa
en monocapa (IPMA) han servido para
el diagnóstico del virus del Síndrome
Respiratorio y Reproductivo Porcino
(VPRRS) en hatos o granjas porcinas;
sin embargo estas pruebas serológicas
no permiten diferenciar a los animales
vacunados de los naturalmente
infectados (en regiones donde se
vacuna), ni recién infectados, ni
portadores que no producen anticuerpos
detectables por estas pruebas. Las
pruebas moleculares como la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) es
una prueba altamente sensible y
permiten identificar, cuantificar y
diferenciar genotipos virales por lo que
es considerada una herramienta
diagnóstica más precisa y confiable.
El presente artículo tiene por
objetivo hacer una breve revisión sobre
los estudios que se han realizado para
identificar el VPRRS utilizando las
principales variantes del PCR.
Palabras clave: PCR, virus PRRS,
nested PCR, multiplex PCR, tiempo real
PCR
2. CARACTERISTICAS VIRALES
2.1. Taxonomía
El PRRS es causado por el virus
del Síndrome Respiratorio y
Reproductivo Porcino (VPRRS). El
VPRRS pertenece a la familia
Arteriviridae, junto al virus de la arteritis
viral equina, al virus elevador de lactato
deshidrogenasa del ratón y al virus de la
fiebre hemorrágica del simio. La familia
Arteriviridae junto con la familia
Coronaviridae forma el nuevo y estable
USO DE LAS VARIANTES DEL PCR EN EL ESTUDIO DEL VIRUS DEL SÍNDROME
RESPIRATORIO Y REPRODUCTIVO PORCINO Mercy G. Ramírez Velásquez ([email protected],)
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orden Nidovirales (Snijder, 1998;
Meulenberg, 2000; Morilla 2005).
2.2. Genotipos
El VPRRS está dividido en dos
genotipos pero antigénica y
genéticamente distinguibles: el genotipo
1, el Europeo, también conocido como
virus Lelystad, y el genotipo 2 o
Americano (Guarino et al., 1999; OIE,
2008; Spilman et al., 2009). Existe una
considerable variabilidad entre ambos
genotipos, inclusive entre cepas del
mismo genotipo 2 (Kleiboeker et al.,
2005). Dependiendo del respectivo gen
bajo investigación, estos dos genotipos
difieren hasta en un 50% en la
secuencia de su ARN (Truyen et al.,
2006), teniendo solo cerca del 50-60%
de identidad entre sus secuencias
(Spilman et al., 2009).
2.3. Organización genómica
El genoma del VPRRS está
contenido en una molécula simple de
ARN poliadenilado de polaridad positiva
asociado a una cubierta proteica y a una
envoltura externa (Kleiboeker et al.,
2005; OIE, 2008). Su genoma consiste
de 8 marcos de lecturas abiertas
(ORFs), 6 de los cuales son expresados
para la formación de ARNs
subgenómicos (Guarino et al., 1999).
Los ORFs 1a y 1b codifican el ARN
polimerasa viral, los ORFs 2-6 codifica
proteínas estructurales (GP2, GP3, Gp4,
GP5 y M) y ORF7 la proteína de la
nucleocápside (N) (Guarino et al., 1999;
Meulemberg, 2000). Hay tres principales
proteínas estructurales: la proteína GP5,
M y N, siendo la proteína GP5 la más
abundante glicoproteína de envoltura y
la principal inductora de anticuerpos
neutralizantes (Meulemberg, 2000; Yang
et al., 2000; Zheng et al., 2007).
Mientras que la proteína N es la más
abundante proteína del virion y es
altamente antigénica, por esto es
utilizada para la detección de
anticuerpos específicos al virus y para el
diagnóstico de la enfermedad (Dea et
al., 2000).
3. EL PCR Y SUS VARIANTES
El PCR es una técnica molecular
altamente sensible y específica utilizada
para el diagnóstico de muchas
enfermedades infecciosas. Hay
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numeroso estudios que señalan el uso
de la transcriptasa reversa de la
reacción en cadena de la polimerasa
(RT-PCR) para la identificación del
ácido nucleico del VPRRS en muestras
de tejidos, suero y semen (Rovira et al.,
2007). Las variantes del PCR más
utilizadas para la identificación del
VPRRS son el PCR nested, el PCR
multiplex y el PCR en tiempo real.
En 1997 Gilbert et al. describió a
la técnica del PCR multiplex y del PCR
nested multiplex para la diferenciación
de genotipos Europeos y Americanos
del VPRRS, con el fin de determinar el
más bajo limite de detección viral por
PCR. Ellos mostraron que la prueba del
PCR nested multiplex es capaz de
detectar 10 dosis infectivas en Cultivo
de Tejido 50 (TCID50) en comparación
con 103TCID50 que pudo detectar el
PCR multiplex en muestras de suero de
animales experimentalmente infectados.
La más alta sensibilidad del PCR nested
multiplex tiene como ventaja la
genotipificación directa del VPRRS.
Guarino et al 1999, analizó 24
diferentes asilados de campo del
VPRRS por un PCR convencional y
PCR nested usando 6 pares de primers
de diferentes regiones del genoma viral,
con el objetivo de identificar primers
universales que permitan amplificar el
genoma de todos o de la mayoría de los
aislados del VPRRS. Ellos demostraron
que el ORF 7 es un blanco exitoso para
el diagnóstico del virus y que permitió la
amplificación de los fragmentos
correspondientes en todos los aislados
probados. Sin embargo, mencionan que
la sensibilidad de algunos primers
disminuyó con muestras de suero, esto
puede estar relacionado a pérdidas en
el procedimiento de extracción o
degradación del RNA por contaminación
con ribonucleasas presentes en el
suero.
Otra variante del PCR empleada
para la detección del VPRRS es el PCR
en tiempo real (RRT-PCR) que tiene la
ventaja, sobre el RT- PCR convencional,
de consumir menos tiempo durante su
desarrollo y disminuir la probabilidad de
contaminación de los amplificados de
ADN. El uso de una técnica como el
RRT-PCR ofrece la oportunidad de
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detectar fácil y rápidamente ARN viral.
Asimismo, puede monitorear amplicones
acumulados directamente, durante el
proceso de amplificación del ADN (Yang
et al., 2006). Un estudio realizado por
Yang et al., 2006 compararon los
resultados obtenido de un RRT-PCR en
tiempo real utilizando SYBR green I con
un RT-PCR convencional. La
sensibilidad del RRT-PCR fue
encontrada por ser de 10-100 veces
más alta que el convencional RT-PCR.
Otro estudio desarrollado por Rovira et
al., 2007 evaluó la sensibilidad del RRT-
PCR en diferentes muestras biológicas,
probadas individualmente y en mezcla
de 3 a 5 muestras. Los resultados de
este estudio sugieren que el suero es la
mejor muestra para detectar el VPRRS
en verracos durante la infección aguda y
que el trabajo en mezcla de 3 a 5
muestras disminuye la sensibilidad del
RT-PCR; ya que, cerca del 6% de las
muestras que pudieran ser detectadas
por RT-PCR en muestras de suero
individuales pueden ser pérdidas si ellas
fueran corridas en una mezcla de 5
muestras.
4. CONCLUSIONES
• Las variantes del PCR más
utilizadas para la identificación
molecular del VPRRS son el PCR
nested, PCR multiplex y el PCR
en tiempo real.
• Que el PCR en tiempo real es
una técnica molecular más
confiable y segura para la
identificación del VPRRS.
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