aprovechamiento del potencial microbiano del salar de
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Aprovechamiento del potencial microbiano del Salar de Uyuni para
la producción de biopolímeros extracelulares
Diego Miranda1,*, Jenny Lundqvist2, Carlos Martín2, Cristhian Carrasco1
1 Instituto de Investigación y Desarrollo de Procesos Químicos, Ingeniería Química,
Facultad de Ingeniería, Universidad Mayor de San Andrés, P.O. Box 12958, La Paz,
Bolivia
2 Department of Chemistry, Umeå University, SE-901 87, Umeå, Sweden
* Correspondencia a: [email protected]
En el presente trabajo se describe el comportamiento de bacterias productoras de
biopolímeros recolectadas del Salar de Uyuni, relacionando parámetros que pudieran afectar
sinérgicamente su crecimiento microbiano y producción de “Exopolisacáridos” (EPS). Se
determinó que la bacteria SU4M (no identificada) presenta mayor crecimiento por lotes y
producción de EPS al compararla con otras dos (SC2A y SU4A(a)), identificadas como
Bacillus subtilis y Bacillus velezensis. Utilizando la cepa SU4M se estudió la composición del
medio salino (%, p/V) NaCl, influencia del pH en el sustrato, relación entre porcentaje de aire
y volumen en la fermentación (%, v/v); y el efecto de la fuente de carbón. Se incluye un diseño
experimental y cinética específica asociados a la optimización en la producción de EPS por
parte de SU4M, en la cual a través de un diagrama específico para el crecimiento microbiano,
se pudo observar que la relación entre Aire-Sustrato tiene mayor efecto sobre la cinética,
además de una alta influencia de NaCl y la combinación de ambos, indicando una alta
dependencia de al menos dos de los tres factores involucrados en el proceso.
Determinándose la concentración de NaCl (4%, p/V) como la más idónea respecto al máximo
crecimiento y producción de EPS, pH=6,5 y 75(%, v/v) de aire en el medio. Se realizó la
separación del biopolímero obteniéndose un liofilizado final de 927,6 mg/L de EPS después
de la primera optimización. Finalmente se aprovechó la capacidad de adaptación de SU4M
para el uso de sustratos obtenidos de residuos agroindustriales en la generación del EPS.
Palabras clave: Halotolerante, exopolisacárido, cinética específica.
2
Introducción
El rápido agotamiento de los recursos
naturales con las continuas demandas de
una población creciente y las altas tasas de
consumo del mundo de hoy causarán
serios problemas en el futuro. Esto, junto
con las preocupaciones medioambientales,
ha dirigido la investigación hacia la
búsqueda de alternativas en una variedad
de sectores, incluidos los bienes de
consumos sostenibles y respetuosos con el
medio ambiente.
El Salar de Uyuni tiene una amplia variedad
de microorganismos en sus terrenos de
alto nivel de salinidad, sin embargo no
todos son halófilos, en la mayoría de los
casos son halotolerantes, que se cree
tienen un gran potencial para producción
de biopolímeros
El término halotolerante se emplea para
todos aquellos microorganismos que son
capaces de desarrollarse en medios
hipersalinos sin ser inhibidos. En la
actualidad está creciendo el interés por
conocer mejor la gran diversidad de
microorganismos halotolerantes ya que
estos organismos producen una amplia
variedad de metabolitos primarios y
secundarios estables que pueden tener
aplicaciones prácticas, además de una
evidente capacidad de adaptación al medio
en el que se encuentra. Existen
microorganismos que producen
polisacáridos que son excretados al medio
o bien quedan adheridos a la célula en
forma de cápsula. El término
“exopolisacárido” ha sido ampliamente
usado para aquellos polisacáridos
localizados en la superficie externa de las
células microbianas, entre los que se ha
encontrado polímeros de diversa
composición química y propiedades
físicas. Para designar a este tipo de
sustancias se ha acuñado el término EPS,
que se usa para hacer referencia a las
“Sustancias Poliméricas Extracelulares”,
“Exopolisacáridos” o “Exopolímeros”
(Flemming and Wingender, 2010).
Las sustancias poliméricas obtenidos de
fuentes renovables han ganado atención e
interés en los últimos años, tanto en las
comunidades científicas como en los
sectores industriales, debido a su
aplicabilidad. A diferencia de los otros
materiales químicos sintetizados
tradicionalmente, los biopolímeros tienen
un conjunto interesante de ventajas, a
saber, la reducción del impacto ambiental,
el bajo consumo de energía en su
producción, el estado de sus recursos
disponibles, el potencial para agregar valor
a los subproductos y los desechos que
llegan de las industrias además su
particular biodegradabilidad y su
especifidad para su aplicación (Arrieta,
2011).
Por otra parte, el territorio boliviano es uno
de los principales productores de quinua en
3
el mundo con una producción de 70.000
TM (Centro Internacional de Quinua, 2018),
mismo en el cual se tiene como segundo
producto mayoritario a la caña de azúcar
con una producción de alrededor de 1,07
millones de TM (Organización de Técnicos
de la Agroindustria, 2018), por lo que se
cuenta con una gran cantidad de residuos
agroindustriales, los que se estudian con la
finalidad de reemplazar medios sintéticos
costosos.
Durante el desarrollo del presente estudio
se han realizado el mantenimiento y
activación de cepas aisladas en el Salar de
Uyuni. La selección de microorganismos se
realizó con base a su potencial para la
producción de EPS. Los microorganismos
estudiados tienen mayor desarrollo con la
presencia de sal en altas cantidades, sin
embargo una excesiva cantidad de sal los
inhibe, por lo que se ha determinado que
estos microorganismos son halotolerantes,
los que toleran la sal, y no halófilos, que
requieren sal.
Se realizó el estudio de tres bacterias
productoras de Exopolisacáridos (EPS),
codificadas como: SU4M, SU4A(a) Y
SC2A, de acuerdo a la región andina de
donde fueron colectadas. Se realizó el
análisis del crecimiento bacteriano
variando los siguientes parámetros que se
consideraron relevantes: pH, relación
volumétrica entre el sustrato y el aire,
concentración de sal, concentración de
glucosa, xilosa como fuente principal de
carbono. Habiéndose obtenido el EPS, se
separó y purificó, para su posterior
identificación.
Finalmente se aprovechó la capacidad de
adaptación observada de la cepa para el
uso de sustratos complejos obtenidos de
residuos agroindustriales (tallos de quínoa
y melaza de caña de azúcar), para la
generación del biopolímero, sugiriendo
como hipótesis que es posible producir el
EPS con estos medios.
Materiales y Métodos
Los ensayos se realizaron en las
instalaciones del Instituto de Investigación
y Desarrollo de Procesos Químicos
(IIDEPROQ) de la Universidad Mayor de
San Andrés, La Paz, Bolivia (3600
m.s.n.m.), con la colaboración del Instituto
de Investigaciones Fármaco Bioquímicas
(IIFB), y Departamento de Química,
Universidad de Umeå, Suecia.
Se identificaron dos cepas microbianas a
través de un estudio de caracterización en
la Universidad de Umeå, Suecia, en el que
se realizó la Secuenciación de la Próxima
Generación (GNS), además se utilizó un
microscopio electrónico de barrido (SEM).
Se realizó la preparación de cultivos
sólidos para mantenimiento y activación de
las bacterias halófilas, con la composición
descrita previamente (Chambi, 2017), se
prepararon tres muestras de diferentes
4
cepas (SU4A(a), S2CA y SU4M) en frascos
de 10ml y posteriormente se cultivaron a
35ºC por 72 horas. Para el medio solido se
utilizó un cultivo base que favorece la
producción de EPS (%, w/v): NaCl 5;
MgSO4×7H2O 0.025; CaCl2×2H2O 0.009;
KCl 0.05; NaBr 0.006; Peptona 0.5;
Extracto de Levadura,0.5; Glucosa, 0.2;
agar 2.0 (Ventosa A., 1982). A partir de
cultivos solidos se prepararon cultivos
líquidos de 10 ml para la activación y
estudio del crecimiento bacteriano, se
utilizó una composición de 50 g/L de NaCl
para la incubación durante 48 horas a
35ºC, hasta densidad óptica (D.O.) 0,500
mínimamente. Inicialmente se preparan
tres medios de cultivo idénticos y se
inocularon con cada cepa por separado, se
colectaron muestras en intervalos iguales
de tiempo y se midió D.O. a 600 nm para
determinar el crecimiento bacteriano. A
continuación se prepararon cinco muestras
de caldo de volumen 1L con concentración
variable de 3, 4, 5, 6, 7 (%, w/v) de NaCl,
se inoculó e incubó a 35ºC y 100 rpm
(Orbital Shaker Incubator, mrc) durante 96
horas, se recolectaron muestras en
intervalos de 2 a 3 horas y se realizó la
lectura de D.O. por medio de un equipo de
espectrofotometría y fluorescencia
(VarioSkan, Thermo, Alemania) a 600nm.
Se evaluó el comportamiento microbiano
variando el volumen de aire presente en el
medio durante la fermentación, realizando
cultivos con 35, 50, 60 y 75 (%, v/v) en aire,
se recolectaron muestras hasta alcanzar
25 días de incubación, se analizó D.O. a
600nm (determinado por un barrido
espectral en espectrofotómetro) para el
crecimiento bacteriano y a 340nm para la
producción de EPS. El comportamiento en
función al pH se evaluó utilizando tres
valores: 4,4; 5,5 y 6,4 de pH. Para evaluar
el efecto de la fuente de carbono se trabajó
muestras de sustrato con concentración de
azúcar variable 5, 10 y 20 g/L de glucosa,
además una muestra con xilosa 20g/L, se
colectaron muestras durante 96 horas y se
registraron los datos de D.O.
Se realizó la extracción y separación del
metabolito principal, llevando el caldo a
centrifugadora a 11320xg y 4ºC para la
separación de la biomasa. Se precipitó el
sobrenadante con alcohol frio al 96% en
una relación de volumen de 1:3 durante 24
horas a 4ºC. Se llevó la solución obtenida
a centrifugadora a 14 000xg por 20 minutos
para separar el biopolímero. Se realizó una
purificación por medio de membranas de
diálisis (Spectra/Por de 10KD) con
agitación durante 36 horas a 10ºC.
Finalmente se liofilizó a -80ºC para obtener
el EPS.
Posteriormente se realizó el Diseño
Experimental, se eligió un diseño 2^k, con
3 factores, por duplicado, resultando un
total de 16 pruebas para el crecimiento
microbiano y las mismas para producción
de EPS. Para este diseño se han elegido
5
los niveles alto y bajo de acuerdo al
comportamiento que demuestra la cepa
seleccionada en función de las variables
que influyan en mayor grado al desarrollo
del microorganismo, por lo que se
prepararon 16 sustratos diferentes y se
incubaron bajo las mismas condiciones
(35ºC y 100 rpm; Orbital Shaker Incubator,
mrc) en matraces Erlenmeyer de 250 ml,
hasta un tiempo significativo de 48 horas,
tomando muestras cada 2 horas durante
las primeras 24. A través de turbidimetría
se colectaron los datos de D.O. asociados
(VarioSkan, Thermo, Alemania), con los
mismos se desarrolló el diseño
experimental en el programa Minitab18.
Habiéndose obtenido el análisis factorial
del diseño se determinaron los efectos de
los factores involucrados.
Finalmente se realizaron los ensayos de
pretratamiento a los residuos
agroindustriales. Para los tallos de quinua,
inicialmente se realizó una fragmentación
mecánica con molino de tres aspas. A
continuación se utilizó una hidrolisis acida
con explosión de vapor a una temperatura
de 200ºC por 5 minutos, obteniendo una
mezcla de lodo y licor, ricos en azúcares
fermentables. Por otro lado la melaza
simplemente se ha esterilizado,
habiéndose caracterizado su composición
en azucares mediante ºBrix.
Finalmente se realizó la adaptación de la
cepa SU4M al medio con hidrolizados de
quínoa de forma gradual, inicialmente en
una relación del 10% hasta 50% (g de
Glucosa en el hidrolizado/g Glucosa total
en el sustrato). De igual forma se realizó la
adaptación de la cepa al sustrato complejo
de Melaza, hasta reemplazar por completo
la concentración requerida de la fuente de
carbón, 100% (g de sacarosa en la
melaza/g azúcar total en el sustrato).
Resultados y Discusión
En el proceso de activación y
mantenimiento de cepas se observa de
manera evidente la formación de biofilm.
Se realizaron las lecturas de barrido de
absorbancia para determinar la longitud de
onda característica del biopolímero
determinándose el valor de lectura a 340
nm.
Figura 1. . Producción de biopolímero. a) SC2A. b) SU4A(a). c) SU4M, esta última presenta mayor producción de biopolímero.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
D.O
. (34
0nm
)
Tiempo (h)SU4A(a) SU4M SC2A
6
SU4M mostró mayor producción de
biopolímero en idénticas condiciones en
contra de las otras cepas, como se ve en la
Figura 1.
Se realizó la identificación de dos cepas en
estudio. SC2A se identificó como Bacillus
subtilis sp. (Fig. 2), SU4A(a) fue
identificada como Bacillus subtilis y Bacillus
Velenzis (Fig. 3).
Figura 2. SC2A: Bacillus subtilis sp.
Figura 3. SU4A(a): Bacillus subtilis. Presencia de Bacillus Velenzis En ambos casos se trata de un bacilo
adaptado o mutado debido al suelo
hipersalino donde se ha desarrollado, lo
cual le proporciona al producto generado
diferentes propiedades de alto interés, sin
embargo SU4M que presenta mayor
producción de biopolímero aún no ha sido
identificada.
Con objeto de determinar la fase del
crecimiento en la que existe mayor
producción de exopolisacáridos variando
parámetros que afectar el proceso se
realizaron determinaciones de D.O. de
cultivos a 600 nm, datos comparables a los
obtenidos por Mata (Mata, J 2006).
La concentración de NaCl que presentó
mayor densidad óptica a 600nm, para
crecimiento microbiano de SU4M fue del 4
(%, w/v), como se muestra en la figura 4.
Figura 4. Densidad óptica en relación a la concentración variable de NaCl. La producción de biopolímero en relación a
la concentración de sal se evaluó a 340nm.
Se puede observar que existe mayor
producción con 3(%, w/v) de NaCl en las
primeras 48 horas es decir en la fase
exponencial del crecimiento bacteriano,
pasado este tiempo el producto generado
con la concentración 4(%, w/v) alcanza y
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Ab
sorb
anci
a (3
40n
m)
Tiempo (h)3% NaCl 4% NaCl
5% NaCl 6% NaCl
7
supera la anterior mencionada, tal como se
observa en la figura 5.
Figura 5. Efecto de la concentración de NaCl en la producción de biopolímero.
Los valores registrados de D.O. para
cultivos con 35, 50, 60 y 75 (%, v/v) de aire,
el restante sustrato, se muestran en la
figura 6, estos se registraron durante 25
días para asegurar el estado estacionario,
observando evidentemente que existe
mayor crecimiento microbiano con 75
(%v/v) de aire.
Figura 6. Influencia del volumen de aire durante el crecimiento microbiano
Para el mismo efecto se evaluó la cantidad
de EPS producido en estas condiciones,
siendo relevante solo la fase exponencial
que se presenta dentro de las primeras 48
horas desde la incubación.
Se observó que se obtiene mayor cantidad
de EPS con una relación de 75%, sin
embargo con una relación del 60% la
producción de EPS es bastante cercana a
la anterior, cabe notar que a mayor
cantidad de aire se produce mayor
cantidad de EPS, figura 7.
Figura 7. Influencia del volumen de Aire presente en el medio de cultivo para la producción de EPS Los valores de pH recolectados durante un
periodo de 25 días muestran un
crecimiento más rápido cerca de pH = 6,5
en los primeros 4 días, sin embargo existe
un momento en el que con pH más acido
existe mayor D.O., se atribuye al aumento
de la fase de latencia, periodo en el que la
cepa enfrenta las condiciones del sustrato
en un ambiente de mayor estrés que lo
obliga inicialmente a adaptarse y
posteriormente se desarrolla con
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
0 20 40 60 80 100
D.O
.
Tiempo (h)3% NaCl 4% NaCl 5% NaCl
6% NaCl 7% NaCl
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
0 100 200 300 400 500 600
D.O
.
Tiempo (h)
60% AIRE 75% AIRE 35% AIRE
0,5
1
1,5
2
2,5
0 20 40
Ab
sorb
anci
a (3
40n
m)
Tiempo (h)75% AIRE 60% AIRE 35% AIRE
8
normalidad. Los valores obtenidos de la
observación se muestran en la figura 8.
Figura 8. Comportamiento del crecimiento
microbiano en relación al potencial de
hidrogeno, primeros 9 días.
La producción de EPS en las primeras 48
horas, es mayor cuando el pH del sustrato
se encuentra cerca de la neutralidad; se
resalta que en la etapa de crecimiento para
Bacillus subtilis (ya estudiada antes), el pH
utilizado normalmente es ligeramente
básico, pH = 8. Se especula que durante la
etapa de acondicionamiento de la bacteria
en un pH más acido no existe producción
de EPS, sin embargo después de 72 horas
si se produce el biopolímero en cantidades
poco menores; se puede apreciar en la
figura 9.
El efecto de la fuente de carbono sobre el
crecimiento se muestra en la figura 10 para
lo cual se evaluó las concentraciones de
Glucosa del 5, 10 y 20 g/L, además una con
xilosa 20 g/L, en la misma se puede
observar que existe mejor desarrollo del
microrganismo a 5g/L de glucosa. Es
evidente que la cepa tiene preferencia por
Glucosa como fuente principal de carbón,
sin embargo es capaz de utilizar también
Xilosa y probablemente incluso disacáridos
como la sacarosa o azúcares simples
mixtas.
Figura 9. Influencia del pH en la producción del EPS.
Figura 10. Influencia de la fuente de carbón en el crecimiento bacteriano
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
0 50 100 150 200
D.O
.
Tiempo (h)pH 4,4 pH 5,5 pH 6,2
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
-10 10 30 50A
bso
rban
cia
(340
nm
)Tiempo (h)
4,5 5,5 6,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
-2 18 38 58 78 98
D.O
.
Tiempo (h)
5 g/L (G) 20g/L (G)
10g/L (G) 20g/L (X)
9
En el proceso de Extracción y separación
se llegó a recuperar hasta 727,5 mg/L de
EPS, obteniéndose este como sólido libre
de humedad, el cual supera la producción
de Bacillus subtilis que reporta 15,8 mg/L
de EPS en un medio basal para producción
del mismo (Vijayabaskar, P y col. 2011).
Habiéndose realizado un diseño
experimental específico para la cepa
SU4M, se analizaran dos diferentes
modelos, el primero se basa en el
crecimiento bacteriano y el segundo en la
producción de EPS.
En la figura 11, diagrama específico para el
crecimiento microbiano, se puede observar
que la relación de volumen entre Aire-
Sustrato tiene mayor efecto sobre el
crecimiento microbiano, además se
observó una alta influencia en la
concentración de NaCl y la combinación de
ambos factores, indicando una alta
dependencia dos de los tres factores
involucrados para el crecimiento.
Figura 11. Diagrama de Pareto para análisis de crecimiento bacteriano (Minitab18).
Figura 12. Evaluación de efectos en el crecimiento bacteriano (Minitab18).
En la Figura 12 se aprecia que los valores
más altos de crecimiento se registran a
altas concentraciones de glucosa, bajas de
NaCl y mayor volumen de aire en la
relación volumétrica con el sustrato.
Por otro lado para la producción de EPS se
tiene la Figura 13, se puede notar que
tienen mayor efecto la relación de
volúmenes entre Aire-Sustrato, además
una influencia apreciable en la
concentración de NaCl, indicando una alta
dependencia también de estos dos factores
involucrados para el crecimiento.
Figura 133. Diagrama de Pareto para análisis de producción de EPS (Minitab18).
10
En la figura 14 se aprecia que los valores
más altos producción de EPS se registran
a altas o bajas concentraciones de
glucosa, bajas concentraciones de NaCl y
definitivamente cuando mayor volumen
de aire existe en relación con el sustrato.
Figura 144. Evaluación de efectos en la producción de EPS (Minitab18).
Para el análisis de Cinética específica de
SU4M se muestra la figura 15. Se observa
que existe una fase de 8 horas, a partir de
este momento inicia el crecimiento
microbiano de manera exponencial con
pendiente negativa, se puede suponer
una fase exponencial hasta 24 horas.
Figura 15. Curva característica de SU4M ajustada.
Para evaluar la cinética específica de esta
cepa se usó la ecuación de Monod:
𝜇 =𝜇𝑚𝑎𝑥∗[𝑆]
𝐾𝑚+[𝑆] …(1)
Después del análisis realizado se obtiene
los datos de velocidad específica de
crecimiento para SU4M y Km para
glucosa como sustrato (Figura 16).
Figura 156. Tasa de crecimiento específico μ en función de la concentración de sustrato S para SU4M
A través del análisis del modelo de Monod
se determinó el valor de Km.
𝒌𝒎 = 𝟎, 𝟒𝟏𝟎𝟕𝟔𝟏𝟕𝟕
El valor de Km sugiere que la cepa tiene
alta afinidad por el sustrato utilizado, es
decir tiene alta afinidad por Glucosa como
sustrato.
Se realizó el proceso de Extracción y
separación luego del diseño experimental
recuperando hasta 927,6 mg/L de EPS,
obteniéndose este como sólido libre de
humedad, el cual supera la producción
realizada antes de la primera
optimización.
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
0 10 20 30 40 50
LN D
.O.
Tiempo (h)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
µ vs S µmax
11
Finalmente el pretratamiento de la materia
lignocelulósica residual se ha realizado en
un reactor de explosión de vapor (Anexo
A) habiéndose obtenido una
concentración promedio de 5g/L de
Glucosa aprovechable, con la que se
realizó la adaptación de la cepa SU4M en
medio líquido y se pasó a medio sólido. Se
observó la formación de Biofilm
característica en la formación de
biopolímeros como se ve en la figura 17.
Figura 17. Cultivo sólido de SU4M en hidrolizados de tallos de Quínoa.
De igual forma se utilizó melaza en el
cultivo sólido y líquido, para reemplazar la
fuente de carbón. La concentración de
azúcar en la melaza fue de 70ºBrix. Para
la preparación de sustrato fue necesario
2,67ml de melaza en 100 de sustrato, y se
agregó únicamente NaCl en la
composición óptima sugerida del anterior
análisis cinético. Se observó un evidente
crecimiento de la biomasa y formación de
Biofilm (Figura 18).
Figura 18. Cultivo liquido de SU4M en sustrato complejo de Melaza de caña de azúcar.
Conclusiones
Las bacterias aisladas en la localidad de
Uyuni han demostrado tener potencial
para la producción de EPS,
especialmente en condiciones de estrés,
es decir presencia de NaCl, pudiendo
desarrollar biopolímeros incluso en pH
ácidos, lo que implica un alto potencial
para el escalamiento de este bioprocesos,
ya que la bacteria no se ve afectada con
las variaciones en el pH durante la cadena
de producción, además estos entornos
obligan a una mayor producción de
metabolito primario. SU4M ha
demostrado mayor producción de EPS y
ha mostrado una evidente capacidad de
adaptación, estos resultados favorecen a
la intención de utilizar fuentes de carbón
de residuos agroindustriales, siendo
fuentes más baratas para la producción
del metabolito primario. Se ha identificado
la cinética específica de este
12
microorganismo con el fin de poder utilizar
biofermentadores de mayor capacidad de
producción. Finalmente se ha demostrado
que es posible utilizar sustratos complejos
para la generación de biopolímeros
utilizando esta cepa SU4M.
En general este biopolímero adquiere
interés por sus propiedades, teniendo
posibles aplicaciones en nanotecnología
(en estudio), entre otros.
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negative Rods’, Microbiology.
Microbiology Society, 128(9), pp. 1959–
1968. doi:
https://doi.org/10.1099/00221287-128-9-
1959.
Vijayabaskar, P. et al. (2011)
‘Quantification and Characterization of
Exopolysaccharides from ( MTCC 121 )’,
Advances in Biological Research, 5(2),
pp. 71–76.
Agradecimentos
SIDA (Swedish International
Development Cooperation Agency) y
Swedish Research Council.
14
ANEXO A
REACTOR DE EXPLOSION DE VAPOR (HIDROLOZADOR)
Caldero
Reactor
Panel de control
Ciclón de
descarga
Válvula de
cámara
Purga
15
ANEXO B
Ilustración 1 Formación de biopolímeros en
muestra diaúxica. Se precipitó utilizando etanol. 1) Biofilm formado por xilosa. 2) Biofilm formado por glucosa
Ilustración 2 Microrganismos en etapa de incubación en incubador agitador orbital
Ilustración 3 Análisis de muestras en VariosKan
Ilustración 4 Bacillus Subtilis sp y Bacillus Velenzis
Ilustración 5 . Exopolisacárido libre de humedad (Liofilizado final)