antonio martínez laborda Área de genética...

Terapia génica

Antonio Martínez LabordaÁrea de GenéticaDepartamento de Biología AplicadaUniversidad Miguel Hernández de ElcheCampus de Sant Joan d’Alacant

Terapia génica

Introducción

• Medicina molecular: Dilucidación de las bases genéticasde las enfermedades, técnicas dediagnóstico y diseño de terapiasadecuadas.

Patologíamolecular

- Terapia génica: Utilización de ácidos nucleicos confines terapéuticos. Incluye:- Restaurar la función de un gen

defectuoso.- Incrementar la función de un gen

endógeno con fines terapéuticos.- Eliminar la expresión de un gen

endógeno con efecto patológico ola expresión del gen/es de un patógeno.

Requiere un profundo conocimiento de las causasmoleculares de la enfermedad:- Identificación de células o tejido diana.- Identificación de los genes y proteínas implicados

Introducción

Introducción

• La terapia génica, según la naturaleza de las célulasdiana, la podemos clasificar en dos clases:

- Terapia génica de células somáticas.Las células diana son células no germinales (noimplicadas en la producción de gametos).Coherente con las técnicas generales de terapiamédica, en las que el tratamiento no alcanza másallá del individuo afectado.

- Terapia génica de células germinales.Implica la potencial modificación de la descendenciadel individuo.En la actualidad, no se contempla dentro de la prácticamédica, además de chocar con cuestiones éticas.

Introducción• La terapia génica consiste en una serie de estrategias confinalidad terapéutica, basadas en la transferencia dematerial genético a un individuo. Esto se puede conseguirmediante técnicas in vivo y ex vivo.

Células delpaciente X-

Algunascélulas son ahora X+

in vivoex vivo

Estrategias de terapia génica

• Terapia de aumento génico (GAT)

La terapia de aumento génico (GAT) consiste en laintroducción y expresión de la versión silvestre de

un gen para corregir enfermedades debidas aldéficit de un determinado producto

• Terapia de aumento génico (GAT)


- Problemas ocasionados por la pérdida de función del gen.

- Copias adicionales el alelo normal aumenta lacantidad de producto funcional hasta un punto en elque se restablece el fenotipo normal.

- Trastornos recesivos en los que una expresión modestadel gen introducido puede suponer una diferenciasustancial.

- Las mutaciones dominantes por haploinsuficiencia noson buenas candidatas a tratarse con esta estrategia.

• Supresión dirigida de células específicas


- Se ha utilizado en tratamientos de cánceres.

- La eliminación directa consiste en la transferencia a lascélulas de genes que codifican toxinas (genes suicidas) oagentes que confieren sesibilidad al tratamiento condeterminados fármacos (prodrogas).

- La eliminación indirecta consiste en la transferencia deun gen cuyo producto va a dirigir una respuesta inmunecontra las células diana.



Eliminación directa de células



Eliminación indirecta de células

Estrategias de terapia génica• Supresión dirigida de células específicas

Eliminación directa de células

Mecanismo de acción de Cerepro. Se trata de un vector adenoviral conel gen de la kinasa de timidina del virus herpes simple. La enzimaconvierte el ganciclovir en un producto tóxico para la célula.

• Inhibición dirigida de la función génica

Inhibición

Gen antisentido m

Si las células enfermas presentan un nuevo producto génicoo la expresión inadecuada de un gen, como en muchoscasos de cáncer o en enfermedades infecciosas, se puedendiseñar estrategias para bloquear la expresión de un únicogen en el DNA, el RNA o la proteína




RNA antisentido y Ribozimas



Interferencia de RNA (shRNA, siRNA, miRNA)



Fosforotiorato

Apuntes históricos de la Terapia Génica

• 1967. El premio Nobel Marshall Niremberg argumenta lasposibilidades y peligros de la terapia génica.

• 1989. Steven A. Rosenberg llevó a cabo la primeratransferencia génica aprobada en humanos.

• 1991. Anderson y col. realizan el primer ensayo terapéuticocon transferencia génica en pacientes de ADA.

• 1999. Muerte de Jesse Gelsinger en un ensayo clínicopara el tratamiento de una deficiencia parcial en la enzimaornitina transcarbamilasa. La muerte se produce por larespuesta inmunológica al vector adenoviral empleado.

• 2000. Curación de la XSCID en los ensayos de terapiagénica. No obstante, varios niños desarrollan leucemiapor la integración de la secuencia introducida cerca deun protooncogén. Muere uno de ellos.


• 2003. Se aprueba en China el primer medicamento basadoen técnicas de terapia génica (Gendicine). Se trata de unvector adenoviral en el que se sustituye la secuencia delgen E1 por la del gen supresor de tumores p53. Diseñadopara el tratamiento de cánceres de cabeza y cuello. Noobstante, se aprobó sin la realización de un ensayo clínicode fase III estándar.

• 2012. El EMA (European Medicines Agency) aprueba eluso con restricciones de Glybera en la UE. Glybera se basaen un vector AAV que lleva un alelo de ganancia de funcióndel gen para la enzima lipoproteína lipasa.


Vitravene es un oligonucleótidoantisentido que inhibe la replicacióndel citomegalovirus (CMV), cuyasinfecciones causan retinitis (derivaen ceguera en enfermos de SIDA)

Macugen se ha diseñado para tratarla mácula degenerativa. Se trata deun aptámero que se une a la proteínaVEGF (vascular endothelium growthfactor), inhibiendo su función. VEGFtiene efectos angiogénicos yproinflamatorios que contribuyena la patología.

Vectores

• La terapia génica requiere la introducción de ácidosnucleicos en células diana y, en ocasiones, la expresiónfuncional de las secuencias introducidas.

• Los vectores son vehículos que facilitan la transferenciade ácidos nucleicos al interior de las células.

• Los sistemas de vectores empleados en terapia génicapueden clasificarse en dos tipos:- Vectores virales.- Vectores no virales.

Vectores. Liposomas

• Vesículas esféricas compuestas de bicapa lipídicasintética que mimetiza la estructura de las membranasbiológicas.

• Clases de liposomas:- Aniónicos. Carga negativa.- Catiónicos. Carga positiva.La carga positiva estabiliza la unión del ADN con carganegativa.Vectores muy utilizados en los intentos de terapia in vivo.

Vectores. Liposomas

Vectores retrovirales

Glicoproteína

Receptorcelular

Reconocimientode la célula

hospedadora

Virus de RNA

Vectores retrovirales (gammaretrovirus)

LTR Gag Pol Env LTR

Retrovirus MLV

Promotor Proteínas dela cápside

RetrotranscriptasaIntegrasa

Glicoproteínade la envuelta

Sitio depoliA

PBS

PPT

Transgén. Hasta 8 kbRiesgos derivados de la inserción en el genoma dela célula receptoraSólo sirve para células quese están dividiendo (usonormal para terapia génicaex-vivo)

La secuencia U3 se duplica durante la transcripción inversa, porlo que aparece también en el LTR 5’ del provirus. Esta regióncontiene elementos esenciales para la transcripción del virus.Se deleciona para construir los vectores retrovirales SIN (self-inactivating)


Los vectores SIN utilizan un promotor fuerte CMV en lugar delpromotor retroviral, lo que da lugar a mejores rendimientos. Además, presentan la deleción de la región U3.Una vez insertados, se minimizan los riesgos de movilizacióndel vector y de activación de protooncogenes.


Vectores retrovirales (lentivirus)

A diferencia de losgammaretroviruspueden infectar acélulas que no sedividen

Vectores adenovirales

E1 L1 L2 L3 L4 E3 L5E2 E2 E4ITR ITR

P

E1 L1 L2 L3 L4 E3 L5E2 E2 E4ITR ITR

P

PromcDNA

5,1 Kb

AdenovirusResponsables de enfermedades respiratorias, conjuntivitis ygastroenteritis. Dan lugar a una fuerte respuesta inmunológica.

Los vectores adenovirales de primera generación sustituían el gen E1para acomodar hasta 5,1 kb, o sustituían los genes E1 y E3 paraacomodar hasta 8,3 kb. Fuerte respuesta del sistema inmunitario.Se producen linfocitos T citotóxicos que eliminan a las célulasInfectadas.

36 kb de ADN bicatenario lineal

Vectores adenoviralesLos vectores adenovirales de segunda generación se diseñaron con laintención de producir una respuesta inmunológica menos aguda.Eliminan los genes E1, E3, E2 y E4, lo que permite incorporar hasta 14 kb de inserto. No obstante, siguen produciendo respuestacitotóxica.

Los vectores adenovirales de tercera generación sustituyen todas lassecuencias del adenovirus, excepto las imprescindibles para lareplicación del DNA viral (ITR) y para el empaquetamiento en lacápside () por un inserto de hasta 37 kb. Siguen produciendorespuestas inmunológicas debido a la cápside viral.

Estos vectores permiten la transformación tanto de células en divisióncomo de células que no se dividen. Se pueden emplear in vivo y ex vivo.El DNA terapéutico no se inserta en el genoma de las célulashospedadoras, quedando como episoma.Debido a la respuesta del sistema inmunológico contra el vector y lascélulas infectadas, la expresión del transgén suele ser transitoria.

Vectores AAV (virus asociados a adenovirus)

ITR Rep ITRCap

AAV

ITR Promot ITRcDNA

Vector AAV

El genoma está formado por 4,7 kb de DNA lineal. Para su replicaciónprecisa la colaboración de otro virus (adenovirus o herpesvirus). Lassecuencias ITR son necesarias para la replicación, el empaquetamientoy la integración en un sitio específico del cromosoma 19. Los genes Repy Cap determinan proteínas implicadas en la replicación y de la cápside.

Los vectores AAV sustituyen las secuencias Rep y Cap por el cDNA delgen terapéutico con un promotor y secuencias de poliadenilación.Mantienen las ITR. Se mantienen en la célula como episomas (al carecerde función Rep no se integra en el cromosoma 19). La expresión puedeser persistente . Pueden empaquetar hasta 4,5 kb de inserto.

Vectores AAV (virus asociados a adenovirus)

Hay al menos12 serotipos diferentes (AAV1-AAV12). El más utilizado esel AAV2. Sin embargo, cápsides de diferentes serotipos muestran distintosreconocimientos celulares. Por ello, se emplean vectores pseudotipos,que tienen secuencias ITR de AAV2 y la cápside de otro serotipo.

Vectores empleados en los ensayos clínicos

Las estrategias más empleadas de transferencia génica en los ensayosclínicos han sido los adenovirus, los retrovirus y el DNA desnudo.

Ensayos clínicos de terapia génica

Los ensayos clínicos se realizaban inicialmente para el tratamiento deenfermedades monogénicas raras, pero actualmente la mayoría de losensayos están encaminados al tratamiento de diferentes tipos decánceres.

El primer éxito de la terapia génica: XSCID

Los afectados de la inmunodeficiencia severa combinada ligada al X(XSCID o SCID-X1) son niños burbuja que carecen de la función de lasubunidad gamma del receptor de interleucina 2 (IL2-RG o c). Por ello,carecen de linfocitos T, B, NK (natural killer) y otras células de defensa.

Terapia génica empleada: introducción ex-vivo del cDNA que codifica la subunidad gamma con un vector retroviral (MFG(B2)‐γC) en célulasmadre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC) de la médula ósea de lospacientes y reintroducción de las células transfectadas sin quimioablación previa de las células de la médula ósea.

Terapia génica para la XSCID

Empaquetamientodel vector con elgen terapéutico enla cápside retroviralen una línea celularde ratón.


PCR semicuantitativa para detectar laexpresión del transgén en diferentestipos celulares de los dos pacientes.

PMBC: células mononucleadasde sangre periférica

CD3: linfocitos BCD19: linfocitos TCD14: monocitosCD15: granulocitosCD56: células NKCD34: células de la médula ósea


Abundancia de los diferentes tipos de linfocitos en los dospacientes. Conteos de linfocitos T (CD3, CD8 y CD4), linfocitosB (CD19) y células NK (CD16, CD56).

Ambos pacientes dejaron el aislamiento protector entre losdías 90 y 95 después de la terapia. En el momento de la publicación, llevaban alrededor de un año viviendo en casa.


De los 2 pacientes iniciales llevan el ensayo a un total de 10 pacientes.

A) Los pacientes P4 y P5 mostraron una proliferación de linfocitos Tmuy rápida después de la terapia génica. B) Estos niños desarrollaronproliferación clonal incontrolada de linfocitos T a los 30 y 34 mesesdespués de la terapia génica.



Activación aberrante del protooncogén LMO2 que codifica un reguladorcentral de la hematopoyesis.Las células que tienen esta activación proliferan más rápidamente ycausan leucemia.


Seguimiento, tras al menos 9 años después de iniciarse la terapia, delos pacientes tratados en los artículos anteriores.De los pacientes tratados 8 mostraron corrección inicial de laenfermedad. Uno de ellos dio resultado negativo y recibió trasplantede médula ósea (P3). Cuatro de los pacientes desarrollaron leucemia(P4, P5, P7 y P10) de los cuales uno falleció (P4).Siete pacientes, incluyendo los tres que sobrevivieron a la leucemia,han reconstituido su sistema inmune. Tres de éstos requirieron terapiade reemplazo de inmunoglobulina (P6, P7 y P10).

Terapia génica para la ADA-SCID

La inmunodeficiencia severa combinada por deficiencia de la enzimadesaminasa de adenosina produce un fallo en el desarrollo y funciónde los linfocitos, así como otras anomalías físicas.Se ha utilizado terapia de reemplazo con PEG conjugado a ADA.La terapia génica se realiza sobre dos pacientes sin posibilidad detrasplante de médula ósea ni terapia de reemplazo.La terapia consiste en la introducción de un transgén ADA medianteun vector retroviral en células madre hematopoyéticas (HSC) yreintroducción en el paciente tras acondicionamiento no mieloablativo.


Vector empleado en elensayo.


Reconstitución de la hematopoyesis yde linfocitos tras la terapia génica.

Neutrófilosy

Plaquetas

Linfocitos

Linfocitos T,Linfocitos NK

yLinfocitos B


Determinación de células con el vector mediante RT-PCR.

Paciente 1

Paciente 2 HST

HST

Granulocitos

Granulocitos

Linfocitos T

Linfocitos T

Linfocitos NK

Linfocitos NK

Linfocitos B

Linfocitos B


Actividad ADA

Glóbulos rojos

Linfocitos


Amplían el estudio anterior a diez niños. Todos ellos están vivos trasun seguimiento desde 1,8 a 8 años, según los individuos.Nueve pacientes reconstituyeron un sistema inmune activo y protecciónactiva contra infecciones, uno de éstos (paciente 2) tuvo que recibirtratamiento de reemplazo enzimático con PEG-ADA a 4,5 años del iniciode la terapia génica.El paciente 8 presentó episodios recurrentes de anemia hemolítica ytrombocitopenia autoinmunes. Tuvo que ser tratado y no se pudo evaluar.

Terapiagénicapara la

ADA-SCID

Persistencia de lascélulas transducidas,de la actividad ADAy los metabolitos dela purina en lasangre periférica

Terapia génica para la MLD

La leucodistrofia metacromática es una enfermedad neurodegenerativamortal por la carencia de función del gen ARSA, que codifica la enzimalisosomal arilsulfatasa B, implicada en el metabolismo de losesfingolípidos. No existe tratamiento farmacológico para la enfermedad.Tratamientos posibles de la enfermedad son el trasplante de células madre de la hematopoyesis (HSC) y la terapia génica de HSC del paciente. La progenie de estas células migra a los tejidos afectados.


Presencia del vector en células de la médula ósea y de sangre periférica.


Actividad de la enzima en granulocitos (CD15), monocitos (CD14) yen el líquido cefalorraquídeo (CNF).


La terapia génicaproporciona unevidente beneficioterapéutico a lospacientes.

Medida de lafunción motora

Velocidadde

conducciónnerviosa

Desmielinización severaasociada a atrofia cerebral


Porcentaje de lecturasde secuencia para cadainserción independiente.No hay ningún clon queesté sobrerrepresentado(no hay leucemia).


Dra. Biffi

Los afectados por este síndrome a los 30 meses van en silla de ruedas,son incapaces de aguantar la cabeza y no pueden hablar.Los niños tratados en este ensayo pueden ponerse en pie, y andar ycorrer sin ayuda. Presentan un coeficiente intelectual, lenguaje yhabilidades cognitivas normales.

Terapia génica para enfermedades de la retina

Utilización de un vector AAV para mediar la transferencia génica.Estos vectores son muy empleados en la terapia génica deenfermedades retinianas.

Terapia génica para enfermedades de la retina

Inyección del vector en el área de la retina.

Terapia génica para la LCA2

La amaurosis congénita de Leber de tipo 2 (LCA2) causa ceguera pormutaciones en el gen RPE65, que codifica una enzima crítica del ciclode los retinoides, no produciéndose 11-cis-retinal, el cromóforo de losconos y los bastones. Finalmente, hay degeneración de la retina yceguera sobre los 30-40 años.Tratamiento mediante inyección subretinal de un vector AAV queexpresa el gen RPE65 (AAV2-hRPE65v2) en el peor de los ojos a dosisbaja (1,5x1010 genomas del vector), media (4,8x1010 genomas delvector) y elevada (1,5x1011 genomas del vector).


Datos de los 12 pacientes incluidos en el tratamiento


Se produce incremento de la agudeza visual en los tres pacientes quehan recibido dosis baja (NP01, NP02 y NP03), tres que han recibidodosis media (NP04, CH10 y CH11) y uno al que se le ha administradola dosis elevada (NP15). Hay disminución en un paciente (CH06). Nohay variaciones significativas en el resto.


Diferencias en sensibilidad entre el ojo inyectado y el ojo no inyectado.La mejora en la sensibilidad es particularmente notable en los pacientesmás jóvenes.

9

810

24

20

35

44

TerapiaGénicapara laLCA2

A) Mejora de losreflejos de lapupila enrespuestaa la luz.

B) Correlación dela mejora en lasensibilidad ala luz y la edaddel paciente.


Tres pacientes del estudio anterior (NP01, CH11 y CH12) participan enun ensayo para establecer posibles mejoras tras una inyección con ladosis máxima (1,5x1011 genomas del vector) en el ojo no intervenido enel primer ensayo.


Características de los pacientes y detalles de la intervención.


Sensibilidad a la luz blanca (blanco y negro),al rojo y a la luz azul (visión cromática).

Pupilometría. Amplitud dela constricción de lapupila tras iluminación.

antonio martínez laborda Área de genética...

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