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ANTIOXIDANTES EN ALIMENTACIÓN: DIFERENTES FORMAS DE EXPRESAR SU

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE.

TIPOS DE UNIDADES Y MÉTODOS DE ANÁLISIS.

ARRATE LACALLEBarcelona, 20 Junio 2007

1-. INTRODUCCIÓN

RADICALES LIBRES

Un radical libre es cualquier especie que contiene uno o más electrones desapareados y que es capaz de mantener una existencia independiente.

El radical libre, en estas condiciones, busca a toda costa otro electrón para poder parearse. Es esta intensa búsqueda la que hace a estos radicales libres extremadamente reactivos.

Hidroxilo, Peroxilo, Superóxido, Hidroperóxilos…

ANTIOXIDANTE

Moléculas que a bajas concentraciones, respecto a las de un sustrato oxidable, retardan o previenen su oxidación.

El antioxidante al chocar con el radical libre cede un electrón, se oxida y se transforma en un radical libre débil no tóxico.

Vitamina E, Vitamina C, Selenio, Flavonoides …

1-. GENERACIÓN ENDÓGENA DE RADICALES LIBRES

Los procesos fisiológicos del organismo generan cierta tasa de estas sustancias oxidantes:

•Respiración Mitocondrial

•Sistemas de defensa

•Retículo Endoplasmático

•Enzima Xantina DHS-a

RESPIRACIÓN MITOCONDRIAL

El la formación de ATP el oxígeno se reduce normalmente hasta agua. Así, el O2 se reduce en cuatro etapas en cada una de las cuales se transfiere un electrón. Sin embargo, el transporte electrónico mitocondrial es imperfecto y la reducción del oxígeno genera O2-..

Se estima que entre 1-3% del oxígeno consumido por el organismo no llega a formar agua y acaba generando ROS y radicales libres.

SISTEMAS DE DEFENSA: Células fagocíticas

Las células fagocíticas del sistema inmune -neutrófilos, monocitos, macrófagos y eosinófilos- que defienden al organismo contra la agresión de agentes extraños, producen grandes cantidades de radicales libres como parte del mecanismo que les permite destruir dichos agentes.

2-. GENERACIÓN EXÓGENA DE RADICALES LIBRES

► Radiaciones

► Contaminantes

► Actividad Física intensa

► Humo del tabaco

► Dietas

► Metabolización de fármacos

NO2.Dióxido Nitrógeno

RO.Alcoxilo

NO.Óxido Nítrico

O2.-Superóxido

HOO.Hidroperoxilo

ROO.Peroxilo

OH.Hidroxilo

HBrOAc. Hipobromoso

O3Ozono

ROONOAlquil peroxinitritos

ONOOHAc. Peroxinitroso

ONOO-Peroxinitrilo

NO2+Catión nitrilo

HNO2Ac. Nitroso

HClOÁc. Hipocloroso

H2O2Peróxido hidrógeno

O2Oxígeno singlete

ROOHPeróxidos orgánicosRADICALES

NO-RADICALES

TIPOS DE RADICALES LIBRES

ANIÓN SUPERÓXIDO

Una molécula de oxígeno que ha adquirido 1 electrón adicional.

HIDROXILO

Una molécula de oxígeno que ha adquirido 3 electrones y un protón adicional.

PERÓXIDO DE HIDRÓGENO

Radical superóxido que adquiere 2 electrones

PEROXILO

Molécula de oxígeno + radical carbono

LÍPIDOS

ADN

PROTEINASCARBOHIDRATOS

-

-

-

-

Moléculas diana de los radicales libres

LÍPIDOS

Los lípidos, especialmente los que contienen ácidos grasos poli-insaturados, son susceptibles a desarrollar procesos de oxidación no controlados, inducidos por radicales libres.

Ésto se traslada en daños significativos en las membranas celulares, desestabilizándolas y alterando todos los procesos bioquímicos celulares

LIPOPEROXIDACIÓN

ADN

Radicales libres

Molécula de ADN dañada

Radical libre neutralizado

Antioxidante

PROTEÍNAS

CARBOHIDRATOS

Los aminoácidos que forman proteínas pueden verse afectados por los ataques de los radicales, originando modificaciones que alteran su estructura impidiendo su acción biológica

La proporción de ataques es inferior, pero azúcares como la glucosa pueden reaccionar con radicales hidroxilo y originar sustancias reactivas.

Radicales libres

Antioxidantes

Peroxilo

SOD

Selenio

Vitamina E

Hidroperoxilo

Peroxilo

Hidroperoxilo

HidroxiloPeroxilo

ESTRÉS OXIDATIVO

CLASIFICACIÓN DE ANTIOXIDANTES

Podemos clasificar los antioxidantes en 4 grande grupos:

Enzimas antioxidantes (SOD, CAT…)

Antioxidantes de alto peso molecular (Albúmina, Ferritina…)

Antioxidantes de bajo peso molecular (Carotenoides, Ascórbico…)

Algunas hormonas (Angiotensina…)

MECANISMOS DE DEFENSA ENDÓGENOS

MECANISMOS DE DEFENSA EXÓGENOS

MECANISMOS DE DEFENSA ENDÓGENOS

(A) SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD)

Radical superóxido

(B) CATALASA (CAT)

Peróxido de hidrógeno

(C) GLUTATIÓN PEROXIDASA (GSH-Px) Y TRANSFERASA (GST)

Peróxido de hidrógeno

Oxígeno + agua

Protección frente al agua oxigenada y compuestos inestables

MECANISMOS DE DEFENSA EXÓGENOS

VITAMINA E (α-tocoferol)

VITAMINA C (ac. ascórbico)

β-CAROTENO (provitamina-A)

OLIGOELEMENTOS

FLAVONOIDES

LICOPENO

VITAMINA E (alfa-tocoferol)

Fuentes: Hortalizas, verduras, frutos secos, aceites (soja, girasol..), arroz integral, lentejas, mantequilla…

Captura radicales hidroxilo y aniones superóxido y neutraliza peróxido de hidrógeno

La vitamina E es un antioxidante natural que reacciona con RL solubles en lípidos de la membrana celular------------INTEGRIDAD

Cada molécula de Vitamina E es capaz de proteger 500 moléculas de fosfolípidos.

Actúa junto con otros sistemas antioxidantes: CAT, SOD

VITAMINA C (ácido ascórbico)

Fuentes: Frutas (cítricos), acelgas, tomates, perejil, coles …

•Captura radicales hidroxilo y aniones superóxido y neutraliza oxigeno singlete.

•Antioxidante hidrosoluble que figura en primera línea de defensa del plasma. Poderoso inhibidor de la oxidación de lípidos.

•Regenera la Vitamina E.

•El cuerpo no fabrica Vitamina C por si solo ni la almacena.

•Reacciona fácilmente con RL-s actuando como antioxidante y pasando el mismo a ser un radical ascorbilo, que rápidamente se descompone para producir ácido ascórbico y ácido dehidroascórbido.

BETA-CAROTENO

Fuentes: Vegetales de hojas verdes, verduras y frutas amarillas …

•Neutraliza oxigeno singlete.

•Es el carotenoide más abundante de la naturaleza y el más importante para la dieta humana.

•Al ser ingerido es transformado en vitamina A.

•Elimina los radicales libres y protege al ADN de su acción mutagénica.

•Pigmentos vegetales de coloración amarilla-naranja.

OLIGOELEMENTOS ( Cu/Zn/Mn/Se/Fe)

Fuentes: Se (ajo, cebollas, brócoli, lácteos, salmón …), Zn (pescados, carnes, legumbres, frutos secos, Mn (frutos secos, cereales, té, piña …), Cu (vísceras, frutos secos, cacao y derivados …)

Forman parte del núcleo activo de muchos antioxidantes:

SOD

GSH-Px El Se forma parte del núcleo activo de esta enzima.

Necesita Zn, Mn y Cu para poder eliminar radicales hidroxilo.

CAT El Fe constituye el núcleo activo de la catalasa.

FLAVONOIDES

•Pigmentos vegetales no nitrogenados.

•Metabolitos secundarios de las plantas.

Fuentes: ajo, cebolla, té, manzanas, peras , espinacas, naranjas, limones, pomelos …

•Se les atribuyen más de 5000 estructuras.

•Se emplean como colorantes naturales.

•Su efecto antioxidante reside tanto en su capacidad para secuestrar radicales como en su capacidad para formar quelatos con metales.

•La mayoría (catequínas) tienen una alta capacidad de neutralizar RL-s.

MECANISMOS DE ACCIÓN ANTIOXIDANTE

1-. Antioxidantes primarios o preventivos

Previenen la formación de nuevos RL, convirtiendo los RL-s existente en moléculas menos perjudiciales antes de que puedan reaccionar y generar así una mayor tasa de RL_s.

Este mecanismo de acción es el que emplean los antioxidantes de naturaleza enzimática (SOD, CAT, GSH-Px…)

2-. Antioxidantes secundarios “chain breaking”

Capturan los RL-s evitando así que se produzcan reacciones en cadena.

3-. Antioxidantes terciarios

Reparan biomoléculas dañadas por los ataques mediados por RL-s.

2-. MÉTODOS

MÉTODOS DETERMINACIÓN DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

11--. HAT (HYDROGEN ATOM TRANSFER) . HAT (HYDROGEN ATOM TRANSFER)

Generador sintético de radicales + Molécula oxidable que actúa como sonda + antioxidante.

ORAC/TRAP/CROCIN/LINOLEICO/CARS

Sustrato oxidable (sonda) + antioxidante ------------------sustrato oxidado

22--. ET (ELECTRON TRANSFER). ET (ELECTRON TRANSFER)

Sonda (oxidante) + e (antioxidante)---------------------sonda reducida + antioxidante oxidado

ABTS/DPPH/DMPD

MÉTODOS

ABTS-TEAC

DPPH

DMPD

ORAC

TEST COMPETICIÓN CINÉTICA

CARS

TOSC

ENSAYO LINOLÉICO

TRAP

B-CAROTENO

FRAP

VOLTAMETRÍA CÍCLICA

COBAS FARA

13

2

4

ABTS-TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) Miller & Rice-Evans 1993

• El compuesto cromógeno ABTS presenta color azul/verde con máximo de absorción a 342nm, es soluble en agua y disolventes orgánicos y químicamente estable.

• El radical ABTS·+ una vez generado por medio de enzimas o químicamente pasa a presentar nuevas características con máximos de absorción a 414, 645, 734 y 815nm.

Generación del radical catión ABTS

1-. En la generación por reacciones enzimáticas, el ABTS se incuba con peróxido de hidrógeno y con metamioglobina, hemoglobina o peroxidasa de rábano.

2-. En la generación por reacciones químicas, el ABTS se hace reaccionar con dióxido de manganeso, persulfato potásico, ABAP. Estas reacciones por lo general requieren tiempos largos de incubación o altas temperaturas.


INHIBICIÓN

DECOLORACIÓN

Los antioxidantes se añaden previamente a la generación del radical ABTS, y se determina la inhibición en la formación del radical, que se traduce en un retraso en la aparición de la coloración verde-azulada.

Los antioxidantes se añaden una vez formado el radical ABTS, y se determina la disminución de la absorbancia debida a la reducción del radical (decoloración)

Evita interferencias debidas a compuestos intermedios y evita una errónea estimación.

Interferencias: FALSOS RESULTADOS

• PEGA: el radical ABTS no se encuentra en nuestro organismo, por lo que representa una fuente no-fisiológica.

• Algunas reacciones requieren de un mayor tiempo para alcanzar el estado final.


• El radical generado químicamente (persulfatopotásico), fue validado por su estabilidad, reproducibilidad y por ser una alternativa mucho más viable económicamente al método anteriormente descrito.

ácido 2-2 azinobis –(3-etilbenzoatoazolin-6-sulfónico)

Radical catión ABTS·+

Persulfato potásico 16hOscuridad

Λ: 734 nm

AO-s

Reducción Radical catión ABTS·+

Decoloración y Disminución en la absorbancia

TROLOX

TEACµmol TROLOX/gµeq TROLOX/g

%AA

ENSAYO DPPH (C. Berset el al.) 1994

• Este método se basa en la reducción del radical DPPH por los antioxidantes de la muestra

• El radical es estable y tiene una coloración púrpura que se pierde progresivamente cuando se añade la muestra conteniendo sustancias antioxidantes. La decoloración del radical se determina a 515 nm y la cuantificación se realiza empleando soluciones patrón de ac. ascórbico o trolox.

En general la reacción se puede medir a los 2, 3, 4, 5 y 10 minutos del inicio, ya que en este intervalo, la mayoría de sustancias completan la reacción con el DPPH,.

VENTAJAS: El ensayo DPPH es un método rápido y sencillo, que no requiere de un equipamiento sofisticado. A diferencia del ensayo ABTS (TEAC), no es necesario generar el radical puesto que el DPPH se comercializa

ENSAYO DPPH (C. Berset el al.) 1994

Sólo puede disolverse en medio orgánico

No obstante, en algunos casos la interpretación resulta complicada, ya que algunos antioxidantes/moléculas pueden causar interferencias si poseen un espectro de absorción similar al DPPH .

carotenoides

2,2-Difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)

Radical anión DPPH.

Metanol

AO-s

Reducción Radical DPPH


Λ: 515 nm

AC. ASCÓRBICO

AEACµmol ac. ascórbico/gµeq ac. ascórbico/g

%AA

• Este método se basa en la reducción del radical catión DMPD por los antioxidantes de la muestra.

•La generación de este radical requiere un pHadecuado (5.25) y la adición de una solución de cloruro férrico.

• La absorbancia del radical se determina a 505 nmy los compuestos antioxidantes, una vez adicionados, son capaces de transferir un átomo de H+, provocando su decoloración (proporcional a su concentración).

•Sólo puede disolverse en medio acuoso.

DMPD ( Fogliano et al.) 1999

Dicloridrato de N,N-Dimetil-p-fenilendiamina (DMPD)

Radical catión DMPD·+

Cloruro férrico pH 5.25

Λ: 505 nm

AO-s

Reducción Radical catión DMPD·+


TROLOX


%AA

FRAP (ferric reducing activity/antioxidant power) Benzie & Strain 1996

• Determina la capacidad de la muestra para reducir un complejo de férrico con la molécula tripiridil s-triazina (TPTZ) a su forma ferrosa (pH bajo).

• De este modo se genera una coloración azul, de intensa proporcionalidad a la capacidad reductora de la muestra (se genera un complejo ferroso-TPTZ) que puede cuantificarse por colorimetría (593nm) en base a un patrón de sulfato ferroso.

La capacidad de reducir el hierro se considera un índice del poder antioxidante de la muestra.

Fe 3+ Fe 2+

FRAP (ferric reducing activity/antioxidant power) Benzie & Strain 1996

• El ensayo FRAP es sencillo y fácilmente automatizable. Es rápido, generalmente la reacción se completa entre 4 y 8 minutos.

• Sin embargo, en el caso de algunos polifenoles se han descrito reacciones más lentas, llegando incluso a requerir 30 minutos hasta completar la reducción del complejo.

La reacción no es específica, y por tanto, cualquier reacción con un potencial redox menos positivo originarála reducción del complejo Fe 3+-TPTZ.

Medir la capacidad reductora no significa medir la capacidad antioxidante

TPTZ (2,4,6-tri-(2 piridil)-s-triazina)

Fe3+

TPTZ-Fe 2+

Reducción

pH bajo

Coloración azulada

593 nm

Demuestra la presencia de un agente REDUCTOR

AO-sSULFATO FERROSO

µΜ Sulfato Ferroso/g

VOLTAMETRÍA CÍCLICA Kohen et al. 1997

• Este ensayo evalúa el poder reductor total de moléculas de bajo peso molecular.

• Una vez procesada la muestra se introduce en una celda donde se sitúan 3 electrodos: electrodo de trabajo, electrodo de referencia, y un electrodo auxiliar.

• Se aplica un potencial constante (100 mV/seg) al electrodo de trabajo, bien hacia el potencial positivo (con lo que evaluaremos agentes reductores) o hacia el potencial negativo (con lo que evaluaremos agentes oxidantes). Durante este proceso se monitoriza una curva de corriente (voltamograma cíclico).

VOLTAMETRÍA CÍCLICA Kohen et al. 1997

• Desventaja: no todos los antioxidantes donan sus electrones a cualquier electrodo de trabajo seleccionado. Se necesitan varios electrodos para determinar antioxidantes concretos: glutatión no se detectaría con este electrodo Au/Hg.

• La compuesto de referencia empleado en este ensayo suele ser el ácido ascórbico.

Unidades: AEAC (ascorbic acid equivalent antioxidant capacity)

CARS (Capacidad Atrapadora Radicales Superóxido) Benov et al. 1998

HE E+oxidación

λ exc:465nmλem: 585 nm

■ La hidroetidina (HE) se oxida dando lugar al compuesto fluorescente Etidio (E+) en presencia del radical anión superóxido (que puede ser añadido como KO2 o producido por activación de leucocitos).

■ Además la oxidación de HE es rápida cuando el oxidante el O2

- y no cuando intervienen O2, H2O2, HOCl, ONOO-. Por eso, este método se aplica como detector de O2

- intracelular).

■ La detección lúminogénica y cromogénica es propensa a generar radicales O2

-, dando lugar a falsos resultados.

CARS (Capacidad Atrapadora Radicales Superóxido) Benov et al. 1998

■ La tasa de radical producido no es proporcional a la tasa de producto fluorescente determinado, lo cual indica que no todo el radical generado está oxidando el HE.

Dismutación del O2-

Oxidación

HIDROETIDINA (EH)

ETIDIO (E+)

O2-

O2-O2-

O2-O2-O2-KO2

Activ. Leucocitos

Compuesto fluoresecnteΛexc: 465 nmΛem: 585 nm

O2-

O2-

O2-

O2-

O2-

(Dismutación)

Peróxido de hidrógeno y oxígeno molecular

TROLOX

AO-s


TOSC (Total oxyradical scavening capacity) Winston et al.1998

■ Oxidación del KMBA a etileno mediante la acción de radicales peroxilo generados a partir del AAPH. La formación de etileno (parcialmente inhibida por la presencia de antioxidantes) se monitoriza por GC.

KMBA ETILENOoxidación

AAPHROO.

■ Se cuantifica la inhibición que ejerce un antioxidante sobre la producción de etileno respecto a una reacción control.

TOSC (Total oxyradical scavening capacity) Winston et al.1998

Ventajas

► VERSATILIDAD ----- El KMBA presenta la propiedad de reaccionar con numerosos oxidantes que son capaces de transformarlo en etileno. Radicales hidroxilo, peroxilo y peroxinitrito.► Sistema de cuantificación.

Desventajas

► Se necesita un equipamiento muy específico (Cromatógrafo de gases).

Reacciones Fenton DescomposiciónAAPH

OH. OH.

OH.

OH.OH.

OH.

ROO.

ROO.

ROO. ROO.

ROO.

ONOO.

ONOO.

ONOO. ONOO.

ONOO.

KMBA

Etileno

OxidaciónAO trolox


•Este ensayo se basa en la oxidación del carotenoide crocinpor radicales peroxilos generados a partir del AAPH.

•La “decoloración” del crocin en ausencia (Vo) y en presencia (V) de antioxidantes se monitoriza durante 10 minutos a 443nm. La decoloración del carotenoide crocin debida a la interacción con radicales peroxilo, disminuye cuando se introduce otro antioxidante en el sistema.

Este método determina la habilidad de un antioxidante en competición con otro.

TEST COMPETICION CINÉTICA (Crocin) Tubaro et al.

TEST COMPETICION CINÉTICA (Crocin) Tubaro et al.

•Crocin es una mezcla de pigmentos vegetales extraídos a partir del azafrán, cuya composición esta sujeta a una variabilidad dependiente del lote de producción .

Dificulta su aplicación industrial en análisis cuantitativos.

•En algunos casos no queda claro si estamos ante una fase de retardo o un periodo de máxima protección del carotenoide crocin.

CAROTENOIDE CROCIN

AAPHROO.

ROO.

ROO.

ROO.

ROO.

OXIDACIÓN CAROTENOIDE CROCIN

443 nm

TROLOX

AO-s

Disminución en la absorbancia


LINÓLÉICO

• Este método induce artificialmente la oxidación del ácido linoleíco o LDL mediante la adición de Cu (II) o un azoiniciador (generalmente APPH).

• El progreso de la oxidación se monitoriza a 234 nm (longitud de onda a la cual la absorbancia de los peróxidos de dienoderivados de la oxidación del ac. Linoleico es máxima).

• La reacción se puede llevar a cabo en micelas o en disolventes orgánicos. En el primero de los casos la preparación de la muestra resulta mucho más compleja y además el progreso de la reacción no puede ser seguido directamente a través de un espectrofotómetro UV.

LINÓLÉICO

VENTAJAS

El uso de ácido linoleíco como sustrato acerca el ensayo a condiciones biológicas reales.

DESVENTAJAS

Existen numerosos compuestos orgánicos que absorben a 234nm (catecol y la hidroquinona reaccionan con radicales peroxilo para dar compuestos (0-quinona y p-quinona) con absorbancia a esa longitud de onda.

En presencia de agua el ac. Linoleico forma micelas, que complican el ensayo ya que la distribución de los compuestos se repartirá en dos fases.

β-CAROTENE BLEACHING TEST (Velioglu et al. 1998)

• Se basa en la capacidad de diversos extractos de disminuir la decoloración oxidativa del betacaroteno en una emulsión ácida de betacaroteno/linoleico.

• El ácido linoléico se oxida fácilmente en presencia de agua oxigenada y los radicales generados atacan el betacaroteno provocando su oxidación con la correspondiente perdida de absorbancia a 470 nm.

• Este ensayo esta indicado para compuestos liposolubles.

• El patrón utilizado suele ser Trolox o ác. Gálico.

Soluciónorgánica

Betacaroteno

Soluciónácido linoleico

Agua oxigenada

OH.OH.

OH.OH.HOO.

HOO.

Oxidación betacaroteno

50ºC2h.

Disminución en la absorbancia (decoloración)

470nm

TROLOXAO-s


GAEµeq AC. GÁLICO/g

TRAP (Total radical trapping power) Wayner et al. 1985

• Este ensayo emplea radicales peroxilo que se generan mediante la descomposición térmica de un compuesto hidrosoluble: ABAP

• Una vez adicionado a la muestra a estudio (plasma originariamente), la oxidación de las moléculas es monitorizada, mediante la determinación de oxígeno consumido.

•El periodo de inducción, en el que la oxidación se inhibe mediante la acción de los compuestos antioxidantes en la muestra, se compara con el generado por el Trolox en iguales condiciones.

MODIFICACIONES

(a) introducir en el ensayo un lípido que reaccionaba con los radicales peroxilo produciéndose una peroxidación..

(b) otra modificación introdujo una proteína (PE) en lugar del lípido como sustrato, que al mostrar señal fluorescente facilitaba la monitorización.

TRAP (Total radical trapping power) Wayner et al. 1985

Descomposición térmica del ABAP o AAPH

ROO.

ROO.

ROO.

ROO.

ROO.ROO.

ROO.

Muestra a estudio

Oxidación de moléculas oxidablesElectrodode oxígeno

Determinación del oxígeno consumido

37ºC

AO-s

TROLOX


ORAC (Oxygen radical absorbance capacity) Prior et al. 2005

• El ensayo ORAC usa como diana a una proteína (ficoeritrina: PE) que, por su sensibilidad, permite evaluar los pasos iniciales del proceso de oxidación.

• Este ensayo utiliza la proteína como un sustrato oxidable y AAPH como generador de radicales peroxilo o Cu2+/H2O2 como generador de radicales hidroxilos.

Si se emplea el cobre como generador de radicales, no podemos utilizar el trolox como Standard de referencia porque el mismo trolox puede interaccionar como pro-oxidante con el cobre.

Utiliza la técnica del área bajo la curva de descenso para la cuantificación (AUC). Por lo tanto combina tanto el porcentaje de inhibición como el periodo de inhibición a lo largo del tiempo producido por los antioxidantes a estudio.


A muestra- A blanco

Blanco

Muestra

Tiempo incubación (min)

Señal


VENTAJAS:

(a) El uso de una proteína como sustrato impide que el propio sustrato genere radicales libres debido a su oxidación.

(b) Sirve para determinar la capacidad de muestras acuosas y hidrofóbicas (simplemente cambiando la fuente generadora de radicales y el disolvente)

INCONVENIENTE: (a) Reside en la PE, que varía de lote a lote, no es fotoestable y puede “blanquearse” tras su exposición a una luz de excitación. (b) la PE es capaz de interaccionar con polifenoles dando lugar a valores erróneos.


Una modificación de este ensayo utiliza fluoresceína (no interacciona con polifenoles, es fotoestable y reduce los costes del experimento) como

sonda fluorescente en lugar de PE.

(c) El tiempo también es un factor limitante (1h: aunque esta pega ya ha sido solucionada a través de ensayos de alto rendimiento)

(d) El empleo de marcadores fluorescentes aumenta la sensibilidad del método pero implica disponibilidad de un fluorímetro.

Fluoresceina

AAPH H2O2/Cu 2+

ROO.ROO.

ROO.

ROO.ROO.

OH..OH..

OH..

OH..OH..

OH..

Oxidación de la fluoresceina

λ exc:484nmλem: 515 nm

Disminución en la fluorescencia

TROLOXAO-s

ORACOxygen radical Absorbance

capacity

COBAS FARA

• Ensayo ORAC automatizado mediante espectrofluorímetro denominado COBAS FARA II (La Roche), que emplea diferentes filtros fluorescentes.

• Mediante una pipeta robotizada dispensa la muestra en diferentes pocillos, centrifuga mezcla e incuba. Determina la capacidad de la muestra para protegerse frente al ataque de los radicales.

• Este aparato emplea una fuente que genera radicales peroxilo, uno de los radicales más comunes.

• Utiliza el trolox a modo de control. Recoge medidas cada 2 minutos una vez añadida la muestra.

• Se mide la capacidad antioxidante total de la muestra (antioxidantes de rápida, media y larga actuación).

HidrosolubleuM sulfato ferroso/gFRAP

HidrosolubleAA%VOLTAMETRÍA CÍCLICA

LiposolubleTEAC, AA%B-CAROTENO

LiposolubleTEAC, AA%LINOLEICO

HidrosolubleTEAC, AA%TEST. COMP. CINÉTICA

HidrosolubleTEAC, AA%CARS

HidrosolubleTEAC, GAE, AA%TOSC

HidrosolubleLiposoluble

Umol peroxil radical trapped/L

TRAP

Liposoluble-hidrosoluble

ORACORAC

HidrosolubleTEAC umol trolox/g. AA%DMPD

LiposolubleAE mg (ueq) ac. Ascórbico/g

TEAC mg (ueq) trolox/g. AA%

DPPH

Liposoluble-hidrosoluble

TEAC umol trolox/g AA%ABTS-TEAC

MatrizUnidadesMétodo

Vegetales, zumos, bebidas alcohólicasFRAP

VinoVOLTAMETRÍA CÍCLICA

Aceite oliva, frutas, vegetales, alimentos integrales

B-CAROTENO

Aceites, LINOLEICO

VinoTEST. COMP. CINÉTICA

Ajo, plantasCARS

Frutas, zumosTOSC

Vino, té, fruta, bebidas alcohólicasTRAP

Frutas, vegetales, frutos secos, cereales, chocolate, bebidas alcohólicas, zumos

ORAC

Vino, vegetales, té, frutasDMPD

Fruta, vegetales, aceites, bebidas alcohólicas, polifenoles

DPPH

Aceite, vegetales, vino, zumos, frutas, bebidas alcohólicas

ABTS-TEAC

AlimentosMétodo

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

OR

AC

Ciru

ela

pasa

Pas

as

Zar

zam

ora

Fre

sa

Fra

mbu

esa

Nar

anja

s

Uva

s

Cer

eza

Kiw

i

Pom

elo

Esp

inac

as

Col

es

Bró

coli

Rem

olac

ha

Pim

ient

os r

ojos

Ceb

olla

Mai

z

Ber

enje

na

Tom

ate

Zan

ahor

ia

Pat

atas

Vin

o tin

to

Té

verd

e

Man

zana

Ban

ana

Mel

ocot

ón

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE ALIMENTOS

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

OR

AC

Cacao Chocolate negro Chocolate conleche

Moltes gràcies

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