vibrio harveyi, una amenaza para las piscifactorías del sur de la península ibérica:...

Prácticas de M.T.E. en Microbiología

Interacción Pez – Bacteria

C. Gallardo, D.L. Márquez, J. Almagro, L. Cerón, A. Cruz, F. Codes, D. López, A. Alves, N. Perea, R. Gómez, J. Moreno,

M. Fontiveros e I. Pla.

Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Universidad de Málaga 29071

Introducción

Solea senegalensis

Introducción

Vibrio harveyi

Análisis de la capacidad hemolítica Introducción

Evidencias experimentales sugieren que las hemolisinas podrían ser uno de los factores de mayor importancia en el desarrollo de

las enfermedades .

Análisis de la capacidad hemolítica Metodología

y 24 h adicionales a 37º C

Análisis de la capacidad hemolítica Resultados

No aparecieron indicios de degradación

Análisis de la capacidad hemolítica Discusión

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Introducción

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Introducción

Ocho especies de algas fueron recolectadas:

Jania rubens

Faro de Calaburra 36°30'23.03"N, 4°38'39.78"W

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Introducción

Procedimiento experimental

Co-cultivo de Dyctiota dichotoma

Efecto de extractos de macroalgas

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Introducción Co-cultivo de Dyctiota dichotoma

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Metodología Co-cultivo de Dyctiota dichotoma

Resuspensión de V. harveyi en solución

salina a concentración aproximada de 108

UFC/mL

Standards de McFarland (0.5, 1 y 2)

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Metodología Co-cultivo de Dyctiota dichotoma

0,2 mL de solución bacteriana

+ 200 mL de agua de mar

+ 4 g del alga

0,2 mL de solución bacteriana

+ 200 mL de agua de mar

Muestra problema

Muestra control

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Metodología Co-cultivo de Dyctiota dichotoma

Estimación de bacterias cultivables

mediante titulación en placa

Toma de muestras de dilución a tiempo 0, a las 24 y a las 48 horas

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Resultados Co-cultivo de Dyctiota dichotoma

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Discusión Co-cultivo de Dyctiota dichotoma

Descenso del 85,47% en el número de vibrios en el co-cultivo frente al descenso del 30% registrado en el control

Incorporación al medio de cultivo de vibrios exógenos algunos de los cuales podrían corresponder a V. alginolíticus

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Introducción Efecto de extractos de macroalgas

Corallina officinalis Jania rubens Halopteris filicina Ulva rigida

Cladophora dalmática Cystoseira tamariscifolia Osmundea pinnatifida

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Metodología Efecto de extractos de macroalgas

Estimación de bacterias cultivables

mediante titulación en placa

Toma de muestras de dilución a tiempo 0, a las 24 y a las 48 horas

Obtención de extractos hidrofóbicos e hidrofílicos

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Metodología Efecto de extractos de macroalgas

Obtención de extractos hidrofóbicos e hidrofílicos

Los extractos hidrofóbicos se obtuvieron macerando 0,2 g de alga en 10 mL de acetona

Los extractos hidrofílicos se obtuvieron macerando

0,2 g de alga en 10 mL de solución salina

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Resultados Efecto de extractos de macroalgas

Extractos hidrofóbicos

Extractos hidrofílicos

En ningún

caso se apreció halo de inhibición

Producción de antimicrobianos por macroalgas

Discusión Efecto de extractos de macroalgas

De acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo, ninguno de las especies analizadas presenta compuestos con actividad antimicrobiana frente a V. harveyi

La actividad antibacteriana se encuentre enmascarada por la presencia de algunos compuestos inhibidores en los extractos

El método de extracción también puede haber afectado al grado de susceptibilidad

Capacidad antimicrobiana de Chlorella

Introducción

Capacidad antimicrobiana de Chlorella

Metodología

Estimación de la concentración de Chlorella

Capacidad antimicrobiana de Chlorella

Metodología

Sembrado de V.harveyi en césped

Realización de perforaciones (técnica well-in agar)

Capacidad antimicrobiana de Chlorella

Metodología

Lisado de Chlorella por ultrasonido

Capacidad antimicrobiana de Chlorella

Metodología

Chlorella intacta Chlorella lisada

Capacidad antimicrobiana de Chlorella

Resultados

Los resultados obtenidos fueron negativos en ambos tratamientos

Chlorella sonicada Chlorella no sonicada

Capacidad antimicrobiana de Chlorella

Discusión

La cepa de Chlorella empleada no produce

sustancias antimicrobianas frente a V. harveyi Es posible que ejerza su acción beneficiosa a través

de otros mecanismos

Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

Introducción

Copépodos Rotíferos

Artémias

Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

Metodología

Cocción durante 10 minutos

Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

Metodología

Exoesqueletos limpios

Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

Metodología

Desmineralización Incubación en HCl 1N durante 2 horas

Exoesqueletos limpios

Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

Metodología

Desmineralización Incubación en HCl 1N durante 2 horas

Desproteinización Incubación en NaOH 15% a 65ºC durante 3 horas

Lavado con dH2O y filtrado

Exoesqueletos limpios

Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

Metodología

Desmineralización Incubación en HCl 1N durante 2 horas

Desproteinización Incubación en NaOH 15% a 65ºC durante 3 horas

Quitina purificada

Lavado con dH2O y filtrado

Lavado con dH2O y filtrado

Exoesqueletos limpios

Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

Metodología

Quitina purificada

Resuspensión en dH2O

Centrifugado

Liofilización

Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

Metodología

Tabla 2. Componentes del agar para la

quitina

Componente Concentración

Sulfato amónico 1 g/L

Dihidrofosfato potásico 0,2 g/L

Monohidrofosfato potásico 1,6 g/L

Sulfato magnésico heptahidratado 0,2 g/L

Cloruro sódico 0,1 g/L

Sulfato de hierro heptahidratado 0,01 g/L

Cloruro cálcico dihidratado 0,02 g/L

Peptonas 15 g/L

Preparación del medio base de acuerdo con Furukawa et al. (1978)

Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

Metodología

0,3 g de quitina en 10 mL de medio base

Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

Metodología

Sonicación A 10 m de longitud, dos ciclos a 50 Hzs y un ciclo a 85 Hzs

0,3 g de quitina en 10 mL de medio base

Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

Metodología

Sonicación A 10 m de longitud, dos ciclos a 50 Hzs y un ciclo a 85 Hzs

0,3 g de quitina en 10 mL de medio base

Esterilización en autoclave 121º C durante 15 min

Adición del agar 1,5 % p/v

Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

Metodología

Sonicación A 10 m de longitud, dos ciclos a 50 Hzs y un ciclo a 85 Hzs

0,3 g de quitina en 10 mL de medio base

Esterilización en autoclave 121º C durante 15 min

Vertido de las placas y siembra de las bacterias

Adición del agar 1,5 % p/v

Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

Resultados

Placa a 72 h Placa a 0 h

Análisis de la capacidad quitinasa de V. harveyi

Discusión

La confirmación de la capacidad quitinasa de la

cepa de V. harveyi aislada puede ser determinante a la hora de prevenir futuras

reapariciones de la enfermedad

Producción de sustancias bioactivas por cepas probióticas

Introducción

De acuerdo con la FAO/WHO:

“Un organismo probiótico es un microorganismo vivo que cuando es suministrado en cantidades adecuadas

confiere un beneficio sobre la salud en el huésped”

Producción de sustancias bioactivas por cepas probióticas

Metodología

Se emplearon ocho cepas potencialmente probióticas

DCF 12.2.14/3

DCF 12.1.14/3

DCF 12.10.14/3

DCF 12.4.14/3

DCF 12.9

P12.14/2

P15.14/3

Vibrio fisheri 14/3

Producción de sustancias bioactivas por cepas probióticas

Metodología

Cultivo primario

Caldo de cultivo 2 mL de solución salina +

masa bacteriana

Placas de medio TSA

Inoculación en pocillos

Producción de sustancias bioactivas por cepas probióticas

Resultados

Los resultados obtenidos fueron positivos

Producción de sustancias bioactivas por cepas probióticas

Resultados

Diámetro (cm)

Producción de sustancias bioactivas por cepas probióticas

Discusión

El empleo de probióticos ofrece una alternativa adecuada

para el control de patógenos en instalaciones acuícolas

La cepa DCF 12.10 se postula como la más prometedora

Son necesarios estudios adicionales para contrastar la utilidad in vivo

No es posible desechar la posible utilidad como organismos probióticos de aquellas cepas que no han dado lugar a halos de inhibición

Conclusiones La actividad hemolisina no es un marcador adecuado para la

identificación de las cepas virulentas de V. harveyi

El empleo de Dictyota dichotoma en piscifactorías se postula como una estrategia eficiente para combatir a V. harveyi

Ninguna de los extractos de las macroalgas presenta compuestos con actividad antibiótica frente a V. harveyi bajo las condiciones empleadas

Chlorella no produce compuestos bioactivos frente a V. harveyi

Los organismos quitinosos son potenciales reservorios de V. harveyi

Las cepas probióticas DCF 12.2.14/3, DCF 12.4.14/3, DCF 12.9 y DCF 12.10.14/3 ofrecen enormes posibilidades para prevenir los

brotes de V. harveyi