universidad interamericana de puerto rico recinto de ... · primeros trabajos en el campo de la...

Profesora: Sullymar Morales Marrero

Biotecnología Molecular

Universidad Interamericana de Puerto Rico

Recinto de Brranquitas

Departamento de Ciencias y Tecnología

Objetivos (Todos estos fueron cumplidos en el laboratorio)

Definir que son los plásmidos.

Diferenciar entre un plásmido y un vector.

Mencionar los tipos de plásmidos naturales

existentes.

Mencionar mecanismos de transformaciónnaturales y compararlos con los realizados en el

laboratorio.

Mencionar las partes importantes de los

plásmidos sintetizados.

Objetivos Enzimas de restricción

Características generales

Nomenclatura

Tipos I, II y III

Ejemplos

Palíndrome

Extremos cohesivos (5’overhang, 3’overhang) y chatos

Degenerate sequences

Isoschizomers, neoschizomers , isocaudomers

Metilación del DNA

Requerimientos (Magnesio, BSA, Temperatura, pH, tiempo)

Inactivación de la enzima

Star activity

Mapa de restricción

Objetivos

Vectores de clonación

Plásmidos (plasmidios)

Conformaciones

High and low copy number

Narrow and broad host-range

Orígenes de replicación (bacterias, células

mamíferas)

Genes de selección (bacterias, células mamíferas)

Genes reporteros (bacterias, células eucariotas)

Multiple cloning site

Shuttle vector

Lo mismo

La tecnología del ADN

recombinante

Clonacióndel gen

ClonaciónMolecular

Incorpora una serie de protocolos

experimentales que conducen a la

transferencia de la información

genética de un organismo a otro

Formato básico de los experimentos para tecnología del

DNA recombinante

El ADN extraído (clonar, insertar, target o extranjero)

Se debe fragmentar enzimáticamente

Unido a otra entidad de ADN para formar una nueva molécula recombinante

Molécula recombinante se transfiere y se mantiene en una célula huésped

Las células transformadas se identifican y se seleccionan de los que no lo hacen

Construcción de ADN se puede crear de modo que el producto proteico codifique

Clonación del gen

Quieres copias de un gen para el estudio o para ser

utilizado.

Obtener una gran cantidad de genes de mRNA o

productos de proteína.

Tecnología de DNA recombinate -

Enzimas de restricción

Clonacióndel gen

Vector Enzimas

http://boletin.inmegen.gob.mx/boletin1/mundogen.html

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Tecnología del DNA recombinante

Desarrollado a partir de los descubrimientos de la biología molecular, ácidos nucleicos.

También por la genética molecular (bacteriófagos y plasmidos). Enzimología y los ácido núcleos,

La genética molecular de los dos bacteriófagos y plásmidos.

No existiría sin la disponibilidad de enzimas que reconocen secuencias específicas de DNA de doble hebra cortan el dsDNA en ambas cadenas en estas secuencias.

Las enzimas de restricción o endonucleasas, exonucleasas de restricción.

Endonucleasas = nucleasas que cortan el acido nucleico

internamente. Cortan dentro de las secuencias (Internamente).

Exonucleasa = degrada el acido nucleico fuera de estructuras.

Cortan en los extremos de la secuencia.

Enzimas de restricción

Endonucleasas reconocen secuencias de DNA (sitio de restricción)

Rompen enlaces fosfodiester en ambas hebras.

Son extraídas de bacterias, donde actúan como mecanismo de defensapara degradar material genético extraño que entre en la célula.

Bacterias metilan su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNAextraño y el DNA propio.

No cortan DNA metilado

Algunas enzimas cortan DNA metilado (DpnI)

Mecanismo de protección de su DNA

Nomenclatura

EcoRI: E = género Escherichia.

co = especie coli

R = cepa RV 13

I = primera endonucleasaaislada de esta cepa

Ejemplos de enzimas de restricción utilizadas en la Tecnología del DNA

Recombinate nombradas por el sustrato que utilizan.

Nomenclatura Enzimas naturales – Se tiene en consideración el

organismo en donde se consiguió y el orden de este proceso.

Enzimas nombradas por el sustrato - Se tiene en consideración el sustrato que utilizan para ser nombradas.

Enzimas putativas – Identificada con la «P» después del numero Romano. Ejemplo: HindIP

Enzimas sintéticas – designado por tres letras que indican el microorganismo y la unión de nombres o números romanos que indiquen la recombinación genética que se obtuvo de las enzimas naturales.

Ejemplo: EcoDR2 provenientes de cepas de E. coli que producen naturalmente estas enzimas: EcoR124Iy EcoDXXI.

Que es palíndrome

La secuencia que reconocen es una secuencia

palindrómica (secuencia que se lee igual en ambas

direcciones).

Secuencias asimétrica

Sistema/Ejemplo Secuencia

reconocida

Sitio de hidrólisis

Tipo II

EcoRI

Palíndrome

5’ GAATTC 3’

3’ CTTAAG 5’

5’ G^ AATTC 3

3’ CTTAA ^G 5’

Tipo IIS

HphI

Asimétrica

5´ GGTGA 3

3´ CCACT 5’

5´ GGTGANNNNNNNN^ 3’

3´ CCACTNNNNNNN^ 5’

Enzimas de restricción

Para clonar el ADN se corta en sitios específicos, que son reconocidos y escindidos por enzimas específicas.

Las enzimas de restricción

Reconocer secuencias cortas de ADN de doble cadena como objetivos para la escisión.

Reconocer diferentes, pero específicos secuencias, cada que van de 4-8 pares de bases.

Las enzimas se nombran con una letra 3 (o 4 letras) abreviatura que identifica su origen.

En función de los diferentes modos de acción, las enzimas de restricción se han clasificado en tres categorías principalesTipo I, Tipo II, Tipo III.

Tipos Enzimas de Restricción

Tipo I

Una sola enzima (multimérica, posee 3 subunidades) reconoce secuencias específicas de DNA, metila y restringe.

Restricción no ocurre en el lugar de reconocimiento, sino que es al azar y en lugares distantes al de reconocimiento.

Requieren ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

Tipo I

Requerir ATP, S-adenosilmetionina

(SAM) y los iones de magnesio (Mg2 +)

para la actividad.

Compuesta de 3 subunidades

Sitio de reconocimiento de DNA

Modificación

Restricción

Tipo I

Cortan el ADN al azar lejos de sus secuencias de

reconocimiento. Originalmente se pensaba que eran raras,

ahora se sabe que a partir del análisis de los genomas

secuenciados que son comunes.

Las enzimas son de considerable interés bioquímico, pero

tienen poco valor práctico (aunque en nuevos

descubrimientos se le han brindado un nuevo interés por esta

línea).

No producen fragmentos de restricción discretas o patrones

de gel de bandas son distintas.

Enzimas diferentes, realizan la restricción y modificación.

La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento o adyacente y

permite romper el DNA en lugares específicos, y así, recuperar

secuencias conocidas.

Ellos producen fragmentos de restricción y patrones de bandas en

gel distintos, y son la clase de enzima mas frecuente utilizada en el

laboratorio para análisis de ADN y clonación de genes.

En lugar de formar una sola familia de proteínas relacionadas, las

enzimas tipo II son una colección de proteínas no relacionadas de

muchos tipos diferentes.

Sólo requieren Mg++ como cofactor.

Utilizadas en clonación de genes.

> 2,300 endonucleasas de restricción.

Tipo II

Dependiendo de las desviaciones sobre

la base de las características de enzimas

de tipo II, un número de subdivisiones se

han hecho:

Secuencias degeneradas

Endonucleasas de restricción de tipo II (REases)

reconocen secuencias específicas de ADN

(normalmente 4-8 pb de longitud) y se unirá ellos en

posiciones específicas dentro o cerca de su sitio de

reconocimiento.

La mayoría de los enzimas de restricción reconocen

fielmente un sitio diana único en el ADN (por ejemplo,

EcoRI se une a GAATTC) y discrimina contra otras

secuencias con una especificidad extrema (factor de

discriminación).

Secuencias degeneradas

Sin embargo, un número significativo de REases es capazde interactuar con secuencias de reconocimientodegenerados lo que significa que más de una base se permite en una posición particular del sitio diana.

Ejemplo:

Por ejemplo, la enzima de restricción Bse634I termófiloreconoce secuencia

R / CCGGY,

donde Y (pirimidina) significa 'C o T',

R (purina) significa 'A o G',

'/' indica la posición de división

Secuencia degeneradas

Los mecanismos moleculares que permiten la escisión

REase en varios sitios diana alternativos, pero impiden el

corte en secuencias de ADN no afines, aún no se

entienden completamente.

Si se logra descifrar estos mecanismos puede revelar

nuevas estrategias para lograr la ingeniería de nucleasas

altamente específicas que se dirigen a sitios únicos en el

genoma.

Subtipos de enzimas II

Tipo III

Las enzimas son también enzimas de restricción y de modificación.

Se escinden fuera de sus secuencias de reconocimiento y requieren dos de tales secuencias en orientaciones opuestas dentro de la misma molécula de ADN para llevar a cabo la escisión; rara vez dan digestiones completas.

Tiene dos subunidades diferentes

M - responsable del reconocimiento y modificación de las secuencias de ADN.

R - responsable de la acción nucleasa

**Requiere iones de magnesio y es estimulada por SAM

Tipos de enzimas

Las enzimas de restricción al cortar DNA pueden

producir dos tipos de cortes:

Cohesivos o pegajosos: cortan a manera escalonada

en dos puntos diferentes.

Abruptos, chatos o truncados: cortan en un sólo

punto.

Tipos de corte

Secuencias isoschizomeros

Neoschizomeros

Isocaudomeros

Hidrolisis enzimática

ocurre por:

Fosfodiesterasa específica

metiltransferasa

Fosfodiesterasa

Ejemplo: metiltransferasa

Consecuencia: Es que la enzima no

generará el corte en la hebra metilada.

Si se le cambia las condiciones

Bases Teóricas de enzimas de restricción

La actividad de las enzimas de restricción depende de unas condiciones precisas :

Pureza del DNA

pH y Temperatura

DNAsas

Contaminantes con carga (-)

Concentración de sal

Iones – (cofactores, magnesio)

BSA – captador de iones (estabiliza enzimas y los hace más resistente a la inactivación por calor).

Una unidad enzimática (U) se define como la cantidad de una enzima requerida para digerir 1 ug de DNA bajo condiciones óptimas:

3-5 U/ug de DNA genómico

1 U/ug de DNA plásmido

Cofactores

Un cofactor es una molécula químicamente diferente a la enzima, que está unida a esta y es necesaria para que ésta pueda tener una actividad catalítica.

Existen tres tipos:

Coenzimas - Una coenzima es una molécula pequeña que está químicamente unida a la enzima y es necesaria para su función catalítica, ya que forma parte de su sitio activo, el lugar de la enzima que realiza la reacción.

grupos prostéticos - Un grupo prostético es una molécula con características químicas diferentes a la enzima (como una coenzima), que está unida a ella, pero que no participa como parte del sitio activo.

iones metálicos – Magnesio

¿Cómo se inactiva la enzima?

Factores químicos

Factores físicos

Restriction

Endonucleases

Video

Qué es star activity

Se ha demostrado que bajo ciertas condiciones

no estándar, las endonucleasas de restricción son

capaces de escindir secuencias que son similares, pero no idénticas a su secuencia de

reconocimiento definido.

Esta capacidad alterada o relajado es la que se

conoce como star activity.

Se ha sugerido que la star activity puede ser una

propiedad general de las endonucleasas de

restricción que en condiciones extremas cortan sitios no canónicos.

Condiciones que contribuyen a la

star activity

1. Alta concentración de glicerol [>5%v/v]

2. Altas unidades con relación a los µg DNA [varia

con cada enzima, normalmente >100unidades/µg]

3. Fuerza iónica baja [<25mM]

4. Alto pH [>pH8.0]

5. Presencia de solventes orgánicos [DMSO,

ethanol, ethylene glycol, dimethylacetamide,

dimethylformamide, sulphalane]

6. La sustitución de Mg++ con otros cationes

divalentes [Mn++, Cu++, Co++, Zn++]

Maneras de disminuir o

inhibir la star activity Utilizar menor número de unidades como sea

posible para conseguir una digestión completa. Esto reduce el overdigestion y reduce la concentración de glicerol final en la reacción.

Asegurase de que la reacción este libre de solventes orgánicos tales como alcoholes que pudieran estar presentes en la preparación del DNA.

Eleve la fuerza ionica del buffer a 100 – 150mM (siempre que la enzima no es inhibida por el alto contenido de sal).

Baje el pH a 7.0

Utilice el Mg++ como catión divalente y evite la presencia de los demás.

Metilación del DNA

El ADN metilado se refiere a hebras de DNA que contienen bases de nucleótidos modificados por contener un grupo metilo (-CH3).

Primeros trabajos en el campo de la metilación del ADN se centraron en el estudio de la restricción - sistema de modificación, y el mecanismo de protección genoma del bacteriano.

Existen reportes a finales de los 1960 que se purificó una entidad capaz de producir 5 metil citosina en células de mamífero.

Metilación de DNA

Luego de dos décadas se informó una metiltransferasamurina clonada (1988)

Desde las bacterias hasta los seres humanos, las methyltransferasa son altamente conservadas durante la evolución, y por lo tanto sólo son considerado como reguladores importantes de una variedad de aspectos de la función celular.

Existen tres metiltransferasas: N4 - metiladenina, N5 -metiladenina y C5 - metilcitosina

Metilación de DNA Mamalia vs Bacteria

Bacteria

• Existen tres metiltransferasas: N4 - metiladenina, N5 - metiladenina y C5 - metilcitosina

Mamíferos

• Sólo un tipo de DNA metiltransferasa se conoce en células de mamífero, 5 – metilcitosina. Transfiere el grupo metilo a la posición 5 de la citosina dentro de la secuencia de reconocimiento del dinucleótido CpG.

Metilación de DNA

Metilación relacionada con las

endonucleasas (sintéticos)

Las cepas de E. coli de laboratorio contiene tres metilasa de ADN específica de sitio.

La metilasa codificada al gen presa (Dam) –transfiere un grupo metilo de SAM a la posición N6 de los residuos de Adenina en la secuencia GATC.

La metilasa Dcm (codifica para el gen DCM0 Existen tres metiltransferasas: N4 - metiladenina, N5 - metiladenina y C5 – metilcitosina. Metila los residuos de citosina internos en el CCAGG y en CCTGG en la posición C5.

Metilasa Eco KI – modifica residuos de adenina en la secuencia AAC (N6) GTGC y GCAC (N6).

Comparación de

frecuencia de metilación

Metilasa Eco KI – modifica residuos GTT ( ̴ 1 sitio por 8Kb) son menos comunes que los otros dos.

Dam ( ̴ 1 sitio por 256pb)

Dcm ( ̴ 1 sitio por 512pb)

Aleatoriamente

Importancia de estas metilasas:

1. Algunos sitios para una endonucleasa pueden

ser resistente a la escisión cuando se aísla a partir

de cepas que expresan estos genes.

2. Puede afectar la frecuencia de

transformación. (Se ha demostrado que la

iniciación de la replicación se suprime).

Enzimas

Ejemplo: EcoRI

https://www.neb.com/products/r0101-ecori

Vectores

DNA extracromosomal

Autorepicable

Primer vector sintetizado - Cohen y Boyer

sintetizaron el primer plásmido cortando dos

plásmidos naturales con la enzima EcoRI y

ligando los mismos este fue llamado pSC101. En el

1980 le concedieron las patentes.

Plásmido pBR322

Construida en 1974, fue uno de los primeros plásmidos modificados genéticamente para ser usado en técnicas de ADN recombinante.

Estos principios fueron a menudo los vectores de bajo número de copias, lo que significa que se replican para producir sólo una o dos copias en cada célula.

Derivado pUC18 de pBR322 tiene un "alto número de copias" plásmido (> 500 copias por célula bacteriana).

Características prácticas de los

vectores de clonación del DNA

Tamaño – deberían ser lo suficientemente

pequeños como para que se puedan separar

fácilmente del DNA cromosómico de la bacteria hospedera.

Origen de replicación (ori) – lugar de replicación

de forma separada a los cromosomas.

Se conoce al número de plásmidos que hay en una

célula .

El número normal es pequeño (menor de 12

plásmidos). Plásmido de baja copias.

Alto número de copias (cientos de miles de copias de

plásmidos por células).

Características prácticas de los

vectores de clonación del DNA

Sitio de clonación – MCS posee secuencias de

reconocimiento para varias enzimas de

restricción. Este lugar se genera para que no se pierda un gen sino que el plásmido circular se

vuelve lineal cuando digiere permitiendo la

inserción de un fragmento de interés.

Genes marcadores – permiten la selección e

identificación de las células transformadas

mediante un plásmido recombinante de aquellas

que no lo están. Ejemplos amp, tet,lacZ.

Recombinant Selection:

Resistances Genes

Características prácticas de los

vectores de clonación del DNA

Secuencias del promotor de RNA – permite la

transcripción in vivo e in vitro por la RNA

polimerasa

Secuencias de cebadores – estos permite la

secuenciación de nucleótidos de fragmentos de

DNA clonado que hayan sido insertados al

plásmidos.

Plasmid must have:

Plásmido pUC

1982, de desarrollar nuevas series de

plásmidos

Identificación de ADN extraño que

contiene células

**Tienen tres característica importante:

Alto número de copias

Azul - blanco selección

Polilinker

pUC19 Restriction Map

pUC19 Multiple Cloning

Site

Continuará

References

Glick, B. R. & Pasternack, J.J (2010). Molecular biotechnology: Principles and application of recombinant DNA. 4th ed. USA: American Society for Microbiology.

Lodge, J., Lund, P.A. & Minchin,S. (c2007). Gene cloning (electronic resource): principles and applications.New York ; Abingdon [England] : Taylor & Francis Group, c2007. Retrieved from http://www.netLibrary.com/urlapi.asp?action=summary&v=1&bookid=184298

Reece, R.J. (2004). Analysis of Genes and Genomes. España; John Wiley & Sons