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Profesora: Sullymar Morales Marrero
Biotecnología Molecular
Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Brranquitas
Departamento de Ciencias y Tecnología
Objetivos (Todos estos fueron cumplidos en el laboratorio)
Definir que son los plásmidos.
Diferenciar entre un plásmido y un vector.
Mencionar los tipos de plásmidos naturales
existentes.
Mencionar mecanismos de transformaciónnaturales y compararlos con los realizados en el
laboratorio.
Mencionar las partes importantes de los
plásmidos sintetizados.
Objetivos Enzimas de restricción
Características generales
Nomenclatura
Tipos I, II y III
Ejemplos
Palíndrome
Extremos cohesivos (5’overhang, 3’overhang) y chatos
Degenerate sequences
Isoschizomers, neoschizomers , isocaudomers
Metilación del DNA
Requerimientos (Magnesio, BSA, Temperatura, pH, tiempo)
Inactivación de la enzima
Star activity
Mapa de restricción
Objetivos
Vectores de clonación
Plásmidos (plasmidios)
Conformaciones
High and low copy number
Narrow and broad host-range
Orígenes de replicación (bacterias, células
mamíferas)
Genes de selección (bacterias, células mamíferas)
Genes reporteros (bacterias, células eucariotas)
Multiple cloning site
Shuttle vector
Lo mismo
La tecnología del ADN
recombinante
Clonacióndel gen
ClonaciónMolecular
Incorpora una serie de protocolos
experimentales que conducen a la
transferencia de la información
genética de un organismo a otro
Formato básico de los experimentos para tecnología del
DNA recombinante
El ADN extraído (clonar, insertar, target o extranjero)
Se debe fragmentar enzimáticamente
Unido a otra entidad de ADN para formar una nueva molécula recombinante
Molécula recombinante se transfiere y se mantiene en una célula huésped
Las células transformadas se identifican y se seleccionan de los que no lo hacen
Construcción de ADN se puede crear de modo que el producto proteico codifique
Clonación del gen
Quieres copias de un gen para el estudio o para ser
utilizado.
Obtener una gran cantidad de genes de mRNA o
productos de proteína.
Tecnología de DNA recombinate -
Enzimas de restricción
Clonacióndel gen
Vector Enzimas
http://boletin.inmegen.gob.mx/boletin1/mundogen.html
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Tecnología del DNA recombinante
Desarrollado a partir de los descubrimientos de la biología molecular, ácidos nucleicos.
También por la genética molecular (bacteriófagos y plasmidos). Enzimología y los ácido núcleos,
La genética molecular de los dos bacteriófagos y plásmidos.
No existiría sin la disponibilidad de enzimas que reconocen secuencias específicas de DNA de doble hebra cortan el dsDNA en ambas cadenas en estas secuencias.
Las enzimas de restricción o endonucleasas, exonucleasas de restricción.
Endonucleasas = nucleasas que cortan el acido nucleico
internamente. Cortan dentro de las secuencias (Internamente).
Exonucleasa = degrada el acido nucleico fuera de estructuras.
Cortan en los extremos de la secuencia.
Enzimas de restricción
Endonucleasas reconocen secuencias de DNA (sitio de restricción)
Rompen enlaces fosfodiester en ambas hebras.
Son extraídas de bacterias, donde actúan como mecanismo de defensapara degradar material genético extraño que entre en la célula.
Bacterias metilan su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNAextraño y el DNA propio.
No cortan DNA metilado
Algunas enzimas cortan DNA metilado (DpnI)
Mecanismo de protección de su DNA
Nomenclatura
EcoRI: E = género Escherichia.
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasaaislada de esta cepa
Ejemplos de enzimas de restricción utilizadas en la Tecnología del DNA
Recombinate nombradas por el sustrato que utilizan.
Nomenclatura Enzimas naturales – Se tiene en consideración el
organismo en donde se consiguió y el orden de este proceso.
Enzimas nombradas por el sustrato - Se tiene en consideración el sustrato que utilizan para ser nombradas.
Enzimas putativas – Identificada con la «P» después del numero Romano. Ejemplo: HindIP
Enzimas sintéticas – designado por tres letras que indican el microorganismo y la unión de nombres o números romanos que indiquen la recombinación genética que se obtuvo de las enzimas naturales.
Ejemplo: EcoDR2 provenientes de cepas de E. coli que producen naturalmente estas enzimas: EcoR124Iy EcoDXXI.
Que es palíndrome
La secuencia que reconocen es una secuencia
palindrómica (secuencia que se lee igual en ambas
direcciones).
Secuencias asimétrica
Sistema/Ejemplo Secuencia
reconocida
Sitio de hidrólisis
Tipo II
EcoRI
Palíndrome
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
5’ G^ AATTC 3
3’ CTTAA ^G 5’
Tipo IIS
HphI
Asimétrica
5´ GGTGA 3
3´ CCACT 5’
5´ GGTGANNNNNNNN^ 3’
3´ CCACTNNNNNNN^ 5’
Enzimas de restricción
Para clonar el ADN se corta en sitios específicos, que son reconocidos y escindidos por enzimas específicas.
Las enzimas de restricción
Reconocer secuencias cortas de ADN de doble cadena como objetivos para la escisión.
Reconocer diferentes, pero específicos secuencias, cada que van de 4-8 pares de bases.
Las enzimas se nombran con una letra 3 (o 4 letras) abreviatura que identifica su origen.
En función de los diferentes modos de acción, las enzimas de restricción se han clasificado en tres categorías principalesTipo I, Tipo II, Tipo III.
Tipos Enzimas de Restricción
Tipo I
Una sola enzima (multimérica, posee 3 subunidades) reconoce secuencias específicas de DNA, metila y restringe.
Restricción no ocurre en el lugar de reconocimiento, sino que es al azar y en lugares distantes al de reconocimiento.
Requieren ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
Tipo I
Requerir ATP, S-adenosilmetionina
(SAM) y los iones de magnesio (Mg2 +)
para la actividad.
Compuesta de 3 subunidades
Sitio de reconocimiento de DNA
Modificación
Restricción
Tipo I
Cortan el ADN al azar lejos de sus secuencias de
reconocimiento. Originalmente se pensaba que eran raras,
ahora se sabe que a partir del análisis de los genomas
secuenciados que son comunes.
Las enzimas son de considerable interés bioquímico, pero
tienen poco valor práctico (aunque en nuevos
descubrimientos se le han brindado un nuevo interés por esta
línea).
No producen fragmentos de restricción discretas o patrones
de gel de bandas son distintas.
Enzimas diferentes, realizan la restricción y modificación.
La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento o adyacente y
permite romper el DNA en lugares específicos, y así, recuperar
secuencias conocidas.
Ellos producen fragmentos de restricción y patrones de bandas en
gel distintos, y son la clase de enzima mas frecuente utilizada en el
laboratorio para análisis de ADN y clonación de genes.
En lugar de formar una sola familia de proteínas relacionadas, las
enzimas tipo II son una colección de proteínas no relacionadas de
muchos tipos diferentes.
Sólo requieren Mg++ como cofactor.
Utilizadas en clonación de genes.
> 2,300 endonucleasas de restricción.
Tipo II
Dependiendo de las desviaciones sobre
la base de las características de enzimas
de tipo II, un número de subdivisiones se
han hecho:
Secuencias degeneradas
Endonucleasas de restricción de tipo II (REases)
reconocen secuencias específicas de ADN
(normalmente 4-8 pb de longitud) y se unirá ellos en
posiciones específicas dentro o cerca de su sitio de
reconocimiento.
La mayoría de los enzimas de restricción reconocen
fielmente un sitio diana único en el ADN (por ejemplo,
EcoRI se une a GAATTC) y discrimina contra otras
secuencias con una especificidad extrema (factor de
discriminación).
Secuencias degeneradas
Sin embargo, un número significativo de REases es capazde interactuar con secuencias de reconocimientodegenerados lo que significa que más de una base se permite en una posición particular del sitio diana.
Ejemplo:
Por ejemplo, la enzima de restricción Bse634I termófiloreconoce secuencia
R / CCGGY,
donde Y (pirimidina) significa 'C o T',
R (purina) significa 'A o G',
'/' indica la posición de división
Secuencia degeneradas
Los mecanismos moleculares que permiten la escisión
REase en varios sitios diana alternativos, pero impiden el
corte en secuencias de ADN no afines, aún no se
entienden completamente.
Si se logra descifrar estos mecanismos puede revelar
nuevas estrategias para lograr la ingeniería de nucleasas
altamente específicas que se dirigen a sitios únicos en el
genoma.
Subtipos de enzimas II
Tipo III
Las enzimas son también enzimas de restricción y de modificación.
Se escinden fuera de sus secuencias de reconocimiento y requieren dos de tales secuencias en orientaciones opuestas dentro de la misma molécula de ADN para llevar a cabo la escisión; rara vez dan digestiones completas.
Tiene dos subunidades diferentes
M - responsable del reconocimiento y modificación de las secuencias de ADN.
R - responsable de la acción nucleasa
**Requiere iones de magnesio y es estimulada por SAM
Tipos de enzimas
Las enzimas de restricción al cortar DNA pueden
producir dos tipos de cortes:
Cohesivos o pegajosos: cortan a manera escalonada
en dos puntos diferentes.
Abruptos, chatos o truncados: cortan en un sólo
punto.
Tipos de corte
Secuencias isoschizomeros
Neoschizomeros
Isocaudomeros
Hidrolisis enzimática
ocurre por:
Fosfodiesterasa específica
metiltransferasa
Fosfodiesterasa
Ejemplo: metiltransferasa
Consecuencia: Es que la enzima no
generará el corte en la hebra metilada.
Si se le cambia las condiciones
Bases Teóricas de enzimas de restricción
La actividad de las enzimas de restricción depende de unas condiciones precisas :
Pureza del DNA
pH y Temperatura
DNAsas
Contaminantes con carga (-)
Concentración de sal
Iones – (cofactores, magnesio)
BSA – captador de iones (estabiliza enzimas y los hace más resistente a la inactivación por calor).
Una unidad enzimática (U) se define como la cantidad de una enzima requerida para digerir 1 ug de DNA bajo condiciones óptimas:
3-5 U/ug de DNA genómico
1 U/ug de DNA plásmido
Cofactores
Un cofactor es una molécula químicamente diferente a la enzima, que está unida a esta y es necesaria para que ésta pueda tener una actividad catalítica.
Existen tres tipos:
Coenzimas - Una coenzima es una molécula pequeña que está químicamente unida a la enzima y es necesaria para su función catalítica, ya que forma parte de su sitio activo, el lugar de la enzima que realiza la reacción.
grupos prostéticos - Un grupo prostético es una molécula con características químicas diferentes a la enzima (como una coenzima), que está unida a ella, pero que no participa como parte del sitio activo.
iones metálicos – Magnesio
¿Cómo se inactiva la enzima?
Factores químicos
Factores físicos
Restriction
Endonucleases
Video
Qué es star activity
Se ha demostrado que bajo ciertas condiciones
no estándar, las endonucleasas de restricción son
capaces de escindir secuencias que son similares, pero no idénticas a su secuencia de
reconocimiento definido.
Esta capacidad alterada o relajado es la que se
conoce como star activity.
Se ha sugerido que la star activity puede ser una
propiedad general de las endonucleasas de
restricción que en condiciones extremas cortan sitios no canónicos.
Condiciones que contribuyen a la
star activity
1. Alta concentración de glicerol [>5%v/v]
2. Altas unidades con relación a los µg DNA [varia
con cada enzima, normalmente >100unidades/µg]
3. Fuerza iónica baja [<25mM]
4. Alto pH [>pH8.0]
5. Presencia de solventes orgánicos [DMSO,
ethanol, ethylene glycol, dimethylacetamide,
dimethylformamide, sulphalane]
6. La sustitución de Mg++ con otros cationes
divalentes [Mn++, Cu++, Co++, Zn++]
Maneras de disminuir o
inhibir la star activity Utilizar menor número de unidades como sea
posible para conseguir una digestión completa. Esto reduce el overdigestion y reduce la concentración de glicerol final en la reacción.
Asegurase de que la reacción este libre de solventes orgánicos tales como alcoholes que pudieran estar presentes en la preparación del DNA.
Eleve la fuerza ionica del buffer a 100 – 150mM (siempre que la enzima no es inhibida por el alto contenido de sal).
Baje el pH a 7.0
Utilice el Mg++ como catión divalente y evite la presencia de los demás.
Metilación del DNA
El ADN metilado se refiere a hebras de DNA que contienen bases de nucleótidos modificados por contener un grupo metilo (-CH3).
Primeros trabajos en el campo de la metilación del ADN se centraron en el estudio de la restricción - sistema de modificación, y el mecanismo de protección genoma del bacteriano.
Existen reportes a finales de los 1960 que se purificó una entidad capaz de producir 5 metil citosina en células de mamífero.
Metilación de DNA
Luego de dos décadas se informó una metiltransferasamurina clonada (1988)
Desde las bacterias hasta los seres humanos, las methyltransferasa son altamente conservadas durante la evolución, y por lo tanto sólo son considerado como reguladores importantes de una variedad de aspectos de la función celular.
Existen tres metiltransferasas: N4 - metiladenina, N5 -metiladenina y C5 - metilcitosina
Metilación de DNA Mamalia vs Bacteria
Bacteria
• Existen tres metiltransferasas: N4 - metiladenina, N5 - metiladenina y C5 - metilcitosina
Mamíferos
• Sólo un tipo de DNA metiltransferasa se conoce en células de mamífero, 5 – metilcitosina. Transfiere el grupo metilo a la posición 5 de la citosina dentro de la secuencia de reconocimiento del dinucleótido CpG.
Metilación de DNA
Metilación relacionada con las
endonucleasas (sintéticos)
Las cepas de E. coli de laboratorio contiene tres metilasa de ADN específica de sitio.
La metilasa codificada al gen presa (Dam) –transfiere un grupo metilo de SAM a la posición N6 de los residuos de Adenina en la secuencia GATC.
La metilasa Dcm (codifica para el gen DCM0 Existen tres metiltransferasas: N4 - metiladenina, N5 - metiladenina y C5 – metilcitosina. Metila los residuos de citosina internos en el CCAGG y en CCTGG en la posición C5.
Metilasa Eco KI – modifica residuos de adenina en la secuencia AAC (N6) GTGC y GCAC (N6).
Comparación de
frecuencia de metilación
Metilasa Eco KI – modifica residuos GTT ( ̴ 1 sitio por 8Kb) son menos comunes que los otros dos.
Dam ( ̴ 1 sitio por 256pb)
Dcm ( ̴ 1 sitio por 512pb)
Aleatoriamente
Importancia de estas metilasas:
1. Algunos sitios para una endonucleasa pueden
ser resistente a la escisión cuando se aísla a partir
de cepas que expresan estos genes.
2. Puede afectar la frecuencia de
transformación. (Se ha demostrado que la
iniciación de la replicación se suprime).
Enzimas
Ejemplo: EcoRI
https://www.neb.com/products/r0101-ecori
Vectores
DNA extracromosomal
Autorepicable
Primer vector sintetizado - Cohen y Boyer
sintetizaron el primer plásmido cortando dos
plásmidos naturales con la enzima EcoRI y
ligando los mismos este fue llamado pSC101. En el
1980 le concedieron las patentes.
Plásmido pBR322
Construida en 1974, fue uno de los primeros plásmidos modificados genéticamente para ser usado en técnicas de ADN recombinante.
Estos principios fueron a menudo los vectores de bajo número de copias, lo que significa que se replican para producir sólo una o dos copias en cada célula.
Derivado pUC18 de pBR322 tiene un "alto número de copias" plásmido (> 500 copias por célula bacteriana).
Características prácticas de los
vectores de clonación del DNA
Tamaño – deberían ser lo suficientemente
pequeños como para que se puedan separar
fácilmente del DNA cromosómico de la bacteria hospedera.
Origen de replicación (ori) – lugar de replicación
de forma separada a los cromosomas.
Se conoce al número de plásmidos que hay en una
célula .
El número normal es pequeño (menor de 12
plásmidos). Plásmido de baja copias.
Alto número de copias (cientos de miles de copias de
plásmidos por células).
Características prácticas de los
vectores de clonación del DNA
Sitio de clonación – MCS posee secuencias de
reconocimiento para varias enzimas de
restricción. Este lugar se genera para que no se pierda un gen sino que el plásmido circular se
vuelve lineal cuando digiere permitiendo la
inserción de un fragmento de interés.
Genes marcadores – permiten la selección e
identificación de las células transformadas
mediante un plásmido recombinante de aquellas
que no lo están. Ejemplos amp, tet,lacZ.
Recombinant Selection:
Resistances Genes
Características prácticas de los
vectores de clonación del DNA
Secuencias del promotor de RNA – permite la
transcripción in vivo e in vitro por la RNA
polimerasa
Secuencias de cebadores – estos permite la
secuenciación de nucleótidos de fragmentos de
DNA clonado que hayan sido insertados al
plásmidos.
Plasmid must have:
Plásmido pUC
1982, de desarrollar nuevas series de
plásmidos
Identificación de ADN extraño que
contiene células
**Tienen tres característica importante:
Alto número de copias
Azul - blanco selección
Polilinker
pUC19 Restriction Map
pUC19 Multiple Cloning
Site
Continuará
References
Glick, B. R. & Pasternack, J.J (2010). Molecular biotechnology: Principles and application of recombinant DNA. 4th ed. USA: American Society for Microbiology.
Lodge, J., Lund, P.A. & Minchin,S. (c2007). Gene cloning (electronic resource): principles and applications.New York ; Abingdon [England] : Taylor & Francis Group, c2007. Retrieved from http://www.netLibrary.com/urlapi.asp?action=summary&v=1&bookid=184298
Reece, R.J. (2004). Analysis of Genes and Genomes. España; John Wiley & Sons