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Universidad De Guadalajara

Centro Universitario de la Costa

•Hibridación: Sondas, southern y northern blot•ClonaciónEquipo 3

Biología molecular

Chávez Mejía FelipeChávez Monteagudo Salvador Iván

Piñón Garfias Miguel EnriqueRamírez de Santiago Andrés Isaías

Hibridación

• Formación de ácido desoxirribonucleico de doble hélice a partir de dos hebras simples complementarias.

Biología molecular del gen. Watson, Baker, Bell, et.al. 5ª edición, Editorial Panamericana

Sondas

• Empleadas para buscar moléculas con secuencias de moléculas complementarias dentro de compuestos formados de ácidos nucleicos.

Deben estar marcadas para poder localizarse y se aplica en una mezcla separada por electroforesis.

ADN nuevo con un precursor marcado

Agregar una señal nueva al extremo de la molécula de

ADN completa

Se pueden detectar en luz UV siendo marcadas con 35S y 32P

Marcada

Señal

Las sondas son útiles para:• Monitorear cantidad o tamaño de una

molécula específica de ADN o ARN en una población de muchas.

Hibridación por transferencia Southern

• Permite identificar el tamaño de un fragmento específico que contiene el gen buscado.

Se toma el ADN seccionado y separado por

la electroforesis en gel

Se transfieren a una membrana + a la que

se adhieren

Todo a concentraciones de temperatura y concentración salina similares a la de la

desnaturalización

Se incuba el ADN unido a la membrana con una sonda de ADN que contiene una secuencia

complementaria del gen buscado

Se sumerge en solución alcalina para

desnaturalizar los fragmentos de ADN

bicatenario

Hibridación por transferencia Northern

• Permite identificar una molécula de ARNm específica en una población de ARN.

Implica transferir moléculas de ARNm separadas a una membrana con carga + y exponerlas a una sonda de ADN radiactiva seleccionada.

CLONACIÓN

Proceso por el que se consiguen copias idénticas de un organismo ya desarrollado, de

forma asexual.

www.unav.es/cryf/clonacion.htm

derivado del griego κλων, que significa "retoño“.

¿Dónde se utiliza?

• La clonación molecular se utiliza en una amplia variedad de experimentos biológicos y las aplicaciones prácticas que van desde la toma de huellas dactilares a producción de proteínas a gran escala.

Transfección y Selección

• Con el fin de amplificar cualquier secuencia en un organismo vivo, la secuencia a clonar tiene que estar vinculada a un origen de replicación; que es una secuencia de ADN

• -Transfección: Se introduce la secuencia formada dentro de células.

• -Selección: Finalmente se seleccionan las células que han sido transfectadas con éxito con el nuevo ADN.

Mejor clonado no puede estar!!!!!!!

Capacidad de construir moléculas de ADN recombinantes y mantenerlas en las células.

Clonación del ADN

Proceso típico de clonación de ADN• Se emplea un vector que aporta información

necesaria para propagar el ADN clonado hacia la célula y un inserto de ADN que se introduce dentro del vector y presenta el ADN mencionado.

Elemento clave para crear moléculas de ADN recombinante

Uso de enzimas de restricción que cortan el ADN en secuencias

específicas

Enzimas que unen entre sí los fragmentos de ADN seccionados

• Mediante creación de moléculas de ADN recombinantes que pueden propagarse a un huésped se puede purificar un inserto determinado de ADN y aislarlo del resto .

• Además amplificarlo para producir grandes cantidades.

En una genoteca un vector común transporta muchos insertos alternativos.

Genoteca: grandes colecciones de este tipo de moléculas híbridas

Clonación de ADN en vectores plásmidos

Una vez segmentado el ADN por una enzima de restricciónnecesita insertarse en un vector para su propagación.

Esto significa que el fragmento de ADN debe insertarse en una 2ª molécula de ADN (el vector) para replicarse en el huésped.

Hospedador más usado es E. coli

Vectores de ADN típicos tienen 3 características:

1. Origen de replicación que permite replicarse en forma independiente del cromosoma hospedador.

2. Algún marcador que permite identificar fácilmente células que contienen el vector.

3. Sitios independientes para unión de una enzima de restricción o varias. Insertando los fragmentos de ADN en un punto específico dentro de un vector íntegro.

Vectores más comunes

Moléculas de ADN circular pequeñas denominadas plásmidos.

Presentes en muchas bacterias y eucariotes unicelulares.

En muchos casos transportan genes que codifican resistencia a antibióticos.

Los plásmidos naturales tienen 2 de las características deseables de los vectores.

• Pueden propagarse en forma independiente en el hospedador.

• Son portadores de un tipo de marcador seleccionable.

• Otro beneficio es que a veces hay muchos plásmidos en la célula, por lo que aumenta la cantidad de ADN que puede aislarse.

• Los plásmidos se simplificaron y modificaron para que un vector plásmido típico tenga más de 20 sitios de restricción.

• Esto permite que haya más variedad de enzimas de restricción para cortar el ADN.

Virus bacterianos (bacteriófagos) se modificaron para usar también como vectores de clonación.

La inserción de un fragmento de ADN en un vector es un proceso simple.

• Un vector plasmídico tiene un sitio de reconocimiento exclusivo para EcoRI, enzima de restricción que dará al plásmido formación lineal.

Como EcoRI produce extremos 5´ protruyentes complementarios entre sí, los extremos adhesivos se aparean y vuelven a formar un círculo con 2 muescas.

• La enzima ADN ligasa y ATP sella las muescas para volver a formar un círculo unido en forma covalente.

• Un segmento específico de DNA evaluado se escinde con una enzima de restricción para producir posibles insertos de ADN

• El vector de ADN cortado con la misma enzima se mezcla con estos insertos y se utiliza ADN ligasa para unir los extremos compatibles del ADN.

• Si la cantidad de insertos supera la de plásmidos de ADN, la mayoría de los vectores volverá a sellarse con el inserto de ADN incorporado en su interior.

Vectores de expresión

• Algunos vectores además del aislamiento y purificación del fragmento específico del ADN, conducen a la expresión de genes dentro del inserto.

• Estos plásmidos se llaman vectores de expresión y tienen promotores de la transcripción justo al lado del sitio de inserción.

• Si la región codificadora del gen (sin su promotor) está en el sitio de inserción en la orientación apropiada, la célula hospedadora transcribirá el gen insertado en un ARNm y lo traducirá.

Uso de vectores de expresión:

• Para expresar genes heterólogos o mutantes con el fin de determinar su función.

• Producen grandes cantidades de una proteína con el propósito de purificarlas

El vector de DNA puede introducirse en organismo hospedadores por transformación

• La propagación del vector con su inserto de DNA requiere a la molécula recombinante en una célula huésped, por un método llamado transformación, que es el proceso por el cual un organismo hospedador pede adquirir DNA proveniente del medio ambiente.

• Se considera que las células tratadas con calcio son competentes para transformarse

La clonación permite crear genotecas compuestas por moléculas de DNA

1. La generación de un clon especifico es un proceso trivial si el DNA donante original es simple o pequeño.

2. La clonación puede llevarse a cabo solo mediante la separación de los fragmentos de DNA después de digerir las moléculas con enzimas de restricción.

3. Separando los fragmentos de DNA pueden purificarse e introducirlos en un vector.

Este proceso es mas difícil si el DNA es mas complejo (genoma humano)

• En la separación electroforética del DNA tratado con una enzima de restricción se obtendrá gran cantidad de fragmentos distribuidos alrededor de los sitios de corte.

• Siendo mas difícil clonar todos los fragmentos y luego separar los clones individuales.

Genoteca

• Población de vectores idénticos que tienen un inserto de DNA diferente en cada uno.

Para construir una genoteca …• Se digiere el DNA evaluado con una enzima de

restricción que permite el tamaño deseado del inserto.

• Luego el DNA cortado se mezcla con el vector apropiado que secciono la misma enzima de restricción en presencia de ligasa.

Proporcionando una gran colección de vectores con diferentes insertos de DNA

• Uso de insertos de DNA de fuentes distintas construyen deferentes clases de genotecas.

Genotecas genómicas

• Genotecas mas simples creadas a partir del DNA geonómico escindido con una enzima de restricción.

• Útil cuando se produce DNA para determinar la secuencia de un genoma.

• Si el objetivo es clonar un fragmento de DNA que codifica un gen en particular la genoteca genómica no será eficiente cando haya poco DNA no codificante

Para aumentar secuencias codificantes se desarrolla una genoteca de cDNA que se construye de la siguiente manera:

En lugar de comenzar con DNA geonómico se usa ARNm para convertirlo es secuencias de DNA por el procedimiento de transcripción inversa y lo lleva a cabo la transcriptasa inversa.

• Cuando sobre las secuencias de ARNm actúa la transcriptasa inversa se hacen copias de DNA bicatenario llamadas cDNA luego se unen al vector

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