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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS
POTOSÍ
COORDINACIÓN ACADÉMICA REGIÓN
ALTIPLANO OESTE
TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE
INGENIERA AGROINDUSTRIAL
Determinación de etanol y metanol en cervezas artesanales por
cromatografía líquida (HPLC)
PRESENTA:
TERESA DE JESÚS RODRÍGUEZ CARDONA
DIRECTOR DE TESIS:
Dr. JUAN ANTONIO RENDÓN HUERTA
CO-DIRECTOR DE TESIS:
Dr. CÉSAR IVÁN GODÍNEZ HERNÁNDEZ
DICIEMBRE 2019
Dedicatoria
Este logro es dedicado a mis padres por ser un pilar fundamental en toda mi vida, por su
amor, trabajo y sacrificio durante estos años que me han permitido llegar a cumplir un sueño
más, por creer y depositar su confianza en mí.
A mi madre Teresa Cardona, principalmente por darme la vida y por haberme apoyado en
todo momento, por sus consejos, paciencia, sus valores, la motivación constante que me ha
permitido ser una persona de bien, pero más que nada por su amor incondicional.
A mi padre Manuel Rodríguez, agradezco el cariño la compresión y paciencia. Por los
ejemplos de perseverancia y constancia que lo caracterizan y que me ha infundado siempre,
por trabajar día a día, por el valor mostrado para salir adelante y principalmente por apoyarme
siempre.
A mis hermanos Aldo, Cindy, Manuel, Saraí y Dionel por ser parte importante de mi vida,
que me han ayudado, motivado a hacer mejor persona, aconsejado y apoyado en el largo
camino de la vida en toda la extensión de la palabra, a mis sobrinos que siempre están ahí
llenándome de alegría y a mi mejor compañero Mario la ayuda que me brindo ha sido
sumamente importante, estuvo a mi lado inclusive en los momentos y situaciones más
tormentosas, siempre ayudándome, fue muy motivador y esperanzador, me ayudo hasta
donde le era posible, incluso más que eso.
Siempre me he sentido maravillada por la linda familia que tengo, se han preocupado de mí
desde el momento en que llegué a este mundo, me han formado para saber cómo luchar y
salir victorioso ante las diversas adversidades de la vida. Muchos años después, sus
enseñanzas no cesan, y aquí estoy, con un nuevo logro exitosamente conseguido.
Quiero agradecerles por todo, no me alcanzan las palabras para expresar el orgullo y lo bien
que me siento por tener una familia tan asombrosa.
Agradecimientos
Principalmente quiero agradecer a la Universidad Autónoma de San Luis Potosí Campus
Salinas, por haberme abierto las puertas para continuar con mi formación profesional, por
tener como prioridad fomentar la educación de calidad en los jóvenes y formar parte de ella.
Agradezco al Dr. Juan Antonio Rendón Huerta por su gran apoyo y motivación para
culminación de mis estudios profesionales, por la paciencia, dedicación y palabras de aliento,
infinitas gracias por ser la persona que me asesoro para la elaboración de esta tesis.
Agradezco al Dr. Cesar Iván Godínez, por sus aportaciones en el trascurso de esta
investigación y su disponibilidad de ayudarme con el equipo ya que sin su contribución no
hubiera sido posible esta investigación.
ÍNDICE
RESUMEN ............................................................................................................................. 1
INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 2
ANTECEDENTES ................................................................................................................. 4
HISTORIA DE LA CERVEZA ............................................................................................. 4
DEFINICIÓN DE CERVEZA................................................................................................ 5
TENDENCIAS DE PRODUCCIÓN Y CONSUMO DE CERVEZA ................................... 6
CONSUMO PER CÁPITA DE CERVEZA ........................................................................... 8
TIPOS DE CERVEZA ........................................................................................................... 9
ESTILOS DE CERVEZA ARTESANAL (ALE) ................................................................ 10
AMERICAN PALE ALE ..................................................................................................... 10
BLONDE .............................................................................................................................. 10
STOUT ................................................................................................................................. 11
PROPIEDADES DEL CONSUMO MODERADO DE CERVEZA ................................... 11
PROCESO DE ELABORACIÓN DE CERVEZA .............................................................. 12
INGREDIENTES DE LA CERVEZA ................................................................................. 15
TIPOS DE MALTAS ........................................................................................................... 15
LEVADURAS (SACCHAROMYCES SPP) ....................................................................... 18
LÚPULOS ............................................................................................................................ 20
AGUA ................................................................................................................................... 21
ADJUNTOS ......................................................................................................................... 22
FERMENTACIÓN ............................................................................................................... 23
ALCOHOLES ...................................................................................................................... 24
TIPOS DE ALCOHOLES .................................................................................................... 25
ALCOHOLES DE FUSEL ................................................................................................... 26
IDENTIFICACIÓN DE ALCOHOLES ............................................................................... 27
DEFECTOS EN LA CERVEZA .......................................................................................... 28
AROMAS Y SABORES EXTRAÑOS EN LA CERVEZA TERMINADA ....................... 28
CROMATOGRAFÍA ........................................................................................................... 29
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) ............................... 29
OBJETIVO GENERAL ....................................................................................................... 30
OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................................... 30
HIPÓTESIS .......................................................................................................................... 31
JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................. 31
MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................. 31
DISEÑO EXPERIMENTAL ................................................................................................ 31
ELABORACIÓN DE CERVEZAS ARTESANALES ........................................................ 31
CUANTIFICACIÓN DE ETANOL Y METANOL POR HPLC ........................................ 33
ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................................. 34
RESULTADOS .................................................................................................................... 35
DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 43
CONCLUSIONES ................................................................................................................ 46
LITERATURA CITADA ..................................................................................................... 47
1
RESUMEN
La cerveza es una bebida fermentada elaborada principalmente a partir de la cebada malteada
(semillas germinadas y secadas artificialmente), que es macera para liberar los azúcares
fermentables vía enzimática en una solución, la cual es aromatizada y amargada con flores
de lúpulo y fermentada con levaduras del género Saccharomyces. El objetivo de este trabajo
fue analizar los tipos de alcoholes que se generan en la fermentación de distintos estilos de
cerveza artesanal (de elaboración propia y comerciales) por cromatografía líquida (HPLC).
Se elaboraron lotes de tres estilos de cervezas artesanales en laboratorio, Blonde, Pale Ale y
Stout en lotes de 15 L. El proceso de elaboración de las cervezas se realiza con una segunda
fermentación en botella con sacarosa al 6 gr/L para su gasificación natural. El proceso de
cada tratamiento fue el mismo, lo único que cambió, fueron las proporciones y cantidades de
malta utilizadas, la cantidad y el tipo de lúpulos usados. Una vez elaboradas las cervezas
artesanales, se calculó el grado alcohólico de cada tratamiento por el método de
cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Lo resultados del análisis indican que
los estilos Pale y Stout presentaron un mayor contenido de etanol en contraste con la cerveza
Blonde. Además, el lote 1 de las tres cervezas fue el que presentó menor contenido etanólico.
Los tres estilos elaborados en la Universidad presentaron un contenido ligeramente mayor al
de las cervezas comerciales. No se encontraron diferencias en el contenido de etanol entre
cervezas filtradas o no filtradas. Por otro lado, no se detectaron niveles de metanol ni otros
alcoholes pesados que sobrepasen la NOM-199-SCFI-2017.
2
INTRODUCCIÓN
La elaboración y consumo de cerveza es muy antiguo y su descubrimiento se le atribuye a
los egipcios en Mesopotamia (Hornsey, 2003). Uno de los grandes cambios del proceso de
elaboración de cerveza fue la incorporación del lúpulo a finales del siglo XIX por los
alemanes, con la finalidad de contrarrestar el sabor dulce de la malta, ya que los únicos
ingredientes que se ocupaban eran la cebada, agua y los microorganismos del ambiente
(Cabras et al., 2016). Los principales países productores de cerveza artesanal son Australia,
Bélgica, Alemania, Estados Unidos y Nueva Zelanda, ya que ellos representan un 65% de la
producción (Deloitte, 2017). El consumo mundial de cerveza en 2017 fue de 186.72 millones
de kilolitros. El consumo de cerveza por país, señala a China (21.5%) como el país de mayor
consumo por 15º año consecutivo, seguido de Estados Unidos (12.8 %), Brasil (6.7 %),
México (4.6 %) y Alemania (4.4 %), es decir estos cinco países consumen el 50 % de la
cerveza que se produjo en el mundo en 2017. La cerveza es una bebida fermentada elaborada
principalmente a partir de la cebada malteada (semillas germinadas y secadas
artificialmente), que es macera para liberar los azúcares fermentables vía enzimática en una
solución, la cual es aromatizada y amargada con flores de lúpulo y fermentada con levaduras
del género Saccharomyces (The Beer Times, 2018). Los principales ingredientes para la
producción de cerveza son cebada, lúpulo, agua y levadura, en la fermentación alcohólica
varias de las sucesiones utilizan diferentes adjuntos que son compuestos aromáticos. El sabor
final de la cerveza depende principalmente del proceso y la composición del mosto en la cepa
de la levadura (Carvalho et al., 2009).
Generalmente una cerveza comercial su grado alcohólico es perfectamente conocido porque
es producto de un proceso completamente estandarizado. En cambio, en la producción de
3
cerveza artesanal, la determinación del grado alcohólico es meramente inferencial mediante
el cambio de densidades del mosto al inicio y al final de la fermentación. Sin embargo, es
necesario conocer a partir de una formulación y un proceso estandarizado de elaboración de
cerveza artesanal los niveles de alcohol que puede alcanzar bajo ciertas condiciones.
Para la cuantificación de alcohol en baja concentración en una solución o producto como la
cerveza, la técnica analítica más utilizada es la cromatografía de líquidos de alta resolución
(HPLC, por sus siglas en ingles). Básicamente es una técnica analítica de separación, la cual
tiene como principio la adsorción selectiva debida a la polaridad o al tamaño, y la capacidad
que tienen las moléculas de eluir a través de una fase móvil sobre una fase estacionaria. De
tal manera, que después de la separación y con la ayuda de un estándar externo (de 99% de
pureza) se puede realizar la cuantificación del compuesto de interés (alcohol y metanol) de
una muestra interpolando dentro de una curva de calibración de diferentes concentraciones
previamente analizada.
4
ANTECEDENTES
Historia de la cerveza
Las bebidas fermentadas son tan antiguas como la domesticación de especies y el desarrollo
de la agricultura, pues surgen con la recolección de frutos azucarados, semillas y raíces
amiláceas, que a su vez les extrajeron los jugos y fermentaron de manera espontánea, gracias
a la microbiota nativa del ambiente (Aguirre, 2012). La elaboración y consumo de cerveza
data de más de 8000 mil años y su descubrimiento se le atribuye a los egipcios (Hornsey,
2003). Hace miles de años en Mesopotamia, nadie entendía que la fermentación natural de
jugos se debía a levaduras presentes en el suelo y en las plantas, por lo cual se pensaba que
era un fenómeno divino (White y Zainasheft, 2010). El proceso de elaboración de cerveza ha
tenido pocos cambios (Bamforth, 2017), y por mucho tiempo se desarrolló de manera
empírica, pues el descubrimiento de los microorganismos responsables de la fermentación
alcohólica fue posterior (mediados del siglo XIX). Uno de los grandes cambios del proceso
de elaboración de cerveza fue la incorporación del lúpulo a finales del siglo XIX por los
alemanes, esto con la finalidad de contrarrestar el sabor dulce de la malta, ya que los únicos
ingredientes que se ocupaban eran la cebada, agua y los microorganismos del ambiente
(Cabras et al., 2016) lo que hacía que fueran fermentaciones más lentas e incompletas. La
producción industrial de cerveza en diferentes países implicó un desarrollo biotecnológico
importante, y el escalamiento del proceso en volúmenes descomunales a principios y
mediados del siglo XX, a tal grado que en la actualidad es considerada la bebida fermentada
más consumida en el mundo. En Alemania, a principios del siglo pasado, descubrimientos
arqueológicos evidenciaron la existencia de jarras que contenían residuos de cerveza hecha
con granos de cebada hace más de 16 siglos, este descubrimiento revela la existencia del
5
conocimiento del proceso de elaboración de bebidas alcohólicas (Grossman y Lemberck,
1983). La producción de cerveza en pequeña escala o nivel doméstico, fue lo que determinó
que la cerveza que se producía en condiciones precarias de equipo, recipientes, maquinaría y
aditamentos especiales para replicar el proceso antiguo, se le diera el concepto de cerveza
“artesanal”. Las pequeñas cervecerías siempre han existido en países de gran tradición
cervecera como Alemania. Sin embargo, a mediados de los años noventa del siglo pasado,
surge la primera cerveza mexicana artesanal inspiradas en las cervezas estadounidenses
(Deloitte, 2017). La producción de estas cervezas artesanales, han tenido un desarrollo y un
auge impresionante en México gracias al acceso de la información por internet y el interés
particular de los jóvenes por elaborar su propia cerveza y comercializarla en nivel local y
nacional.
Definición de cerveza
La cerveza es la bebida fermentada elaborada principalmente a partir de la cebada malteada
(semillas germinadas y secadas artificialmente), que se macera para liberar los azúcares
fermentables vía enzimática en una solución, la cual es aromatizada y amargada con flores
de lúpulo y fermentada con levaduras del género Saccharomyces (The Beer Times, 2018).
Los azúcares simples o fermentables que se obtienen de la maceración de la cebada malteada
son derivados de la hidrólisis enzimática del almidón, principalmente glucosa, maltosa y
maltotriosa. Sin embargo, no todo el almidón es convertido en azúcares fermentables, una
parte de este almidón queda en solución en forma de cadenas dobles de glucanos. Estos
glucanos solubles aportan calorías a esta bebida alcohólica, más que los azúcares
fermentables remantes al final de la fermentación. El contenido de alcohol que llega a
6
alcanzar una cerveza es variable y dependerá de las proporciones y cantidades de cebada y
otros granos utilizados, pero oscila entre 5 - 8 % de alcohol.
Tendencias de producción y consumo de cerveza
Para poder consultar datos específicos del consumo y producción de cerveza en México se
consultaron las estadísticas más recientes en nivel mundial (2017) que la Kirin Holdings
Company con sede en Japón, ha publicado desde 1975. Dichas estadísticas se obtienen a
través de encuestas realizadas a diversas asociaciones de cerveceros de 170 países.
Los principales países productores de cerveza artesanal son Australia, Bélgica, Alemania,
Estados Unidos y Nueva Zelanda, ya que ellos representan un 65% de la producción
(Deloitte, 2017).
El consumo mundial de cerveza en 2017 fue de 186.72 millones de kilolitros. El consumo de
cerveza por país, señala a China (21.5%) como el país de mayor consumo por 15º año
consecutivo, seguido de Estados Unidos (12.8 %), Brasil (6.7 %), México (4.6 %) y Alemania
(4.4 %), es decir estos cinco países consumen el 50 % de la cerveza que se produjo en el
mundo en 2017.
El mercado global de cerveza por regiones en el mismo año, se distribuye de la siguiente
manera: Asia con 33.7 %, Europa 26 % Centro y sur América 17.2 %, Norte América 13.9
%, África 7.3 %, Oceanía 1.2 % y otros 0.6 %. La cerveza artesanal ha tenido un crecimiento
muy favorable en los últimos años, como se muestra en el Cuadro 1, ya que cada vez hay
más productores que elevan su nivel de profesionalismo.
7
Cuadro 1. Crecimiento y ventas de cerveza artesanal en el mundo (Fuente: Alonso 2017).
Año Crecimiento % Ventas en Hectolitros.
2011 - 10,594
2012 43 15,179
2013 68 25,509
2014 77 45,200
2015 43 64,561
2016 62 104, 446
2017 59 166, 069
La cerveza mexicana tiene aparición en más de 180 países a nivel mundial, los principales
destinos son Estados Unidos, Australia, Chile, Canadá, Reino Unido y Brasil. Por lo que la
producción de cerveza, México ocupa el cuarto lugar por debajo de China, Estados Unidos y
Brasil, pero prevaleciendo a Alemania y Rusia (Alonso 2017).
Una encuesta realizada por el corporativo Deloitte (2017) señala que en México los
consumidores de productos con alcohol, el 53% de los encuestados prefieren cerveza
industrial, seguida por la cerveza artesanal con un 14%. Sin embargo, la cerveza artesanal va
creciendo su demanda.
La producción de cerveza por países en 2017 (186.2 millones de kilolitros) en el mundo,
China encabeza el ranking con 20.8 %, Estados unidos 11.4 %, Brasil 7.3 %, México 5.8 %
y Alemania 4.9 %. Los países que más consumen cerveza son los mismos países que
producen la mayor parte de su cerveza a excepción de China y E.E. U.U., México, Brasil y
Alemania son autosuficientes y exportan una pequeña parte a países con déficit de cerveza.
La tendencia del consumo de cerveza a través del tiempo generalmente es positiva, sin
8
embargo, los pequeños retrocesos que se logran ver en las estadísticas de ciertos países con
respecto a otros años, es quizás debido al desarrollo y consolidación de las cervecerías
artesanales, que muchas veces no se contabiliza en estas estadísticas.
Consumo per cápita de cerveza
El consumo per capita de cerveza (litros de cerveza por persona al año) más alto en 2017 fue
Republica Checa, seguido de Austria, Alemania, Polonia, Rumania, Irlanda y España, en 19°
lugar E.E. U.U. y en 25° lugar México (Figura 1).
Figura 1. Consumo per cápita de cerveza (litros por persona por año) por país en 2017.
Fuente: Kirin Holdings Company, 2017.
Rosovsky et al. (2013) mencionan que el consumo per cápita en 1989 fue de 4.7 litros de
etanol para la población mayor de 15 años (3 litros para la población total). En comparación
con otros países incluyendo a los de Latinoamérica, el consumo en México es bajo. La ingesta
de bebidas con etanol en México está representada principalmente por la cerveza (alrededor
del 70%), seguida de los destilados (casi el 30%) y, en forma menor, por los vinos
(aproximadamente 1%). Entre los años 2005-2010, España tenía las estadísticas de mayor
consumidor de cerveza con bajo contenido de alcohol, entre el 4.0 % y 5.0 % (Branyik et al.,
2011). Panda et al. (2015) indican que las bebidas alcohólicas más aceptadas a nivel mundial
9
son el vino y la cerveza, y las bebidas espirituosas como el whisky, el vodka, la ginebra y el
ron. La bebida alcohólica más vendida globalmente es la cerveza, y es la tercera bebida más
consumida después del agua y té.
Tipos de cerveza
Oliver (2012) hace mención que las cervezas se dividen en dos grandes categorías de familias
de cervezas tipo Ale y Lager que a continuación se describen algunas de sus características:
Las del tipo Ale comprende una amplia clase de cervezas aromáticas hechas con malta
de cereales generalmente más amarga que otras cervezas y elaborada con la levadura
de fermentación superior Saccharomyces cerevisiae, es una fermentación rápida de 2
a 7 días y a temperaturas altas de 15° C – 24° C (60° F – 78° F) (Grossman y
Lemberck 1983).
Cervezas tipo Lager, es una bebida brillante de cuerpo ligero, espumosa y
efervescente, elaborada con mezclas de maltas de diferentes cereales, tales como
sémola de maíz o maíz molido, por otro lado, utiliza una levadura de fermentación
inferior Saccharomyces pastorianus (En honor a Luis Pasteur), considerada como una
fermentación lenta de 5 a 10 días a temperaturas bajas de 7° C a 13° C (45° F – 55°
F) (Grossman y Lemberck 1983).
Las cervezas con bajo contenido de alcohol se especializaron por compuestos procedentes de
la malta. Adjuntas por pirazinas y furanos, y mezclados volátiles como linalool, β-humuleno
y α-terpineol derivados del aceite esencial de lúpulo. El Benzaldehído, el acetilpirrol, el
furfural y el 2-furanmetanol fueron características de las cervezas sin alcohol (Riu-Aumatell
et al., 2014).
10
Estilos de cerveza artesanal (Ale)
American Pale Ale
Uno de los primeros estilos americanizados, elaborados por las nuevas cervecerías en la
década de 1980, surgió cuando se utilizaron ingredientes estadounidenses para emular la pale
ale británica. La cerveza resultante mostro sabores cítricos y de lúpulo americanos con esto
fue encendiendo su amplia popularidad en el estilo de cerveza American Pale ale o también
conocida como americana pálida (Garrett, 2012). Las cepas de levadura de cerveza americana
producen menos ésteres que las levaduras de cerveza inglesa, por lo tanto, las cervezas
americanas tienen un sabor afrutado, también tienen más del carácter del lúpulo en sabor y
aroma amargos. El contenido de alcohol varia de tan bajo como 4.5% a tan alto como 6.2%
(Palmer, 2017).
Blonde
Las cervezas rubias o también conocidas como cerveza dorada son muy similares a las
cervezas pálidas, excepto que los lúpulos se han marcado para crear una cerveza que se pueda
beber como una cerveza ligera, puesto que es a menudo la cerveza más accesible para un
nuevo bebedor de cerveza artesanal (Palmer, 2017). La amargura para las cervezas rubias es
de 15-25 IBU en comparación con 25-25 IBU para las cervezas pálidas. El color suele ser un
dorado brillante y son generalmente muy suaves y las cualidades del éster se mantiene al
mínimo, el contenido de alcohol de 4.5% a 5.5%. Algunos cerveceros dicen que prepararlos
requiere habilidad, porque cualquier falla será notable (Garrett, 2012).
11
Stout
Las stouts evolucionaron del robusto portero que era un estilo muy popular en Londres en el
siglo XIX, aunque el termino robusto surgió por primera vez en Inglaterra en la década de
1700 para describir la versión con el alto contenido alcohólico y con sabor más audaz de
cualquier estilo de cerveza. Son una categoría de estilos de cerveza fermentada en caliente
que se distingue por su color, así como su carácter tostado que a menudo se percibe como a
chocolate oscuro o café (Garrett, 2012). La cerveza stout es posiblemente uno de los estilos
más populares entre los cerveceros caseros, varían mucho en sabor, grado de tostado y
cuerpo. La característica definitoria de una cerveza negra es el uso de maltas altamente
tostadas o cebada tostada sin maltear. Hay stout secos con una amargura de 25-45 IBU, su
color es de un marron oscuro a negro (Palmer, 2017).
Propiedades del consumo moderado de cerveza
El consumo de cerveza se ha asociado a contrarrestar un gran número de enfermedades, sin
embargo, aún no hay evidencias contundentes para su comprobación, únicamente se ha
asociado y comprobado que el consumo moderado puede reducir la incidencia de
enfermedades cardiovasculares, debido a sus efectos vasodilatadores, mejoradores del perfil
lipídico a causa en parte al contenido alcohólico bajo, pero en gran parte a los compuestos
no alcohólicos, principalmente compuestos fenólicos, los cuales se derivan del tostado de la
malta y del lúpulo añadido en su elaboración. Así, se ha reconocido que el consumo
moderado de cerveza (28 mL de alcohol, equivalente a dos cervezas de 355 mL al día) puede
reducir la incidencia de enfermedades cardiovasculares (de Gaetano et al., 2016), debido a
sus efectos vasodilatadores, mejoradores del perfil lipídico, atenuantes de la oxidación de las
lipoproteínas de baja densidad, antiinflamatorios y reguladores de los procesos de apoptosis
12
en el endotelio vascular. Capece et al., (2018) mencionan que el incremento de la ingesta de
antioxidantes en la dieta puede ser suministrada por medio de bebidas ampliamente
consumidas, tales como el vino, el café y la cerveza.
Proceso de elaboración de cerveza
El proceso de elaboración de cerveza es el mismo o similar tanto a nivel industrial como de
manera artesanal, comienza con el malteado de los granos, consiste en colocar el grano con
agua fría para estimular la germinación del grano por 24 horas y posteriormente secarlo,
algunos cambios con el uso de abrasión y ácido gilberelico para estimular y homogenizar la
germinación, sin embargo, actualmente no se aplica universalmente (Bamforth, 2017). Las
bacterias ácido lácticas se usan popularmente en las fermentaciones de los alimentos para
mejorar las propiedades sensoriales aromáticas y texturales. La aplicación de estas bacterias
a los granos en el proceso de malteado ayuda a prevenir que los microbios del ambiente se
adhieran a las maltas para la elaboración de la cerveza, resultando en la producción de una
cerveza de mayor calidad (Rouse y Sinderen, 2008). Una vez germinada la cebada es secada
y tostada dependiendo del tipo de cerveza que se quiera y es secada en hornos para su
estabilización y almacenamiento. Posteriormente, la cebada malteada se tritura con un
molino sin llegar a moler completamente, hasta reducir el tamaño de partícula de una cuarta
parte de la cebada malteada. Después se realiza una maceración que consiste en colocar la
cebada malteada malta en agua purificada a 65 – 68° C dependiendo del estilo de cerveza,
por un tiempo de 60 min, el líquido obtenido se llama mosto y es separado por un proceso
de filtración del grano o bagazo de cebada, el siguiente paso consiste en realizar una
pasteurización del mosto, como primer paso se realiza un hervido a 85° C, una vez que
comienza a hervir el mosto se agrega el lúpulo y se deja a hervor durante 60 min, transcurrido
13
este tiempo, se realiza un choque térmico con agua a 0° C con la ayuda de un intercambiador
de calor (Serpentin, placas, etc) y se baja la temperatura del mosto, este se coloca en un
fermentador al que se le agrega la levadura y se deja fermentar por 10 días a 19° C. Para que
ocurra la fermentación en necesaria la interacción de un microorganismo y un sustrato
orgánico susceptible a fermentarse (azucares fermentables). En el proceso de fermentación
de la cerveza el sustrato son los azúcares de la cebada malteada y macerada y el
microorganismo es la levadura, y como consecuencia sus principales subproductos son
dióxido de carbono y alcohol etílico (Vieira, 1996).
Actualmente, las cervecerías artesanales tienen más preferencia por sus estrategias
innovadoras, ya que producen cerveza de temporada con diferentes sabores y niveles de
alcohol, por ejemplo, en invierno se prefiere cervezas de malta caramelizada que es más
fuerte que la de verano ya que esta posee sabor a cítricos y es más ligera (Stewart, 2017)
La elaboración de la cerveza se divide en dos procesos principales, que corresponde a la
conversión del almidón de un cereal en azúcares fermentables por acción de las enzimas que
se encuentran en la malta y la posterior fermentación alcohólica de los mismos por la acción
de la levadura, pues en las siguientes imágenes podemos observar dos formas de elaboración
de cerveza, en la Figura 2, se presentan los pasos de un proceso industrial con puntos de
control establecidos y automatizados, y en la Figura 3 se muestra el proceso de elaboración
de cerveza artesanal.
14
Figura 2. Diagrama de proceso industrial de elaboración de cerveza (imagen tomada de
Lynch et al., 2016).
Molienda Agua Dosificación del lúpulo
Silo de malta Maceración Hervidor Mezclador
Levadura Enfriador
de mosto
Fermentación Maduración Limpiador
de botellas
Limpieza de barriles
Llenado
Llenado
Filtro de cerveza
PROCESO DE
ELABORACIÓN
15
Figura 3. Diagrama de elaboración de cerveza tipo artesanal (Fuente:www.haztucheve.com).
Ingredientes de la cerveza
Los principales ingredientes para la producción de cerveza son cebada, lúpulo, agua y
levadura. En la fermentación alcohólica varias de las sucesiones se utilizan diferentes
adjuntos que son compuestos aromáticos que confieren cualidades organolépticas al
producto. El sabor final de la cerveza depende principalmente del proceso y la composición
del mosto en la cepa de la levadura (Carvalho et al., 2009).
Tipos de Malta
Lewis y Bamforth (2006) hacen referencia que la cebada debe de ser una variedad baja en
proteínas (11% a 13%) para evitar turbidez por la precipitación de las mismas durante la
maceración, y bastante baja en humedad (12%-14%) ya que esta se cosecha en otoño, para
maltearla durante todo el año, esta debe ser movida y limpiada de forma regular y mantener
una temperatura de 13°C y una humedad menor al 13%.
16
Pilsner: Esta es la malta más suave de todas, y le da
a la cerveza un sabor que oscila entre lo dulce y
granulado.
Pale: Se parece mucho a la pilsner, pero la
diferencia radica en el tiempo de horneado, lo que
le da a la cerveza un sabor muy cercano al pan.
Típicamente se usa en la cerveza tipo ale.
Vienna: Es todavía más oscura que la Pale, y se
utiliza para hacer cerveza amber, tales como la Bock
o la Oktoberfest.
Munich: Es el doble de oscura que la vienna, y a
pesar de que no lo parece por su tonalidad ámbar, se
utiliza en cervezas con un sabor un poco más pesado
que la pilsner, pale o vienna. Muchos cerveceros
utilizan esta malta por su sabor acaramelado con
pequeños acentos de tostado y nueces.
Acarameladas: Son utilizadas bastante, tanto para
cervezas ligeras como la pale ale, y un poco más
fuertes como la dark ale, pero las cervezas que se
caracterizan por utilizar esta malta son la ale
inglesa, stout, y porter.
17
Chocolate: Para un sabor mucho más pesado y
fuerte, esta malta es la que más utilizan los
cerveceros, ya que su leve amargura le da un sabor
que se asemeja bastante al cacao. Muchas stout y
porter utilizan este tipo de malta.
Roasted Barley: Este tipo de malta se utiliza en la
stout, ya que le da un sabor profundo y tostado a la
cerveza. La stout irlandes, tal como la Guiness, son
las que utilizan este tipo de malta.
Trigo: Se utiliza mucho por sus proteínas, ya que
éstas ayudan a que la cerveza obtenga sabores
inusuales, como por ejemplo el sabor a plátano o a
clavo y presenten turbidez.
Centeno: Se da en lugares con condiciones
climáticas desfavorables, por eso, su uso en la
cerveza se da en lugares fríos, como Rusia o
Finlandia. De hecho, la cerveza tradicional de estos
dos países es hecha a base de este tipo de malta.
18
Avena: Se utiliza para realzar la textura de la
cerveza, ya que ayuda a crear una profunda
experiencia en el paladar que oscila entre lo
cremoso y sedoso. La cerveza stout y la pale ale son
las que más la utilizan.
Malta negra: Al igual que un café expresso, el
sabor de esta malta es amargo, e inclusive quemado,
pero justo por eso se utiliza en cervezas para
paladares más especializados. Por lo general se
utiliza para añadir profundidad y complejidad a la
cerveza, ya que ayuda a balancear los sabores dulces
propios de cualquier cerveza
Figura 4. Tipos de maltas (imágenes tomadas de Cerveceros de México, 2017).
Levadura Saccharomyces spp
De acuerdo con Kurtzaman et al. (2011) la levadura es microorganismo unicelular eucariota
y perteneciente al reino fungi, se considera un microorganismos económicamente importante
(figura 5). Ya que tiene un amplio uso en la industria como; 1) productores de etanol (bebidas
embriagantes, farmacéutica, solvente, esterilizante), 2) productores de biomasa y bióxido de
carbono (panificación), 3) productores de extractos (membranas celulares, mánanos,
glucanos, vitaminas, etc).
19
Figura 5. Estructura típica de una célula de levadura (imagen tomada de Stewart, 2017)
El nombre del género (Saccharomyces) es una palabra que proviene del griego “Sákcharon”
que significa azucar y “mykes” significa hongo. Este género comprende unas 10 especies, en
los que se encuentran S. cerevisae, S. paradoxus, S. mikatae, S. Kudriavzevii, S. arborícola,
S. eubayanus, S. uvarium, así como, híbridos desarrollados por la industria S. pastorianus y
S. bayanus (Stewart, 2017).
La importancia de la levadura en las bebidas fermentadas es producir el alcohol (White y
Zainasheff, 2010), la ecuación general [1] que describe la conversión de azúcar a etanol es:
Núcleo
Retículo
endoplamático
Mitocondria Globulo
de grasa
Vesículas
Brote
Cables
de actina
Aparato de
Golgi
Pared celular
Membrana
celular
endoplamático
Vacuola
20
Glucosa + 2 ADP + 2 grupos fosfato → 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP [1]
Y por cada gramo de azúcares en solución se produce 0.51 g de alcohol y el resto de CO2 y
otros compuestos minoritarios o congéneres.
Lúpulos
Palmer (2017) menciona que el lúpulo es una la planta tipo enredadera, que puede trepar
sobre cualquier soporte disponible hasta una altura de 9.0 metros o más, es nativa de las zonas
templadas de América del norte, Europa y Asia, el lúpulo florece en verano y los frutos se
obtienen entre finales de agosto y primeros de septiembre (figura 6). El lúpulo (Humulus
lupulus) es una planta estróbilo porque despliegan hojas reproductivas masculinas y
femeninas (las femeninas producen el fruto). Las hojas del lúpulo son parecidas a las de la
vid (uva) mientras que los conos (frutos) se asemejan a una piña en forma, pero es de color
verde claro y delgadas (Anderson et al., 2019). El lúpulo se utiliza en la producción de
cerveza debido a que le confiere un sabor amargo y aroma agradable, que son las
características más distinguibles de la bebida. La vida útil de la planta es de 10 a 15 años para
después sustituirla por otra. Las hojas externas del lúpulo se encuentran unas glándulas de
lupulina amarillas que contienen los aceites esenciales y las resinas que los cerveceros
aprecian por sus cualidades de amargor y aroma. El amargor se logra al isomerizar los ácidos
a los isoácidos más solubles durante la ebullición del mosto, mientras que el aroma de la
cerveza proviene de una mezcla de compuestos volátiles derivados de los aceites esenciales
del lúpulo (Anderson et al., 2019) Los aceites y resinas inhiben el crecimiento bacteriano, y
esta propiedad conservante natural es una de las razones por las que el lúpulo se utilizó por
primera vez en la cerveza.
21
Figura 6. Ilustración de la planta del lúpulo a) plantíos de lúpulo a gran escala, b)
inflorescencias de lúpulo conocidos como piñas y c) lúpulo peletizado.
Agua
La pureza del agua es posiblemente el parámetro más importante en la cerveza, pues esta
representa aproximadamente el 90% de la cerveza y tiene algunos parámetros que pueden
afectar el sabor, incluido el pH, la alcalinidad, las concentraciones de iones metálicos, los
microbios y la presencia de subproductos de desinfección. Algunas recomendaciones para su
uso en la industria cervecera es que debe estar limpia, hervida previamente para eliminar la
dureza temporal, la alcalinidad debe ser inferior a 50 mg/L y debe contener de 50-100 mg de
calcio/L (Palmer y Kaminski, 2013)
Anderson et al., (2019) indican que el pH del agua potable es de alrededor de 7.5, las cervezas
tienen un pH en que oscila entre 3.0 a 6.0 y las cervezas agrias pueden tener un pH tan bajo
como 3.3. La alcalinidad del agua afecta directamente el pH del mosto y el de la cerveza.
Palmer y Kaminski (2013) mencionan que el agua contiene muchos minerales y compuestos
naturales, así como contaminantes artificiales. Los altos niveles de magnesio causan un sabor
agrio y amargo desagradable en la cerveza. El sodio puede hacer que el carácter de la malta
a
b
c
22
sea más dulce a bajas concentraciones, pero también puede interactuar con el cloruro para
dar un sabor salado. El cloruro proporciona una calidad, más completa y más dulce a la
cerveza y también se usa para reducir la alcalinidad. Una cantidad moderada de sulfato
aumenta el "tiempo de permanencia" del amargor y acentúa el sabor del lúpulo, además de
aumentar la sequedad de algunas cervezas.
Adjuntos
Los adjuntos pueden ser macerados porque contienen almidón para convertirlos en azúcares
fermentables, como puede ser el maíz o el arroz, y los adjuntos que no necesitan ser
macerados y se añaden directamente a la olla de hervido pueden ser otro tipo de azúcares
como melazas y jarabes. Lewis y Bamforth (2006) indican que los adjuntos son utilizados
principalmente para que la cerveza sea más sabrosa y menos suave y ayude a diluir la
contribución de la malta al mosto. Algunos cerveceros de Alemania bajo los términos de
Reinheitsgebot pueden usar colorantes un ejemplo es la cerveza farbebier hecha con malta
tostada y filtrada con carbón activado para eliminar el carácter quemado, puesto que hay una
gama de extractos de maltas tostadas en las que los componentes de color y sabor sean
fraccionados y se puedan usar para introducir color sin sabores a las maltas y viceversa
(Lewis y Bamforth, 2006). Aquilani et al., (2015) señalan que los productores enfatizan el
sabor típico y distintivo de sus cervezas, debido a la adicción de frutas hierbas y especias que
puedan transformar la cerveza ordinaria en cerveza especial, junto con otros aromatizantes y
sustratos fermentables. Las primeras cervezas no utilizaban lúpulo, solo agregaban aditivos
para darle un sabor diferente, hoy en día es un ingrediente que contiene glándulas de lupulina
que produce el amargor de la cerveza (Mosher y Thantham, 2017). En la elaboración de la
cerveza el uso de cultivos iniciadores tiene como objetivo aumentar la eficiencia de la
23
fermentación, desarrollar nuevas cervezas y mejorar la complejidad sensorial de la cerveza
que se produce (Capece et al., 2018).
Fermentación
La levadura de cerveza puede ser tolerante a los distintos niveles de etanol ya que no
requieren función genética. Dahabieh et al. (2009) hacen referencia a que la cepa de S.
cerevisiae reduce la formación de carbamato de etilo, un carcinógeno que se produce durante
la fermentación de la cerveza.
Los tipos y la concentración de compuestos fenólicos y nitrogenados presentes en la cerveza
pueden variar según el estilo de cerveza, y están directamente influenciados por la
composición de las materias primas utilizadas en la producción de esta. Dichas materias
primas presentan características diferentes según las peculiaridades genéticas de la planta y
las condiciones ambientales durante el cultivo (Cheiran et al., 2019). Además, el proceso de
elaboración también influye en estos componentes.
La hidrólisis del almidón se puede lograr mediante dos procesos:
El primero de ellos se lleva a cabo por la maceración de algunos cereales malteados,
principalmente cebada u otros cereales. La segunda hidrolisis se realiza por la acción de
enzimas amilasas aisladas de bacterias y hongos para obtener los azúcares que después serán
fermentados con levaduras del género Saccharomyces (Stewart, 2017). Una vez hidrolizado
el almidón en azúcares más simples (maltosa y glucosa), entran a la ruta de la glucolisis
(figura 7) anaerobia para la producción de etanol.
24
Sulfato
Azúcares (C6H12O6) Aminoácidos
Piruvato Cetoácido
Acetil-CoA Etanol
Acil-CoA graso Alcoholes fusel
Lípidos
Figura 7. Principales rutas metabólicas durante la fermentación por las cuales la levadura
sintetiza alcoholes de fusel, ésteres, compuestos de azufre, VDK, acetaldehído y etanol
La fermentación alcohólica implica el rompimiento del piruvato a acetaldehído y CO2 y la
posterior reducción del acetaldehído a etanol por el alcohol deshidrogenasa (Mathews et al.,
2013).
Alcoholes
Los alcoholes son derivados de hidrocarburos saturados o insaturados en los cuales un átomo
de H se ha sustituido por un grupo hidroxilo (-OH). El cual está unido a un átomo de carbono
H2S + SO2
Acetaldehído Ácidos
orgánicos
Ácidos
grasos
Ésteres
Dicetonas
vecinales
25
alifático (Whitten et al., 2015). Garrett (2012) menciona que los alcoholes son precursores
de ésteres aún más potentes de sabor, derivados por reacciones catalizadas por enzimas en
levaduras a través del acoplamiento de los alcoholes con ácidos. Los alcoholes superiores
que se producen en la cerveza y en muchas bebidas espirituosas son n-propanol, isobutanol,
2-metl-1-butanol y 3-metil-1-butanol. Stewart (2017) señala que a medida que la biosíntesis
de alcohol superior es complicada, ya que pueden producirse como subproductos del
metabolismo de aminoácidos o mediante piruvato producidos a partir del metabolismo de
carbohidratos. Las cervezas ale tienden a contener mayores niveles de alcoholes fusel, un
ejemplo, los niveles de propanol son característicamente cuatro veces más altos en cervezas
ale que en cervezas lager y las elevaciones de isobutanol son tres veces más altos en cerveza
ale que en cervezas lager (Garrett, 2012)
Tipos de alcoholes
El etanol que también recibe el nombre de alcohol etílico o alcohol de grano, se obtiene por
la fermentación de azúcares. El metanol o alcohol de madera, se obtiene por la destilación de
madera y hoy en día se produce por monóxido de carbono e hidrógeno (Whitten et al., 2015).
(Etanol: CH3CH2OH, Metanol: CH3OH)
Las cervezas son exquisitas en compuestos alcohólicos de semejantes orígenes, mencionando
hexanol, heptanol y decanol y se derivan de diferentes vías de degradación. Mientras que el
α-terpineol citronelol, geraniol y el vinilfenol provienen del aceite esencial de lúpulo. Los
elementales alcoholes y ésteres podrían perderse por procedimientos físicos o por métodos
biológicos (Riu-Aumatell et al., 2014).
El piruvato tiene numerosos destinos alternativos en los microorganismos anaerobios, las
bacterias del ácido láctico reducen el piruvato a lactato en un solo paso. En cambio, las
26
levaduras convierten el piruvato en etanol en una ruta de dos pasos (Figura 8). La ecuación
[1] se divide en dos partes principales: glucosa a piruvato (glucolisis), luego el piruvato a
etanol. La primera es la descomposición de una molécula de glucosa en dos moléculas de
piruvato (White y Zainasheft, 2010) y la segunda fase (fermentación alcohólica) comienza
con la descarboxilacion no oxidativa del piruvato a acetaldehído catalizada por la piruvato
descarboxilasa (Mathews et al., 2013)
Figura 8. Reacción bioquímica de la generación de etanol a partir de piruvato.
Alcoholes de fusel
Garrett (2012) describe que este tipo de alcoholes son subproductos de la fermentación de
etanol, químicamente hablando presentan más de dos átomos de carbono en la molécula y
con puntos de ebullición más altos que el etanol, están presentes en concentraciones más altas
en cervezas más robustas y alcohólicas como los vinos de cebada y las cervezas tipo stout
imperiales, esto por las altas concentraciones de etanol y fermentaciones más extenuantes.
La levadura comienza a formar alcoholes fusel a partir de piruvato y acetil CoA durante la
síntesis de aminoácidos o de la absorción de aminoácidos, la formación de alcoholes fusel
implica la reoxidación de NADH a NAD+ en el paso final y algunos científicos creen que la
levadura produce alcoholes fusel para que NAD+ vuelva a estar disponible para la glucolisis
(White y Zainasheft, 2010) las condiciones de fermentación que promueven el crecimiento
27
celular, tales como la temperatura, la aireación y el nitrógeno dan como resultado niveles
mucho más altos de alcoholes fusel.
Identificación de alcoholes
El metanol (CH3OH) es el alcohol más sencillo, la ingestión de una cantidad tan pequeña
como 30 ml puede provocar ceguera permanente o la muerte. En la producción de metanol
interviene una reacción del monóxido de carbono con hidrógeno. El etanol CH3CH2OH, tiene
un punto de ebullición de 78ºC, se produce en la fermentación de granos al igual que el
metanol y otros alcoholes de bajo peso molecular (Burns, 2001).
El alcohol etílico (etanol) es el que se obtiene en la fermentación, especialmente de materias
primas que contienen azúcar o almidones sacarificables. El alcohol etílico se clasifica según
su contenido de congenéricos como se muestra en el cuadro 2.
Cuadro 2. Clasificación de las bebidas alcohólicas de acuerdo a su contenido de etanol.
Alcohol etílico mg/100ml
Espíritu neutro 8
De calidad 17
Común 75
La elaboración de bebidas alcohólicas se regula por la NOM-199-SCFI-2017, que no permite
la utilización o mezclas de alcoholes de otros orígenes a los derivados de materias primas
(Cuadro 3).
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Cuadro 3. Especificaciones de la NOM-199 a bebidas Ale y cerveza
Especificaciones
Limites
Mínimos Máximos
Contenido de alcohol 2 % Alc. Vol. 20 % Alc. Vol.
Metanol (alcohol anhidro) - 300 mg/100ml
Acidez total (ácido láctico) - 10 g/l
(Fuente: Diario Oficial de la Federación, 2017)
Defectos en la cerveza
Aromas y sabores extraños en la cerveza terminada
Acetaldehído: generalmente la presencia de acetaldehído en la cerveza nos indica que la
fermentación de la cerveza fue estresada o incompleta. Los aromas pueden ser a calabaza
cortada o una habitación recién pintada, y los sabores pueden ser a sidra, así como a manzana
verde inmadura.
Alcohólico: un sabor alcohólico es un sabor fuerte, a veces picante que puede ser suave y
agradable pero también puede ser caliente y molesto.
Diacetil: es un sabor a mantequilla o caramelo, es una diacetona vecinal que se produce en
la fermentación por una reacción química de precursores de la levadura tales como amino
ácidos y α-acetolactato (Mosher y Trantham, 2017).
Carnoso: los sabores a carne o caldo generalmente son causados por la autolisis de la
levadura, en la cual las células mueren y derraman sus organelos sobre la cerveza. La autolisis
es causada por el hambre de la levadura y es más probable que ocurra con paquetes de
levadura viejos, condiciones de fermentación pobres o fermentaciones prolongadas (Palmer,
2017).
29
Carácter afrutado y alcoholes fusel: la razón más común de altos niveles de alcoholes, ésteres
y α-cetoácidos, puede deberse a un control insuficiente de temperatura, así como producir 2-
butanol, 3-metil-2-butanol, y 2-pentanol a partir de valina e isoleucina (dos aminoácidos) por
el rápido crecimiento de la levadura (Mosher y Trantham, 2017).
Fenoles: algunas cepas de levadura de cerveza producen compuestos fenólicos aromáticos a
través de una reacción de descarboxilacion de ácidos fenólicos que comúnmente se encuentra
en la malta y produce unos sabores extraños, al tener estos aromas y sabores se debe de
examinar los procesos de saneamiento y limpieza (White y Zainasheft, 2010)
Cromatografía
El término cromatografía procede de la palabra griega chroma- que significa color y -
graphein que significa escribir. El primer uso registrado fue del científico ruso Mikhail Tsvet
quien trituro carbonato de calcio y agrego plata verde homogeneizada en un tubo, y seguido
de un solvente orgánico. Así pudo observar bandas de colores separadas conforme el solvente
pasaba a través del tubo (Dhandapani, 2017)
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Miranda y Martin (2018) indican que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por
sus siglas en inglés) es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla. Es
un tipo de cromatografía en columna en el que, por acción de una bomba, se hace pasar una
mezcla de compuestos o analitos en un sistema disolvente comúnmente conocido como fase
móvil (figura 9). La fase móvil pasa a través de una columna cromatográfica, que contiene
la fase estacionaria a un flujo especifico. La separación de los compuestos ocurre con base
en la interacción de éstos con la fase móvil y la fase estacionaria (Dhandapani, 2017).
30
Figura 9. Representación de un equipo HPLC modelo 1260 infinity II Prime de la marca
Agilent (imagen tomada de https://www.agilent.com/en/products/liquid-
chromatography/infinitylab-analytical-lc-solutions/1260-infinity-ii-lc-systems/1260-
infinity-ii-prime-lc-system#zoom1405084609839)
OBJETIVO GENERAL
Estudiar los alcoholes como etanol y metanol que se generan en la fermentación de distintos
estilos de cerveza artesanal (de elaboración propia y comerciales) por cromatografía líquida
de alta resolución (HPLC).
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Analizar el grado de alcohol presente en tres estilos de cerveza artesanal (Blonde,
Pale Ale y Stout).
2. Identificar y comparar el predominio de etanol y metanol que se generan durante la
fermentación de la cerveza artesanal (de elaboración propia versus comercial) por el
método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
31
HIPÓTESIS
La formación de metanol en la fermentación de cerveza artesanal (tipo Blonde ale, Pale ale
y Stout) se produce en igual cantidad que el etanol tanto en cervezas de elaboración propia
como en cervezas comerciales.
JUSTIFICACIÓN
La producción de alcoholes durante la fermentación de cerveza pueden ser varios tipos
(metanol, etanol), sin embargo, no hay suficiente información de la presencia y dominio de
cierto tipo de alcoholes en las cervezas artesanales, que pudieran ser dañinos para la salud de
los consumidores y que además cumplan con la norma de grado alcohólico de bebidas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño experimental
El diseño experimental fue completamente al azar de tratamientos, donde cada
tratamiento será el tipo de cerveza, Blonde, Pale-Ale y Stout, cada tratamiento se realizó por
triplicado en distintos tiempos. La unidad experimental fue una cubeta de 15 L utilizada como
fermentador. Una vez envasada la cerveza en botellas, se seleccionó al azar tres botellas de
cada tratamiento y de cada replica como submuestra para su análisis de etanol y metanol por
cromatografía de líquidos, como variables dependientes.
Elaboración de cervezas artesanales
Se elaboraron en el laboratorio de Procesos Agrícolas de la Coordinación Académica
Región Altiplano Oeste de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí, tres lotes de 15
litros de tres estilos de cervezas artesanales del tipo ale, Blonde, Pale y Stout. Todo el proceso
se realizó bajo condiciones controladas de asepsia e higiene en los materiales, recipientes y
32
mangueras lavados y/o sanitizados con alcohol al 70 %. El proceso de cada tratamiento fue
el mismo, lo único que varío, fueron las proporciones y cantidades de malta utilizadas con
otros granos, la cantidad y el tipo de lúpulos usados. Las formulaciones de las diferentes
mezclas de maltas, tipos de lúpulos y levaduras se describen en el Cuadro 4:
Cuadro 4. Formulaciones y materiales para la elaboración de lote de 15 litros de cervezas
artesanales estilos Blonde, Pale y Stout
Estilos
Ingredientes Blonde (T1) Pale-Ale (T2) Stout (T3)
Malta (kg) 4.10 Base
0.15 Caramelo
4.40 Base
0.30 Munich
0.20 Trigo
0.30 Victory
4.00 Base
0.40 Chocolate
0.25 Caramelo 120ºL
0.20 Negra
Levadura (g) 11.5 Safale US-05 11.00 Safale US-05 11.00 Safale S-04
Lúpulo (g) 28.00 *Willamette 14.00 *Columbus 32.00 *East Kent Golding
Otros lúpulos 7.00**Cascade
7.00**Centennial
14.00 ***Cascade
14.00***Centennial
Agregación de lúpulos: * 60 min en hervor, ** últimos 10 minutos del hervor, *** transcurridos los
60 min de hervor
Se realizó una maceración del grano a 67° C con agua purificada en hieleras de 50 L de
capacidad, para lo cual se calentó agua de garrafón (20 litros) a 78° C, 15 litros de agua
caliente se colocaron en la hielera en contacto con el grano y se dejaron reposar o macerar
por 60 min. Los otros 5 litros restantes se colocaron en otra hielera limpia y se utilizaron para
hacer lavados al bagazo. Posteriormente, se filtró la fase líquida (mosto) del bagazo de cebada
(fase sólida) y se realizó una pasteurización del mosto, como primer paso de este proceso el
mosto se colocó en una olla de acero inoxidable de 20 L y se hirvió a 80° C, una vez que el
mosto comenzó a hervir se agregó el lúpulo y se dejó a hervor durante 60 min, transcurrido
este tiempo se realizó un choque térmico con la ayuda de un intercambiador de calor tipo
33
serpentín de cobre de 7 m de largo y de 3/8 de diámetro, este se colocó adentro de la olla y
se le hizo circular agua a 0° C hasta que la temperatura del mosto descendiera a 35° C.
Después, se pasó el mosto pasteurizado a fermentadores tipo cubeta de plástico grado
alimentario, previamente sanitizados con alcohol al 70%, se les añadió la levadura y se
taparon y se sellaron con airlock (trampa de alcohol). La fermentación se llevó a cabo en un
cuarto oscuro a 19° C por 15 días. Pasado este tiempo, se realizó una segunda fermentación
en botella para su gasificación natural, se preparó una solución de sacarosa (6.0 g/L por litro
de cerveza) y se diluyo en 300 ml de agua purificada, esta se esterilizó, se agregó al
fermentador y se dejó reposar por 30 min. El lavado de botellas y corcholatas se realizó con
una solución de agua y jabón líquido grado alimentario (Starsan) 1.6 mL de jabón/1 L de
agua purificada. Una vez envasada la cerveza se mantuvo en un cuarto oscuro a 19° C por 15
días.
Una vez elaboradas las cervezas artesanales, se estimó el grado alcohólico de cada
tratamiento y cada repetición por densimetría, así como su cuantificación por cromatografía
de líquidos de alta resolución. Los datos de las variables dependientes se presentan con los
valores medios de las repeticiones de cada tratamiento y su desviación estándar.
Cuantificación de etanol y metanol por HPLC
La identificación y cuantificación de etanol y metanol se realizó utilizando el método de
Ewen (2011) por medio de un estándar externo con un cromatógrafo de líquidos de alta
resolución (Serie Agilent 1100, EE. UU.), con un detector de índice de refracción y una
columna Hi-Plex (Animex HPX 87-C, EE. UU.), y un lup de inyección de 20 µl, se utilizaron
etanol y metanol grado HPLC (J.T. Baker, EE. UU.) como estándares. Para su cuantificación,
se construyó una curva de calibración para cada estándar de acuerdo al contenido esperado
34
en las muestras. Como fase móvil se utilizó agua grado HPLC a 5 mM de H2SO4, la cual se
utilizó para la preparación de las muestras por dilución. Cada submuestra de cerveza se
sometió a un baño de sonicación (Branson 1510, EE. UU.) previamente de tomar el volumen
para su análisis, para eliminar el CO2, se hizo una dilución de 1:10 de muestra y fase móvil,
y las muestras se filtraron en membranas de poros de 0,45 µm (Millipore, EE. UU.) antes de
inyectar al HPLC. El compartimento de la columna como el detector de índice de refracción
se operó a una temperatura de 55 °C y con un flujo de 0.6 ml/ min. El tiempo de corrida de
las muestras fue de 26 minutos. Además, se realizó una comparación con cervezas artesanales
de los mismos estilos ya existentes en el mercado.
Análisis estadístico
Los resultados del contenido de alcohol entre lotes de cada estilo de cerveza (Blonde ale,
American pale ale y Stout, triplicado y n = 3.) elaboradas en nuestro laboratorio (propias), se
analizaron por medio de un diseño completamente al azar y con un análisis de varianza,
donde el único factor para cada estilo de cerveza fue el número de lote (3 lotes). Además, se
realizó un análisis estadístico por medio de un diseño de bloques al azar y un análisis de
varianza, donde los bloques resultaron ser los estilos de cerveza y los tratamientos fueron los
lotes, finalmente se hizo una prueba de medias de Tukey con una significancia de p<0.05.
Por otro lado, se compararon los contenidos de porcentaje de alcohol de las cervezas propias
y se compararon contra cuatro marcas comerciales de cervezas artesanales, para esto, se
realizó un diseño de bloques completamente al azar y un análisis de varianza con contrastes
ortogonales, donde los bloques resultaron ser los estilos de cerveza y los contrastes fueron
“cervezas propias vs marcas comerciales”, “cervezas con levadura filtrada vs no filtrada”,
35
finalmente, se hizo una prueba de medias de Tukey con una significancia de p<0.05 con el
software estadístico RStudio (2017).
RESULTADOS
Lo resultados del análisis de alcoholes presentes en las cervezas elaboradas y adquiridas de
marcas comerciales, se hicieron por el método de cromatografía HPLC, en el cual se logró
identificar solamente picos de etanol en un tiempo de retención de 22.44 min, tal como se
muestra en la Figura 10, por otro lado, aun cuando se corrieron estándares de metanol (tiempo
de retención de 18.39 min), este no se detectó en ninguna de las muestras.
Figura 10. Ejemplo de un cromatograma de las muestras de cerveza analizadas en HPLC
Cuantificación de etanol
Los valores del porcentaje del volumen de alcohol en cada uno de los estilos de cerveza
(Blonde, American pale ale (APA) y Stout) se muestran en la figura 11, 12 y 13,
respectivamente. De acuerdo con el análisis estadístico para el estilo de cerveza blonde ale
(figura 11), se observó que si hay diferencias significativas entre lotes (p<0.0001), los valores
más altos de contenido de alcohol se presentaron en los lotes número 2 y 3 siendo ambos
estadísticamente iguales entre ellos y con una media de 6.19 y 5.99, respectivamente. Por
Etan
ol
36
otro lado, el lote número uno fue el que presentó menor contenido de etanol (3.25 % vol.
etanol).
Figura 11. Comparación de contenido de alcohol en tres lotes de cerveza propia estilo
Blonde ale, elaboradas en la Universidad. Columnas con literales distintas son
estadísticamente diferentes (α<0.05). Barras de error están representadas por Desviación
Estándar.
El análisis estadístico para el estilo de cerveza APA, que se muestra en la figura 12, dicho
análisis indica que no hay diferencias significativas entre los lotes (p= 0.0660), el contenido
de alcohol de los tres lotes fue estadísticamente igual entre ellos con una media de 5.28, 7.24
y 6.53, para los lotes 1, 2 y 3 respectivamente.
b
a a
37
Figura 12. Comparación de contenido de alcohol en tres lotes de cerveza propia estilo
American Pale Ale, elaboradas en la Universidad. Columnas con literales distintas son
estadísticamente diferentes (α<0.05). Barras de error están representadas por Desviación
Estándar.
Los resultados del análisis estadístico para el estilo de cerveza Stout, se muestra en la figura
13, no se encontraron diferencias significativas entre los lotes (p = 0.3103) ya que los valores
de contenido de alcohol en los lotes 1, 2 y 3 resultaron estadísticamente iguales entre ellos
con una media de 5.84, 6.83 y 6.40 % vol. de etanol, respectivamente.
a
a
a
38
Figura 13. Comparación de contenido de alcohol en tres lotes de cerveza propia estilo
Stout, elaboradas en la Universidad. Columnas con literales distintas son estadísticamente
diferentes (α<0.05). Barras de error están representadas por Desviación Estándar.
De acuerdo al análisis estadístico del diseño por bloques al azar, indica que los resultados
mostraron diferencias significativas debido al bloque (estilos de cerveza, p<0.002) y los
tratamientos (lotes p<0.0001). Para los bloques las cervezas Stout y APA como se muestra
en la figura 14, fueron estadísticamente iguales con valores de % de vol. de alcohol igual a
6.36 y 6.35, respectivamente, siendo el estilo Blonde el que menor porcentaje de volumen de
alcohol presentó (5.14). Para los tratamientos, los lotes con valores más altos en contenido
de alcohol fue el lote 2 y 3 con una media de 6.75 y 6.30, respectivamente, quedando el lote
1 con el menor porcentaje de volumen de alcohol ya que mostro 4.79, como se observa en la
Figura 15.
a
a
a
39
Figura 14. Comparación del contenido de % de vol. de alcohol entre los tres estilos de
cerveza (Blonde, Pale Ale y Stout) por cada lote. Columnas con distinta literal, son
diferentes estadísticamente (p<0.05). Barras de error están representadas por el Error
Estándar de la Media.
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Blonde Ale Pale Ale Stout
Con
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Bloques por estilo de cerveza
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Lote 1 Lote 2 Lote 3
Conte
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cohol,
% v
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a a
b
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Figura 15. Contenido de % de vol. de alcohol de cada estilo de cerveza (Blonde, Pale Ale y
Stout) por lote 1, 2 y 3. Columnas con distinta literal, son diferentes estadísticamente
(p<0.05). Barras de error están representadas por el Error Estándar de la Media.
De acuerdo al análisis de bloques al azar, se detectaron diferencias significativas del
contenido de etanol entre tratamientos (p=0.0554), el mayor contraste de volumen de alcohol
se logró entre la cerveza elaborada (Testigo) y la comercial # 4 (Figura 16). Además, con el
factor de bloque (estilos) también se detectaron diferencias estadísticas (p<0.01), donde las
cervezas Pale y Stout mostraron mayor contenido de etanol en contraste con la Blonde
(Figura 16).
Figura 16. Comparación del contenido de % de vol de alcohol en cada uno de los estilos de
cerveza, así como en todas las cervezas propias como las ya comerciales. Barras sólidas
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Tes
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Co
mer
cial
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mer
cial
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Co
mer
cial
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Conte
nid
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cohol,
% v
ol
Tratamientos
Blonde ale Pale ale Stout
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corresponden a cervezas sin filtrar y con asientos de levadura, barras con textura
corresponden a cervezas filtradas.
Los resultados del análisis de varianza indicaron que si se detectaron diferencias
significativas (p<0.01) entre los tres tipos de cerveza (bloques), los estilos pale ale y stout
fueron los presentaron el mayor contenido alcohólico (5.64% volumen, en los dos) siendo
ambos iguales estadísticamente hablando, el estilo de Blonde fue el exhibió menor % de vol.
de alcohol (4.89) (Figura 17).
Figura 17. Comparación del contenido de % de volumen de alcohol entre los tres estilos
(Blonde, Pale ale y Stout) en cada estilo se agruparon la cerveza elaborada en la
universidad, así como la de marcas comerciales. Columnas con distinta literal, son
diferentes estadísticamente (p<0.05). Barras de error están representadas por el Error
Estándar de la Media
El análisis de contraste ortogonal de los tratamientos (los diferentes tipos de marcas de
cervezas) mostró que si hubo diferencias significativas entre los tratamientos (p < 0.05) donde
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Blonde Pale Ale Stout
Conte
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Bloqueo por estilo de cerveza
b
a a
(p < 0.01)
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se observó que valores de contenido de alcohol en el tratamiento de la cerveza propia
(UASLP) contiene mayor contenido etanólico en contraste con los otros tratamientos de
marcas comerciales, los tratamientos (comercial #1, comercial #2 y comercial #3) son
estadísticamente iguales, la mayor diferencia estadística se presentó entre el tratamiento de
cerveza propia y la cerveza comercial # 4 (Figura 18).
Figura 18. Comparación del contenido de % de vol. de alcohol de la cerveza artesanal
elaborada en la universidad contra cervezas artesanal comerciales. Columnas con distinta
literal, son diferentes estadísticamente (p<0.05). Barras de error están representadas por el
Error Estándar de la Media
El análisis de contraste ortogonal para ver diferencias del contenido alcohólico entre cervezas
que filtran o no la levadura en cerveza para la gasificación de CO2, el cual muestra en la
figura 19, dicho análisis señala que no hay diferencias significativas si se filtra o no la
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UASLP Comercial 1 Comercial 2 Comercial 3 Comercial 4
Conte
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cohol,
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Tratamientos
aab ab ab
b
(p < 0.05)
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levadura (p = 0.0834), el contenido de alcohol de cervezas filtradas o no fue estadísticamente
igual.
Figura 19. Comparación del contenido de % de vol. de alcohol de la cerveza artesanal con
la levadura filtrada y sin filtrar. Barras de error están representadas por Error Estándar de la
Media.
DISCUSIÓN
El objetivo de este estudio fue identificar los tipos y predominio de alcoholes presentes en la
cerveza artesanal, en los estilos blonde, pale ale y stout, al ser una cerveza artesanal no
pasteurizada y sin filtrar (es decir con sedimento de levadura), la cerveza artesanal por su
proceso pudiera llegar a contaminarse y desviar la fermentación en otros subproductos y
desarrollar alcoholes con efectos negativos sobre la salud (Capece et al., 2018), y al no haber
suficiente información sobre los tipos de alcoholes que se generan durante la fermentación
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Sin Filtrar Filtrada
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ol,
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Levadura en cerveza
(p = 0.0834)
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en cervezas artesanales en México, de ahí la importancia del desarrollo del presente proyecto,
pues además ello, la cerveza es la tercer bebida más popular en todo el mundo después del té
y el café, y es la bebida alcohólica más consumida en el mundo (Rodhouse y Carbanero,
2017).
En un trabajo realizado por Giovenzana et al. (2014) midieron el contenido de alcohol de
cervezas tipo ales y lager por espectrofotometría, y sus resultados concuerdan con los
obtenidos en nuestro trabajo, donde el contenido de etanol varía entre 4.9 y 7.1 % vol de
alcohol.
La identificación y cuantificación de etanol en bebidas alcohólicas no es exclusiva de la
cromatografía de gases, en cromatografía de líquidos recientemente se ha desarrollado
columnas más específicas como la Hiplex- H, que es una columna muy versátil para el
análisis muestras de fermentación, además de medir algunos alcoholes también puede separar
mono y disacáridos, además de algunos ácidos orgánicos.
Por ello el rango del contenido del alcohol encontrados en las muestras de cerveza por HPLC
fue similar al que reporta Rossi et al., (2014) al analizar el contenido de etanol de cervezas
de distintos países, sin embargo, la ventaja que tiene la cromatografía de gases de la del
HPLC es que además del etanol que se encuentra como producto principal de la fermentación,
se puede identificar más de 50 compuestos minoritarios o congéneres de la cerveza.
Zhao et al. (2010) analizaron 34 marcas comerciales internacionales de cerveza y los valores
de contenido alcohólico (entre 3.0 y 8.0 % v/v) también son consistentes con nuestros valores,
además señalan, que variaciones de etanol entre cervezas, se debe principalmente a la
formulación y a las cantidades de malta utilizada así como su calidad.
45
Es importante reconocer que el proceso de elaboración de cerveza se basa en una
fermentación completa de los azúcares (es decir, que se agotan completamente y se
transforman en etanol), por el tiempo que tarda en fermentar y porque la precepción de la
cerveza no es ni ligeramente dulce. Por ello el grado alcohólico es dependiente de la cantidad
de malta que la formulación nos diga, a mayor cantidad de malta, mayor es el grado
alcohólico que esperaremos al final de la fermentación. Eso se refleja con el grado alcohólico
que obtuvimos en el tipo de cerveza Blonde con 4.25 kg de malta, fue la que menor grado
alcohólico tuvo. En cambio, la Pale ale y la Stout con 5.2 y 4.85 kg de malta respectivamente,
fueron superiores que la Blonde, así la formulación es crítica para estimar el grado alcohólico
que puede llegar a alcanzar nuestra cerveza.
Es decir si Coehlo et al. (2019) mencionan que fermentar cerveza en barriles de madera por
largos periodos (3 meses), incrementa la producción de etanol (11% v/v) y otros compuestos
volátiles de mayor peso molecular 3-metil-1-butanol, 2-metil-1-butanol y 2- feniletanol,
quiere decir que para alcanzar ese nivel de alcohol al menos los grados Brix del mosto era
superior a 20° Brix, es decir, casi el doble de lo que se espera de una cerveza normal en el
doble de tiempo, por lo tanto el desarrollo de fermentaciones lentas puede deberse a varias
circunstancias entre ellas insuficiencia de levadura, pero también a un concentración alta de
azúcares del mosto al inicio de la fermentación alcohólica.
Las sustancias con actividad antioxidante presentes en la cerveza provienen esencialmente
de las materias primas empleadas en su elaboración, estando ya presentes en aquellas u
obteniéndose por modificación y transformación de sus constituyentes. Entre estas sustancias
destacan los polifenoles, que provienen esencialmente de la cáscara de la cebada malteada y
del lúpulo. Entre los compuestos que se encuentran en menor proporción en la cerveza, se
46
pueden destacar los compuestos fenólicos y nitrogenados. Vanderhaegen et al. (2006)
señalan que los compuestos fenólicos pueden influir en las características sensoriales de la
cerveza al agregar un sabor amargo y astringente a la bebida, estos compuestos tienen una
capacidad antioxidante y pueden estar relacionados con la estabilidad oxidativa de la cerveza,
aunque la principal fuente de amargor se debe al lúpulo.
El contenido de alcohol de las cervezas sin filtrar (con sedimento de levadura) y las filtradas
no hubo diferencias significativas, ya que las levaduras en es atapa de la fermentación muchas
de las levaduras están muertas y solo las pocas que quedas suspendidas en la cerveza son las
que llevan a cabo la segunda fermentación. Al contrario, si se agrega más sacarosa del rango
normal para fermentar suele presentarse gushing debido una mayor producción de CO2.
CONCLUSIONES
La cerveza artesanal se elabora siguiendo puntos de control de sanitización y limpieza, los
sabores son el resultado de la mezcla de agua, malta, lúpulo y levadura. Su producción es
limitada debido a los costos altos, sin embargo, sus sabor, amargor, aspecto y grado
alcohólico son distintos a las marcas comerciales industriales.
El mayor contenido alcohólico detectado en todas las cervezas analizadas fue de etanol. El
lote uno en las tres cervezas elaboradas fue el que presentó menor contenido etanólico. Los
estilos Pale y Stout, fueron los que mayor contenido de etanol presentaron en contraste con
el estilo Blonde y se relaciona con la cantidad de malta utilizada. Tanto las cervezas propias
como las comerciales presentan un contenido de etanol no mayor a 7.0 % de vol, es decir que
todos cumplen con la Norma Oficial Mexicana. La cerveza elaborada presenta mayor
47
volumen de alcohol, en comparación con marcas de cerveza artesanal comercial, quizás sea
debido a la cantidad de azúcar utilizada para realizar la segunda fermentación en botella para
gasificar de manera natural, esto le aporta un extra de alcohol a la cerveza de la primera
fermentación. Las cervezas sin filtrar (Con asientos de levadura) no presentan mayor
volumen de etanol en contraste con las cervezas filtradas. Con esta técnica no se detectó
producción de metanol, ni de otros alcoholes pesados.
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