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Técnicas de genética molecular

- Detección de secuencias de ADN y ARN

- Localización de un gen

- Estructura y función de una región genómica

- Expresión génica

Se requieren métodos para trabajar con una pequeña

parte del ADN o del ARN

Técnicas de genética molecular

Separación de moléculas por tamaño y carga eléctrica

Permite visualizar fragmentos de ADN:

electroforesis en gel de agarosa

electroforesis en gel de poliacrilamida

electroforesis capilar

Electroforesis

Preparación:

Electroforesis en gel de agarosa

Electroforesis horizontal:

Electroforesis en gel de agarosa

Escaleras de fragmentos de tamaño conocido

100 pb p-GEM PhiX-HaeIII

Marcadores de tamaño molecular

Preparación:

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Electroforesis vertical:

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Secuenciador automático

ABI 3130

Electroforesis capilar

Agentes intercalantes emisores de fluorescencia en

transiluminador de luz UV

Visualización de los fragmentos de ADN

Bromuro de etidio (Sharp en 1973):

- molécula plana capaz de unirse al ADN

- agente carcinogénico y mutagénico.

- se une al ADN de dos formas:

- unión fuerte intercalándose entre los pares

de bases,

- unión débil, “no intercalante”, luego de que

los sitios de intercalación están saturados.

Agentes intercalantes

Intercalación de la molécula de

BrEt- entre dos bases contiguas en

la molécula de ADN.

Luego de la unión, la fluorescencia

del colorante a la luz UV aumenta

casi 20 veces.

Máximo de emisión del BrEt- a

595 nm.

Agentes intercalantes

Riesgo de exposición al BrEt: cancerígeno

Utilización de colorantes inocuos:

Sybr Green, Sybr Gold, Sybr Safe, GelRed, GelGreen.

Agentes intercalantes

Marcación radioactiva del ADN con 32P y

detección por autorradiografías

1 2 3 E 4 5 6 7 8 9 10

Visualización de los fragmentos de ADN

Nitrato de plata, con transiluminador de luz visible

Visualización de los fragmentos de ADN

Marcación con fluoróforos + lector láser

Visualización de los fragmentos de ADN

Obtención de moléculas de ADN genómico

Etapas generales de una extracción de ADN:

-ruptura de membranas

-digestión proteica

-purificación

-precipitación

-resuspensión del ADN

Obtención de moléculas de ADN genómico

Obtención de moléculas de ADN genómico

Fuentes de ADN

• Sangre: • leucocitos de mamíferos (camélidos: eritrocitos

nucleados) • Eritrocitos y leucocitos de otros grupos

Fuentes de ADN

• Otros fluidos corporales: • Líquido amniótico • Semen • Orina

Fuentes de ADN

• Pelos: • Con folículo: ADN nuclear y mitocondrial • Sin folículo: ADN mitocondrial

Fuentes de ADN

• Epitelio bucal: • hisopado de mucosa bucal • enjuague bucal • hisopado de objetos

Fuentes de ADN

• Hueso: • exhumaciones • restos arqueológicos

Fuentes de ADN

• Materia fecal:

Fuentes de ADN

• Material vegetal: • Hojas • Semillas • Flores, etc.

Fuentes de ADN

• Microorganismos: • Cultivos de laboratorio • Material arqueológico (sarro dental antiguo)

Obtención de ARN

Minimizar la actividad de ARNasas (¡muy estables!) - uso de material descartable libre de ARNasas - tratamiento del material de vidrio y las soluciones con DEPC 0,1% - uso de inhibidores de ARNasas (tiocianato de guanidina y agentes reductores) - trabajar rápido, en baja temperatura, con tapas cerradas - utilización permanente de guantes