tecnicas de biologia molecular química biológica patológica dra. silvia varas svaras@unsl.edu.ar...

TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Química Biológica Patológica

Dra. Silvia Varassvaras@unsl.edu.ar

Tema:1 (1)

IV- ParteAplicadas al diagnóstico de Enfermedades Genéticas

TIPO DE MUTACION

DEFINE LA TECNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR A USAR PARA EL DIAGNOSTICO MOLECULAR

Espectro de diferentes tipos de mutaciones en genes humanos

(Human Gene Mutation Database)

14.363 mutaciones en 783 genes

Mutaciones con cambio de sentidoMutaciones sin sentido

6,1%

15,8%

45,1%

11,2% 9,6%

En la región regulatoria En el splicing Sin sentido (nonsense) Con cambio de sentido (missense)

MUTACIONES PUNTUALES

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular

Grandes Deleciones

Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA

Mutaciones Puntuales y deleciones pequeñas

RFLP-PCR(ER-PCR) Mutagenesis mediada

por PCR Alelo-Específicas: MAS-PCR ARMS- MARMS DOT-ASO

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular II

Desconozco la mutación o polimorfismo

SSCP (single strand conformation polymorphism)

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

SSCP (single strand conformation polymorphism) es un método simple y accesible para detectar alteraciones en la secuencia en un fragmento obtenido por PCR

SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena única)

SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena única)

La técnica de SSCP detecta variaciones en la secuencia del ADN (mutaciones puntuales y otros cambios pequeños) debido a la generación de diferencias en la movilidad electroforética.Bajo condiciones no desnaturalizantes, las moléculas de ssADN asumen conformaciones únicas que dependen de su secuencia de nucleótidos.Los cambios conformacionales producidos por variaciones en la secuencia de ADN pueden resultar en diferencia de movilidad detectables.

1. Un par de primers específico es utilizado para amplificar el ADN blanco.

2. La muestra se enriquece en ssADN por medio de una PCR asimétrica, debido a la presencia de uno de los primers en mayor cantidad que el otro.

3. Las movilidades de los fragmentos simple cadena se comparan mediante electroforesis en un gel neutro de poliacrilamida.

4. Las bandas son detectadas.

Rápido enfriamiento

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

Los productos de PCR son cargados en un gel con un gradiente desnaturalizante

Típicamente 20-80% formamida

ADN doble cadena migra hasta encontrar su melting

El melting es determinado por su secuencia y contenido de GC

Las diferentes secuencias migran a diferentes distancias

simple complejo

20%

80%

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular

Grandes Deleciones

Southern Blotting GAP-PCR PCR Multiplex MLPA

Tipos de Blots

Southern Blot – transfiere DNA y la sonda o probe es

de ADN

Northern Blot – transfiere RNA y la sonda o probe es

de ADN

Western Blot – transfiere proteínas y la sonda o

probe son anticuerpos.

The Southern blotting technique

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular

Grandes Deleciones

Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA

PCR Multiplex

Es una variante de PCR en donde dos o más loci son simultáneamente amplificados en la misma reacción.

Cuidados especiales:

1-Los primers de 18-24 pb deben tener un contenido de GC 35-60% de esa forma tiene una T anneling de 55-58ºC o mayor.

2-Distribuir los amplicones de distintos tamaños.

3-Diseñar primers con características similares: sin estructura secundaria ni interacciones entre ellos.

4-Se debe calcular el Tm (no muy diferentes entre primers) y analizar las interacciones entre los primers).

PCR Multiplex

Cuidados especiales II:

5- Se deberá optimizar: Tº extensión, Tiempo de extensión, Tiempo y temperatura de anneling, número de ciclos, cantidad de primers, concentración de dNTP y MgCl2, uso de adyuvantes (glicerol, DMSO, BSA), etc.

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular

Grandes Deleciones

Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA

GAP-PCR.

Se utiliza un par de primers que flanqueen la zona delecionada (para el alelo mutado) y un primers ubicado sobre la deleción (para el alelo normal).

Se generará dos productos de amplificación, el fragmento de menor tamaño se producirá a partir del alelo que presenta la mutación.

Delecion African

HPFH-2

N

M

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular

Grandes Deleciones

Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA

MLPA (múltiple amplificación de sondas dependiente de ligación)

Es una técnica basadas en una amplificación cuantitativa por PCR.

Presentan la ventaja de permitir el análisis de hasta 40-50 secuencias blanco simultáneamente.

Son técnicas muy usadas para detección de delecciones y duplicaciones del genoma.

Se aplica a estudios en genética humana, citogenética e investigación en cáncer

Instrumentos

Un termociclador y un sistema de electroforesis tipo de secuencia son requeridos para MLPA

Los resultados son obtenidos en 24 hs. Mas de 96 Ms pueden ser procesados en un experimento

Mix-Probes

MLPA probes consiste de 2 oligonucleotidos: La sonda oligonucleotido izquierda(LPO) (7) y la sonda oligonucleotido

derecha(RPO) (8)

Cada oligo a su vez contiene 2 partes: El LPO contiene en su extremo 5’ el F y en su extremo 3’La secuencia de la sonda de hibridización izquierda (LHS). El RPO contiene en su extremo 5’ la sonda de hibridización

derecha (RHS) y el primer R en su extremo 3’

Las sondas hibridizan de manera inmediatamente adyacente, de esta manera solo aquellos pares de sondas que encuentran sus secuencias blanco pueden ser ligadas y amplificadas por PCR.

Protocolo típico de MLPA

• Característica General

La amplificación es de las sondas de MLPA, no de las muestra de ADN.

El pattern de los picos son generadas sobre la muestras de un paciente y una muestra de ADN de referencia. Se compara la altura relativa de los picos. Las diferencias reflejan los cambios en el número de copias detectados por las probes de MLPA.

Mas de 50 probes están presentes en una reacción de MLPA

VENTAJAS de MLPA:

Detección de número de copias de 40-50 secuencias de ADN genómicos en una simple reacción, basada en PCR

Requiere únicamente 20 ng de ADN humano (3.000 células/0,5 ml de fluido amniótico).

MLPA puede ser usado sobre Ms de ADN parcialmente degradadas tales como ADN extraído de tacos de tejidos parafinados.

PROBLEMAS de MLPA:

Costo Necesidad de instrumental especifico

Deleciones

Alguna pregunta?