tecnicas de analisis en genetica forense
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Muestra obtenida de la escena del crimen o de
una prueba de paternidadBIOLOGÍA
Extraccion de ADN
Extraccion de ADN
Cuantificacion de ADN
Cuantificacion de ADN
Amplificación PCR de marcadores STRs
Amplificación PCR de marcadores STRs
TECNOLOGÍA
Separación y Detección de productos PCR ( Alelos de STRs)
Determinación genotipo muestra
GENÉTICAComparación del
genotipo de la muestra con otros resultados
Comparación del genotipo de la muestra
con otros resultados
Análisis de los resultados (comparación con datos
poblacionales)
Análisis de los resultados (comparación con datos
poblacionales)
Entrega de resultados (cálculos estadísiticos)
Entrega de resultados (cálculos estadísiticos)
PASOS EN EL PROCESAMIENTO DE UNA MUESTRA DE ADN
Muestras utilizadas para extracción de ADN
•Describir tipo de muestra, su color, su forma, su marca, etiqueta y talla si procede, tipo de envoltorio que lo contenía y estado de conservación.
•Muestras dubitadas
•Muestras indubitadas
EXTRACCION DE ADN
Extracción orgánica (fenol-cloroformo)
Extracción no orgánica (agentes quelantes): agentes quelantes: resina Chelex, formada por copolímeros de estirenodivinilbenceno que contienen iones iminodiacetato que actúan como grupos quelantes.
CUANTIFICACION DEL ADN
Fluorometría
Fundamento: capacidad de unión del ADN a ciertos tintes fluorescentes como H33258
Comparación de las muestras problema con muestras de cantidad de ADN conocida
Se utiliza un Fluorímetro: lámpara de mercurio y un detector para medir fluorescencia relativa a 460nm
ADN de doble cadena
CUANTIFICACION DEL ADN
Espectrofotometría Medida de la cantidad de luz
ultravioleta que absorben las bases nitrogenadas
Utiliza un espectrofotómetro, medidas de absorbancia a 260 y 280nm
OD260/OD280: pureza del ácido nucleico
Poco sensible: no dectecta concentraciones de ADN inferiores a 250ng/ml
ESPECTRO DE ABSORBANCIA ADN
http://www.cardiff.ac.uk/biosi/staffinfo/kille/Methods/Gene/Spec_Analysis.html
CUANTIFICACION DEL ADN
Minigel de agarosa Midiendo la fluorescencia
inducida por ultravioleta que se produce cuando se intercalan moléculas de bromuro de etidio entre el ADN
Comparar con patrones estandar de cantidad de ADN conocida
Poco sensible
Ventajas: se puede visualizar el grado de degradación del ADN
CUANTIFICACION DEL ADN
Hibridación con sondas (Dot Blot y Slot Blot)
Hibridación de las muestras a cuantificar con una sonda del locus humano alfa satélite D17Z11.
ADN problema se inmoviliza en una membrana de nylon (punto: dot-blot; guión:slot-blot), se pone en contacto con la sonda
Sondas marcadas
Comparación intensidad de señal de la muestra con estándares
CUANTIFICACION DEL ADN
Hibridación con sondas (Dot Blot y Slot Blot)
•Solo cuantifica ADN humano
•Altamente sensible, detecta cantidades del orden de 20pg
•Cuantifica ADN de cadena sencilla y muestras de ADN no purificadas
CUANTIFICACION DEL ADN
Cuantificación enzimática Uso de una serie de enzimas para producir una cantidad de ATP
que depende de la cantidad de AD N presente en la muestra seguida de la generación de una señal luminosa, dependiente de la concentración de ATP
Copias (extensión de primers )
ADN MOLDE 5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
Adición de primers
(alineamiento)
5’3’
3’5’
Forward primer
Reverse primer
TÉCNICA DE PCR
Cadenas separadas
(denaturación)
5’
5’3’
3’
En 32 ciclos con un 100% de eficiencia se pueden producir hasta 1.07 billones de copias de ADN molde
En 32 ciclos con un 100% de eficiencia se pueden producir hasta 1.07 billones de copias de ADN molde
MULTIPLES COPIAS DE ADN POR PCR
Original DNA target region
Thermal cycleThermal cycle
MULTIPLEX PCR
Se pueden analizar hasta 10 loci simultáneamente
Alta sensibilidad menos de 1 ng de ADN
Util en análisis de muestras degradadas y de mezclas
Ventajas: disminuye costos, tiempo, contaminación del ADN
SEPARACION de PRODUCTOS PCR
PCR Multiple: diferentes marcadores fluorocromos pueden ser usados para el análisis de loci donde se sobrelapan el tamaño de los alelos
Separación de productos PCR:
TIPIFICACION MANUAL: Tinción de nitrato de plata DETECCION FLUORESCENTE SEMIAUTOMATICA
Electroforesis capilar Electroforesis en geles de poliacrilamida
EJEMPLO DE UN KIT DE MULTIPLEX
D3 FGAvWA 5-FAM (blue)
D13D5 D7 NED (yellow)
A D8 D21 D18 JOE (green)
Estandar interno GS500
ROX (red)
AmpFlSTR® Profiler Plus™
9 STRs amplificados junto con Amelogenina en una sola reacción de PCR
100 pb 400 pb300 pb200 pb
Separación por tamaño
Sep
ara
ció
n p
or
colo
r
ELECTROFORESIS
Electroforesis convencional Geles de agarosa Geles de poliacrilamida
Fundamento El ADN está cargado
negativamente y al someterlo a una diferencia de potencial se moverá hacia el ánodo a través del gel una distancia proporcional a su tamaño, alcanzando mayor distancia las moléculas de menor peso.
Cuando los fragmentos de ADN alcanzan la ventana capilar, el láser excita los colorantes fluorescentes. La fluorescencia emitida por los colorantes es colectada por el detector a longitudes de onda particulares y registrados como señales digitales en el computador.
El instrumento de secuenciación automática genera un cromatograma mostrando la emisión de los fluorocromos cuando ellos pasan por el detector en el instrumento. El orden de estos colores corresponde a el orden de las bases en el ADN. Así una secuencia de ADN puede ser leída directamente desde el cromatograma.
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